Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn lactobacillus sinh bacteriocin từ thủy sản

Nghiên cứu Lactobacillus từ thủy sản mở ra tiềm năng ứng dụng to lớn trong nhiều lĩnh vực. 58 trang · Học viện Nông nghiệp Việt Nam · 2022.

• Tác giả: Nguyễn Hoàng Thảo Minh
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thùy Dương
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ vi sinh
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Điểm Sinh Học Chủng Vi Khuẩn Lactobacillus Từ Thủy Sản
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 1.1. Mục đích
• 1.2. Đối tượng nghiên cứu
• 1.3. Nội dung nghiên cứu
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Khái quát về vi khuẩn Lactobacillus
• 2.2. Khái niệm về Lactobacillus
• 2.3. Vai trò của vi khuẩn Lactobacillus
• 2.4. Định nghĩa về Bacteriocin
• 2.5. Lịch sử nghiên cứu Bacteriocin
• 2.6. Phân loại bacteriocin
• 2.6.1. Bacteriocin lớp I
• 2.6.1.1. Lớp Ia
• 2.6.1.2. Lớp Ib
• 2.6.2. Bacteriocin lớp II
• 2.6.2.1. Lớp IIa
• 2.6.2.2. Lớp IIb
• 2.6.2.3. Lớp IIc
• 2.6.3. Bacteriocin lớp III
• 2.6.4. Bacteriocin lớp IV
• 2.7. Đặc tính sinh hóa của bacteriocin
• 2.7.1. Tính chất vật lí
• 2.7.2. Tính chất hóa học
• 2.8. Bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus
• 3. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.3. Đối tượng nghiên cứu
• 3.4. Thiết bị và hóa chất
• 3.5. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu
• 3.6. Phương pháp nghiên cứu
• 3.6.1. Phương pháp thu thập mẫu
• 3.6.2. Phương pháp phân lập
• 3.6.3. Khảo sát khả năng kháng khuẩn
• 3.6.4. Khảo sát khả năng sinh bacteriocin
• 3.6.5. Định danh chủng vi khuẩn
• 3.6.6. Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu
• 3.6.7. Khảo sát khả năng chịu muối mật
• 3.6.8. Khảo sát khả năng chịu acid dạ dày
• 3.6.9. Phân lập vi khuẩn Lactic
• 3.6.10. Khảo sát khả năng kháng khuẩn
• 3.6.11. Khảo sát khả năng sinh bacteriocin
• 3.6.12. Xử lí bằng enzyme phân giải proteinase-K
• 3.6.13. Đặc điểm sinh học
• 3.6.14. Định danh chủng vi khuẩn
• 3.6.15. Khuếch đại trình tự DNA bằng phản ứng PCR
• 3.6.16. Định danh và phân tích bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA
• 3.6.17. Nồng độ ức chế tối thiểu
• 3.6.18. Khảo sát khả năng chịu muối mật
• 3.6.19. Khảo sát khả năng chịu acid dạ dày
• 4. PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Lactobacillus Từ Thủy Sản

Nghiên cứu Lactobacillus từ thủy sản mở ra tiềm năng ứng dụng to lớn trong nhiều lĩnh vực. Vi khuẩn Lactobacillus không chỉ đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái thủy sản mà còn hứa hẹn mang lại giải pháp tự nhiên cho bảo quản thực phẩm và cải thiện sức khỏe đường ruột. Bài viết này sẽ khám phá những đặc điểm sinh học độc đáo của chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ nguồn gốc thủy sản, mở ra hướng đi mới cho các nghiên cứu tiếp theo. Việc tìm hiểu sâu hơn về đặc điểm sinh học của các chủng Lactobacillus này là vô cùng cần thiết. Theo nghiên cứu của FAO (2018), sản lượng nuôi trồng thủy sản toàn cầu đã tăng đáng kể, đặt ra nhu cầu cấp thiết về các giải pháp bền vững để đảm bảo chất lượng và an toàn sản phẩm.

1.1. Tại Sao Nghiên Cứu Lactobacillus Từ Thủy Sản Quan Trọng

Nghiên cứu Lactobacillus từ thủy sản quan trọng vì nhiều lý do. Thứ nhất, thủy sản là một nguồn giàu vi khuẩn Lactobacillus. Thứ hai, Lactobacillus có thể được sử dụng để cải thiện chất lượng và an toàn của sản phẩm thủy sản. Thứ ba, Lactobacillus có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm mới từ thủy sản. Chế phẩm sinh học chứa Lactobacillus có thể cải thiện khả năng miễn dịch và cân bằng hệ vi sinh đường ruột của thủy sản. Ứng dụng Lactobacillus có thể thay thế kháng sinh, giảm thiểu rủi ro kháng thuốc.

1.2. Tiềm Năng Ứng Dụng Của Vi Khuẩn Lactobacillus Trong Thủy Sản

Tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn Lactobacillus trong thủy sản rất lớn. Chúng có thể được sử dụng như probiotic để cải thiện sức khỏe và tăng trưởng của thủy sản. Lactobacillus cũng có thể được sử dụng để bảo quản thực phẩm thủy sản bằng cách ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây hư hỏng. Thêm vào đó, Enzyme do Lactobacillus sản xuất có thể được sử dụng trong chế biến thủy sản. Ứng dụng Lactobacillus cũng có thể giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường trong nuôi trồng thủy sản.

II. Phân Lập Và Định Danh Lactobacillus Từ Nguồn Gốc Thủy Sản

Quá trình phân lập và định danh Lactobacillus từ nguồn gốc thủy sản đòi hỏi quy trình nghiêm ngặt và chính xác. Các phương pháp truyền thống như nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường chọn lọc kết hợp với các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại như PCR và phân tích trình tự gen 16S rRNA đóng vai trò then chốt. Mục tiêu là xác định chính xác loài Lactobacillus và hiểu rõ đặc tính di truyền của chúng. Điều này rất quan trọng cho việc lựa chọn các chủng vi khuẩn Lactobacillus phù hợp cho các ứng dụng khác nhau. Theo nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Thảo Minh (2022), quy trình phân lập và định danh Lactobacillus đóng vai trò quan trọng trong việc xác định các chủng vi khuẩn có khả năng sinh bacteriocin từ thủy sản.

