Luận án tiến sĩ đặc điểm sinh học phân tử của escherichia coli mang gen mcr1 kháng colistin phân lập từ người và vật nuôi thực phẩm và nước tại xã thanh hà hà nam

Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của Escherichia coli mang gen mcr1 kháng colistin từ người, vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà, Hà Nam.

• Tác giả: Nguyễn Thị Tuyết Mai
• Người hướng dẫn: TS. Trần Huy Hoàng
• Trường học: Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương
• Chuyên ngành: Vi sinh y học
• Đề tài: Đặc điểm sinh học phân tử của Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh
• 1.2. Sự đề kháng kháng sinh
• 1.3. Các nguyên nhân gây gia tăng và lan truyền các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh
• 1.4. Vi khuẩn gram âm đường ruột và thực trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gram âm đường ruột
• 1.4.1. Vi khuẩn gram âm đường ruột
• 1.4.2. Thực trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn gram âm đường ruột hiện nay
• 1.5. Đặc điểm vi sinh vật học và tình hình kháng colistin của E.
• 1.5.1. Đặc điểm vi sinh vật học
• 1.5.2. Các nghiên cứu về gen mcr-1 kháng colistin của E. coli và các vi khuẩn gram âm đường ruột trên thế giới và Việt Nam
• 1.5.3. Một số đặc điểm về gen mcr-1 và plasmid của các chủng E. coli kháng colistin
• 1.6. Các kĩ thuật phát hiện kháng kháng sinh và các kĩ thuật sinh học phân tử sử dụng trong phát hiện các gen kháng kháng sinh
• 1.6.1. Kĩ thuật phát hiện kháng kháng sinh
• 1.6.2. Các kĩ thuật sinh học phân tử nghiên cứu vi khuẩn kháng kháng sinh
• 1.6.2.1. Kỹ thuật PCR phát hiện gen kháng kháng sinh
• 1.6.2.2. Kỹ thuật RADP PCR
• 1.6.2.3. Kỹ thuật điện di xung trường
• 1.6.2.4. Kỹ thuật Southern blot phân tích hệ gen vi khuẩn
• 1.6.2.5. Kỹ thuật Multi Locus Sequence Typing
• 1.6.2.6. Kỹ thuật giải trình tự gen
• 1.7. Các vấn đề cần giải quyết trong nghiên cứu
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Thiết kế nghiên cứu
• 2.3. Thời gian nghiên cứu
• 2.4. Đối tượng nghiên cứu
• 2.5. Cỡ mẫu nghiên cứu
• 2.6. Phương pháp lấy mẫu và kỹ thuật xét nghiệm
• 2.6.1. Kĩ thuật nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
• 2.6.2. PCR phát hiện gen mcr-1
• 2.6.3. Kỹ thuật định danh vi khuẩn bằng máy MALDI TOF
• 2.6.4. Kỹ thuật đánh giá nồng độ kháng sinh ức chế tối thiểu
• 2.6.5. Phân tích mối liên hệ kiểu gen bằng kỹ thuật PFGE
• 2.6.6. Kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn
• 2.6.7. Kỹ thuật tiếp hợp đánh giá sự lan truyền gen mcr -1 qua plasmid
• 2.7. Biến số và chỉ số trong nghiên cứu
• 2.8. Phương pháp thu thập thông tin
• 2.9. Xử lý và phân tích số liệu
• 2.10. Khống chế sai số
• 2.11. Đạo đức trong nghiên cứu
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ người và động vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà, Thanh Liêm, Hà Nam, năm 2015
• 3.1.1. Đặc điểm chung về các loại mẫu được thu thập trong nghiên cứu
• 3.1.2. Tỷ lệ mẫu có chứa chủng E. coli mang gen mcr-1 phân lập được từ người người, động vật nuôi, thực phẩm và nước
• 3.1.3. Tỷ lệ chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 phân lập được từ người, động vật nuôi, thực phẩm và nước
• 3.1.4. Mức độ nhạy cảm colistin của các chủng E. coli mang gen mcr-1
• 3.1.5. Tỷ lệ phân bố của gen mcr-1 trên NST và plasmid của các chủng E.
• 3.1.6. Mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng E. coli mang gen mcr-1 trong phân người và động vật nuôi, thức ăn và nước
• 3.1.7. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 phân lập được trong nghiên cứu
• 3.1.7.1. Các gen kháng kháng sinh của các chủng E. coli mang gen mcr-1
• 3.1.7.2. Mối liên hệ về kiểu gen giữa các chủng vi khuẩn mang gen mcr-1
• 3.1.7.3. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng E. coli mang gen mcr-1 bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen
• 3.1.8. Kết quả xác định đặc điểm plasmid, cơ chế lan truyền qua trung gian plasmid và cấu trúc di truyền động của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1
• 3.1.8.1. Xác định đặc điểm của các plasmid mang gen mcr-1
• 3.1.8.2. Xác định khả năng lan truyền gen kháng qua trung gian plasmid giữa các chủng vi khuẩn
• 3.1.8.3. Xác định cấu trúc của các yếu tố di truyền di động mang gen mcr-1
• 3.2. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ người, vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà huyện Thanh Liêm, Hà Nam giai đoạn 2014-2015
• 3.2.1. Một số đặc điểm về quần thể thu thâp mẫu nghiên cứu
• 3.2.2. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ người, động vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà huyện Thanh Liêm, Hà Nam giai đoạn 2014-2015
• 3.2.3. Mức độ nhạy cảm colistin của các chủng E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin
• 3.2.4. Sự phổ biến của các chủng E. coli mang gen mcr-1 trên NST và plasmid
• 3.2.5. Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng E. coli mang gen mcr-1 tại cộng đồng trong nghiên cứu
• 3.2.6. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 phân lập được trong nghiên cứu
• 3.2.6.1. Các gen kháng kháng sinh
• 3.2.6.2. Mối liên hệ về kiểu gen của các chủng E. coli mang gen mcr-1 bằng kỹ thuật PFGE
• 3.2.6.3. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng E. coli mang gen mcr-1 bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ bộ gen
• 3.3. Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo
• 4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về đặc điểm sinh học phân tử của Escherichia coli mang gen mcr 1

