Tuyển Chọn và Đánh Giá Đặc Điểm Sinh Học Của Các Chủng Vi Khuẩn Bacillus Probiotic Trong Thức Ăn Heo

Nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn bacillus probiotic, ứng dụng trong thức ăn cho heo, nhằm nâng cao sức khỏe và hiệu suất chăn nuôi.

• Tác giả: Vũ Thị Thanh Xuân
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Xuân Cảnh
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Điểm Sinh Học Các Chủng Vi Khuẩn Bacillus Probiotic Cho Thức Ăn Heo
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• THESIS ABSTRACT
• MỞ ĐẦU. MỞ ĐẦU
• 1. Mục đích nghiên cứu
• 2. Đối tượng nghiên cứu
• 3. Vi sinh vật kiểm định
• 4. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
• 5. Nội dung nghiên cứu
• 6. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 6.1. GIỚI THIỆU VỀ PROBIOTIC
• 6.2. Lịch sử probiotic
• 6.3. Định nghĩa probiotic
• 6.4. Đặc điểm chung vi khuẩn probiotic

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Đặc Điểm Vi Khuẩn Bacillus Probiotic

Trong dinh dưỡng động vật, việc tăng cường sức khỏe hệ thống tiêu hóa thông qua tác động đến hệ vi sinh vật đường ruột heo là một giải pháp hiệu quả. Hệ vi sinh vật đường ruột rất phong phú, và sự biến động về cơ cấu, số lượng có thể dẫn đến rối loạn tiêu hóa và hấp thu. Do đó, việc sử dụng các biện pháp kỹ thuật thông qua thức ăn và nuôi dưỡng để tạo cân bằng tối ưu giữa các loài vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ là một hướng nghiên cứu quan trọng. Việc sử dụng probiotic cho heo được xem là một giải pháp thay thế kháng sinh hiệu quả. Nghiên cứu này tập trung vào việc tuyển chọn và đánh giá các chủng vi khuẩn Bacillus probiotic phù hợp với heo nội địa, nhằm sản xuất các chế phẩm probiotic chất lượng cao, giảm sự phụ thuộc vào nhập khẩu. Các sản phẩm probiotic nhập khẩu dùng trong chăn nuôi có mặt trên thị trường Việt Nam nhiều nhưng các đáp ứng tích cực cho vật nuôi chưa được rõ ràng.

1.1. Giới Thiệu Chung Về Vi Khuẩn Bacillus Probiotic

Vi khuẩn Bacillus probiotic là một nhóm vi sinh vật có lợi, được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi để cải thiện sức khỏe đường ruột và tăng cường hệ miễn dịch cho vật nuôi. Các chủng Bacillus thường được sử dụng bao gồm Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, và Bacillus amyloliquefaciens. Chúng có khả năng sinh bào tử, giúp chúng tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt của môi trường và đường tiêu hóa, đảm bảo hiệu quả khi sử dụng làm probiotic cho heo. Việc nghiên cứu và ứng dụng các chủng Bacillus bản địa có tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm thức ăn heo chất lượng cao.

1.2. Mục Tiêu Nghiên Cứu Đặc Điểm Sinh Học Bacillus Probiotic

Mục tiêu chính của nghiên cứu này là tuyển chọn và đánh giá đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính probiotic để tạo chế phẩm bổ sung vào thức ăn heo. Nghiên cứu tập trung vào việc phân lập các chủng Bacillus từ các mẫu phân và chất chứa trong ruột heo, sau đó tiến hành sàng lọc và tuyển chọn dựa trên các đặc tính probiotic quan trọng như khả năng chịu axit, chịu muối mật, sinh enzyme ngoại bào và kháng khuẩn gây bệnh. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các sản phẩm probiotic hiệu quả, phù hợp với điều kiện chăn nuôi heo tại Việt Nam.

II. Thách Thức Sử Dụng Kháng Sinh Giải Pháp Probiotic Cho Heo

Việc sử dụng kháng sinh liều thấp trong thức ăn heo đã trở nên phổ biến từ những năm 1950. Tuy nhiên, việc lạm dụng kháng sinh gây ra nhiều hệ lụy, bao gồm sự phát triển của vi khuẩn kháng kháng sinh và ảnh hưởng tiêu cực đến hệ vi sinh vật đường ruột heo. Do đó, việc tìm kiếm các giải pháp thay thế kháng sinh là vô cùng cấp thiết. Probiotic cho heo nổi lên như một giải pháp tiềm năng, giúp cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, tăng cường sức khỏe và năng suất vật nuôi. Tuy nhiên, hiệu quả của các sản phẩm probiotic nhập khẩu chưa thực sự rõ ràng, đòi hỏi cần có những nghiên cứu chuyên sâu về các chủng vi khuẩn Bacillus bản địa.

2.1. Tác Hại Của Việc Lạm Dụng Kháng Sinh Trong Chăn Nuôi Heo

Việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi heo, mặc dù có thể giúp kiểm soát bệnh tật và tăng trưởng, nhưng lại mang đến nhiều tác hại tiềm ẩn. Kháng sinh có thể tiêu diệt cả vi khuẩn có lợi và vi khuẩn có hại trong hệ vi sinh vật đường ruột, gây mất cân bằng và ảnh hưởng đến quá trình tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng. Ngoài ra, việc lạm dụng kháng sinh còn dẫn đến sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh, gây khó khăn trong việc điều trị bệnh sau này. Do đó, việc tìm kiếm các giải pháp thay thế kháng sinh là vô cùng quan trọng để đảm bảo sức khỏe và năng suất của heo.

