Luận án nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc xin phòng bệnh cho cá mú epinephelus spp

Nghiên cứu đặc tính sinh học vi rút gây hoại tử thần kinh và phát triển kháng nguyên tái tổ hợp cho vắc xin phòng bệnh cá mú Epinephelus spp.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thanh
• Người hướng dẫn: PGS. Phạm Công Hoạt
• Trường học: Viện Đại học Mở Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu vi rút hoại tử thần kinh và phát triển vắc xin cho cá mú
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Một số đặc điểm sinh học của cá mú
• 1.2. Hệ thống phân loại cá mú
• 1.3. Đặc điểm phân bố
• 1.4. Đặc điểm sinh trưởng
• 1.5. Đặc điểm sinh sản
• 1.6. Đặc điểm về hệ miễn dịch ở cá mú
• 1.7. Ý nghĩa kinh tế và tình hình nuôi cá mú
• 1.8. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới và Việt Nam
• 1.8.1. Đặc điểm của bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển
• 1.8.2. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới
• 1.8.3. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam
• 1.8.4. Các phương pháp chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh trên cá
• 1.8.5. Tổng quan về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh
• 1.8.6. Một số biện pháp phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú
• 2. KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP VÀ TÌNH HÌNH SỬ DỤNG VẮC-XIN PHÒNG BỆNH CHO CÁ
• 2.1. Kháng nguyên tái tổ hợp của tác nhân gây bệnh
• 2.2. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá trên thế giới
• 2.3. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá tại Việt Nam
• 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Nội dung nghiên cứu
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Nhóm các phương pháp cho nội dung xác định vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú
• 3.3.1.1. Phương pháp thu và xử lý mẫu
• 3.3.1.2. Phương pháp mô bệnh học
• 3.3.1.3. Phương pháp phân lập vi rút bằng kỹ thuật nuôi cấy trên tế bào
• 3.3.1.4. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
• 3.3.1.5. Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)
• 3.3.1.6. Điện di axit nucleic trên gel agarose
• 3.3.1.7. Phương pháp tách dòng gen
• 3.3.1.8. Phương pháp xác định đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh (NNV)
• 3.3.1.9. Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên tế bào GS1
• 3.3.1.10. Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên cá mú
• 3.3.1.11. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút trên tế bào GS1
• 3.3.1.12. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút trên cá mú
• 3.3.2. Nhóm các phương pháp biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên và đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp
• 3.3.2.1. Chuẩn bị vector pET32a+ để thực hiện phản ứng nối gen
• 3.3.2.2. Nối gen T4 vào vector pET32a+
• 3.3.2.3. Chuyển gen vào E. coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET32a+-T4
• 3.3.2.4. Tách chiết plasmid từ các khuẩn lạc sau biến nạp chuẩn bị cho kiểm tra bằng PCR và enzyme giới hạn
• 3.3.2.5. Phương pháp điện di SDS-PAGE
• 3.3.2.6. Phương pháp Western blot
• 3.3.2.7. Phương pháp đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hòa của kháng nguyên tái tổ hợp
• 3.3.2.8. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam
• 4.2. Sàng lọc mẫu nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp mô bệnh học
• 4.3. Xác định mẫu cá nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp RT-PCR
• 4.4. Xác định vi rút gây bệnh trên tế bào
• 4.5. Giải trình tự gen mã hóa kháng nguyên T4 của NNV
• 4.6. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú
• 4.6.1. Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào
• 4.6.2. Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú
• 4.6.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào GS1
• 4.6.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú
• 4.7. Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú
• 4.7.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+- T4
• 4.7.2. Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên T4 của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh
• 4.7.2.1. Tạo chủng vi khuẩn E.coli BL21(DE3) mang gen mã hóa kháng nguyên của NNV
• 4.7.2.2. Biểu hiện gen T4 trong tế bào vi khuẩn tái tổ hợp
• 4.7.2.3. Đánh giá các điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên T4 của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh
• 4.7.3. Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp
• 4.7.4. Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp
• 4.7.4.1. Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp trên thỏ
• 4.7.4.2. Đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp trên cá mú
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN TIẾN SĨ
• DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về vi rút hoại tử thần kinh

Bệnh hoại tử thần kinh (Viral Nervous Necrosis - VNN) là một trong những bệnh nghiêm trọng nhất ảnh hưởng đến cá mú. Vi rút gây bệnh thuộc họ Betanodavirus, có khả năng tấn công cá ở mọi giai đoạn phát triển. Tại Việt Nam, tỷ lệ cá mú nhiễm vi rút này có thể lên tới 82%. Bệnh thường xuất hiện từ tháng 5 đến tháng 10, khi nhiệt độ nước từ 24 đến 30ºC. Các triệu chứng bao gồm rối loạn thần kinh, bơi mất thăng bằng và tỷ lệ chết cao từ 80-100%. Việc nghiên cứu về vi rút này là cần thiết để phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

1.1. Đặc điểm của bệnh hoại tử thần kinh

Bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú có những đặc điểm nổi bật như tỷ lệ chết cao và khả năng lây lan nhanh chóng. Vi rút có thể gây ra các triệu chứng như bơi xoay tròn, đầu chúc xuống dưới, và nằm dưới đáy bể. Tình hình dịch bệnh đang gia tăng, đòi hỏi cần có các biện pháp phòng bệnh hiệu quả. Việc xác định vi rút gây bệnh và nghiên cứu các đặc tính sinh học của nó là rất quan trọng để phát triển vắc xin.

II. Phát triển vắc xin cho cá mú

Việc phát triển vắc xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú là một nhiệm vụ cấp thiết. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng cá mú có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch tốt khi tiếp xúc với kháng nguyên. Kháng nguyên tái tổ hợp protein T4 của vi rút gây bệnh đã được sản xuất và đánh giá khả năng kích thích sinh miễn dịch. Kết quả cho thấy kháng nguyên này có thể tạo ra đáp ứng miễn dịch bền vững cho cá mú, mở ra cơ hội cho việc sản xuất vắc xin hiệu quả.

2.1. Kháng nguyên tái tổ hợp và khả năng sinh miễn dịch

Kháng nguyên tái tổ hợp protein T4 đã được tạo ra từ vi rút gây hoại tử thần kinh. Nghiên cứu cho thấy kháng nguyên này có khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ trên cá mú. Đánh giá khả năng tạo kháng thể cho thấy kháng nguyên này có thể bảo vệ cá mú trong thời gian dài, từ 60 đến 90 ngày sau khi tiêm. Điều này chứng tỏ rằng kháng nguyên tái tổ hợp có tiềm năng lớn trong việc phát triển vắc xin phòng bệnh cho cá mú.

III. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin khoa học về vi rút hoại tử thần kinh mà còn có ý nghĩa thực tiễn quan trọng trong ngành thủy sản. Việc phát triển vắc xin sẽ giúp giảm thiểu thiệt hại do dịch bệnh gây ra, tăng sản lượng cá nuôi và đảm bảo sự phát triển bền vững cho nghề nuôi cá mú. Dữ liệu từ nghiên cứu sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo và ứng dụng trong thực tiễn nuôi trồng thủy sản.

3.1. Đóng góp mới của nghiên cứu

Nghiên cứu này là công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu toàn diện về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú. Các đặc tính sinh học của vi rút đã được xác định, cùng với khả năng gây bệnh trên tế bào và cá mú. Việc tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp protein T4 mở ra hướng đi mới cho việc sản xuất vắc xin, góp phần quan trọng trong việc phòng ngừa dịch bệnh cho cá mú.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh hoại tử thần kinh (Viral Nervous Necrosis - VNN), hay còn gọi là bệnh não và võng mạc do vi rút (Viral Encephalopathy and Retinopathy - VER), do tác nhân Betanodavirus thuộc họ Nodaviridae gây ra, là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất đối với cá biển nuôi trên phạm vi toàn cầu và tại Việt Nam. Bệnh có khả năng tấn công cá ở tất cả các giai đoạn phát triển, từ cá bột, cá hương, cá giống đến cá thương phẩm, gây tỷ lệ chết từ 50% đến 100% trong khoảng thời gian 3-5 ngày. Tại Việt Nam, cá mú (Epinephelus spp.) là đối tượng nuôi biển chủ lực với sản lượng đạt trên 3.000 tấn/năm và giá trị thương phẩm ước tính trên 300 tỉ đồng, phân bố tập trung ở các tỉnh ven biển như Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Nghệ An, Khánh Hòa, Phú Yên, Bình Thuận. Tuy nhiên, các khảo sát dịch tễ cho thấy tỷ lệ cá mú nhiễm vi rút hoại tử thần kinh (NNV) trong các đợt bùng phát dịch bệnh tại một số vùng nuôi lên tới 82,8%.

Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định xuất phát từ thực trạng: các biện pháp phòng chống bệnh VNN hiện nay chủ yếu dựa vào xử lý môi trường, sát trùng nguồn nước và cách ly nguồn bệnh nhưng hiệu quả kiểm soát dịch bệnh còn hạn chế. Các nghiên cứu về vắc-xin tại Việt Nam trước đây chủ yếu tập trung vào vi khuẩn gây bệnh trên cá nước ngọt hoặc vắc-xin vô hoạt từ vi rút nuôi cấy mô tế bào. Vắc-xin vô hoạt nuôi cấy trên tế bào có nhược điểm là quy trình nuôi cấy phức tạp, chi phí cao và khó tinh khiết ở quy mô công nghiệp. Việc nghiên cứu toàn diện các đặc tính sinh học của NNV phân lập tại Việt Nam, kết hợp ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp để tạo kháng nguyên protein vỏ làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin thế hệ mới cho cá mú, là vấn đề cấp thiết và chưa từng được công bố trong nước.

Đề tài luận án tiến sĩ: “Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh cho cá mú (Epinephelus spp.)”, do nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thanh thực hiện (bảo vệ năm 2018 tại Viện Đại học Mở Hà Nội, thuộc Đề tài cấp Nhà nước mã số KC04), giải quyết các mục tiêu và phạm vi cụ thể:

Mục tiêu nghiên cứu

1. Xác định được vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam và một số đặc tính sinh học của vi rút gây bệnh.
2. Tạo được kháng nguyên tái tổ hợp và đánh giá khả năng kích thích sinh miễn dịch của kháng nguyên để làm nguyên liệu phục vụ sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh (NNV); kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú; 51 mẫu cá mú nghi nhiễm bệnh hoại tử thần kinh (thuộc các loài cá mú chấm nâu Epinephelus coioides, cá mú cọp Epinephelus fuscoguttatus, cá mú chuột Cromileptes altivelis).
• Phạm vi không gian thu mẫu: 51 mẫu bệnh phẩm được thu thập tại 5 tỉnh, thành phố ven biển của Việt Nam, gồm: Quảng Ninh (8 mẫu, ký hiệu QN1 - QN8), Hải Phòng (11 mẫu, ký hiệu HP1 - HP11), Nam Định (11 mẫu, ký hiệu NĐ1 - NĐ11), Khánh Hòa (9 mẫu, ký hiệu KH1 - KH9), Bình Thuận (12 mẫu, ký hiệu BT1 - BT12).
• Địa điểm thực nghiệm: Phòng thí nghiệm vi sinh, Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội.
• Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 7 năm 2012 đến tháng 5 năm 2015.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tác giả đã điểm lại hệ thống các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến đặc điểm sinh học cá mú, tác nhân Betanodavirus, các phương pháp chẩn đoán và công nghệ vắc-xin phòng bệnh:

Các hướng nghiên cứu quốc tế

• Phân loại và cấu trúc di truyền của Betanodavirus: Nishizawa và cs. (1997) công bố cấu trúc hệ gen phân đoạn gồm RNA1 (3,1 kb mã hóa protein RNA-dependent RNA polymerase - protein A) và RNA2 (1,4 kb mã hóa protein vỏ capsid), đồng thời xác định hai vùng bảo tồn cao trên RNA2 là gen T2 (870 bp) và gen T4 (420 bp). Iwamoto và cs. (2000) phân loại Betanodavirus thành 4 kiểu gen chính: SJNNV (gây bệnh trên cá măng sọc ở 20-25ºC), TPNNV (cá nóc hổ ở 20ºC), BFNNV (cá nước lạnh ở 15-20ºC) và RGNNV (gây bệnh trên các loài cá vùng nước ấm như cá mú, cá chẽm ở 25-30ºC). Bovo và cs. (1999) phân tích chi tiết hạt virion RGNNV đường kính 30 nm, đối xứng 20 mặt (T=3), chứa 180 tiểu phần protein vỏ.
• Dịch tễ và cơ chế truyền lây: Munday và cs. (2002), Doan và cs. (2017) thống kê bệnh VNN xuất hiện trên hơn 70 loài thủy sản, trong đó có 32 loài cá biển. Các đợt bùng phát dịch bệnh trên cá mú được ghi nhận tại Nhật Bản (Fukuda và cs., 1996; Nakai và cs., 1995; Nishizawa và cs., 2012), Thái Lan (Danayadol và cs., 1995), Singapore (Hegde và cs., 2003), Đài Loan (Chi và cs., 2003; Lai và cs., 2001), Hàn Quốc (Sohn và cs., 1998), Indonesia (Zafran và cs., 2001) và Malaysia (Ransangan và cs., 2013). Phương thức lan truyền gồm truyền ngang qua thức ăn tươi sống, nước biển ô nhiễm (Chi và cs., 2003; Tanaka và cs., 2001) và truyền dọc từ bố mẹ sang trứng qua tuyến sinh dục (Arimoto và cs., 1993; Peducasse và cs., 1999).
• Chẩn đoán và phân lập trên dòng tế bào: OIE (2005) chuẩn hóa các phương pháp mô bệnh học nhuộm H&E, RT-PCR và ELISA. Iwamoto và cs. (2000) phát triển dòng tế bào E-11 từ SSN-1. Các dòng tế bào mẫn cảm khác được công bố gồm tế bào SF từ cá chẽm (Chang và cs., 2001), dòng GB từ não cá mú (Lai và cs., 2001) và dòng GS từ lách cá mú Epinephelus coioides (Qin và cs., 2006).
• Nghiên cứu vắc-xin phòng bệnh: Sommerset và cs. (2005), Lorenzen và cs. (2005), Christie và cs. (1997) đánh giá các dạng vắc-xin DNA và protein tái tổ hợp trên cá hồi và cá bơn. Đối với cá mú, Tanaka và cs. (2001) biểu hiện protein vỏ tái tổ hợp trên E. coli; Kai và cs. (2010), Pakingking và cs. (2010) đánh giá vắc-xin bất hoạt formalin trên cá mú chấm nâu và cá mú cọp; Nishizawa và cs. (2012) thử nghiệm vắc-xin sống trên cá mú bảy vạch ở 17ºC.