2.1. Phương Pháp Phân Lập Lactobacillus Hiệu Quả Từ Thủy Sản

Để phân lập Lactobacillus hiệu quả từ thủy sản, cần sử dụng môi trường MRS (De Man, Rogosa and Sharpe) chọn lọc. Mẫu thủy sản được nghiền và pha loãng trước khi cấy lên đĩa MRS. Sau khi ủ, các khuẩn lạc nghi ngờ là Lactobacillus sẽ được chọn lọc dựa trên hình thái và thử nghiệm catalase. Các chủng vi khuẩn được chọn lọc sau đó được nuôi cấy lại để đảm bảo độ tinh khiết. Việc kiểm tra đặc tính sinh hóa cũng cần thiết để xác định sơ bộ loài Lactobacillus.

2.2. Kỹ Thuật PCR Và Phân Tích Trình Tự Gen 16S rRNA Để Định Danh

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) và phân tích trình tự gen 16S rRNA là công cụ mạnh mẽ để định danh Lactobacillus. DNA của vi khuẩn được chiết xuất và vùng gen 16S rRNA được khuếch đại bằng PCR. Sản phẩm PCR sau đó được giải trình tự và so sánh với cơ sở dữ liệu gen để xác định loài Lactobacillus. Phương pháp này cho phép định danh Lactobacillus đến cấp độ loài một cách chính xác. Phân tích trình tự gen này đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu đặc điểm sinh học.

2.3. Đặc Tính Sinh Hóa Của Lactobacillus Phân Lập Từ Thủy Sản

Đặc tính sinh hóa của Lactobacillus phân lập từ thủy sản bao gồm khả năng lên men các loại đường khác nhau, khả năng chịu pH và nhiệt độ khác nhau, và khả năng sản xuất acid lactic. Các thử nghiệm như nhuộm Gram, kiểm tra catalase và oxidase cũng được sử dụng để xác định đặc tính sinh học cơ bản của vi khuẩn. Các đặc tính sinh hóa này giúp phân biệt các loài Lactobacillus khác nhau và đánh giá khả năng ứng dụng của chúng.

III. Đặc Điểm Sinh Học Và Khả Năng Kháng Khuẩn Của Lactobacillus

Đặc điểm sinh học của Lactobacillus đóng vai trò quan trọng trong việc xác định khả năng ứng dụng của chúng. Các yếu tố như khả năng chịu pH, nhiệt độ, NaCl, khả năng sống sót trong môi trường có muối mật và acid dạ dày ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của Lactobacillus trong môi trường khác nhau. Khả năng kháng khuẩn của Lactobacillus, đặc biệt là khả năng sản xuất bacteriocin, là một yếu tố quan trọng trong việc ứng dụng chúng làm chất bảo quản tự nhiên và probiotic. Việc đánh giá khả năng kháng oxy hóa cũng cần thiết để hiểu rõ hơn về vai trò bảo vệ của Lactobacillus.

3.1. Ảnh Hưởng Của pH Nhiệt Độ Và NaCl Đến Lactobacillus

pH, nhiệt độ và NaCl là những yếu tố môi trường quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển và hoạt động của Lactobacillus. Mỗi loài Lactobacillus có một khoảng pH và nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển. Nồng độ NaCl cao có thể ức chế sự phát triển của một số loài Lactobacillus. Việc hiểu rõ ảnh hưởng của các yếu tố này là rất quan trọng trong việc nuôi cấy vi khuẩn và ứng dụng chúng trong các sản phẩm khác nhau.

3.2. Đánh Giá Khả Năng Kháng Khuẩn Và Sản Xuất Bacteriocin

Đánh giá khả năng kháng khuẩn của Lactobacillus được thực hiện bằng cách sử dụng các phương pháp như khuếch tán trên đĩa thạch hoặc pha loãng trong ống nghiệm. Bacteriocin là các protein kháng khuẩn được sản xuất bởi Lactobacillus và có thể ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác. Việc xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của bacteriocin là rất quan trọng để đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của chúng.

3.3. Khả Năng Kháng Oxy Hóa Của Lactobacillus Từ Thủy Sản

Khả năng kháng oxy hóa của Lactobacillus từ thủy sản là một đặc điểm quan trọng. Lactobacillus có thể sản xuất các chất kháng oxy hóa như glutathione và superoxide dismutase, giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do gốc tự do. Đánh giá khả năng kháng oxy hóa có thể được thực hiện bằng các phương pháp như DPPH assay hoặc ABTS assay.

IV. Ứng Dụng Vi Khuẩn Lactobacillus Từ Thủy Sản Trong Thực Tế

Ứng dụng Lactobacillus từ thủy sản trong thực tế rất đa dạng. Chúng có thể được sử dụng trong thực phẩm lên men để cải thiện hương vị và kéo dài thời gian bảo quản. Lactobacillus cũng có thể được sử dụng làm probiotic trong thức ăn chăn nuôi thủy sản để cải thiện sức khỏe và tăng trưởng của vật nuôi. Ngoài ra, Lactobacillus có thể được sử dụng trong bảo quản thực phẩm thủy sản để ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây hư hỏng. Theo các nghiên cứu gần đây, ứng dụng Lactobacillus có thể thay thế các chất bảo quản hóa học, mang lại lợi ích cho sức khỏe người tiêu dùng.

4.1. Sử Dụng Lactobacillus Trong Thực Phẩm Lên Men Từ Thủy Sản

Sử dụng Lactobacillus trong thực phẩm lên men từ thủy sản là một phương pháp truyền thống để cải thiện hương vị và kéo dài thời gian bảo quản. Ví dụ, Lactobacillus có thể được sử dụng để lên men nước mắm, mắm tôm, hoặc các sản phẩm cá muối. Quá trình lên men giúp tạo ra các acid hữu cơ và các hợp chất thơm, làm tăng giá trị dinh dưỡng và cảm quan của sản phẩm.

4.2. Lactobacillus Như Probiotic Trong Nuôi Trồng Thủy Sản

Lactobacillus có thể được sử dụng như probiotic trong thức ăn chăn nuôi thủy sản để cải thiện sức khỏe và tăng trưởng của vật nuôi. Probiotic Lactobacillus giúp cân bằng hệ vi sinh đường ruột, tăng cường hệ miễn dịch, và cải thiện khả năng hấp thụ dinh dưỡng của thủy sản. Điều này giúp giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh và các hóa chất khác trong nuôi trồng.