2.2. Vai Trò Của Probiotic Như Giải Pháp Thay Thế Kháng Sinh

Probiotic được xem là một giải pháp thay thế tiềm năng cho kháng sinh trong chăn nuôi heo. Probiotic là các vi sinh vật sống có lợi, khi được bổ sung vào thức ăn heo, sẽ giúp cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, tăng cường hệ miễn dịch và cải thiện khả năng tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng. Các chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh bào tử, giúp chúng tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt của đường tiêu hóa, đảm bảo hiệu quả khi sử dụng làm probiotic. Việc nghiên cứu và ứng dụng các chủng Bacillus bản địa có tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm thức ăn heo chất lượng cao.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Phân Lập Đánh Giá Bacillus Probiotic

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus từ mẫu phân và chất chứa đường tiêu hóa của heo. Các chủng phân lập được sẽ được đánh giá dựa trên các đặc tính probiotic quan trọng như khả năng chịu axit, chịu muối mật, sinh enzyme ngoại bào và kháng khuẩn gây bệnh. Phương pháp sinh học phân tử, cụ thể là giải trình tự gen 16S rRNA, sẽ được sử dụng để định danh loài. Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng vi khuẩn Bacillus cũng sẽ được nghiên cứu để tối ưu hóa quá trình sản xuất sản phẩm probiotic.

3.1. Quy Trình Phân Lập Và Tuyển Chọn Vi Khuẩn Bacillus

Quy trình phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus bao gồm các bước chính sau: (1) Thu thập mẫu phân và chất chứa đường tiêu hóa của heo từ các trang trại chăn nuôi. (2) Phân lập các chủng Bacillus bằng phương pháp cấy trải trên môi trường chọn lọc. (3) Sàng lọc các chủng Bacillus dựa trên khả năng sinh bào tử và các đặc tính hình thái khuẩn lạc. (4) Tuyển chọn các chủng Bacillus có hoạt tính probiotic cao dựa trên các thử nghiệm in vitro như khả năng chịu axit, chịu muối mật, sinh enzyme ngoại bào và kháng khuẩn gây bệnh.

3.2. Đánh Giá Đặc Tính Probiotic Của Các Chủng Bacillus

Việc đánh giá đặc tính probiotic của các chủng Bacillus được thực hiện thông qua các thử nghiệm in vitro. Khả năng chịu axit được đánh giá bằng cách ủ các chủng Bacillus trong môi trường có pH thấp (tương tự pH dạ dày) và đo số lượng tế bào sống sót sau một khoảng thời gian nhất định. Khả năng chịu muối mật được đánh giá tương tự, nhưng trong môi trường có chứa muối mật. Khả năng sinh enzyme ngoại bào được đánh giá bằng cách quan sát vòng phân giải cơ chất trên môi trường đặc hiệu. Hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá bằng phương pháp đục lỗ thạch, sử dụng các chủng vi khuẩn gây bệnh làm đối tượng kiểm định.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Tuyển Chọn Chủng Bacillus Tiềm Năng

Nghiên cứu đã phân lập được 40 chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh bào tử từ các mẫu phân và chất chứa ruột heo. Qua quá trình sàng lọc và tuyển chọn, 3 chủng Bacillus (23, 24 và 25) đã được xác định là có tiềm năng sử dụng làm probiotic cho heo. Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA cho thấy chủng 23 là B. vegensis, chủng 24 là B. paralicheniformis và chủng 25 là B. coagulans. Các chủng này đều thể hiện khả năng chịu axit, chịu muối mật và sinh enzyme ngoại bào tốt, đồng thời có hoạt tính kháng khuẩn đối với một số vi khuẩn gây bệnh.

4.1. Định Danh Và Phân Loại Các Chủng Vi Khuẩn Bacillus

Việc định danh và phân loại các chủng vi khuẩn Bacillus được thực hiện bằng phương pháp sinh học phân tử, cụ thể là giải trình tự gen 16S rRNA. Kết quả giải trình tự cho thấy chủng 23 có mức tương đồng 99,93% với B. vegensis, chủng 24 có mức tương đồng 100% với B. paralicheniformis và chủng 25 có mức tương đồng 99,66% với B. coagulans. Các chủng này đều thuộc chi Bacillus, một chi vi khuẩn gram dương, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, có khả năng sinh bào tử và được sử dụng rộng rãi trong sản xuất probiotic.

4.2. Đặc Điểm Sinh Học Của Các Chủng Bacillus Đã Tuyển Chọn

Các chủng Bacillus đã tuyển chọn (23, 24 và 25) đều thể hiện các đặc điểm sinh học phù hợp với vai trò probiotic. Chúng có khả năng chịu axit tốt, cho phép chúng sống sót khi đi qua dạ dày. Chúng cũng có khả năng chịu muối mật, cho phép chúng phát triển trong ruột non. Ngoài ra, chúng còn có khả năng sinh enzyme ngoại bào, giúp cải thiện quá trình tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng. Cuối cùng, chúng có hoạt tính kháng khuẩn đối với một số vi khuẩn gây bệnh, giúp duy trì cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Tạo Chế Phẩm Bacillus Probiotic Cho Heo

Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho các chủng Bacillus đã tuyển chọn, bao gồm nhiệt độ và pH ban đầu. Kết quả cho thấy nhiệt độ và pH tối ưu cho B. vegensis là 37°C và pH 7,0; cho B. paralicheniformis là 37°C và pH 7,0; và cho B. coagulans là 40°C và pH 7,0. Nghiên cứu cũng đã chọn được cơ chất và thời gian lên men xốp thích hợp nhất cho hàm lượng vi khuẩn cao. Các kết quả này sẽ được sử dụng để tạo ra chế phẩm Bacillus probiotic có hiệu quả cao, giúp cải thiện sức khỏe và năng suất của heo.