Kiểu gen	Tuýp huyết thanh	Nhiệt độ tối ưu	Vật chủ chính	Nguồn tham khảo
SJNNV	A	20-25ºC	Cá măng sọc (Striped jack)	Iwamoto và cs., 2000
TPNNV	B	20ºC	Cá nóc hổ (Tiger puffer)	Iwamoto và cs., 2000
BFNNV	C	15-20ºC	Cá nước lạnh (Atlantic halibut, cá tuyết, cá bơn)	Iwamoto và cs., 2000
RGNNV	C	25-30ºC	Cá nước ấm (Cá mú, cá chẽm châu Á, cá chẽm châu Âu)	Iwamoto và cs., 2000

Các hướng nghiên cứu tại Việt Nam

• Phan Thị Vân và Bùi Ngọc Thanh (2004) ghi nhận VNN lần đầu trên cá mú lồng tại Quảng Ninh năm 2002 và Nghệ An, xác định bệnh xuất hiện từ tháng 5 đến tháng 10 khi nhiệt độ nước 25-30ºC. Đỗ Thị Hòa và cs. (2004) mô tả triệu chứng xoay tròn, phồng bóng hơi và tỷ lệ chết 50-100%.
• Nguyễn Ngọc Du và cs. (2005) khảo sát 64 mẫu cá mú giống tại Vũng Tàu, ghi nhận 53 mẫu nhiễm NNV (82,8%). Trần Vĩ Hích và Phạm Thị Duyên (2008) quan sát biến đổi mô học tạo không bào hình tròn và elip (đường kính 4-30 µm) tại não và mắt cá mú nuôi tại Khánh Hòa và Phú Yên.
• Nghiên cứu vắc-xin thủy sản trong nước từng chế tạo thành công vắc-xin vi khuẩn Aeromonas hydrophila cho cá trắm cỏ (Bùi Quang Tề và cs., 2006; Vũ Dũng Tiến và cs., 2003) và vắc-xin Edwardsiella ictaluri cho cá tra (Nguyễn Thị Biên Thùy, 2006). Đối với cá mú, Phạm Thị Tâm và cs. (2015) thuộc Đề tài KC04 đã chế tạo vắc-xin vô hoạt bằng formalin 0,03% phối trộn chất bổ trợ Montanide ISA70 cho hiệu lực bảo vệ trên 83%.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Luận án tập trung giải quyết khoảng trống: thiết lập quy trình phân lập, giám định phân tử đoạn gen T4 của các chủng NNV lưu hành tại các vùng biển Việt Nam; phân tích động học gây bệnh và hiệu ứng bệnh tích tế bào (CPE) trên dòng tế bào GS1 và trên cá mú sống dưới sự biến động của nhiệt độ môi trường; thiết kế hệ thống vector biểu hiện pET32a+-T4 trong tế bào vi khuẩn Escherichia coli BL21(DE3), tối ưu hóa các điều kiện lên men sinh tổng hợp protein T4 tái tổ hợp, tinh sạch và đánh giá hiệu giá kháng thể trung hòa in vitro/in vivo trên thỏ và khả năng bảo hộ miễn dịch kéo dài trên cá mú.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Đặc điểm vi rút học: Betanodavirus có vỏ capsid không màng bao, cấu trúc đối xứng 20 mặt cấu thành từ 180 đơn vị protein vỏ do đoạn RNA2 mã hóa. Kháng nguyên protein T4 nằm trong vùng bảo tồn của vỏ capsid, giữ vai trò nhận diện thụ thể và kích thích cơ thể vật chủ sinh kháng thể trung hòa.
• Cơ chế miễn dịch ở cá biển: Cá mú (Epinephelus spp.) sở hữu hệ thống miễn dịch không đặc hiệu và đặc hiệu dịch thể. Kháng thể dạng Immunoglobulin (chủ yếu là IgM) xuất hiện trong huyết thanh sau 10-15 ngày kể từ khi tiếp xúc kháng nguyên và đạt nồng độ đỉnh sau 20-30 ngày (Kim Văn Vạn và Lê Thanh Hòa, 2009). Thận và lách đóng vai trò là cơ quan lympho ngoại vi tiếp nhận, xử lý và trình diện kháng nguyên.
• Công nghệ DNA tái tổ hợp: Ứng dụng plasmid biểu hiện pET32a+ chứa promoter T7 mạnh, mang đoạn gen mục tiêu T4 để biến nạp vào chủng E. coli BL21(DE3). Quá trình phiên mã được cảm ứng bằng IPTG (isopropyl β-D-thiogalactoside), protein tái tổ hợp được gắn đuôi His-tag hỗ trợ quá trình tinh sạch ái lực.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

51 mẫu cá mú nghi nhiễm VNN (5 tỉnh ven biển)
   Đánh giá đặc tính sinh học của NNV
   - Độc lực & hiệu ứng bệnh tích tế bào (CPE, TCID50)
   - Độc lực trên cá mú sống (tỷ lệ chết, biểu hiện thần kinh)
   - Khảo sát nhiệt độ: 28ºC ổn định vs. 28ºC ngày / 24ºC đêm
   Tạo kháng nguyên tái tổ hợp Protein T4
   - Cắt/nối tạo vector biểu hiện pET32a+-T4 bằng enzym EcoRI & T4 ligase
   - Tối ưu hóa biểu hiện (Nhiệt độ, thời gian, nồng độ IPTG)
   - Kiểm tra bằng SDS-PAGE 15% và Western blot
   - Tinh sạch protein bằng cột sắc ký ái lực Nikel chelating Resin
   Đánh giá đáp ứng miễn dịch
   - Đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hòa trên mô hình thỏ thí nghiệm
   - Đánh giá hiệu giá kháng thể và mức độ bảo hộ in vivo trên cá mú đến ngày 90