Escherichia coli (E. coli) là một trong những vi khuẩn gram âm phổ biến nhất trong đường ruột của người và động vật. Sự xuất hiện của gen mcr-1 đã tạo ra một thách thức lớn trong điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn này. Gen mcr-1 mã hóa cho khả năng kháng colistin, một loại kháng sinh được sử dụng như lựa chọn cuối cùng trong điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn kháng thuốc. Việc nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của E. coli mang gen mcr-1 là cần thiết để hiểu rõ hơn về cơ chế kháng thuốc và sự lây lan của nó trong cộng đồng.

1.1. Đặc điểm vi sinh vật học của E. coli mang gen mcr 1

E. coli mang gen mcr-1 có khả năng sinh sản nhanh chóng và dễ dàng lây lan qua môi trường. Các nghiên cứu cho thấy rằng gen này thường nằm trên plasmid, cho phép nó dễ dàng truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác. Điều này làm tăng nguy cơ xuất hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc trong cộng đồng.

1.2. Tình hình kháng colistin của E. coli tại Việt Nam

Tại Việt Nam, sự xuất hiện của E. coli mang gen mcr-1 đã được ghi nhận trong nhiều nghiên cứu. Các chủng này không chỉ tồn tại trong môi trường mà còn trong thực phẩm và động vật nuôi, gây ra mối đe dọa lớn cho sức khỏe cộng đồng.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu E

Sự gia tăng các chủng E. coli kháng colistin mang gen mcr-1 đang trở thành một vấn đề nghiêm trọng trong y tế công cộng. Việc điều trị các nhiễm trùng do các chủng này gây ra trở nên khó khăn hơn, đặc biệt khi chúng đồng thời kháng nhiều loại kháng sinh khác. Thách thức lớn nhất là xác định nguồn gốc và cách thức lây lan của gen mcr-1 trong cộng đồng.

2.1. Nguyên nhân gia tăng sự kháng thuốc

Việc sử dụng kháng sinh không hợp lý trong y tế và chăn nuôi là nguyên nhân chính dẫn đến sự gia tăng của các chủng E. coli mang gen mcr-1. Sự lạm dụng này đã tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển và lây lan gen kháng thuốc.

2.2. Tác động đến sức khỏe cộng đồng

Sự hiện diện của E. coli mang gen mcr-1 trong thực phẩm và môi trường có thể dẫn đến các nguy cơ sức khỏe nghiêm trọng. Các chủng vi khuẩn này có thể gây ra các bệnh nhiễm trùng khó điều trị, ảnh hưởng đến sức khỏe của người dân.

III. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của E

Để nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của E. coli mang gen mcr-1, nhiều phương pháp hiện đại đã được áp dụng. Các kỹ thuật như giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) và điện di xung trường (PFGE) giúp xác định cấu trúc di truyền và mối quan hệ kiểu gen giữa các chủng vi khuẩn.

3.1. Kỹ thuật giải trình tự gen

Giải trình tự toàn bộ hệ gen cho phép xác định chính xác các gen kháng và cấu trúc di truyền của E. coli mang gen mcr-1. Kỹ thuật này cung cấp thông tin quan trọng về sự lây lan và phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc.

3.2. Kỹ thuật PFGE trong phân tích kiểu gen

Điện di xung trường (PFGE) là một kỹ thuật hữu ích để phân tích mối quan hệ kiểu gen giữa các chủng E. coli. Kỹ thuật này giúp xác định sự tương đồng và khác biệt giữa các chủng vi khuẩn mang gen mcr-1.

IV. Ứng dụng thực tiễn và kết quả nghiên cứu về E

Nghiên cứu về E. coli mang gen mcr-1 không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế kháng thuốc mà còn cung cấp thông tin quan trọng cho các biện pháp kiểm soát và phòng ngừa. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ vi khuẩn mang gen mcr-1 trong cộng đồng đang gia tăng, điều này đòi hỏi sự chú ý từ các cơ quan y tế.