5.1. Tối Ưu Hóa Điều Kiện Nuôi Cấy Vi Khuẩn Bacillus Probiotic

Việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy là rất quan trọng để đảm bảo hàm lượng vi khuẩn cao trong chế phẩm probiotic. Nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH ban đầu đến khả năng sinh trưởng của các chủng Bacillus đã tuyển chọn. Kết quả cho thấy mỗi chủng có một khoảng nhiệt độ và pH tối ưu riêng. Việc điều chỉnh các yếu tố này trong quá trình lên men sẽ giúp tăng sinh khối vi khuẩn và cải thiện hiệu quả của chế phẩm probiotic.

5.2. Quy Trình Lên Men Xốp Và Bảo Quản Chế Phẩm Probiotic

Quy trình lên men xốp được sử dụng để sản xuất chế phẩm probiotic với hàm lượng vi khuẩn cao. Nghiên cứu đã chọn được cơ chất và thời gian lên men xốp thích hợp nhất cho từng chủng Bacillus. Sau khi lên men, chế phẩm được sấy khô và bảo quản để đảm bảo tính ổn định và khả năng sống sót của vi khuẩn trong quá trình lưu trữ và sử dụng. Khả năng chịu nhiệt của chế phẩm cũng được kiểm tra để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

VI. Kết Luận Triển Vọng Ứng Dụng Bacillus Probiotic Bền Vững

Nghiên cứu đã thành công trong việc tuyển chọn và đánh giá các chủng vi khuẩn Bacillus có tiềm năng sử dụng làm probiotic cho heo. Các chủng B. vegensis, B. paralicheniformis và B. coagulans đã được chứng minh là có khả năng chịu axit, chịu muối mật, sinh enzyme ngoại bào và kháng khuẩn gây bệnh. Việc ứng dụng các chủng Bacillus probiotic này trong chăn nuôi heo có thể giúp giảm sự phụ thuộc vào kháng sinh, cải thiện sức khỏe và năng suất vật nuôi, đồng thời góp phần vào sự phát triển của ngành chăn nuôi heo bền vững.

6.1. Đánh Giá Hiệu Quả Của Chế Phẩm Probiotic Trên Heo

Để đánh giá hiệu quả của chế phẩm probiotic trên heo, cần thực hiện các thử nghiệm in vivo trên heo thực nghiệm. Các chỉ tiêu đánh giá bao gồm tăng trưởng, tỷ lệ tiêu chảy, khả năng tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng, và các chỉ số miễn dịch. Kết quả của các thử nghiệm này sẽ cung cấp bằng chứng khoa học về hiệu quả của chế phẩm probiotic trong việc cải thiện sức khỏe và năng suất của heo.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Bacillus Probiotic Trong Chăn Nuôi

Các hướng nghiên cứu tiếp theo về Bacillus probiotic trong chăn nuôi có thể tập trung vào việc: (1) Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của các chủng Bacillus lên hệ vi sinh vật đường ruột và hệ miễn dịch của heo. (2) Phát triển các công thức phối trộn probiotic tối ưu để đạt hiệu quả cao nhất. (3) Nghiên cứu ảnh hưởng của probiotic đến chất lượng thịt heo. (4) Đánh giá tính an toàn và hiệu quả của probiotic trong điều kiện chăn nuôi thực tế.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong chăn nuôi heo công nghiệp hiện đại, việc kiểm soát sức khỏe đường ruột đóng vai trò then chốt đối với năng suất sinh trưởng và tỷ lệ sống của đàn vật nuôi. Kể từ ngày 01 tháng 01 năm 2006, Liên minh Châu Âu đã cấm hoàn toàn việc sử dụng kháng sinh kích thích sinh trưởng trong thức ăn chăn nuôi nhằm ngăn ngừa thảm họa kháng kháng sinh toàn cầu. Tại Việt Nam, áp lực chuyển dịch sang mô hình chăn nuôi an toàn sinh học đòi hỏi các giải pháp thay thế kháng sinh hiệu quả, trong đó chế phẩm sinh học probiotic nổi lên như một hướng đi bền vững nhất. Tuy nhiên, phần lớn các chế phẩm probiotic nhập khẩu hiện nay chưa mang lại hiệu quả rõ ràng do chủng vi sinh vật ngoại nhập khó thích nghi với hệ vi sinh đường ruột của đàn heo bản địa và điều kiện khí hậu nhiệt đới.