1. Nhóm phương pháp xác định vi rút gây bệnh:

   • Thu và xử lý mẫu: 51 mẫu mắt và não cá nghi nhiễm VNN được nghiền đồng hóa trong dung dịch muối cân bằng Hanks (HBSS) theo tỷ lệ 1:10, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4ºC, lọc dịch nổi qua màng lọc 0,25 µm (Hegde và cs., 2003).
   • Mô bệnh học: Cố định mẫu bệnh phẩm trong dung dịch Davidson’s (tỷ lệ 1:10), khử nước, đúc khối paraffin, cắt tiêu bản độ dày 4-5 µm, nhuộm màu bằng Hematoxylin - Eosin (H&E) và quan sát tổn thương không bào hóa mô não và võng mạc dưới kính hiển vi quang học (OIE, 2005).
   • Phân lập trên tế bào: Sử dụng dòng tế bào lách cá mú GS1 (Sigma, Đức) nuôi cấy trong môi trường Leibovitz’s (LB) bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê (FCS). Gây nhiễm dịch lọc mô não/mắt lên lớp đơn tế bào đạt độ che phủ 90%, ủ và theo dõi hiệu ứng bệnh tích tế bào (CPE).
   • Sinh học phân tử: Tách chiết RNA tổng số, thực hiện kỹ thuật RT-PCR khuyếch đại đoạn gen T4 thuộc RNA2, điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% nhuộm Ethidium Bromide, tinh sạch sản phẩm PCR và nhân dòng vào vector pGEM-T (Novagen, Mỹ), giải trình tự gen.

2. Phương pháp xác định đặc tính sinh học của NNV:

   • Độc lực trên tế bào và cá mú: Xác định liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy (TCID50) và liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD50).
   • Thí nghiệm ảnh hưởng nhiệt độ: Đánh giá tốc độ phát triển bệnh tích CPE trên tế bào GS1 và tỷ lệ chết trên cá mú sống ở hai chế độ nhiệt: nhiệt độ ổn định 28ºC cả ngày lẫn đêm so với chế độ dao động 28ºC ban ngày và 24ºC ban đêm.

3. Phương pháp biểu hiện gen và đánh giá miễn dịch:

   • Thiết kế vector và biểu hiện: Cắt plasmid pGEM-T-T4 và vector pET32a+ bằng enzym giới hạn EcoRI, thực hiện phản ứng nối gen bằng T4 DNA ligase. Biến nạp vector tái tổ hợp pET32a+-T4 vào E. coli JM109 để nhân dòng, kiểm tra bằng cắt enzym giới hạn và PCR, sau đó chuyển gen vào tế bào biểu hiện E. coli BL21(DE3).
   • Phân tích protein: Cảm ứng biểu hiện bằng IPTG; kiểm tra protein tái tổ hợp bằng điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 15% và lai miễn dịch Western blot với kháng thể đặc hiệu; tinh sạch protein bằng cột sắc ký ái lực Nikel chelating Resin (Invitrogen).
   • Thử nghiệm miễn dịch: Tiêm kháng nguyên T4 tinh sạch cho thỏ và cá mú (Epinephelus coioides). Xác định hiệu giá kháng thể trung hòa in vitro trên tế bào GS1 và đánh giá tỷ lệ bảo hộ in vivo trước thử thách vi rút độc lực cao theo dõi đến ngày thứ 90 sau gây miễn dịch.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương 1 hệ thống hóa toàn diện các kiến thức nền tảng về cá mú, dịch tễ học bệnh VNN và công nghệ sản xuất vắc-xin tái tổ hợp:

• Đặc điểm sinh học và giá trị của cá mú: Trình bày hệ thống phân loại (99 loài thuộc giống Epinephelus, trong đó vùng biển Việt Nam có khoảng 30 loài), đặc điểm phân bố nhiệt độ (22-32ºC, tối ưu 25-30ºC), độ mặn (11-41‰), tập tính chuyển đổi giới tính từ cái sang đực và tốc độ sinh trưởng theo từng giai đoạn phát triển (từ cá bột 1 ngày tuổi dài 2,18 mm đến cá thương phẩm sau 1 năm đạt 0,8 - 1,2 kg). Về kinh tế, giá cá mú đen, chấm nâu đạt 200.000 - 240.000 đ/kg, cá mú chấm đỏ đạt 400.000 - 600.000 đ/kg.
• Đặc tính bệnh lý và phân loại Betanodavirus: Mô tả chi tiết triệu chứng cá bệnh (bơi mất định hướng, xoay tròn, phồng bóng hơi, màu thân sẫm đen), các tổn thương hoại tử hệ thần kinh trung ương và cấu trúc hạt vi rút đường kính 25-30 nm không vỏ bao. Khái quát 4 kiểu gen (SJNNV, TPNNV, BFNNV, RGNNV), trong đó kiểu gen RGNNV thích ứng ở vùng nước ấm (25-30ºC) chiếm ưu thế tuyệt đối tại khu vực Châu Á - Thái Bình Dương.
• Tổng quan công nghệ vắc-xin: Đánh giá các phương pháp phòng bệnh truyền thống (sát trùng nước bằng Ozon 0,2 - 4 µg/ml, ngâm PVP iodine 50 µg/ml, xử lý tia UV 1.000 µW/s.cm2). So sánh ưu nhược điểm của các dạng vắc-xin: vắc-xin vô hoạt, vắc-xin sống giảm độc lực, vắc-xin DNA và protein tái tổ hợp (Bảng 1.3, Bảng 1.4).