4.3. Bảo Quản Thực Phẩm Thủy Sản Bằng Vi Khuẩn Lactobacillus

Bảo quản thực phẩm thủy sản bằng vi khuẩn Lactobacillus là một phương pháp tự nhiên và hiệu quả. Lactobacillus sản xuất acid lactic và các chất kháng khuẩn khác, giúp ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây hư hỏng như vi khuẩn hiếu khí và nấm mốc. Phương pháp này giúp kéo dài thời gian bảo quản và duy trì chất lượng của sản phẩm thủy sản.

V. Kết Luận Và Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Lactobacillus

Nghiên cứu Lactobacillus từ thủy sản mở ra nhiều triển vọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học và chế biến thực phẩm. Việc phân lập, định danh và nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn Lactobacillus giúp chúng ta hiểu rõ hơn về tiềm năng ứng dụng của chúng. Các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc tối ưu hóa quá trình sản xuất bacteriocin, đánh giá an toàn thực phẩm và hiệu quả của Lactobacillus trong các ứng dụng thực tế. Theo xu hướng phát triển bền vững, vi khuẩn Lactobacillus hứa hẹn sẽ đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe con người và môi trường.

5.1. Tổng Kết Các Kết Quả Nghiên Cứu Về Lactobacillus Từ Thủy Sản

Các kết quả nghiên cứu về Lactobacillus từ thủy sản cho thấy tiềm năng to lớn của chúng trong nhiều lĩnh vực. Các chủng vi khuẩn Lactobacillus được phân lập có khả năng kháng khuẩn mạnh, chịu được các điều kiện khắc nghiệt, và có thể được sử dụng trong thực phẩm lên men, thức ăn chăn nuôi, và bảo quản thực phẩm. Việc ứng dụng Lactobacillus giúp cải thiện chất lượng sản phẩm, giảm thiểu việc sử dụng hóa chất, và bảo vệ môi trường.

5.2. Đề Xuất Hướng Nghiên Cứu Mới Về Ứng Dụng Lactobacillus

Các hướng nghiên cứu mới về ứng dụng Lactobacillus bao gồm: Nghiên cứu về cơ chế hoạt động của bacteriocin, phát triển các sản phẩm probiotic đặc hiệu cho thủy sản, và ứng dụng Lactobacillus trong xử lý chất thải thủy sản. Ngoài ra, cần có các nghiên cứu về tác động của Lactobacillus đến sức khỏe đường ruột và hệ miễn dịch của thủy sản, cũng như đánh giá tính an toàn thực phẩm của các sản phẩm chứa Lactobacillus.

5.3. Tiềm Năng Thương Mại Hóa Các Sản Phẩm Từ Lactobacillus

Tiềm năng thương mại hóa các sản phẩm từ Lactobacillus rất lớn. Các sản phẩm như thực phẩm lên men, thức ăn chăn nuôi, và chất bảo quản tự nhiên có thể được phát triển và đưa ra thị trường. Việc xây dựng thương hiệu và chứng nhận chất lượng cho các sản phẩm này là rất quan trọng để thu hút người tiêu dùng. Ngoài ra, cần có sự hợp tác giữa các nhà khoa học, doanh nghiệp, và chính phủ để thúc đẩy sự phát triển của ngành công nghiệp Lactobacillus.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Nuôi trồng thủy sản là một trong những ngành kinh tế có tốc độ tăng trưởng nhanh nhằm đáp ứng nguồn protein động vật chất lượng cao cho nhu cầu dinh dưỡng toàn cầu. Theo báo cáo của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO, 2018), sản lượng nuôi trồng thủy sản toàn cầu đã ghi nhận mức tăng trưởng từ 148 triệu tấn vào năm 2010 lên đến 178 triệu tấn vào năm 2018. Đi cùng với sự gia tăng quy mô và mật độ nuôi thâm canh, ngành thủy sản phải đối mặt với rủi ro bùng phát dịch bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn, làm suy giảm nghiêm trọng năng suất và sản lượng cá. Các tác nhân gây bệnh phổ biến trong môi trường nuôi bao gồm các chi vi khuẩn:

• Staphylococcus: tác nhân gây xuất huyết vây và xương nắp mang.
• Aeromonas: vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá.
• Vibrio: nguyên nhân dẫn đến bệnh nhiễm khuẩn máu.
• Edwardsiella: tác nhân gây bệnh mủ gan ở cá.
• Pseudomonas: gây tình trạng nhiễm khuẩn huyết diện rộng.

Trong nhiều năm, việc sử dụng thuốc kháng sinh và các chất kích thích tăng trưởng đã trở thành biện pháp can thiệp chính để phòng ngừa và điều trị dịch bệnh. Tuy nhiên, việc lạm dụng kháng sinh trong thời gian dài đã để lại nhiều hệ lụy nghiêm trọng: làm biến đổi cấu trúc quần xã vi sinh vật tự nhiên trong hệ thống nuôi, phá vỡ cân bằng hệ vi sinh có lợi, làm gia tăng hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc và tiềm ẩn nguy cơ tồn dư hóa chất ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người.

Trước thực trạng này, việc ứng dụng chế phẩm sinh học (probiotic) chứa các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp hoạt chất kháng khuẩn tự nhiên được xem là giải pháp thay thế an toàn và bền vững. Trong đó, chi vi khuẩn Lactobacillus đóng vai trò quan trọng nhờ khả năng cải thiện hệ miễn dịch, duy trì cân bằng hệ vi sinh đường ruột và tiết ra các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên như acid lactic, bacteriocin nhằm ức chế chọn lọc các vi khuẩn gây bệnh mà không gây hiện tượng kháng thuốc diện rộng.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu:

1. Tuyển chọn được chủng vi khuẩn Lactobacillus có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin phân lập từ nguồn phụ phẩm đường ruột thủy sản.
2. Đánh giá và xác định các đặc điểm sinh học, khả năng ức chế vi khuẩn kiểm định và khả năng thích ứng với điều kiện đường tiêu hóa của chủng tuyển chọn.