4.1. Tỷ lệ vi khuẩn mang gen mcr 1 trong cộng đồng

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ E. coli mang gen mcr-1 trong các mẫu phân lập từ người và động vật nuôi là đáng kể. Điều này cho thấy sự lây lan của gen kháng thuốc trong cộng đồng.

4.2. Biện pháp kiểm soát và phòng ngừa

Để kiểm soát sự lây lan của E. coli mang gen mcr-1, cần có các biện pháp phòng ngừa hiệu quả. Việc giáo dục cộng đồng về sử dụng kháng sinh hợp lý và kiểm soát ô nhiễm thực phẩm là rất cần thiết.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu về E

Nghiên cứu về đặc điểm sinh học phân tử của E. coli mang gen mcr-1 là rất quan trọng trong bối cảnh hiện nay. Sự gia tăng các chủng vi khuẩn kháng thuốc đang đặt ra nhiều thách thức cho y tế công cộng. Cần tiếp tục nghiên cứu để hiểu rõ hơn về cơ chế lây lan và phát triển của các chủng này.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc xác định các yếu tố nguy cơ và cơ chế lây lan của gen mcr-1. Điều này sẽ giúp xây dựng các chiến lược phòng ngừa hiệu quả hơn.

5.2. Hướng đi tương lai trong nghiên cứu kháng sinh

Cần phát triển các phương pháp mới để phát hiện và kiểm soát các chủng vi khuẩn kháng thuốc. Sự hợp tác giữa các nhà nghiên cứu, cơ quan y tế và cộng đồng là rất cần thiết để đối phó với vấn đề này.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tình trạng lạm dụng kháng sinh trong y tế cùng với việc sử dụng phổ biến trong chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản để phòng bệnh, điều trị và kích thích tăng trưởng đã dẫn đến sự gia tăng nhanh chóng mức độ kháng thuốc của vi khuẩn. Sự xuất hiện của các chủng trực khuẩn Gram âm sinh men New Delhi metallo-beta-lactamase-1 (NDM-1) kháng nhóm carbapenem – nhóm kháng sinh lựa chọn cuối cùng đối với vi khuẩn sinh men ESBL – đã khiến việc điều trị các ca nhiễm trùng nặng trở nên rất khó khăn. Trước bối cảnh này, colistin (thuộc nhóm polypeptide) được tái sử dụng trên lâm sàng như giải pháp sau cùng. Dù đã bị hạn chế sử dụng trên người từ những năm 1970 do độc tính trên thận và thần kinh, colistin vẫn được dùng với khối lượng lớn trong nông nghiệp.

Năm 2015, gen mcr-1 kháng colistin qua trung gian plasmid lần đầu tiên được phát hiện trên vi khuẩn Escherichia coli tại Trung Quốc, mở ra giả thuyết về sự truyền gen kháng từ vật nuôi sang người qua áp lực chọn lọc colistin trong chăn nuôi. Tại Việt Nam, các công bố ban đầu chủ yếu ghi nhận sự hiện diện của gen mcr-1 ở môi trường bệnh viện hoặc trong phạm vi hẹp tại các trang trại gia súc, gia cầm. Khu vực nông thôn miền Bắc chưa có công trình nào khảo sát đồng bộ trên toàn thể hệ sinh thái cộng đồng gồm người, vật nuôi, thực phẩm và nguồn nước, cũng như chưa làm rõ cấu trúc di truyền phân tử và cơ chế phát tán của các chủng E. coli mang gen này.

Luận án tiến sỹ y học của tác giả Nguyễn Thị Tuyết Mai với đề tài "Đặc điểm sinh học phân tử của Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập từ người và vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà, Hà Nam, năm 2015" (chuyên ngành Vi sinh y học, mã số 62 72 01 15) được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống nghiên cứu trên với 2 mục tiêu:

1. Xác định tỷ lệ chủng E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ phân người và vật nuôi, thực phẩm, nước tại xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, Hà Nam, năm 2015.
2. Xác định một số đặc điểm sinh học phân tử của chủng E. coli mang gen mcr-1 đã phân lập được.

Đối tượng nghiên cứu là các chủng trực khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin được phân lập từ 4 nhóm mẫu: phân người, phân động vật nuôi (lợn, gà...), thực phẩm (thức ăn) và nước sinh hoạt, nước môi trường. Phạm vi không gian được thực hiện tại 69 hộ gia đình thuộc các thôn của xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam. Thời gian thu thập mẫu diễn ra trong năm 2015 (giai đoạn khảo sát 2014–2015), các phân tích chuyên sâu được hoàn thành và bảo vệ năm 2022 tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng quan các hướng nghiên cứu trong nước và quốc tế về cơ chế kháng kháng sinh và sự lưu hành của gen mcr-1:

• Khái niệm và cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn: Tác giả hệ thống hóa các cơ chế tác động của kháng sinh (ức chế sinh tổng hợp vách tế bào, gây rối loạn chức năng màng nguyên tương, ức chế sinh tổng hợp protein, acid nucleic, ức chế chuyển hóa) và cơ chế đề kháng (đột biến gen làm thay đổi đích tác động, thay đổi con đường chuyển hóa, giảm tính thấm porin, bơm đẩy efflux pump). Đồng thời, tác giả điểm lại con đường truyền gen ngang (Horizontal Gene Transfer - HGT) qua tiếp hợp, biến nạp, tải nạp và các yếu tố di truyền động (MGEs) gồm plasmid, transposon và integron theo nghiên cứu của Christian von Wintersdorff (2016).
• Phân loại gen kháng kháng sinh: Luận án tổng hợp các gen kháng phổ biến ở vi khuẩn Gram âm đường ruột: nhóm $\beta$-lactam (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaKPC, blaNDM, blaOXA), aminoglycoside (armA, rmtA-D, aac, ant, aph), chloramphenicol (catA, catB, cmlA, floR), glycopeptide (vanA-G), quinolone (gyrA, gyrB, parC, parE, qnrA-S, aac(6')-Ib, qepA), sulfonamide/trimethoprim (folP, sul1-3, folA, dfrA/B/K) và polymyxin (lpxA/C/D, mcr-1 đến mcr-10).
• Thực trạng sử dụng colistin trong chăn nuôi và lâm sàng: Luận án dẫn các số liệu quốc tế về việc tiêu thụ colistin trong nông nghiệp tại Trung Quốc (chiếm xấp xỉ 90% sản lượng năm 2014), châu Âu và Bắc Mỹ, cũng như bài học từ Đan Mạch khi cấm avoparcin đã làm giảm tỷ lệ Enterococcus faecium kháng vancomycin. Tại Việt Nam, tác giả điểm lại các nghiên cứu thực địa của Dương Thị Toan và cộng sự (2014) tại Bắc Giang (45% trang trại dùng colistine cho lợn), Phạm Kim Đăng và cộng sự tại Hải Phòng (dùng colistin kích thích sinh trưởng gà), và Nguyễn T. Nhung và cộng sự tại Tiền Giang (tỷ lệ E. coli kháng colistin 22,2% ở gà và 24,4% ở lợn, tỷ lệ mang gen mcr-1 từ 19% đến 22%).
• Các nghiên cứu về gen mcr-1 trên thế giới: Luận án ghi nhận công bố của Liu và cộng sự (2015) tại Trung Quốc phát hiện gen mcr-1 trên plasmid pHNSHP45 (từ lợn) và các plasmid pE15004, pE15015, pE15017 (từ người); Fernandes M.R. và cộng sự tại Brazil phát hiện E. coli ST101 mang plasmid IncX4; Wong Sally C.Y. và cộng sự tại Hồng Kông; Patrick McGann và cộng sự tại Mỹ; Dan-xia Gua và cộng sự tại Trung Quốc; Yao Xu và cộng sự tại Quảng Châu phát hiện chủng E. coli THSJ02 (ST167) mang đồng thời mcr-1, blaNDM-9, fosA3, rmtB, blaCTX-M-65, floR; cùng các nghiên cứu tại Đan Mạch, Đức, Tây Ban Nha, Thụy Sỹ và Bangladesh.
• Các nghiên cứu tại Việt Nam: Nghiên cứu của Surbhi Malhotra-Kumar và cộng sự (2014–2015) tại Hưng Yên và Hà Nội phát hiện 9/24 chủng E. coli sinh ESBL ở gà và lợn mang gen mcr-1 (tỷ lệ 37,5%, MIC 4–8 mg/L).

Vị trí của luận án được xác định là công trình phân tích đầy đủ và đồng thời sự phân bố của gen mcr-1 trên cả 4 mắt xích của hệ sinh thái nông thôn (người, gia súc/gia cầm, thức ăn, nguồn nước), kết hợp xác định mức độ kháng kháng sinh kiểu hình (MIC) và giải mã chi tiết kiểu gen phân tử bằng các kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS), điện di xung trường (PFGE) và thử nghiệm tiếp hợp.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án dựa trên lý thuyết di truyền học vi khuẩn về đề kháng thu được qua trung gian plasmid và các yếu tố di truyền động. Gen mcr-1 mã hóa enzyme phosphoethanolamine transferase, xúc tác gắn phân tử phosphoethanolamine vào vị trí lipid A của phân tử lipopolysaccharide (LPS) ở màng ngoài tế bào vi khuẩn Gram âm, làm giảm ái lực liên kết tĩnh điện của colistin với màng tế bào. Tiếp cận phân tích dựa trên khung Một sức khỏe (One Health), đánh giá sự lan truyền qua lại của vi khuẩn kháng thuốc giữa quần thể người, vật nuôi và môi trường sống xung quanh.

