Nghiên cứu đặc tính sinh học vi rút gây hoại tử thần kinh và phát triển vắc xin cho cá mú Epinephelus spp

• Tác giả: Nguyễn Thị Thanh
• Người hướng dẫn: PGS. Phạm Công Hoạt
• Trường học: Viện Đại học Mở Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu vi rút hoại tử thần kinh và phát triển vắc xin cho cá mú
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Một số đặc điểm sinh học của cá mú
• 1.2. Hệ thống phân loại cá mú
• 1.3. Đặc điểm phân bố
• 1.4. Đặc điểm sinh trưởng
• 1.5. Đặc điểm sinh sản
• 1.6. Đặc điểm về hệ miễn dịch ở cá mú
• 1.7. Ý nghĩa kinh tế và tình hình nuôi cá mú
• 1.8. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới và Việt Nam
• 1.8.1. Đặc điểm của bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển
• 1.8.2. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới
• 1.8.3. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam
• 1.8.4. Các phương pháp chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh trên cá
• 1.8.5. Tổng quan về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh
• 1.8.6. Một số biện pháp phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú
• 2. KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP VÀ TÌNH HÌNH SỬ DỤNG VẮC-XIN PHÒNG BỆNH CHO CÁ
• 2.1. Kháng nguyên tái tổ hợp của tác nhân gây bệnh
• 2.2. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá trên thế giới
• 2.3. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá tại Việt Nam
• 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Nội dung nghiên cứu
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Nhóm các phương pháp cho nội dung xác định vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú
• 3.3.1.1. Phương pháp thu và xử lý mẫu
• 3.3.1.2. Phương pháp mô bệnh học
• 3.3.1.3. Phương pháp phân lập vi rút bằng kỹ thuật nuôi cấy trên tế bào
• 3.3.1.4. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
• 3.3.1.5. Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)
• 3.3.1.6. Điện di axit nucleic trên gel agarose
• 3.3.1.7. Phương pháp tách dòng gen
• 3.3.1.8. Phương pháp xác định đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh (NNV)
• 3.3.1.9. Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên tế bào GS1
• 3.3.1.10. Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên cá mú
• 3.3.1.11. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút trên tế bào GS1
• 3.3.1.12. Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút trên cá mú
• 3.3.2. Nhóm các phương pháp biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên và đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp
• 3.3.2.1. Chuẩn bị vector pET32a+ để thực hiện phản ứng nối gen
• 3.3.2.2. Nối gen T4 vào vector pET32a+
• 3.3.2.3. Chuyển gen vào E. coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET32a+-T4
• 3.3.2.4. Tách chiết plasmid từ các khuẩn lạc sau biến nạp chuẩn bị cho kiểm tra bằng PCR và enzyme giới hạn
• 3.3.2.5. Phương pháp điện di SDS-PAGE
• 3.3.2.6. Phương pháp Western blot
• 3.3.2.7. Phương pháp đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hòa của kháng nguyên tái tổ hợp
• 3.3.2.8. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam
• 4.2. Sàng lọc mẫu nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp mô bệnh học
• 4.3. Xác định mẫu cá nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp RT-PCR
• 4.4. Xác định vi rút gây bệnh trên tế bào
• 4.5. Giải trình tự gen mã hóa kháng nguyên T4 của NNV
• 4.6. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú
• 4.6.1. Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào
• 4.6.2. Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú
• 4.6.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào GS1
• 4.6.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú
• 4.7. Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú
• 4.7.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+- T4
• 4.7.2. Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên T4 của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh
• 4.7.2.1. Tạo chủng vi khuẩn E.coli BL21(DE3) mang gen mã hóa kháng nguyên của NNV
• 4.7.2.2. Biểu hiện gen T4 trong tế bào vi khuẩn tái tổ hợp
• 4.7.2.3. Đánh giá các điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên T4 của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh
• 4.7.3. Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp
• 4.7.4. Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp
• 4.7.4.1. Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp trên thỏ
• 4.7.4.2. Đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp trên cá mú
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN TIẾN SĨ
• DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng quan về vi rút hoại tử thần kinh

Bệnh hoại tử thần kinh (Viral Nervous Necrosis - VNN) là một trong những bệnh nghiêm trọng nhất ảnh hưởng đến cá mú. Vi rút gây bệnh thuộc họ Betanodavirus, có khả năng tấn công cá ở mọi giai đoạn phát triển. Tại Việt Nam, tỷ lệ cá mú nhiễm vi rút này có thể lên tới 82%. Bệnh thường xuất hiện từ tháng 5 đến tháng 10, khi nhiệt độ nước từ 24 đến 30ºC. Các triệu chứng bao gồm rối loạn thần kinh, bơi mất thăng bằng và tỷ lệ chết cao từ 80-100%. Việc nghiên cứu về vi rút này là cần thiết để phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

1.1. Đặc điểm của bệnh hoại tử thần kinh

Bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú có những đặc điểm nổi bật như tỷ lệ chết cao và khả năng lây lan nhanh chóng. Vi rút có thể gây ra các triệu chứng như bơi xoay tròn, đầu chúc xuống dưới, và nằm dưới đáy bể. Tình hình dịch bệnh đang gia tăng, đòi hỏi cần có các biện pháp phòng bệnh hiệu quả. Việc xác định vi rút gây bệnh và nghiên cứu các đặc tính sinh học của nó là rất quan trọng để phát triển vắc xin.

II. Phát triển vắc xin cho cá mú

Việc phát triển vắc xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú là một nhiệm vụ cấp thiết. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng cá mú có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch tốt khi tiếp xúc với kháng nguyên. Kháng nguyên tái tổ hợp protein T4 của vi rút gây bệnh đã được sản xuất và đánh giá khả năng kích thích sinh miễn dịch. Kết quả cho thấy kháng nguyên này có thể tạo ra đáp ứng miễn dịch bền vững cho cá mú, mở ra cơ hội cho việc sản xuất vắc xin hiệu quả.

2.1. Kháng nguyên tái tổ hợp và khả năng sinh miễn dịch

Kháng nguyên tái tổ hợp protein T4 đã được tạo ra từ vi rút gây hoại tử thần kinh. Nghiên cứu cho thấy kháng nguyên này có khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ trên cá mú. Đánh giá khả năng tạo kháng thể cho thấy kháng nguyên này có thể bảo vệ cá mú trong thời gian dài, từ 60 đến 90 ngày sau khi tiêm. Điều này chứng tỏ rằng kháng nguyên tái tổ hợp có tiềm năng lớn trong việc phát triển vắc xin phòng bệnh cho cá mú.

III. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin khoa học về vi rút hoại tử thần kinh mà còn có ý nghĩa thực tiễn quan trọng trong ngành thủy sản. Việc phát triển vắc xin sẽ giúp giảm thiểu thiệt hại do dịch bệnh gây ra, tăng sản lượng cá nuôi và đảm bảo sự phát triển bền vững cho nghề nuôi cá mú. Dữ liệu từ nghiên cứu sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo và ứng dụng trong thực tiễn nuôi trồng thủy sản.

3.1. Đóng góp mới của nghiên cứu

Nghiên cứu này là công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu toàn diện về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú. Các đặc tính sinh học của vi rút đã được xác định, cùng với khả năng gây bệnh trên tế bào và cá mú. Việc tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp protein T4 mở ra hướng đi mới cho việc sản xuất vắc xin, góp phần quan trọng trong việc phòng ngừa dịch bệnh cho cá mú.