Nội dung nghiên cứu cụ thể:

1. Phân lập các chủng vi khuẩn Lactobacillus từ mẫu ruột cá thu thập tại thực địa.
2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Lactobacillus có hoạt tính đối kháng với chủng vi khuẩn kiểm định Staphylococcus aureus.
3. Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn thông qua thử nghiệm độ bền nhiệt và độ nhạy cảm với enzyme phân giải protein (Proteinase K).
4. Nghiên cứu các đặc tính sinh học, định danh phân tử bằng kỹ thuật giải trình tự đoạn gen 16S rRNA, xác định thể tích ức chế tối thiểu, cũng như đánh giá khả năng chịu muối mật và chịu acid dạ dày của chủng vi khuẩn tiềm năng nhất.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn Lactobacillus sinh bacteriocin được phân lập từ 9 mẫu ruột cá tươi thu nhận từ các địa phương nuôi trồng thủy sản; chủng vi khuẩn kiểm định đối kháng là Staphylococcus aureus được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
• Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; nguồn mẫu thu thập tại các huyện Việt Yên (tỉnh Bắc Giang), Hưng Hà (tỉnh Thái Bình) và Nghĩa Hưng (tỉnh Nam Định).
• Phạm vi thời gian: Nghiên cứu được triển khai thực hiện từ tháng 03/2022 đến tháng 09/2022.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và phân loại khoa học

Nghiên cứu dựa trên cơ sở lý thuyết về vi sinh vật học đường ruột động vật thủy sản và đặc tính sinh hóa của nhóm vi khuẩn acid lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB), đặc biệt là chi Lactobacillus (họ Lactobacillaceae). Đây là nhóm trực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, catalase âm tính, có khả năng di động, có lịch sử sử dụng an toàn và được xếp vào nhóm sinh vật nhìn chung được công nhận là an toàn (Generally Recognized As Safe - GRAS) bởi Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) và các tiêu chuẩn châu Âu.

Bacteriocin do vi khuẩn Lactobacillus sinh ra là các chuỗi peptide hoặc protein kháng khuẩn được tổng hợp qua con đường ribosome. Khác với các chất kháng sinh truyền thống tác động phổ rộng không chọn lọc, bacteriocin thể hiện hoạt tính ức chế đặc hiệu cao đối với các dòng vi khuẩn có quan hệ họ hàng gần hoặc các tác nhân gây bệnh trong cùng ổ sinh thái. Về mặt phân loại, bacteriocin được chia thành 4 nhóm chính:

• Lớp I (Lantibiotic): Các peptide nhỏ (<5 kDa), chịu nhiệt tốt, chứa các acid amin thioether đa vòng đặc trưng (lanthionine, methyl-lanthionine). Nhóm này gồm phân lớp Ia (phân tử điện tích dương dạng sợi xoắn như nisin, lacticin 3147 gây thủng màng tế bào) và phân lớp Ib (phân tử hình cầu 2–3 kDa như mersacidin ức chế sinh tổng hợp thành tế bào peptidoglycan).
• Lớp II (Non-Lantibiotic): Các peptide có trọng lượng phân tử <10 kDa, không chứa lanthionine, chia thành IIa (hoạt tính kháng Listeria mạnh như pediocin PA-1, sakacin A), IIb (hệ hai peptide hiệp đồng như lacticin F, lactococcin G) và IIc (peptide xoắn lưỡng tính dạng vòng như gassericin A, carnocyclin A tạo lỗ thủng qua màng).
• Lớp III: Các protein kháng khuẩn có khối lượng phân tử lớn (>30 kDa), không bền với nhiệt độ cao (ví dụ: helveticin J từ L. helveticus 481, lactacin B từ L. acidophilus).
• Lớp IV: Các phức hợp protein liên kết với nhóm ngoại lipid hoặc carbohydrate (như leuconocin S, lactocin 27).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Đề tài sử dụng phương pháp nghiên cứu thực nghiệm trong phòng thí nghiệm vi sinh và sinh học phân tử, bao gồm các quy trình chuẩn:

1. Phương pháp thu thập và phân lập mẫu: Mẫu ruột cá được làm sạch bằng nước muối sinh lý 0,9% ở 4°C, nghiền mịn vô trùng và pha loãng theo nồng độ từ $10^{-2}$ đến $10^{-4}$, sau đó cấy gạt trên môi trường De Man, Rogosa and Sharpe (MRS) thạch có bổ sung 0,5% $\text{CaCO}_3$, ủ ở 37°C trong 24–48 giờ. Tuyển chọn các khuẩn lạc màu trắng đục có vòng phân giải $\text{CaCO}_3$ rõ rệt.
2. Phương pháp khảo sát đối kháng (khuếch tán giếng thạch): Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau 48 giờ trong môi trường MRS lỏng được ly tâm lạnh (6.000 vòng/phút, 4°C, 20 phút), thu dịch nổi và trung hòa pH về 6,5 bằng dung dịch NaOH để loại bỏ tác động ức chế của acid hữu cơ. Nhỏ 100 µl dịch xử lý vào các giếng thạch trên đĩa môi trường Luria Bertani (LB) đã trang sẵn vi khuẩn chỉ thị Staphylococcus aureus, giữ ở 4°C trong 2 giờ để khuếch tán trước khi ủ ở 30°C trong 12 giờ. Hoạt tính được tính qua đường kính vòng vô khuẩn: $$\text{ĐK (mm)} = D - d$$ (trong đó $D$ là đường kính vòng ức chế, $d$ là đường kính lỗ thạch).
3. Phương pháp xác định bản chất bacteriocin:
   • Xử lý nhiệt độ: Dịch nổi sau ly tâm đã trung hòa pH được ủ ở các mức nhiệt độ 60°C, 80°C, 100°C trong 30 phút và 121°C trong 15 phút (hấp vô trùng), sau đó đánh giá hoạt tính kháng khuẩn còn lại.
   • Xử lý enzyme thủy phân: Dịch vi khuẩn được ủ với enzyme Proteinase K (nồng độ 10 mg/ml) ở 37°C trong 2 giờ, đun ở 100°C trong 5 phút để bất hoạt enzyme trước khi thử nghiệm khuếch tán thạch.
4. Phương pháp thử nghiệm hóa sinh và đặc tính sinh học: Kiểm tra hình thái tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram; kiểm tra khả năng di động trên môi trường thạch mềm (0,5% agar); kiểm tra enzyme catalase; kiểm tra khả năng khử nitrate ($\text{NO}_3^-$ thành $\text{NO}_2^-$) sử dụng thuốc thử Grien A (acid sulfanilic) và Grien B (naphtylamin).
5. Phương pháp sinh học phân tử và định danh gen: Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp phenol-chloroform-isoamylalcohol (25:24:1 và 24:1); thực hiện phản ứng khuếch đại gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi phổ biến 27F (mồi xuôi) và 1492R (mồi ngược); điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% trong đệm TAE 1X; giải trình tự nucleotide và so sánh độ tương đồng bằng công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI); xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm MEGA X với thuật toán bootstrap.
6. Phương pháp đánh giá chỉ tiêu probiotic:
   • Thể tích ức chế tối thiểu (MIC-volume): Khảo sát dải thể tích dịch nổi từ 20 µl, 40 µl, 60 µl, 80 µl đến 100 µl đối với S. aureus.
   • Khả năng chịu muối mật: Nuôi cấy chủng vi khuẩn trong môi trường MRS lỏng bổ sung muối mật (bile salt) ở các nồng độ từ 0,0% đến 0,8%, đo mật độ quang $\text{OD}_{600}$ tại các thời điểm 0h, 12h, 24h và 48h.
   • Khả năng chịu acid dạ dày: Nuôi cấy thu sinh khối, rửa tế bào và chuyển vào môi trường MRS lỏng có pH được điều chỉnh từ 1 đến 4, đo mật độ quang $\text{OD}_{620}$ tại các mốc 0h, 3h, 6h và 9h.