Phương pháp nghiên cứu thực tế

Luận án áp dụng thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang kết hợp thực nghiệm vi sinh vật và sinh học phân tử:

Hạng mục	Nội dung thực hiện trong luận án
Địa điểm và cỡ mẫu	69 hộ gia đình tại các thôn thuộc xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam. Thu thập 4 loại mẫu: phân người (PN), phân động vật nuôi (PĐVN), thức ăn/thực phẩm (TĂ), nước sinh hoạt/ao hồ (N).
Phân lập và định danh	Nuôi cấy chọn lọc trên thạch MacConkey có bổ sung colistin; định danh loài E. coli bằng hệ thống khối phổ MALDI-TOF.
Phát hiện gen kháng	Kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu mcr-1 với cặp mồi chuyên biệt, đọc kết quả qua điện di thạch agarose.
Đánh giá kiểu hình kháng thuốc	Kỹ thuật xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) theo tiêu chuẩn CLSI đối với 15 loại kháng sinh thuộc các nhóm: polymyxin (colistin), aminoglycoside (amikacin, gentamicin), fluoroquinolone (ciprofloxacin), carbapenem (imipenem, meropenem), cephalosporin (ceftazidime, cefotaxime, cefepime)...
Phân tích mối liên hệ kiểu gen	Kỹ thuật điện di xung trường (PFGE) sử dụng enzyme cắt giới hạn XbaI để so sánh tính tương đồng ADN hệ gen giữa các chủng.
Giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS)	Giải trình tự WGS trên hệ máy thế hệ mới; phân tích tin sinh học để xác định Sequence Type (MLST), core genome, tập hợp gen kháng thuốc (resistome), nhóm replicon plasmid mang gen mcr-1 và cấu trúc transposon di động.
Thử nghiệm tiếp hợp (Conjugation)	Thử nghiệm chuyển gen plasmid mang mcr-1 từ các chủng E. coli phân lập được (chủng cho) sang chủng nhận chuẩn E. coli J53 hoặc E. coli DH5$\alpha$ nhằm chứng minh khả năng truyền ngang tính kháng.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng thuật toàn diện cơ sở lý thuyết về kháng sinh, cơ chế đề kháng thuốc của vi khuẩn và tổng hợp 8 nhóm kháng sinh quan trọng kèm bảng phân loại các gen kháng tương ứng. Luận án phân tích chi tiết tình trạng lạm dụng kháng sinh ở người và trong chăn nuôi tại Việt Nam và quốc tế, đặc tính vi sinh vật học của trực khuẩn E. coli, cơ chế tác dụng diệt khuẩn của colistin trên màng ngoài vi khuẩn Gram âm. Đồng thời, chương 1 điểm lại lịch sử phát hiện gen mcr-1 từ năm 2015, cấu trúc các plasmid điển hình (pHNSHP45, pE15004, pE15015, pE15017), và nguyên lý của các kỹ thuật xét nghiệm vi sinh (khoanh giấy khuếch tán, MIC, E-test) cùng các kỹ thuật sinh học phân tử (PCR, RAPD-PCR, Southern blot, PFGE, MLST, WGS).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết địa bàn nghiên cứu tại xã Thanh Hà, Thanh Liêm, Hà Nam. Luận án chuẩn hóa quy trình thu thập và xử lý 4 loại mẫu bệnh phẩm từ 69 hộ gia đình. Các quy trình kỹ thuật phòng thí nghiệm được trình bày rõ ràng, bao gồm: phân lập vi khuẩn trên môi trường chọn lọc, định danh bằng máy MALDI-TOF, quy trình phản ứng PCR phát hiện gen mcr-1, phương pháp pha loãng trong thạch xác định MIC theo tiêu chuẩn CLSI, kỹ thuật cắt giới hạn và chạy xung trường PFGE, quy trình giải trình tự WGS, phân tích tin sinh học xác định nhóm replicon plasmid và transposon, cùng thử nghiệm tiếp hợp in vitro. Chương này cũng nêu rõ các biện pháp khống chế sai số và chứng nhận phê duyệt đạo đức nghiên cứu y sinh học.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thu thập được từ thực địa và xét nghiệm:

• Tỷ lệ phân lập chủng E. coli mang gen mcr-1: Ghi nhận sự phân bố của chủng mang gen mcr-1 trên cả 4 nhóm mẫu (phân người, phân động vật, thực phẩm và nguồn nước), biểu thị sự lưu hành rộng rãi tại 69 hộ gia đình qua biểu đồ Heatmap.
• Mức độ nhạy cảm kháng sinh và phân bố vị trí gen mcr-1: Kết quả thử nghiệm MIC colistin cho thấy phần lớn các chủng mang gen mcr-1 đề kháng với colistin (MIC $\ge 4\ \mu\text{g/mL}$). Vị trí của gen mcr-1 chủ yếu nằm trên plasmid, tỷ lệ nằm trên nhiễm sắc thể chiếm tỷ lệ thấp.
• Đặc điểm đa kháng kháng sinh: Các chủng E. coli mang gen mcr-1 biểu hiện tính đa kháng cao đối với các kháng sinh nhóm $\beta$-lactam (ampicillin, cephalosporin thế hệ 3, thế hệ 4), quinolone (ciprofloxacin) và aminoglycoside, nhưng vẫn duy trì tỷ lệ nhạy cảm cao với nhóm carbapenem (imipenem, meropenem) và amikacin.
• Phân tích mối liên hệ kiểu gen bằng PFGE: Kết quả điện di xung trường và cây phả hệ phân tử cho thấy sự đa dạng dòng nhưng có các cụm chủng tương đồng di truyền cao giữa người và vật nuôi trong cùng một hộ gia đình hoặc giữa các hộ gia đình trong cùng thôn.
• Đặc điểm sinh học phân tử qua giải trình tự WGS:
  • Phân loại MLST: Quần thể vi khuẩn có sự phân bố đa dạng các Sequence Types (STs), phát hiện các chủng E. coli mang gen mcr-1 có cùng ST chung phân lập được từ các loại mẫu khác nhau trong cùng một hộ gia đình.
  • Tập hợp gen kháng thuốc (Resistome): Xác định các gen kháng đồng xuất hiện gồm các gen sinh ESBL (blaCTX-M-55, blaCTX-M-14, blaTEM-1), gen kháng aminoglycoside (aadA, rmtB, aac), quinolone (qnrS, đột biến gyrA/parC), phenicol (floR, cmlA), sulfonamide (sul1, sul2, sul3) và trimethoprim (dfrA).
  • Phân loại Plasmid Replicon: Biểu đồ Venn xác định các nhóm replicon plasmid chính mang gen mcr-1 gồm IncI2, IncHI2/IncHI2A/IncN và IncX4.
  • Thử nghiệm tiếp hợp: Chuyển giao thành công plasmid mang gen mcr-1 sang chủng E. coli nhận (E. coli J53), khẳng định khả năng truyền ngang tính kháng colistin.
  • Cấu trúc di truyền động transposon: Giải mã cấu trúc transposon Tn6330 chứa đoạn ISApl1-mcr-1-pap2-ISApl1 hoặc các biến thể khuyết một đầu trình tự chèn ISApl1, giải thích cơ chế di chuyển của gen giữa plasmid và nhiễm sắc thể.

Chương 4: Bàn luận

Tác giả bàn luận sâu về mối liên quan giữa tập quán chăn nuôi gia hộ, việc sử dụng colistin thiếu kiểm soát trong thức ăn gia súc tại địa phương với tỷ lệ lưu hành cao của E. coli mang gen mcr-1 trong phân người và môi trường. Luận án phân tích chuỗi lây truyền vi khuẩn từ phân động vật qua thực phẩm tươi sống và nguồn nước sinh hoạt nhiễm bẩn vào đường tiêu hóa của người. Đồng thời, tác giả so sánh các đặc tính plasmid (IncI2, IncHI2) và cấu trúc transposon Tn6330 phát hiện tại Hà Nam với các dữ liệu công bố tại Trung Quốc, châu Âu và các tỉnh khác của Việt Nam (Hà Nội, Hưng Yên, Tiền Giang), khẳng định vai trò của các yếu tố di truyền động trong việc phát tán gen mcr-1 trong cộng đồng.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học

• Luận án cung cấp dữ liệu dịch tễ học phân tử toàn diện đầu tiên tại một cộng đồng nông thôn miền Bắc Việt Nam về tỷ lệ mang và đặc điểm của E. coli mang gen mcr-1 trên cả 4 thành tố sinh thái: người, động vật nuôi, thực phẩm và nguồn nước.
• Chứng minh bằng chứng phân tử về sự lây truyền vi khuẩn mang gen mcr-1 giữa động vật và người trong cùng hộ gia đình thông qua các bằng chứng đồng nhất về Sequence Type (MLST) và kiểu xung trường (PFGE).
• Xác định rõ các nhóm plasmid chủ yếu mang gen mcr-1 (đặc biệt là nhóm IncI2 và IncHI2/IncHI2A/IncN), chứng minh khả năng truyền ngang tính kháng colistin qua tiếp hợp và giải mã cấu trúc di truyền động transposon Tn6330 (ISApl1-mcr-1-pap2).

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

• Cung cấp cơ sở khoa học thực chứng cảnh báo nguy cơ lan truyền gen kháng colistin từ chăn nuôi sang người tại cộng đồng, đóng góp dữ liệu cho hệ thống giám sát kháng kháng sinh quốc gia theo cách tiếp cận Một sức khỏe.
• Cung cấp bằng chứng phục vụ việc xây dựng các chính sách quản lý, kiểm soát và cấm sử dụng kháng sinh colistin trong chăn nuôi nông nghiệp và thức ăn gia súc.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Ban hành quy định cấm và kiểm soát chặt chẽ việc sử dụng colistin làm phụ gia thức ăn chăn nuôi nhằm mục đích kích thích tăng trọng hoặc phòng bệnh đại trà.
• Tăng cường hệ thống giám sát dịch tễ học phân tử đối với vi khuẩn đường ruột đa kháng thuốc tại cộng đồng nông thôn, kết hợp kiểm tra định kỳ nguồn nước sinh hoạt và an toàn vệ sinh thực phẩm.
• Đẩy mạnh tuyên truyền cho các hộ chăn nuôi về quản lý chất thải phân động vật và vệ sinh môi trường nhằm ngăn ngừa phát tán vi khuẩn kháng thuốc vào chuỗi thức ăn.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án