Ký chủ	Loại vắc-xin	Giai đoạn cá	Cách dùng	Liều dùng	Thời gian bảo hộ	Nguồn tham khảo
E. akaara	Protein vỏ GNNV	Tiền trưởng thành	In vitro	0,1 ml	8 tuần	Lai và cs., 2001
E. lanceolatus	Bất hoạt formalin	Tiền trưởng thành	Tiêm cơ	$\text{TCID}_{50} = 10^{-7}$	7 ngày	Lorenzen và cs., 2005
E. lanceolatus	Vắc-xin DNA	Tiền trưởng thành	Tiêm cơ	$\text{TCID}_{50} = 10^{-7}$	7 ngày	Lorenzen và cs., 2005
E. lanceolatus	VLPs (Hạt giả vi rút)	Cá giống	Tiêm cơ	10 - 100 µg	2 tuần	Lorenzen và cs., 2005
E. coioides	Protein tái tổ hợp	Ấu trùng	Cho ăn	$\text{TCID}_{50} = 10^{-7}$	35 ngày	Lorenzen và cs., 2005
E. coioides	Bất hoạt formalin	Ấu trùng	Tắm	$\text{TCID}_{50} = 10^{-7}$	30 ngày	Kai và cs., 2010
E. fuscoguttatus	Bất hoạt formalin	Tiền trưởng thành	Tiêm cơ	0,1 ml	75 ngày	Pakingking và cs., 2010
E. septemfasciatus	Vắc-xin sống (17ºC)	Tiền trưởng thành	Ngâm	$\text{TCID}_{50} = 10^{-7}$	-	Nishizawa và cs., 2012

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết vật liệu, trang thiết bị và quy trình các bước thực nghiệm:

• Trình bày nguồn gốc tế bào lách cá mú GS1 (Sigma), plasmid pGEM-T và vector biểu hiện pET32a+ (Novagen), các chủng vi khuẩn E. coli JM109 và E. coli BL21(DE3) (HV Biotek), cột ái lực Nikel chelating Resin (Invitrogen).
• Chi tiết hóa quy trình cố định mẫu bằng dung dịch Davidson's, đúc sáp paraffin, cắt lát 4-5 µm, nhuộm kép Hematoxylin - Eosin phục vụ chẩn đoán mô bệnh học; quy trình tách chiết RNA tổng số và thông số chu nhiệt phản ứng RT-PCR nhân bản đoạn gen T4 kích thước 420 bp.
• Thiết kế bố trí các lô thí nghiệm đánh giá độc lực vi rút trên tế bào GS1 và cá mú sống; quy trình cắt nối plasmid tái tổ hợp bằng enzym EcoRI, chuyển gen, kiểm tra thể biến nạp bằng PCR và cắt enzym giới hạn; quy trình phân tích Western blot và điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 15%.
• Phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch dịch thể in vitro qua phản ứng trung hòa tế bào và in vivo qua tỷ lệ sống sót sau công cường độc trên thỏ và cá mú.

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được theo 3 nội dung trọng tâm:

1. Xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam:

   • Kết quả mô bệnh học phát hiện tổn thương không bào hóa rõ rệt tại tổ chức mô não và võng mạc mắt của các mẫu cá bệnh (Hình 3.1, Bảng 3.1).
   • Kỹ thuật RT-PCR phát hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu đoạn gen T4 của NNV ở các mẫu bệnh phẩm thu thập từ 5 tỉnh ven biển (Hình 3.2, Bảng 3.2).
   • Gây nhiễm dịch lọc bệnh phẩm lên dòng tế bào GS1 cho thấy sự xuất hiện hiệu ứng bệnh tích tế bào (CPE) điển hình sau 3-5 ngày: tế bào co tròn, tạo các mảng không bào, tách rời đáy chai và thoái hóa hoàn toàn (Hình 3.3, Hình 3.4, Bảng 3.3).
   • Giải trình tự đoạn gen T4 phân lập từ mẫu cá bệnh tại Việt Nam cho thấy mức độ đồng nhất và tương đồng nucleotide đạt tỷ lệ rất cao khi so sánh đối chiếu với trình tự chuẩn của Betanodavirus kiểu gen RGNNV trên GenBank mã số HM017077.1 (Bảng 3.4, Hình 3.7).

2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh:

   • Xác định độc lực của vi rút trên dòng tế bào GS1: vi rút nhân lên mạnh, gây hủy hoại hoàn toàn lớp đơn tế bào với mật độ tế bào sống sót giảm mạnh theo thời gian gây nhiễm (Bảng 3.5, Hình 3.8).
   • Độc lực trên cá mú sống: cá cảm nhiễm xuất hiện các dấu hiệu điển hình của bệnh hoại tử thần kinh như bơi mất thăng bằng, xoay tròn, đổi màu thân sẫm đen, bỏ ăn và chết nhanh chóng (Bảng 3.6, Bảng 3.7).
   • Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường: Ở điều kiện nhiệt độ ổn định 28ºC cả ngày và đêm, vi rút thể hiện độc lực mạnh nhất, tốc độ gây bệnh tích tế bào nhanh và tỷ lệ cá chết đạt đỉnh ngắn ngày (Bảng 3.8). Khi duy trì nhiệt độ dao động 28ºC ban ngày và hạ xuống 24ºC ban đêm, thời gian ủ bệnh kéo dài hơn và tỷ lệ cá chết giảm rõ rệt (Bảng 3.9).

3. Tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin:

   • Thiết kế thành công vector tái tổ hợp pET32a+-T4 mang đoạn gen T4 kích thước 420 bp (Hình 3.5, Hình 3.9, Hình 3.10, Hình 3.11).
   • Biến nạp vector vào chủng E. coli JM109 để lưu giữ và chuyển gen thành công vào chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3) (Hình 3.12 - 3.17).
   • Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện: Xác định các thông số nuôi cấy tối ưu cho chủng E. coli BL21(DE3) mang pET32a+-T4 tổng hợp protein T4 tái tổ hợp cao nhất về nhiệt độ nuôi, thời gian cảm ứng và nồng độ chất cảm ứng IPTG (Hình 3.21, Hình 3.22, Hình 3.23). Điện di SDS-PAGE gel 15% và lai Western blot xác nhận sự có mặt của phân tử protein T4 tái tổ hợp với kích thước đặc hiệu (Hình 3.18 - 3.20).
   • Tinh sạch protein T4 bằng cột sắc ký ái lực Nikel chelating Resin thu được sản phẩm protein có độ tinh khiết cao (Hình 3.24).
   • Đánh giá khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch: Protein T4 tái tổ hợp kích thích tạo kháng thể trung hòa hiệu giá cao trên mô hình thỏ in vitro và in vivo (Bảng 3.10, Bảng 3.11). Khi tiêm trên cá mú (Epinephelus coioides), kháng nguyên kích hoạt đáp ứng miễn dịch đặc hiệu, duy trì hiệu giá kháng thể trung hòa và bảo vệ cá sống sót trước thử thách vi rút kéo dài đến ngày thứ 90 sau khi tiêm (Bảng 3.12).