---

Nội dung chính theo từng chương

Tổng quan tài liệu

Chương này hệ thống hóa các kiến thức cơ bản về vi khuẩn Lactobacillus và các peptide kháng khuẩn bacteriocin:

• Khái quát về vi khuẩn Lactobacillus: phân loại sinh học, đặc điểm hình thái trực khuẩn Gram dương, catalase âm tính, vai trò chuyển hóa đường thành acid lactic, vị trí cư trú trong đường tiêu hóa người và động vật, cùng các ứng dụng probiotic và bảo quản thực phẩm đạt chuẩn GRAS.
• Lịch sử nghiên cứu bacteriocin: khởi nguồn từ phát hiện "Principe V" của Gratia năm 1925 trên E. coli, định danh thuật ngữ "colicin" (1946) và sự phát triển của thuật ngữ "bacteriocin" từ năm 1953 cho đến nay.
• Phân loại cấu trúc và sinh hóa: phân tích 4 lớp bacteriocin kèm dẫn chứng cụ thể về độ bền nhiệt, dải pH hoạt động và độ nhạy cảm với các enzyme protease (như Trypsin, Pepsin, Chymotrypsin, Pronase P).
• Cơ chế ức chế vi sinh vật: cơ chế tác động lên màng tế bào (tạo lỗ thủng màng, khử cực màng, gắn kết phân tử lipid II ngăn cản tổng hợp peptidoglycan) và cơ chế nội bào (ức chế men RNA polymerase như MccJ25, DNA gyrase như microcin B17, aspartyl-tRNA synthetase hoặc hoạt tính nuclease phân cắt DNA/RNA tế bào đích).
• Ứng dụng thực tiễn: tổng hợp các ứng dụng của nisin, pediocin, divercin trong bảo quản thực phẩm, màng bọc nano kháng khuẩn, phòng chống viêm vú bò trong thú y (Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae) và chế phẩm thúc đẩy sinh trưởng ở cây trồng.
• Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước: điểm qua các công trình phân lập Lactobacillus plantarum UL487 (Đồng Thị Hoàng Anh & cs., 2017), Lactobacillus suntoryeus LH5 trên cá tra (Nguyễn Văn Thành & Nguyễn Ngọc Trai, 2012), Lactobacillus acidophilus DC1.8 từ dưa chua (Hà Thị Quyên & Hòa Thị Minh Tú, 2016), cũng như các nghiên cứu quốc tế về bacteriocin phân lập từ ruột tôm (L. plantarum, Karthikeyan & cs., 2009) và sữa chua (L. helveticus, L. plantarum, Hassan & cs., 2020).

Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết quy chuẩn nguyên vật liệu, địa điểm, thiết bị và các bước thực nghiệm:

• Địa điểm và thời gian: Thực hiện tại PTN Bộ môn Công nghệ Vi sinh từ tháng 03/2022 đến 09/2022.
• Nguồn gốc mẫu: 9 mẫu ruột cá thu thập tại Bắc Giang (4 mẫu), Thái Bình (3 mẫu) và Nam Định (2 mẫu).
• Thành phần môi trường: Môi trường MRS đặc/lỏng (glucose 20 g/l, cao nấm men 5 g/l, Tween 80 1 ml, $\text{K}_2\text{HPO}_4$ 2 g/l) và môi trường LB đặc/lỏng (peptone 10 g/l, cao nấm men 5 g/l).
• Thiết lập quy trình phản ứng PCR: Chu trình nhiệt gồm giai đoạn biến tính ban đầu 95°C trong 5 phút; tiếp nối 29 chu kỳ gồm biến tính 94°C (30 giây), gắn mồi 54°C (30 giây), kéo dài 72°C (1 phút); giai đoạn kéo dài cuối cùng 72°C trong 10 phút và giữ mẫu ở 4°C.
• Quy trình chuẩn hóa đo lường hoạt tính đối kháng và các chỉ số sinh lý (chịu nhiệt, chịu enzyme, chịu muối mật, chịu acid) nhằm đảm bảo tính lặp lại của thí nghiệm.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương này trình bày toàn bộ số liệu thu được từ các chuỗi thực nghiệm:

Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn đối kháng

Từ 9 mẫu ruột cá ban đầu, nghiên cứu đã phân lập được 95 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải $\text{CaCO}_3$ trên môi trường MRS sau 12 giờ nuôi cấy. Kết quả nhuộm Gram sơ bộ phân tách quần thể thành 59 chủng cầu khuẩn Gram dương và 36 chủng trực khuẩn Gram dương.