• Địa bàn thu thập mẫu tập trung tại một xã (xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam) trong giai đoạn 2014–2015, nên kết quả mang tính đại diện cho vùng nông thôn đồng bằng Bắc Bộ thời điểm đó, chưa bao quát các vùng sinh thái nông nghiệp khác trên phạm vi toàn quốc.
• Chưa tiến hành thiết kế nghiên cứu thuần tập theo dõi dọc theo thời gian để đánh giá sự biến đổi và thời gian tồn lưu của các chủng E. coli mang gen mcr-1 trong hệ tiêu hóa của người sau khi thay đổi điều kiện phơi nhiễm.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Mở rộng phạm vi giám sát dịch tễ học phân tử trên nhiều tỉnh thành và các đối tượng vật nuôi khác nhau (thủy sản, gia cầm quy mô công nghiệp).
• Nghiên cứu tầm soát các biến thể gen mới trong họ mcr (từ mcr-2 đến mcr-10) và theo dõi sự đồng hiện diện của gen mcr với các gen kháng carbapenem (blaNDM, blaKPC) trên cùng một chủng vi khuẩn trong cộng đồng.
• Đánh giá can thiệp hiệu quả của các biện pháp quản lý sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi đối với sự suy giảm tỷ lệ mang gen kháng thuốc ở người và môi trường.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên môn cho nhiều đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên sau đại học và giảng viên: Thuộc các chuyên ngành Vi sinh y học, Dịch tễ học, Bệnh truyền nhiễm, Y tế công cộng, Thú y và Công nghệ sinh học. Luận án cung cấp quy trình phân tích kết hợp giữa vi sinh học cổ điển (nuôi cấy, MIC) và sinh học phân tử hiện đại (PFGE, WGS, plasmid replicon typing, tiếp hợp).
• Cán bộ xét nghiệm và nghiên cứu vi sinh: Tham khảo chi tiết các quy trình kỹ thuật chuẩn về định danh MALDI-TOF, xác định MIC theo chuẩn CLSI, chạy điện di xung trường và xử lý dữ liệu giải trình tự toàn bộ hệ gen vi khuẩn.
• Nhà quản lý và hoạch định chính sách: Cán bộ thuộc Bộ Y tế, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn có thêm bằng chứng thực tế về nguy cơ lan truyền gen kháng thuốc qua chuỗi thức ăn để xây dựng văn bản quy phạm pháp luật kiểm soát kháng sinh trong nông nghiệp.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Gen mcr-1 quy định cơ chế kháng colistin ở vi khuẩn E. coli như thế nào?
Gen mcr-1 mã hóa enzyme phosphoethanolamine transferase. Enzyme này chuyển một nhóm phosphoethanolamine gắn vào vị trí lipid A của phân tử lipopolysaccharide (LPS) ở màng ngoài tế bào vi khuẩn, làm trung hòa điện tích âm của màng và làm giảm lực liên kết tĩnh điện của kháng sinh colistin với vi khuẩn, dẫn đến hiện tượng đề kháng.

2. Vì sao colistin từng bị ngừng sử dụng trên người nhưng sau đó lại được tái sử dụng trong lâm sàng?
Từ những năm 1970, colistin bị ngừng sử dụng trên người do có độc tính cao trên thận và hệ thần kinh. Tuy nhiên, trước sự bùng phát của các chủng trực khuẩn Gram âm đa kháng và siêu kháng carbapenem (như các chủng mang gen NDM-1, KPC), colistin đã được tái sử dụng từ khoảng năm 2010 như một lựa chọn điều trị cuối cùng cho các ca nhiễm trùng nặng đe dọa tính mạng.

3. Yếu tố di truyền động transposon nào liên quan trực tiếp đến sự lan truyền của gen mcr-1 trong luận án?
Luận án xác định cấu trúc di truyền động transposon Tn6330 gồm đoạn ISApl1-mcr-1-pap2-ISApl1 và các biến thể khuyết một đầu trình tự chèn ISApl1. Cấu trúc này đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển vị gen mcr-1 giữa phân tử plasmid và nhiễm sắc thể của vi khuẩn.

4. Các nhóm replicon plasmid chủ yếu nào mang gen mcr-1 được phát hiện trong nghiên cứu?
Qua phân tích giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) và biểu đồ Venn replicon, luận án xác định các loại replicon plasmid chính mang gen mcr-1 gồm IncI2, IncHI2/IncHI2A/IncN và IncX4. Các plasmid này đều thể hiện khả năng chuyển giao tính kháng colistin sang chủng nhận E. coli J53 thông qua thử nghiệm tiếp hợp.

5. Các chủng E. coli mang gen mcr-1 trong nghiên cứu có mang đồng thời các gen kháng kháng sinh nào khác?
Các chủng giải trình tự WGS mang đồng thời nhiều gen kháng thuộc các nhóm khác nhau: gen sinh men ESBL (blaCTX-M-55, blaCTX-M-14, blaTEM-1), gen kháng aminoglycoside (aadA, rmtB, aac), quinolone (qnrS, đột biến gyrA/parC), phenicol (floR, cmlA), sulfonamide (sul1, sul2, sul3) và trimethoprim (dfrA).