Nhằm giải quyết triệt để vấn đề trên, đề tài nghiên cứu tuyển chọn và đánh giá đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính probiotic bổ sung vào thức ăn cho heo đã được thực hiện trong thời gian từ tháng 6 năm 2018 đến tháng 10 năm 2019 tại phòng thí nghiệm Công ty TNHH Dược Hanvet phối hợp cùng Khoa Công nghệ Sinh học thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Mục tiêu trọng tâm của nghiên cứu là phân lập các chủng vi khuẩn sinh bào tử bản địa từ phân và chất chứa ruột heo, sàng lọc các đặc tính probiotic tiêu chuẩn, định danh loài bằng sinh học phân tử và xây dựng quy trình lên men xốp tạo chế phẩm đạt mật độ tế bào hữu hiệu từ 10^8 đến 10^9 CFU/g. Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học vững chắc giúp giảm tỷ lệ tiêu chảy ở heo sau cai sữa từ 79,64% xuống 42,22%, cải thiện hệ số chuyển hóa thức ăn FCR từ 1,55 xuống 1,50, đồng thời thúc đẩy chủ động sản xuất chế phẩm sinh học nội địa chất lượng cao thay thế nguồn hàng nhập khẩu.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên định nghĩa chuẩn hóa của Fuller (1989) và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2001), xác định probiotic là các vi sinh vật sống khi bổ sung vào cơ thể vật chủ qua đường tiêu hóa với số lượng đầy đủ sẽ mang lại lợi ích sức khỏe rõ rệt thông qua việc cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột.

Nền tảng lý thuyết cốt lõi thứ hai là mô hình cân bằng hệ vi sinh vật đường tiêu hóa ở động vật đơn dạ dày. Trong trạng thái sinh lý khỏe mạnh của heo, quần thể vi khuẩn đường ruột duy trì tỷ lệ hòa hoãn sinh thái với hơn 90% là các vi khuẩn có lợi kỵ khí sinh acid hữu cơ (Lactobacillus, Bifidobacterium), khoảng 1% là vi khuẩn cơ hội (Enterococci, Escherichia coli) và dưới 0,01% là các vi khuẩn gây bệnh tiềm tàng như Proteus, Staphylococcus hay Pseudomonas. Khi gặp các tác nhân gây stress như cai sữa hoặc đổi thức ăn, hiện tượng loạn khuẩn (dysbiosis) xảy ra làm suy giảm nghiêm trọng hàng rào bảo vệ niêm mạc ruột.

Bên cạnh đó, lý thuyết về sinh học nội bào tử của chi vi khuẩn Bacillus (họ Bacillaceae) cung cấp cơ sở quan trọng cho nghiên cứu: cấu trúc nội bào tử có tính ổn định cực cao, chịu được nhiệt độ sấy lên tới 100 độ C, kháng lại dịch vị acid dạ dày có độ pH 2,0 - 3,0 và nồng độ muối mật 0,3% - 2,0%, đồng thời sở hữu hệ enzyme ngoại bào đa dạng (amylase, protease, cellulase) giúp phân giải nhanh các hợp chất hữu cơ khó tiêu trong thức ăn chăn nuôi.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu khởi đầu của đề tài gồm 40 chủng vi khuẩn sinh bào tử được phân lập từ các mẫu phân tươi và chất chứa đường tiêu hóa của heo khỏe mạnh tại các trang trại nuôi công nghiệp. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích kết hợp kỹ thuật xử lý sốc nhiệt ở 80 đến 85 độ C trong 15 đến 30 phút nhằm loại bỏ hoàn toàn các tế bào sinh dưỡng và vi sinh vật không sinh bào tử, chỉ giữ lại các bào tử bền nhiệt thuần khiết.

Quy trình sàng lọc 4 bước được triển khai nghiêm ngặt:

• Khảo sát hoạt tính đối kháng in vitro bằng phương pháp đục lỗ thạch khuếch tán (đường kính lỗ 8 mm) đối với 4 chủng vi khuẩn gây bệnh phổ biến ở heo do Hanvet cung cấp gồm Salmonella choleraesuis Sc1 (phó thương hàn), Pasteurella suiseptica Ps1 (tụ huyết trùng), Escherichia coli Co1 (tiêu chảy) và Escherichia coli Co21 (phù đầu).
• Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào trên môi trường thạch bổ sung 1% tinh bột tan, 1% casein và 0,5% carboxymethyl cellulose (CMC) để đánh giá hoạt tính amylase, protease và cellulase qua đường kính vòng phân giải cơ chất.
• Khảo sát sức sống trong dịch dạ dày nhân tạo ở các ngưỡng pH 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 trong khoảng thời gian từ 0 đến 180 phút và dịch muối mật nồng độ 0,3% đến 2,0%.
• Định danh chính xác đến loài bằng sinh học phân tử qua kỹ thuật tách chiết ADN tổng số, phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA với cặp mồi chuẩn 27F và 1492R, điện di trên gel agarose 1%, tinh sạch sản phẩm bằng cột kit silica và giải trình tự so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI bằng công cụ BLAST.
• Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ từ 30 đến 45 độ C, pH từ 5,0 đến 8,0) và thiết lập quy trình lên men xốp trên các cơ chất nông sản rẻ tiền (tinh bột sắn, bột đậu tương, cám gạo) trong thời gian từ 24 đến 72 giờ.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Từ 40 chủng vi khuẩn phân lập ban đầu, qua 4 bước sàng lọc khắt khe, đề tài đã tuyển chọn thành công 3 chủng vi khuẩn ưu tú nhất mang ký hiệu 23, 24 và 25 đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn khắt khe của vi sinh vật probiotic.

Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA và phân tích cây phát sinh loài đã định danh chính xác:

• Chủng 23 là Bacillus velezensis với mức độ tương đồng di truyền đạt 99,93%.
• Chủng 24 là Bacillus paralicheniformis với độ tương đồng đạt 100%.
• Chủng 25 là Bacillus coagulans với mức độ tương đồng đạt 99,66%.

Cả 3 chủng vi khuẩn đều thể hiện hoạt tính sinh học xuất sắc: kháng mạnh cả 4 chủng vi khuẩn kiểm định gây bệnh ở heo, đồng thời chủng 23 và 24 có khả năng sinh tổng hợp mạnh mẽ cả 3 hệ enzyme ngoại bào amylase, protease và cellulase.

Về điều kiện lên men và tạo chế phẩm, nghiên cứu đã xác lập các thông số tối ưu: chủng Bacillus velezensis 23 sinh trưởng tốt nhất ở 37 độ C, pH 7,0 trên cơ chất tinh bột sắn bổ sung 10% đậu tương sau 72 giờ lên men; chủng Bacillus paralicheniformis 24 đạt mật độ cực đại ở 37 độ C, pH 7,0 trên cơ chất tinh bột sắn bổ sung 5% đậu tương sau 48 giờ; chủng Bacillus coagulans 25 sinh trưởng tối ưu ở 40 độ C, pH 7,0 trên cơ chất cám gạo sau 48 giờ. Chế phẩm dạng bột sau khi sấy ở nhiệt độ 100 độ C vẫn duy trì tỷ lệ sống sót cao, bảo đảm mật độ tế bào đạt từ 10^8 đến 10^9 CFU/g.

Thảo luận kết quả

Sự vượt trội của 3 chủng Bacillus tuyển chọn mở ra giải pháp công nghệ mang tính bước ngoặt. Khác với các vi khuẩn Lactic truyền thống rất nhạy cảm với nhiệt độ và điều kiện sấy, các chủng Bacillus velezensis, Bacillus paralicheniformis và Bacillus coagulans ở dạng nội bào tử có khả năng tồn tại bền vững qua môi trường dịch dạ dày pH 2,0 - 3,0 trong 90 đến 180 phút và dung nạp tốt dịch muối mật nồng độ trên 0,3%. Khi đi vào đường ruột non, bào tử nảy mầm và bám dính nhanh vào lớp biểu mô ruột để tạo ưu thế cạnh tranh.

Khi trình bày dữ liệu qua đồ thị biểu diễn động thái sinh trưởng theo pH, nhiệt độ và bảng phân tích đường kính vòng kháng khuẩn, kết quả phản ánh cơ chế tác động đa chiều: vi khuẩn Bacillus vừa tiết chất kháng khuẩn sinh học và acid hữu cơ để ức chế mầm bệnh, vừa sản sinh enzyme thủy phân các chất dinh dưỡng phức tạp thành dạng dễ tiêu hóa.

Kết quả này hoàn toàn thống nhất với các thử nghiệm lâm sàng thực tế trên heo lai D x YL sau cai sữa (từ 28 đến 56 ngày tuổi): khẩu phần bổ sung probiotic Bacillus đã giúp tăng trọng bình quân đạt 415,18 g/ngày (vượt xa mức 348,66 g/ngày ở đối chứng và 383,93 g/ngày ở lô dùng kháng sinh avilamycin 10%), giảm FCR từ 1,55 xuống 1,50, hạ tỷ lệ tiêu chảy từ 79,64% xuống 42,22% và đưa tỷ lệ mẫu phân nhiễm Salmonella từ 25% về 0%. Đồng thời, ở đàn heo con từ 1 đến 28 ngày tuổi với quy mô 1.400 con, việc bổ sung chế phẩm probiotic đã hạ tỷ lệ tiêu chảy từ 52% xuống 25% và giảm lượng vi khuẩn E. coli trong phân lúc 21 ngày tuổi từ 560,5 x 10^4 CFU/g xuống 373,2 x 10^4 CFU/g.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm chuyển giao nhanh chóng kết quả nghiên cứu vào thực tế sản xuất chăn nuôi, các đề xuất và khuyến nghị hành động bao gồm:

• Ứng dụng quy trình lên men xốp đa tầng ở quy mô bán công nghiệp và công nghiệp: Các doanh nghiệp sản xuất thuốc thú y và chế phẩm sinh học như Hanvet cần lắp đặt hệ thống buồng lên men xốp kiểm soát tự động nhiệt độ 37 đến 40 độ C, kiểm soát độ ẩm và sấy khô liên tục để đạt mục tiêu mật độ thành phẩm từ 10^9 đến 10^10 CFU/g trong lộ trình thực hiện từ 6 đến 12 tháng.
• Phối chế công thức probiotic đa chủng thế hệ mới: Phòng R&D của các nhà máy sản xuất thức ăn chăn nuôi cần phối hợp 3 chủng Bacillus velezensis, Bacillus paralicheniformis và Bacillus coagulans theo tỷ lệ sinh khối tối ưu nhằm tạo hiệu ứng hiệp đồng, đặt mục tiêu giảm tỷ lệ tiêu chảy ở heo cai sữa xuống dưới 20% và giảm hệ số FCR thêm 5% đến 8% trong thời gian 3 đến 6 tháng.
• Triển khai khảo nghiệm mở rộng trên đàn heo quy mô lớn: Các cơ quan khuyến nông và hiệp hội chăn nuôi cần tổ chức thử nghiệm trên quy mô 500 đến 1.000 heo thịt và heo con tại các vùng chăn nuôi tập trung phía Bắc và phía Nam, theo dõi định kỳ các chỉ tiêu tăng trọng, phân tích máu và vi sinh vật phân trong thời gian 6 đến 12 tháng.
• Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và hồ sơ công bố chất lượng: Đơn vị nghiên cứu cần hoàn thiện hồ sơ kỹ thuật đăng ký sản phẩm thức ăn bổ sung sinh học theo tiêu chuẩn GMP và nộp lên Cục Chăn nuôi thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn để được cấp phép lưu hành trong vòng 6 tháng tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và dữ liệu thực nghiệm trong luận văn mang lại giá trị thiết thực cho 4 nhóm đối tượng chính:

• Cán bộ nghiên cứu, giảng viên và học viên cao học chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học ứng dụng và Chăn nuôi Thú y: Tiếp cận tài liệu chuẩn mực về quy trình phân lập vi khuẩn sinh bào tử, kỹ thuật giải trình tự 16S rRNA định danh loài và phương pháp đánh giá hoạt tính probiotic in vitro theo tiêu chuẩn quốc tế.
• Chuyên gia R&D và kỹ sư công nghệ tại các nhà máy sản xuất thức ăn chăn nuôi, dược thú y: Áp dụng trực tiếp công thức cơ chất nông nghiệp rẻ tiền (tinh bột sắn, cám gạo, bột đậu tương) và thông số kỹ thuật lên men xốp để tối ưu hóa chi phí sản xuất chế phẩm sinh học quy mô lớn.
• Chủ trang trại chăn nuôi heo công nghiệp và kỹ thuật viên trang trại: Nắm vững phương pháp và liều lượng phối trộn chế phẩm vi sinh vào thức ăn hàng ngày (200 đến 300 g chế phẩm/tấn thức ăn) nhằm phòng ngừa hiệu quả bệnh tiêu chảy, giảm chi phí thuốc kháng sinh điều trị từ 30% đến 50%.
• Các cơ quan quản lý nông nghiệp và hoạch định chính sách an toàn sinh học: Sử dụng cơ sở dữ liệu khoa học của đề tài để xây dựng lộ trình loại bỏ hoàn toàn kháng sinh phòng bệnh trong chăn nuôi và ban hành các quy chuẩn kỹ thuật cho phụ gia vi sinh.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus lại được ưu tiên lựa chọn hơn vi khuẩn Lactic truyền thống trong sản xuất thức ăn chăn nuôi?

Vi khuẩn Bacillus có khả năng tạo nội bào tử bền vững, chịu được nhiệt độ sấy lên tới 100 độ C và áp lực ép viên thức ăn công nghiệp. Khi vào đường tiêu hóa, bào tử vượt qua được dịch acid dạ dày pH 1,5 - 3,0 và muối mật 0,3% - 2,0%, trong khi vi khuẩn Lactic dạng tế bào sinh dưỡng rất dễ bị bất hoạt trong quá trình chế biến và bảo quản.

Ba chủng vi khuẩn được tuyển chọn trong đề tài sở hữu những ưu thế sinh học cụ thể nào?

Ba chủng vi khuẩn gồm Bacillus velezensis 23, Bacillus paralicheniformis 24 và Bacillus coagulans 25 có hoạt tính đối kháng mạnh với 4 tác nhân gây bệnh nguy hiểm ở heo (E. coli tiêu chảy, E. coli phù đầu, Salmonella choleraesuis, Pasteurella suiseptica), đồng thời sản sinh mạnh mẽ hệ enzyme amylase, protease và cellulase giúp tăng cường tối đa hiệu quả tiêu hóa thức ăn.

Khả năng chịu đựng môi trường khắc nghiệt trong đường tiêu hóa của các chủng Bacillus tuyển chọn đạt mức nào?

Cả 3 chủng vi khuẩn đều duy trì tỷ lệ sống sót cao trong dịch dạ dày nhân tạo ở dải pH từ 2,0 đến 3,0 trong suốt 90 đến 180 phút và sinh trưởng ổn định trong môi trường chứa muối mật nồng độ từ 0,3% đến 2,0%, bảo đảm khả năng nảy mầm và hoạt động hiệu quả khi xuống tới ruột non.

Hiệu quả kinh tế kỹ thuật khi bổ sung probiotic chứa Bacillus vào khẩu phần ăn của heo con cai sữa ra sao?

Thử nghiệm thực tế chứng minh việc bổ sung probiotic giúp tăng trọng bình quân của heo con cai sữa tăng từ 348,66 g/ngày lên 415,18 g/ngày (tăng 19,07%), cải thiện hệ số chuyển hóa thức ăn FCR từ 1,55 xuống 1,50 và hạ tỷ lệ tiêu chảy từ 79,64% xuống 42,22%, giúp người chăn nuôi tiết kiệm đáng kể chi phí thú y.

Cơ chất nông sản và thời gian lên men xốp tối ưu cho từng chủng vi khuẩn là gì?

Chủng Bacillus velezensis 23 đạt mật độ cao nhất trên cơ chất tinh bột sắn bổ sung 10% bột đậu tương ở 37 độ C sau 72 giờ; chủng Bacillus paralicheniformis 24 tối ưu trên tinh bột sắn bổ sung 5% đậu tương ở 37 độ C sau 48 giờ; chủng Bacillus coagulans 25 phát triển mạnh nhất trên nền cám gạo ở 40 độ C sau 48 giờ lên men.