Địa phương lấy mẫu	Số lượng mẫu	Ký hiệu chủng phân lập	Tổng số chủng
Bắc Giang	4	L1 đến L46	46
Thái Bình	3	L47 đến L74	28
Nam Định	2	L75 đến L95	21
Tổng cộng	9	L1 đến L95	95

Khi thực hiện thử nghiệm đối kháng khuếch tán giếng thạch với dịch nổi đã trung hòa pH 6,5, có 20/95 chủng thể hiện hoạt tính kháng chủng kiểm định Staphylococcus aureus. Trong đó, 4 chủng đạt đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất:

• Chủng L4: $21 \pm 1\text{ mm}$
• Chủng L19: $21 \pm 1,73\text{ mm}$
• Chủng L18: $20 \pm 1\text{ mm}$
• Chủng L80: $20 \pm 1\text{ mm}$ (Các chủng còn lại có đường kính vòng kháng dao động trong khoảng từ $16 \pm 1,5\text{ mm}$ đến $19\text{ mm}$).

Xác định bản chất sinh bacteriocin

• Thử nghiệm chịu nhiệt: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn sau khi ủ dịch nổi ở 60°C, 80°C, 100°C và 121°C:
  • Chủng L15 và L83 mất hoạt tính hoàn toàn khi xử lý ở 80°C (kém bền nhiệt).
  • Chủng L5 và L28 mất hoạt tính khi nâng nhiệt độ lên 100°C.
  • Chủng L18 duy trì được hoạt tính kháng khuẩn ổn định từ 60°C đến 100°C trong 30 phút và chỉ bị bất hoạt hoàn toàn tại 121°C (15 phút).
  • 15 chủng còn lại (L1, L4, L6, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L16, L17, L19, L80, L81, L94, L95) vẫn giữ nguyên hoạt tính sau khi hấp ở 121°C, chứng tỏ tác nhân ức chế của các chủng này không phải là protein.
• Thử nghiệm với enzyme Proteinase K: Sau khi xử lý dịch ly tâm với Proteinase K (10 mg/ml), chỉ có 5 chủng bị mất hoàn toàn hoạt tính kháng khuẩn gồm: L5, L15, L18, L28 và L83. Điều này khẳng định hoạt chất kháng khuẩn do 5 chủng này tiết ra có bản chất là protein (bacteriocin).
• Chủng vi khuẩn L18 được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu sâu vì vừa có hoạt tính ức chế mạnh, vừa có độ bền nhiệt cao (chịu được 100°C).

Đặc điểm sinh học và định danh chủng L18

• Đặc tính hình thái và hóa sinh: Chủng L18 là trực khuẩn Gram dương, có khả năng phân giải $\text{CaCO}_3$, có khả năng sinh acid lactic, phản ứng catalase âm tính, có khả năng di động và có phản ứng khử nitrate dương tính (xuất hiện màu đỏ với thuốc thử Grien A/B). Các đặc điểm này tương đồng với các đặc trưng chi Lactobacillus.
• Định danh phân tử: Phản ứng PCR đoạn gen 16S rRNA của chủng L18 với cặp mồi 27F/1492R cho sản phẩm khuếch đại đơn băng rõ nét có kích thước khoảng 1500 bp. So sánh trình tự trên BLAST cho thấy mức độ tương đồng nucleotide đạt 99,43% với chủng Lactobacillus fermentum strain IMAU32653. Cây phát sinh loài dựng bằng MEGA X xếp L18 nằm chung nhánh với L. fermentum IMAU32653 với hệ số bootstrap 83. Do đó, chủng được đặt tên khoa học là Lactobacillus fermentum L18.

Đặc tính kiểm tra	Chủng vi khuẩn L18	Chuẩn chi Lactobacillus sp.
Khả năng phân giải $\text{CaCO}_3$	Dương tính (+)	Dương tính (+)
Khả năng sinh acid	Dương tính (+)	Dương tính (+)
Khả năng sinh catalase	Âm tính (-)	Âm tính (-)
Hình thái và nhuộm Gram	Trực khuẩn, Gram dương (+)	Trực khuẩn, Gram dương (+)
Khả năng di động	Dương tính (+)	Dương tính (+)
Khả năng khử Nitrate	Dương tính (+)	Dương tính (+)

Thể tích ức chế tối thiểu và các đặc tính probiotic của chủng L18

• Thể tích ức chế tối thiểu: Đường kính vòng vô khuẩn tăng tỷ lệ thuận với thể tích dịch nổi: thể tích 100 µl cho vòng kháng $19 \pm 1,53\text{ mm}$; 80 µl đạt $14 \pm 1\text{ mm}$; 60 µl đạt $13 \pm 1\text{ mm}$; 40 µl đạt $9 \pm 1,53\text{ mm}$. Tại thể tích 20 µl, chủng vi khuẩn kiểm định không bị ức chế. Như vậy, thể tích ức chế tối thiểu xác định được là 40 µl.
• Khả năng chịu muối mật: Chủng L. fermentum L18 sinh trưởng tốt trong dải nồng độ muối mật từ 0,0% đến 0,4% (mật độ quang tăng mạnh trong 24–48 giờ). Ở nồng độ 0,5%, chủng phát triển từ 12–24 giờ nhưng suy giảm sau 48 giờ. Ở dải nồng độ cao (0,6% – 0,8%), mật độ quang thấp cho thấy khả năng dung nạp kém.
• Khả năng chịu acid dạ dày: Mật độ quang $\text{OD}_{620}$ của chủng L18 tăng đều ở tất cả các mức pH thử nghiệm từ 1 đến 4 trong suốt khoảng thời gian theo dõi từ 3 đến 9 giờ, khẳng định khả năng tồn tại qua môi trường acid dịch vị đường tiêu hóa.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng chính của công trình