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học

• Luận án là công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu một cách toàn diện về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh (Betanodavirus) trên cá mú, xác định đặc điểm gây bệnh tích tế bào trên dòng tế bào lách cá mú GS1 và trên cá mú sống.
• Cung cấp dẫn liệu khoa học về ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường (chế độ nhiệt 28ºC ổn định so với nhiệt độ dao động 28ºC ngày / 24ºC đêm) đến độc lực và khả năng gây nhiễm của NNV trên tế bào mẫn cảm và vật chủ cá mú.
• Giải mã và xác định mức độ tương đồng trình tự đoạn gen T4 mã hóa kháng nguyên vỏ của chủng vi rút phân lập tại Việt Nam, khẳng định quan hệ phát sinh loài thuộc kiểu gen RGNNV tương đồng với chủng mã số GenBank HM017077.1.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

• Lần đầu tiên tại Việt Nam thiết kế và tạo thành công chủng vi khuẩn tái tổ hợp E. coli BL21(DE3) mang vector pET32a+-T4 có khả năng sinh tổng hợp kháng nguyên protein T4 của NNV với độ ổn định cao.
• Xây dựng hoàn chỉnh quy trình biểu hiện, tối ưu hóa các điều kiện lên men và tinh sạch protein T4 tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái lực Nikel chelating Resin.
• Chứng minh kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp có khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể trung hòa trên thỏ và có khả năng bảo hộ miễn dịch cho cá mú (Epinephelus coioides) kéo dài đến ngày thứ 90 sau khi tiêm. Đây là nguồn nguyên liệu khoa học phục vụ sản xuất vắc-xin thế hệ mới phòng bệnh VNN cho nghề nuôi cá mú tại Việt Nam.

Kiến nghị và đề xuất của tác giả

• Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp ở quy mô lên men công nghiệp (bioreactor).
• Thử nghiệm phối chế protein T4 tái tổ hợp với các chất bổ trợ miễn dịch chuyên dụng và khảo sát các phương thức sử dụng vắc-xin thay thế đường tiêm (như ngâm tắm, phối trộn thức ăn cho ấu trùng và cá giống nhỏ) nhằm thuận tiện cho việc ứng dụng đại trà trong thực tiễn sản xuất.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Các thử nghiệm đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch và hiệu lực bảo hộ in vivo của kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp chủ yếu được thực hiện qua đường tiêm trên đối tượng cá mú chấm nâu (Epinephelus coioides) trong điều kiện phòng thí nghiệm.
• Thời gian theo dõi hiệu lực bảo hộ miễn dịch mới dừng lại ở mốc 90 ngày sau khi gây miễn dịch.
• Chưa tiến hành thử nghiệm vắc-xin protein tái tổ hợp trên diện rộng tại các vùng nuôi lồng bè thương phẩm ngoài tự nhiên.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Mở rộng đánh giá khả năng bảo hộ chéo của kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp trên các loài cá mú kinh tế khác như cá mú cọp (Epinephelus fuscoguttatus) và cá mú chuột (Cromileptes altivelis).
• Nghiên cứu phát triển công nghệ bao màng hoặc tạo hạt giả vi rút (VLPs) từ protein T4 tái tổ hợp để nâng cao tính ổn định của kháng nguyên khi đưa qua đường tiêu hóa (trộn vào thức ăn hoặc làm giàu sinh học qua Artemia).
• Kéo dài thời gian theo dõi đáp ứng miễn dịch và hiệu giá kháng thể trung hòa sau 90 ngày nhằm xác định chính xác thời điểm cần tái chủng vắc-xin cho cá nuôi thương phẩm.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao đối với nhiều nhóm đối tượng hoạt động trong lĩnh vực khoa học và thực tiễn thủy sản:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên: Thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học, Bệnh học thủy sản và Nuôi trồng thủy sản. Phần đáng tham khảo nhất là quy trình thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+, các bước tinh sạch protein bằng cột ái lực Nikel chelating Resin và phương pháp đánh giá hiệu giá kháng thể trung hòa in vitro trên dòng tế bào GS1.
• Giảng viên và cán bộ nghiên cứu: Dữ liệu của luận án cung cấp tư liệu bài giảng chuẩn xác về cơ chế bệnh sinh của Betanodavirus, đặc điểm miễn dịch dịch thể ở cá xương và các phương pháp chẩn đoán phân tử RT-PCR, mô bệnh học Davidson's.
• Các viện nghiên cứu và cơ sở sản xuất giống thủy sản: Cán bộ kỹ thuật tại các Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I, II, III và các trung tâm sản xuất giống cá biển có thể tham khảo quy trình chẩn đoán sàng lọc nhanh mẫu cá bố mẹ nhiễm NNV, cũng như các thông số quản lý nhiệt độ nguồn nước nhằm kiểm soát độc lực và nguy cơ bùng phát dịch bệnh VNN trong các trại giống.
• Các doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học và vắc-xin thú y thủy sản: Tham khảo dữ liệu về chủng giống vi khuẩn tái tổ hợp E. coli BL21(DE3) mang gen T4 và điều kiện tối ưu hóa biểu hiện protein kháng nguyên làm tiền đề cho việc xây dựng dây chuyền sản xuất vắc-xin quy mô công nghiệp.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tác nhân gây bệnh hoại tử thần kinh (VNN) trên cá mú trong luận án thuộc kiểu gen nào và có đặc điểm phân tử ra sao?

Tác nhân gây bệnh được xác định là Betanodavirus thuộc họ Nodaviridae. Dựa trên kết quả giải trình tự và phân tích phả hệ đoạn gen T4, chủng phân lập tại Việt Nam thuộc kiểu gen RGNNV (Red-spotted grouper nervous necrosis virus), có mức độ tương đồng cao với trình tự chuẩn trên GenBank mã số HM017077.1. Hệ gen của vi rút gồm 2 đoạn RNA mạch đơn sợi dương: RNA1 (3.105 bp) mã hóa enzyme RNA-dependent RNA polymerase (protein A, 110 kDa) và RNA2 (1.434 bp) mã hóa protein vỏ capsid (37 kDa - 42 kDa).

2. Tác giả đã lựa chọn đoạn gen nào để tạo dòng biểu hiện protein tái tổ hợp và kích thước của đoạn gen này là bao nhiêu?

Tác giả đã lựa chọn đoạn gen T4 nằm trên phân tử RNA2 mã hóa cho protein vỏ của Betanodavirus. Đoạn gen T4 này có kích thước 420 bp (nằm trong vùng bảo tồn cao của hệ gen vi rút). Đoạn gen T4 được khuếch đại bằng RT-PCR, nhân dòng vào vector pGEM-T và sau đó chuyển vào vector biểu hiện pET32a+ để tạo vector tái tổ hợp pET32a+-T4.

3. Nhiệt độ môi trường ảnh hưởng như thế nào đến khả năng gây bệnh của NNV trên tế bào GS1 và trên cá mú sống?

Nghiên cứu chỉ ra rằng ở mức nhiệt độ ổn định 28ºC cả ngày và đêm, vi rút NNV thể hiện độc lực mạnh nhất, phá hủy lớp tế bào lách cá mú GS1 nhanh hơn và gây tỷ lệ chết cao, chết nhanh trên đàn cá mú thí nghiệm. Ngược lại, ở chế độ nhiệt độ dao động 28ºC ban ngày và hạ xuống 24ºC ban đêm, tốc độ gây hiệu ứng bệnh tích tế bào (CPE) chậm hơn, thời gian ủ bệnh trên cá mú kéo dài hơn và tỷ lệ cá chết giảm rõ rệt.