Kết luận

Luận văn thạc sĩ đã mang lại những đóng góp khoa học quan trọng và giải pháp công nghệ đột phá cho ngành chăn nuôi:

• Phân lập thành công 40 chủng vi khuẩn sinh bào tử từ mẫu phân và đường ruột heo nuôi trang trại công nghiệp.
• Tuyển chọn và định danh chính xác bằng giải trình tự 16S rRNA 3 chủng vi sinh vật ưu tú: Bacillus velezensis (độ tương đồng 99,93%), Bacillus paralicheniformis (độ tương đồng 100%) và Bacillus coagulans (độ tương đồng 99,66%).
• Xác lập hoạt tính đối kháng phổ rộng với 4 chủng vi khuẩn gây bệnh (E. coli, Salmonella, Pasteurella), khả năng chịu dịch vị pH 2,0 - 3,0, muối mật trên 0,3% và năng lực sinh enzyme tiêu hóa vượt trội.
• Hoàn thiện công nghệ lên men xốp trên nguồn cơ chất nông sản sẵn có, tạo chế phẩm bột chịu nhiệt 100 độ C với mật độ tế bào đạt chuẩn từ 10^8 đến 10^9 CFU/g.
• Chứng minh hiệu quả cải thiện tăng trọng đạt 415,18 g/ngày, giảm tỷ lệ tiêu chảy trên 37,42% và loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn Salmonella trong phân heo sau cai sữa.

Để đón đầu xu hướng chăn nuôi không kháng sinh, các nhà máy chế biến thức ăn và các trang trại chăn nuôi nên chủ động liên kết, tiếp nhận chuyển giao quy trình công nghệ và ứng dụng ngay chế phẩm probiotic Bacillus vào quy trình chăm sóc dinh dưỡng cho đàn heo nhằm nâng cao tối đa hiệu quả kinh tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Trong dinh dưỡng động vật, việc tăng cường sức khoẻ hệ thống tiêu hoá của vật nuôi thông qua những tác động tới hệ vi sinh vật đường ruột được coi là một giải pháp rất hữu hiệu. Hệ vi sinh vật đường ruột của vật nuôi rất phong phú về chủng loại và số lượng, những biến động về cơ cấu, số lượng các loài vi sinh vật đường ruột là một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến những rối loạn trong tiêu hoá và hấp thu. Bởi vậy, việc sử dụng các biện pháp kỹ thuật thông qua thức ăn và nuôi dưỡng nhằm tạo nên một thế cân bằng tối ưu giữa các loài vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ đã và đang là hướng nghiên cứu được các nhà nghiên cứu trong và ngoài nước quan tâm. Có nhiều biện pháp để cải thiện quan hệ cân bằng giữa các nhóm vi khuẩn có lợi và có hại trong đường tiêu hoá của gia súc, gia cầm.

Biện pháp cổ điển được ứng dụng rộng rãi từ những năm 1950 của thế kỷ trước là sử dụng kháng sinh liều thấp. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi ngày càng bị hạn chế (kể từ ngày 01 tháng 01 năm 2006, các nước thuộc EU cấm hoàn toàn việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi - Hector Cervanter, 2006), nên nhu cầu tìm ra các giải pháp thay thế kháng sinh ngày càng trở thành cấp bách. Một trong những giải pháp hữu hiệu nhất hiện nay là probiotic. Probiotic - theo Fuller (1992) là chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích trong thức ăn nhằm cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ.

Các sản phẩm probiotic nhập khẩu dùng trong chăn nuôi có mặt trên thị trường Việt Nam nhiều nhưng các đáp ứng tích cực cho vật nuôi chưa được rõ ràng. Các nhà khoa học cho rằng có thể là các vi sinh vật đó không phù hợp với hệ vi sinh vật đường ruột của vật chủ bản địa. Mặt khác, các nghiên cứu sản xuất các chế phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi ở nước ta còn rất hạn chế. Chính vì thế, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tuyển chọn và đánh giá đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính probiotic bổ sung vào thức ăn cho heo” với định hướng tìm ra các vi khuẩn Bacillus có hoạt tính probiotic phù hợp với heo nội địa.

Đề tài này được thực hiện thành công sẽ mở ra triển vọng trong việc sản xuất đáp ứng với yêu cầu của ngành chăn nuôi heo (hoàn toàn dựa vào các nguyên liệu từ thiên nhiên) theo hướng công nghiệp ở nước ta, hạn chế nhập khẩu. 1 c Mục đích nghiên cứu Sử dụng chủng Bacillus có đặc tính probiotic đã tuyển chọn để bổ sung vào thức ăn cho heo. Đối tượng nghiên cứu. Các chủng vi khuẩn Baillus phân lập từ các mẫu phân và chất chưa trong ruột heo của các trại chăn nuôi heo (theo quy mô công nghiệp).

Vi sinh vật kiểm định Các chủng vi khuẩn gây bệnh ở heo: Salmonella choleraesuis – Sc1 (gây bệnh phó thường hàn), Pasteurella suiseptica – Ps1 (gây bệnh tụ huyết trùng), Escherichia coli – Co1 (gây bệnh tiêu chảy), Escherichia coli – Co21 (gây bệnh phù đầu) (do công ty TNHH dược Hanvet cung cấp). Thời gian, địa điểm nghiên cứu. - Thời gian: 6/2018-10/2019 - Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm của công ty TNHH dược Hanvet Nội dung nghiên cứu - Phân lập các chủng Bacillus từ mẫu phân và chất chứa đường tiêu hóa của heo. - Tuyển chọn chủng Bacillus có đặc tính của probiotic.