Chỉ số / Đặc tính	Kết quả thực nghiệm ghi nhận
Số lượng chủng LAB phân lập	95 chủng (46 từ Bắc Giang, 28 từ Thái Bình, 21 từ Nam Định)
Số chủng có hoạt tính đối kháng S. aureus	20 chủng (đường kính vòng kháng từ $16 \pm 1,5\text{ mm}$ đến $21 \pm 1,73\text{ mm}$)
Số chủng sinh chất kháng khuẩn bản chất protein	5 chủng (L5, L15, L18, L28, L83)
Độ bền nhiệt của bacteriocin chủng L18	Ổn định ở 60°C – 100°C trong 30 phút; mất hoạt tính ở 121°C
Định danh phân tử chủng L18	Lactobacillus fermentum (đồng nhất 99,43% với strain IMAU32653, gen 16S rRNA ~1500 bp)
Thể tích ức chế tối thiểu (MIC-volume) của L18	40 µl (đường kính vòng kháng $9 \pm 1,53\text{ mm}$)
Ngưỡng dung nạp muối mật của L18	Tốt ở dải nồng độ 0,0% – 0,4% (sau 24–48 giờ)
Khả năng chịu acid dạ dày của L18	Sinh trưởng và duy trì mật độ tốt ở dải pH từ 1 đến 4 (từ 3 đến 9 giờ)

Giải pháp và kiến nghị đề xuất từ tác giả

• Tác giả kiến nghị tiếp tục nghiên cứu khảo sát các điều kiện môi trường nuôi cấy thích hợp (nhiệt độ, pH, thành phần nguồn carbon, nguồn nitơ) nhằm tối ưu hóa hiệu suất sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Lactobacillus fermentum L18.

Đóng góp học thuật và thực tiễn

• Bổ sung vào nguồn gen vi sinh vật bản địa một chủng vi khuẩn acid lactic (Lactobacillus fermentum L18) phân lập trực tiếp từ đường ruột động vật thủy sản tại Việt Nam, sở hữu hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với vi khuẩn Gram dương gây bệnh.
• Chứng minh hoạt chất kháng khuẩn của chủng L18 có bản chất là bacteriocin bền nhiệt (chịu được 100°C), đồng thời xác nhận chủng có các đặc tính sinh học probiotic quan trọng (chịu muối mật đến 0,4% và chịu acid pH 1–4), mở ra tiềm năng ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học thay thế kháng sinh trong chăn nuôi thủy sản.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của khóa luận:
  • Phạm vi khảo sát hoạt tính đối kháng mới chỉ thực hiện in vitro trên một đối tượng vi khuẩn kiểm định chỉ thị là Staphylococcus aureus, chưa mở rộng kiểm tra trực tiếp trên các vi khuẩn gây bệnh thủy sản chuyên biệt khác (như Aeromonas hydrophila, Vibrio, Edwardsiella).
  • Nghiên cứu dừng lại ở mức dịch chiết thô, chưa tiến hành tinh sạch phân đoạn bacteriocin và chưa xác định khối lượng phân tử phân tích bằng SDS-PAGE hoặc giải mã trình tự peptide.
  • Các thử nghiệm probiotic mới thực hiện trong điều kiện in vitro mô phỏng, chưa tiến hành thử nghiệm in vivo (bổ sung vào thức ăn đánh giá tỷ lệ sống của cá).
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy và điều kiện lên men để thu nhận bacteriocin đạt hoạt độ cao nhất.
  • Tinh sạch bacteriocin bằng sắc ký và phân tích cấu trúc phân tử.
  • Đánh giá khả năng ức chế trên phổ rộng các vi khuẩn gây bệnh thủy sản và thử nghiệm thực địa bổ sung chủng L. fermentum L18 vào khẩu phần ăn của cá nuôi.

---

Giá trị tham khảo

Bản khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho:

• Sinh viên và học viên cao học ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học, Bệnh học Thủy sản và Chăn nuôi Thú y: Cung cấp quy trình thực nghiệm chuẩn mực về phân lập vi khuẩn acid lactic, kỹ thuật sàng lọc hoạt chất sinh học (khuếch tán giếng thạch, xử lý nhiệt, xử lý enzyme protease) và quy trình định danh phân tử dựa trên gen 16S rRNA.
• Các nhà nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học: Cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm về các đặc tính sinh lý đường ruột (chịu acid pH thấp từ 1 đến 4, chịu muối mật đến 0,4%) của chủng Lactobacillus fermentum nguồn gốc thủy sản để thiết kế công thức probiotic dạng bột hoặc dịch bổ sung thức ăn chăn nuôi.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Nghiên cứu sử dụng phương pháp nào để chứng minh hoạt chất kháng khuẩn do chủng L18 tiết ra có bản chất là bacteriocin chứ không phải do acid lactic hay các chất khác?
Tác giả đã thực hiện 3 bước kiểm chứng: (1) Trung hòa dịch nổi nuôi cấy về pH 6,5 bằng dung dịch NaOH để triệt tiêu hoàn toàn tác dụng ức chế của acid lactic; (2) Xử lý nhiệt độ cao (hoạt tính mất hoàn toàn ở 121°C do biến tính protein); (3) Xử lý dịch vi khuẩn với enzyme phân giải protein Proteinase K (10 mg/ml) làm mất hoàn toàn vòng kháng khuẩn, chứng minh chất kháng khuẩn có cấu trúc chuỗi peptide/protein.

2. Đoạn gen 16S rRNA của chủng L18 sau khi khuếch đại PCR có kích thước bao nhiêu và có độ tương đồng với loài nào trên GenBank?
Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 27F/1492R có kích thước khoảng 1500 bp. Kết quả phân tích BLAST đối chiếu trình tự nucleotide cho thấy chủng L18 có độ tương đồng 99,43% với chủng Lactobacillus fermentum strain IMAU32653 và nằm chung nhánh trên cây phát sinh loài (bootstrap 83).

3. Khả năng chịu nhiệt của chất kháng khuẩn do chủng L18 sinh ra đạt mức nào so với các chủng khác trong nghiên cứu?
Trong 5 chủng sinh chất kháng khuẩn có bản chất protein (L5, L15, L18, L28, L83), chủng L18 có độ bền nhiệt cao nhất khi duy trì được hoạt tính kháng khuẩn sau khi ủ ở dải nhiệt độ từ 60°C đến 100°C trong 30 phút, trong khi L15, L83 mất hoạt tính ở 80°C và L5, L28 mất hoạt tính ở 100°C.

