CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1. Hội chứng chết sớm – Bệnh hoại tử gan tụy cấp trong nuôi trồng thủy sản Hội chứng chết sớm (Early Mortality Syndrome – EMS) là tên gọi chung được đặt ra để mô tả tỉ lệ tử vong cao bất thường có thể xảy ra trong vòng 30 ngày đầu tiên của quá trình nuôi tôm thương phẩm do một loạt các nguyên nhân liên quan đến khâu quản lý ao nuôi và các yếu tố gây bệnh. Ngoài các vấn đề về quản lý ao nuôi, nhiều nghiên cứu cũng cho thấy sự liên quan giữa các tác nhân gây bệnh như virus gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV), virus gây bệnh đầu vàng (Yellow Head Virus – YHV) và các bệnh do vi khuẩn Vibrio sp. đối với hội chứng chết sớm.
Kể từ năm 2009, những trường hợp chết trong giai đoạn nuôi ban đầu đã xuất hiện một cách rõ ràng ở tôm sú và tôm thẻ chân trắng. Hội chứng này làm tôm chết với số lượng lớn và tỉ lệ chết lên đến 100% trong vòng 20 – 30 ngày sau thả nuôi. Các cá thể tôm nhiễm bệnh có biểu hiện bất thường ở gan tụy, thường là bị teo và có màu trắng kèm theo triệu chứng bong vỏ, đổi màu nhạt, chậm lớn và khi đến giai đoạn gần chết sẽ bơi chìm xuống đáy ao. Kiểm tra mô học gan tụy của các cá thể tôm bệnh này cho thấy có sự xuất hiện hoại tử mạnh ở gan tụy.
Thuật ngữ Hội chứng hoại tử gan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome – AHPNS) được đặt dựa trên thương tổn đặc biệt của bệnh xuất hiện trên gan tụy của tôm, và những dấu hiệu cũng như hậu quả của bệnh đã làm cho hội chứng này trở thành tiêu chuẩn trong chẩn đoán Hội chứng chết sớm so với các nguyên nhân gây bệnh tiềm năng khác [16]. Như vậy, Hội chứng chết sớm là một thuật ngữ bao hàm các nguyên nhân gây nên từ các yếu tố môi trường như virus gây bệnh đốm trắng, virus gây bệnh đầu 3 vàng. Tuy nhiên, ở Việt Nam, thuật ngữ này cũng được gọi với một các tên khác là bệnh hoại tử gan tụy cấp [17]. Các triệu chứng của bệnh hoại tử gan tụy cấp được nhận thấy thông qua sự tổn thương nghiêm trọng gan tụy ở tôm vào giai đoạn cấp tính của bệnh.
Trong đó, vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus được xác định là nguyên nhân gây ra bệnh hoại tử gan tụy cấp ở Việt Nam [17]. Probiotic Nuôi trồng thủy sản đã trở thành một hoạt động kinh tế quan trọng ở nhiều quốc gia trên thế giới. Trong những cơ sở sản xuất qui mô lớn, thủy sản phải chịu những điều kiện khắc nghiệt, đây là vấn đề có liên quan đến dịch bệnh và sự ô nhiễm môi trường thường xảy ra dẫn đến sự hao hụt kinh tế nghiêm trọng [7] [12]. Việc sử dụng các chế phẩm sinh học hoặc các vi khuẩn có lợi có thể kiểm soát được các tác nhân gây bệnh thông qua nhiều cơ chế khác nhau ngày càng được xem như là một lựa chọn thay thế cho kháng sinh.
Sự bổ sung các probiotic vào chế độ dinh dưỡng trong thủy sản đã được thực hiện và ứng dụng vào nhiều năm trước đây [18 – 22]. Probiotic trong thủy sản Moriarty (1999) đã đề nghị một định nghĩa mở rộng hơn đề cập đến nuôi trồng thủy sản rằng cũng có thể bổ sung những vi sinh vật sống trong môi trường tự nhiên vào những bể hoặc ao, hồ bởi vì những vi sinh vật này có thể làm thay đổi hệ vi sinh vật trong nước và bùn lắng. Sức khỏe của động vật được cải thiện thông qua việc loại bỏ hoặc làm giảm mật độ tác nhân gây bệnh và cải thiện môi trường nước thông qua sự phân hủy nhanh hơn các bã thải hữu cơ. Không giống như động vật trên cạn, những động vật trong các ngư trường bị bao phủ bởi hàng triệu tác nhân gây bệnh vô cùng phong phú và đa dạng về chủng loại sống độc lập với vật chủ [23].