- Định danh đến loài các chủng Bacillus đã tuyển chọn - Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng vi khuẩn Bacillus đã tuyển chọn - Tạo chế phẩm probiotic và kiểm tra khả năng sống sót của các chủng nghiên cứu trong chế phẩm sau bảo quản. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. GIỚI THIỆU VỀ PROBIOTIC 2. Lịch sử probiotic Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry Tisser (1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của những đứa trẻ mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh.

Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, đạt giải Nobel – đã chứng minh được rằng việc tiêu thụ LactoBacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dăc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life (1908). Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic. Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi khuẩn lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh (Fuller.

Cùng năm đó, các nhà nghiên cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là LactoBacillus acidophilus có khả năng làm giảm bệnh táo bón thường xuyên. Các nhà khoa học đại học Havard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất ra được. Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men – đặt tên là “Yakult” từ sữa được cho là hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất. Khái niệm chung probiotics được chấp nhận ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản phẩm lên men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập niên 80.

Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc LactoBacillus được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những nguồn thực phẩm chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi. Định nghĩa probiotic Theo ngôn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Thuật ngữ probiotic được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ “những vi sinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” (Fuller, 1989). Từ đó đến nay thuật ngữ probiotic đã được cả thế giới sử dụng để chỉ những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được đưa vào cơ thể động vật thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ.

Kể từ khi xuất hiện, khái niệm probiotic vẫn chưa có một định nghĩa thống nhất. Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học: (i) theo Fuller (1989), probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi cho vật chủ”; (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ” 2. Đặc điểm chung vi khuẩn probiotic Về lý thuyết, bất cứ loài vi khuẩn, nấm sợi, nấm men hay sinh vật đơn bào không gây độc nào cũng đều có khả năng sử dụng làm probiotic (Hồ Trung Thông, Hồ Lê Huỳnh Châu (2009). Tuy nhiên, để có thể tác động có lợi lên tiêu hóa vật chủ thì trước hết chúng phải khả năng sống sót ở điều kiện khắc nghiệt trong đường tiêu hóa, cụ thể như sau:  Chịu muối mật Muối mật được coi là chất kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo vệ ruột khỏi sự xâm nhập của các vi sinh vật gây bệnh.

Do vậy, khi thức ăn cùng vi sinh vật probiotic từ dạ dày chuyển xuống vùng ruột, tại đây chúng sẽ chịu tác động của muối mật. Khả năng sống sót của các chủng vi sinh vật sau tác dụng của muối mật là một trong những đặc tính quan trọng của vi sinh vật được sử dụng làm probiotic.  Chịu pH thấp Các nhà khoa học đã chứng minh, các probiotic phải trải qua quá trình tiêu hóa khắc nghiệt hơn 90 phút trước khi được giải phóng từ dạ dày vào ruột. Tuy nhiên, các quá trình tiêu hóa có thời gian xảy ra lâu hơn nên vi sinh vật probiotic phải chịu áp lực dạ dày với pH thấp ít nhất là 90 phút, tiếp đến chúng phải gắn vào biểu mô ruột và phát triển được trong ruột trước khi phát huy vai trò đối với 4 c vật chủ.

Vì vậy, đây là yếu tố cần thiết để tạo sự thích ghi ban đầu, là một trong những tiêu chí quan trọng khi sàng lọc, tuyển chọn các chủng probiotic.  Chịu kháng sinh Kháng sinh được sử dụng phổ biến trong điều trị bệnh đường ruột cho người cũng như vật nuôi. Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích do kháng sinh mang lại thì phương pháp trị liệu bằng kháng sinh có một số hạn chế nhất định như tác động không chọn lọc, không phân biệt được mầm bệnh thật sự hay vi sinh vật có lợi trong đường ruột. Vì thế, phương pháp này đã dẫn đến sự mất cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột và có thể gây ra một số ảnh hưởng xấu cho vật chủ như tiêu chảy, rối noạn tiêu hóa,…(Nguyễn Văn Bá và cs.

Chính vì vây, việc sử dụng probioic thường được bổ sung cho vật chủ trong thời gian điều trị bằng kháng sinh để hạn chế sự mất cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột. Do đó, các chủng dùng làm probiotic cần phải có khả năng chịu được kháng sinh và đảm bảo không chuyển gen đề kháng kháng sinh sang những vi khuẩn khác có mặt trong đường tiêu hóa, đặc biệt là những vi khuân gây bệnh.  Khả năng bám dính vào tế bào biểu mô ruột Các chủng vi sinh vật probiotic chỉ có thể tác động tốt nhất khi chúng có thể sinh trưởng và phát triển được trong đường tiêu hóa. Bên cạnh khả năng sống sót được trong đường tiêu hóa thì chúng phải có khả năng bám dính vào thành biểu mô ruột để không bị rửa trôi ra ngoài cùng với phân.

Nhờ khả năng bám dính đó mà các chủng probiotic có thể ngăn cản được khu trú của các vi khuẩn gây bệnh bằng cách giành vị trí bám dính trên thành ruột hay trên các bề mặt khác.