4. Hệ thống vector và tế bào chủ nào đã được sử dụng để biểu hiện kháng nguyên protein T4 và phương pháp tinh sạch là gì?

Luận án sử dụng vector biểu hiện pET32a+ (Novagen) mang đoạn gen T4 kích thước 420 bp gắn tại vị trí cắt của enzyme giới hạn EcoRI. Tế bào chủ được sử dụng để nhân dòng và lưu giữ plasmid là E. coli JM109, sau đó plasmid được biến nạp vào tế bào chủ biểu hiện E. coli BL21(DE3). Quá trình sinh tổng hợp protein được kích hoạt bằng chất cảm ứng IPTG. Protein T4 tái tổ hợp gắn đuôi His-tag được tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực Nikel chelating Resin (Invitrogen).

5. Hiệu lực kích thích miễn dịch và bảo hộ của kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp trên cá mú kéo dài trong bao lâu?

Kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp sau khi tinh sạch đã kích thích cơ thể thỏ và cá mú (Epinephelus coioides) sinh kháng thể đặc hiệu có khả năng trung hòa vi rút trong các thử nghiệm in vitro và in vivo. Trên mô hình cá mú sống được tiêm kháng nguyên, đáp ứng miễn dịch đặc hiệu được kích hoạt và duy trì khả năng bảo hộ giúp cá chống lại thử thách vi rút độc lực cao kéo dài đến ngày thứ 90 sau khi tiêm.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Thanh đã khảo sát và xác định toàn diện đặc tính vi rút học của các chủng Betanodavirus kiểu gen RGNNV gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ngành thủy sản trong những năm gần đây đã và đang phát triển nhanh chóng, dần khẳng định vị trí của mình và trở thành một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của Việt Nam. Nghề nuôi cá biển được đánh giá là nghề mang lại hiệu quả kinh tế cao và cá mú được xem là một trong những loài nuôi chủ lực.) có giá trị kinh tế rất cao do hàm lượng dinh dưỡng giàu axit béo không no, thịt cá thơm ngon bổ dưỡng cho nên được thị trường trong và ngoài nước rất ưa chuộng. Tuy nhiên, khi nghề nuôi cá mú phát triển thì người nuôi cũng gặp không ít khó khăn bởi dịch bệnh gây ra trên cá. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng những tác nhân gây bệnh chủ yếu trên cá mú thường là vi rút, nấm và vi khuẩn trong đó nguy hiểm nhất là bệnh hoại tử thần kinh (Viral Nervous Necrosis-VNN) hay bệnh não và võng mạc (Viral Encephalopathy and Retinopathy -VER) do Betanodavirus gây ra.

Vi rút có thể tấn công và gây bệnh trên cá mú ở tất cả các giai đoạn phát triển từ ấu trùng, cá giống đến cá thương phẩm. Khi bị bệnh cá có biểu hiện rối loạn thần kinh như bơi mất thăng bằng, bơi xoay tròn, đầu chúc xuống dưới hoặc treo trên mặt nước hay nằm dưới đáy bể, đáy lồng. Cá bệnh có thể chết sau 3-5 ngày với tỷ lệ chết cao từ 80-100%. Ở Việt Nam, bệnh phân bố ở hầu hết các vùng nuôi cá trên cả nước.

Mùa vụ xuất hiện bệnh từ tháng 5 đến tháng 10 khi nhiệt độ nước từ 24 đến 30ºC. Tỷ lệ chết do VNN gây ra dao động từ 50 - 100% tùy thuộc theo loài và giai đoạn xuất hiện bệnh (Đỗ Thị Hoà và cs, 2004) [2]. Hiện tại, ở Việt Nam mặc dù chưa có báo cáo tổng quát về bệnh hoại tử thần kinh gây ra cho cá mú nuôi, nhưng các số liệu từ nghiên cứu của trường Đại học Nha Trang, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II cho thấy, tỷ lệ cá mú nhiễm vi rút hoại tử thần kinh cao lên tới 82% mẫu cá bệnh thu thập (Nguyễn Ngọc Du và cs, 1 2005; Phan Thị Vân và Bùi Ngọc Thanh, 2004; Trần Vĩ Hích và Phạm Thị Duyên, 2008) [1][13][3]. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú đang ngày càng gia tăng đòi hỏi cần có các biện pháp phòng bệnh hiệu quả.

Cá mú có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch khá tốt khi tiếp xúc với kháng nguyên, do đó việc nghiên cứu tạo nguyên liệu để sản xuất vắc-xin phòng bệnh cho cá đang là vấn đề cấp thiết hiện nay. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh cho cá mú (Epinephelus spp. Mục tiêu của đề tài luận án: - Xác định được vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam và một số đặc tính sinh học của vi rút gây bệnh. - Tạo được kháng nguyên tái tổ hợp và đánh giá khả năng kích thích sinh miễn dịch của kháng nguyên để làm nguyên liệu phục vụ sản xuất vắc- xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu: - Mẫu cá mú nghi mắc bệnh hoại tử thần kinh được thu từ các vùng biển Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Khánh Hòa, Bình Thuận. - Vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú được xác định - Kháng nguyên tái tổ hợp protein T4 của vi rút gây hoại tử thần kinh cá mú - Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm vi sinh, Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội - Thời gian nghiên cứu: tháng 7 năm 2012 đến tháng 5 năm 2015 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn: - Tính khoa học: Luận án đã xác định được vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú và một số đặc tính sinh học của chúng. Đồng thời luận án đã sản xuất kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp của vi rút gây bệnh, bước đầu 2 đánh giá được khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch làm cơ sở cho việc sản xuất vắc-xin phòng bệnh cho cá mú. Dữ liệu khoa học của luận án sẽ cung cấp thêm tư liệu giảng dạy và nghiên cứu về bệnh ở cá mú cũng như định hướng sản xuất vắc- xin phòng bệnh cho cá mú nuôi hiện nay.