4. Thể tích ức chế tối thiểu của dịch nổi nuôi cấy vi khuẩn L. fermentum L18 đối với S. aureus là bao nhiêu?
Thể tích ức chế tối thiểu xác định được là 40 µl (với đường kính vòng kháng khuẩn $9 \pm 1,53\text{ mm}$). Ở thể tích 20 µl, dịch chiết không còn khả năng ức chế vi khuẩn kiểm định; trong khi ở các thể tích 60 µl, 80 µl và 100 µl đường kính vòng kháng lần lượt đạt $13 \pm 1\text{ mm}$, $14 \pm 1\text{ mm}$ và $19 \pm 1,53\text{ mm}$.

5. Khả năng tồn tại của chủng L. fermentum L18 trong điều kiện mô phỏng đường tiêu hóa (muối mật và acid dạ dày) thể hiện ra sao?
Chủng L. fermentum L18 có khả năng dung nạp muối mật tốt ở dải nồng độ từ 0,0% đến 0,4% qua 24–48 giờ nuôi cấy. Đồng thời, chủng thể hiện khả năng thích ứng cao với môi trường acid dịch vị khi mật độ tế bào ($\text{OD}_{620}$) liên tục tăng trưởng trong suốt 3 đến 9 giờ ở các dải pH khắc nghiệt từ pH 1 đến pH 4.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Hoàng Thảo Minh đã thực hiện thành công việc phân lập 95 chủng vi khuẩn lactic từ 9 mẫu ruột cá và tuyển chọn được chủng Lactobacillus fermentum L18 có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin ức chế mạnh vi khuẩn kiểm định Staphylococcus aureus. Hoạt chất kháng khuẩn của chủng L18 có bản chất là protein với độ bền nhiệt cao (duy trì hoạt tính ở 100°C trong 30 phút) và thể tích ức chế tối thiểu đạt 40 µl. Bên cạnh đó, chủng L. fermentum L18 thể hiện các đặc tính probiotic thích ứng với đường tiêu hóa nhờ khả năng dung nạp muối mật đến 0,4% và chịu được dải pH acid từ 1 đến 4. Đây là công trình thực nghiệm vi sinh có số liệu rõ ràng, cung cấp cơ sở khoa học cho định hướng ứng dụng vi khuẩn lactic bản địa trong sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ ngành nuôi trồng thủy sản.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Nuôi trồng thủy sản nổi lên như một ngành phát triển nhanh nhất vì nó cung cấp protein động vật chất lượng cao để tăng cường dinh dưỡng và lương thực. Sản lượng nuôi trồng thủy sản toàn cầu đã tăng từ 148 triệu tấn (năm 2010) lên đến 178 triệu tấn (năm 2018) (FAO, 2018). Bên cạnh với sự phát triển đó ngành nuôi trồng thủy sản đang gặp phải một số hạn chế làm giảm tốc độ phát triển như sự bùng phát các bệnh truyền nhiễm - vi khuẩn, dẫn đến sản lượng cá bị giảm sút. Các đợt bùng phát dịch bệnh thường do các chủng vi khuẩn gây bệnh thuộc các chi như: Staphylococcus (gây xuất huyết vây và xương nắp mang), Aeromonas (gây bệnh xuất huyết trên cá), Vibrio (gây bệnh nhiễm khuẩn máu), Edwardsiella (bệnh mủ gan trên cá), Pseudomonas (gây nhiễm khuẩn huyết) (Defoirdt & cs.

Để giải quyết những vấn đề này, thuốc kháng sinh đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều năm để chống lại các bệnh đó và các chất kích thích tăng trưởng cũng đã được áp dụng để cải thiện năng suất vật nuôi trong nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc kháng sinh trong thời gian dài gây nhiều hậu quả nghiêm trọng, ảnh hưởng đến sức khỏe con người, làm thay đổi trong hệ vi sinh vật của các hệ thống nuôi trồng thủy sản, gây ra hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn (Resende & cs., 2012) và thậm chí ảnh hưởng đến vi khuẩn có lợi tự nhiên. Hiện nay, chế phẩm sinh học đang được xem là giải pháp hữu hiệu để ngăn chặn các mầm bệnh và kiểm soát dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản. Trong đó, chủng vi khuẩn Lactobacillus đóng vai trò quan trọng do cải thiện khả năng miễn dịch, cân bằng hệ vi sinh đường ruột và tiết ra chất kháng khuẩn như acid lactic, bacteriocin… để ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh (Badina, 2013; Maeda & cs.

Bacteriocin là các peptit hoặc protein kháng khuẩn được tổng hợp theo con đường ribosome ở vi khuẩn Gram âm và Gram dương. Bacteriocin không 1 được coi là một nhóm kháng sinh vì chúng thể hiện phổ kháng khuẩn chống lại các chủng của các loài có quan hệ họ hàng gần. Trong khi kháng sinh là chất kháng khuẩn giúp tiêu diệt và ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn gây bệnh, ngay cả khi hoạt tính của kháng sinh bị hạn chế, nó không cho thấy bất kỳ tác dụng ưu tiên nào đối với các loài có họ hàng gần (Walsh & cs. Vì vậy bacteriocin hiện được xem như là hợp chất tiềm năng nhằm thay thế cho kháng sinh trong nuôi trồng thuỷ sản.

Từ những điều thực tế trên, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn Lactobacillus sinh bacteriocin từ thủy sản”. Mục đích và nội dụng nghiên cứu 1. Mục đích Tuyển chọn chủng vi khuẩn Lactobacillus sinh bacteriocin từ thủy sản. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học chủng tuyển chọn.

Đối tượng nghiên cứu Chủng vi khuẩn Lactobacillus sinh bacteriocin được phân lập từ thủy sản. Nội dung nghiên cứu - Phân lập vi khuẩn Lactobacillus từ thủy sản. - Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Lactobacillus có khả năng đối kháng với vi khuẩn kiểm định. - Khảo sát khả năng sinh bacteriocin với các chủng vi khuẩn được tuyển chọn.

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Khái quát về vi khuẩn Lactobacillus 2. Khái niệm về Lactobacillus Lactobacillus (Lactobacilli) là vi khuẩn acid lactic, thuộc họ Lactobacillaceae.

Chúng là những trực khuẩn Gram dương, không hình thành bào tử, catalase âm tính, có khả năng di động. Chúng sản sinh ra các peptit kháng khuẩn và các protein nhỏ gọi là bacteriocin (Messaoudi & cs.