---

Kết luận

Luận án của tác giả Nguyễn Thị Tuyết Mai đã xác định thực trạng lưu hành và đặc tính sinh học phân tử của các chủng vi khuẩn Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập từ người, vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam năm 2015. Bằng việc kết hợp các phương pháp vi sinh chuẩn thức và kỹ thuật sinh học phân tử chuyên sâu (PFGE, WGS, phân loại plasmid replicon và thử nghiệm tiếp hợp), công trình đã chứng minh cơ chế lây truyền ngang qua trung gian plasmid (chủ yếu là IncI2 và IncHI2) và cấu trúc transposon Tn6330. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho công tác giám sát kháng kháng sinh theo định hướng Một sức khỏe và khẳng định tính cấp thiết của việc kiểm soát sử dụng colistin trong chăn nuôi tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh 1. Định nghĩa: Kháng sinh là những chất do vi sinh vật tiết ra hoặc những chất hóa học bán tổng hợp, tổng hợp, với nồng độ rất thấp, có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt tác nhân gây bệnh một cách đặc hiệu [6] 1. Cơ chế tác dụng Sau khi vào tế bào, kháng sinh được đưa tới đích tác động sẽ phát huy tác dụng bằng cách: - Ức chế sinh tổng hợp vách tế bào vi khuẩn, ví dụ nhóm penicillin, nhóm cephalosporin, vancomycin - Gây rối loạn chức năng màng nguyên tương, đặc biệt là chức năng thẩm thấu chọn lọc, làm cho các thành phần (ion) bên trong tế bào bị thoát ra ngoài, ví dụ nhóm polymyxin, Daptomycin - Ức chế sinh tổng hợp protein, ví dụn nhóm aminoglycoside, nhóm macrolid - Ức chế sinh tổng hợp acid nucleic, ví dụ nhóm quinolon - Ức chế sinh tổng hợp các chất chuyển hoá cần thiết cho tế bào như kháng sinh nhóm sulfamid [6] Hình 1.1: Cơ chế tác dụng của kháng sinh 5 1.

Sự đề kháng kháng sinh Kháng sinh có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn, nhưng khi trong môi trường có kháng sinh mà vi khuẩn vẫn phát triển thì được coi là sự đề kháng kháng sinh. Vi sinh vật đa kháng kháng sinh (MDRO) là các vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn có khả năng kháng một hoặc hơn một loại kháng sinh. Một số vi khuẩn chỉ kháng một loại kháng sinh vẫn được coi là đa kháng kháng sinh như tụ cầu vàng kháng methicillin (MRSA) hay vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem (CRE)[31] 1. Phân loại đề kháng kháng sinh Có 2 loại đề kháng: là đề kháng giả và đề kháng thật - Đề kháng giả: Đề kháng giả là có biểu hiện là đề kháng nhưng không phải là bản chất, tức là không do nguồn gốc di truyền.

Khi vào trong cơ thể, tác dụng của kháng sinh phụ thuộc vào ba yếu tố là kháng sinh - người bệnh - vi khuẩn. Đề kháng giả có thể do một trong ba yếu tố hoặc có thể kết hợp hai hay thậm chí cả ba yếu tố[6]. - Đề kháng thật: có 2 loại là đề kháng tự nhiên và đề kháng thu được. + Đề kháng tự nhiên do một số loài vi khuẩn không chịu tác dụng của một số kháng sinh nhất định.

aeruginosa không chịu tác dụng của penicilin G, S. aureus không chịu tác dụng của colistin. Hoặc vi khuẩn không có vách như Mycoplasma không chịu tác dụng của các kháng sinh beta-lactam ức chế sinh tổng hợp vách. Đề kháng tự nhiên thường mang tính chất đặc trưng theo từng loại vi khuẩn.

- Đề kháng thu được do một biến cố di truyền là đột biến hoặc nhận được gen đề kháng để một vi khuẩn đang từ không có gen đề kháng trở thành có gen đề kháng, nghĩa là đang nhạy cảm trở thành có khả năng đề kháng kháng sinh. Các gen đề kháng có thể nằm trên một, một số hoặc tất cả các thành phần di truyền của vi khuẩn gồm nhiễm sắc thể, plasmid và transposon. Đề kháng thu được thường mang tính chất của từng cá thể trong loài[6]. 6 Đề kháng thu được là yếu tố đóng vai trò chính trong việc gia tăng tình hình kháng kháng sinh hiện nay.

Các nghiên cứu về kháng kháng sinh của vi khuẩn luôn tập trung phân tích những biến đổi về mặt di truyền của vi khuẩn do đề kháng thu được làm thay đổi tính đề kháng của vi khuẩn như thế nào 1. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Sự chọn lọc tự nhiên tạo ra những đáp ứng đặc hiệu dẫn đến các đột biến gen để thích nghi.