- Tính thực tiễn: Đề tài đã tạo được kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp và đánh giá được khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch trên động vật thí nghiệm khi được tiêm kháng nguyên tái tổ hợp này. Trên cơ sở đó có thể dùng kháng nguyên protein tái tổ hợp làm nguồn nguyên liệu sản xuất vắc- xin phòng bệnh cho cá mú góp phần hạn chế dịch bệnh, tăng sản lượng cá nuôi và phát triển bền vững nghề nuôi cá mú ở nước ta. Đóng góp mới của đề tài luận án: - Lần đầu tiên tại Việt Nam đã nghiên cứu một cách toàn diện về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú với một số đặc tính sinh học như khả năng gây bệnh tích trên tế bào GS1 và trên cá mú, đánh giá được ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh tích trên tế bào GS1 và trên cá mú. - Luận án là công trình đầu tiên tại Việt Nam đã tạo được kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp, kháng nguyên có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch và bảo hộ cho cá mú cho đến ngày thứ 90 sau khi tiêm.

Đây là cơ sở khoa học vững chắc để sử dụng kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Một số đặc điểm sinh học của cá mú 1. Hệ thống phân loại cá mú Cá mú thuộc họ Serranidae, họ phụ cá mú (Epinephelinae), giống Epinephelus, tên tiếng Anh: groupers.

Giống Epinephelus gồm 99 loài, khu vực Ấn Độ, Thái Bình dương đã phát hiện được 63 loài thuộc giống Epinephelus. Theo Viện Hải dương học Nha Trang, vùng biển nước ta có khoảng 30 loài cá mú (Lê Anh Tuấn, 2004) [11]. Ngành Chordata Lớp Pisces Bộ Perciformes Họ Serranidae Giống Epinephelus Hình 1.1 Hình thái ngoài cá mú chấm nâu (Epinephelus coioides) 1. Đặc điểm phân bố Cá mú là loài cá sống tại những vùng nước ấm, phân bố chủ yếu ở những vùng biển nhiệt đới, á nhiệt đới và ít thấy ở vùng biển ôn đới.

Nhiệt độ thích hợp cho các loài cá mú phát triển là từ 22-32ºC, thích hợp nhất là 25- 30ºC. Cá chịu được độ mặn từ 11- 41‰. Môi trường sống của chúng thay đổi tuỳ theo loài, chẳng hạn như loài E. akaara, Cephalopholis miniata sống ở những nơi nước có độ trong cao, có chất đáy là rạn đá ngầm, san hô (ngoài khơi).

bleekeri sống chủ yếu ở vùng biển cạn, nơi có bờ đá và rạn san hô, độ mặn cao và ổn định. Cá con thường tìm thấy ở trong các đám rong, cỏ biển. sexfasciatus thường sống cả ở vùng nước lợ và nước mặn nơi có độ mặn 4 dao động từ 10-32‰, chất đáy rất đa dạng từ đáy cứng, cát đến đáy bùn. Cá con thường tìm thấy ở vùng triều ven bờ, cửa sông và rừng ngập mặn.

Theo Viện Hải dương học Nha Trang, vùng biển Việt Nam có khoảng 30 loài, trong đó có nhiều loài có giá trị kinh tế, giá trị xuất khẩu cao như: cá mú chấm đỏ (E. brunneus), cá mú chấm tổ ong (E. megchir), cá mú chấm nâu (E. Vùng biển Bắc bộ có cá mú mỡ, cá mú đen, cá mú cáo, cá mú chấm nâu.

Vùng biển Trung bộ có cá mú đỏ, vùng biển Đông và Tây Nam bộ có cá mú đỏ, cá mú mỡ. Ngoài ra cũng có nhiều loại có giá trị cao nhưng chưa được đưa vào nuôi phổ biến, chủ yếu là do đánh bắt như cá mú nghệ (E. Đặc điểm sinh trưởng Sự tăng trưởng cá mú khác nhau giữa các loài. Cá nuôi sau 1 năm, với cá mú chấm đỏ (E.

akaara) đạt khoảng từ 0,3 - 0,4 kg, cá mú chấm xanh (E. malabaricus), cá mú chấm nâu (E. coioides) là 0,8 kg, cá mú mỡ (E. tauvina) là 1,0 - 1,2 kg; cá mú nghệ (E.

lanceoratus) là 3 - 4 kg, đây cũng là loài lớn nhất trong họ cá mú. Hiện nay đã khai thác được cá mú ngoài tự nhiên có những con đạt khối lượng tới 150 kg. Cá bột sau 1 ngày tuổi có chiều dài trung bình 2,18 mm, miệng đóng, chưa có sắc tố, khối noãn hoàng vẫn còn. Sau 3 ngày tuổi, miệng mở, cá bắt đầu ăn thức ăn ngoài, lúc này ống tiêu hoá chưa hoàn chỉnh.

Khi cá đạt 12 ngày tuổi, dài 3,57 mm; miệng, mắt, ống tiêu hoá hoàn chỉnh, bắt đầu phát triển sắc tố thân. Sau 18 ngày tuổi, chiều dài cá từ 5-8 mm, gai lưng thứ 2 dài, giai đoạn này cá rất nhạy cảm với các yếu tố bên ngoài, thời điểm này tỷ lệ hao hụt rất lớn. Cá 32 ngày tuổi, chiều dài 8-10 mm; vây phát triển hoàn thiện và có sắc tố đen trên tất cả các tia vây, gai lưng thứ 2 và cơ thể ngắn lại. Cá 39 ngày tuổi dài 10-12 mm, các vây hoàn chỉnh, tỷ lệ gai lưng thứ 2 giảm đáng kể.

Cá 54 ngày tuổi dài 16,5 mm, gai lưng ngắn, hình dáng và sắc tố giống cá trưởng thành. Thông thường cá mú chấm đỏ (E. akaara) lúc 1 5 tuổi dài 18 cm, 2 tuổi dài 18 -24 cm, 3 tuổi dài 23-28 cm, khối lượng 0,5 kg, 4 tuổi dài 26- 33 cm khối lượng 0,7-1,0 kg, 5 tuổi dài 31-34 cm (Nguyễn Thị Vui, 2012) [14]. Đặc điểm sinh sản Cá mú có khả năng chuyển đổi giới tính, thông thường lúc nhỏ là cá cái, khi trưởng thành chuyển thành cá đực.

Cá thường sinh sản vào ban đêm theo tuần trăng. Trứng đẻ ra được thụ tinh ngay trong môi trường nước, đường kính trứng khoảng 0,76-0,82 mm và có giọt dầu nhỏ giúp trứng nổi trong nước. Trứng sau khi thụ tinh sẽ xảy ra quá trình phân cắt tế bào và sự phát triển phôi. Ở độ mặn 30‰, hàm lượng oxy trên 5 mg/l, nhiệt độ 26- 30oC và sau thời gian từ 15 đến 25 giờ trứng sẽ nở ra cá bột.

Đặc điểm về hệ miễn dịch ở cá mú Ở cá xương nói chung và cá mú nói riêng có các hàng rào cơ học như dịch nhờn, da và mang bảo vệ giúp cơ thể cá chống lại sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh (Kim Văn Vạn và Lê Thanh Hòa, 2009) [12].