4 Có rất nhiều định nghĩa về probiotic, tuy nhiên, không có định nghĩa nào trong số đó phù hợp với nuôi trồng thủy sản bởi vì những vật nuôi trong thủy sản có một mối quan hệ rất chặt chẽ với môi trường của chúng hơn là những vật nuôi trên cạn. Thực ra, trong thủy sản, những tác nhân gây bệnh tăng sinh độc lập với vật chủ, vì vậy những sinh vật cơ hội có thể đạt đến mật độ cao quanh những vật nuôi trong thủy sản [24]. Sự tương tác chặt chẽ giữa môi trường và vật nuôi thủy sản đã dẫn đến một định nghĩa probiotic được điều chỉnh phù hợp với nuôi trồng thủy sản. Dựa vào những căn cứ trên, một định nghĩa mới cho probiotic được đưa ra như sau: “Một chế phẩm bổ sung vi sinh vật sống có một tác dụng có lợi lên vật chủ bằng cách điều chỉnh quần thể vi sinh vật có tương tác với vật chủ hoặc môi trường xung quanh, bằng cách đảm bảo việc sử dụng thức ăn đã được cải thiện hoặc gia tăng giá trị dinh dưỡng của chúng, bằng cách gia tăng đáp ứng của vật chủ đối với bệnh, hoặc bằng cách cải thiện chất lượng của môi trường xung quanh” [20].
Định nghĩa trên đã trao cho các chế phẩm vi sinh trong nuôi trồng thủy sản một khả năng lớn trong việc tác động tích cực đến sức khỏe của vật nuôi bằng khả năng đối kháng cạnh tranh [12], bằng việc cung cấp enzyme để tiêu hóa và bằng sự tăng cường đáp ứng miễn dịch hoặc bằng việc tạo ra những hợp chất ức chế [9]. Vi khuẩn lactic 1. Khái niệm Vi khuẩn lactic (LAB – Lactic Acid Bacteria) là nhóm Gram dương, cầu khuẩn không sinh bào tử và trực khuẩn, kị khí tùy nghi. Chúng sản sinh ra acid lactic như một sản phẩm chính trong suốt quá trình lên men carbonhydrate.
Theo Orla-Jensen (1919), những chi LAB đại diện là Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus. Vi khuẩn lactic được chia thành hai nhóm xét về hình thái và xét về kiểu lên men. Trong đó, hình thái gồm có cầu khuẩn và trực khuẩn. Kiểu lên men gồm vi khuẩn lactic lên men đồng hình với sản phẩm chính là acid lactic qua quá trình lên men đường và vi khuẩn lactic lên men dị hình với sản phẩm sinh ra là acid lactic và một lượng đáng kể acid acetic và alcohol [25].
5 Nhiều chủng của các loài vi khuẩn lactic có ảnh hưởng tích cực đến nuôi trồng thủy sản như Lactobacillus acidophilus, L. plantarum, Lactococcus lactis và Pediococcus acidilactici. Tuy nhiên, chỉ có một vài báo cáo khoa học đề cập đến việc sử dụng chúng trên tôm. Mathieu Castex và cộng sự (2008) đã từng nghiên cứu về những hiệu quả của vi khuẩn lactic, đối tượng nghiên cứu là Pediococcus acidilactici làm probiotic, khảo sát về mức độ tăng trưởng, dinh dưỡng và về khía cạnh vi sinh của tôm.
Kết quả thu được là tôm có khả năng chịu được dịch bệnh và tăng khả năng sống sót của tôm khi bổ sung probiotic Pediococcus acidilactici vào thức ăn. Nghiên cứu này càng khẳng định sự hiệu quả của vi khuẩn lactic đối với sức khỏe của vật chủ trong nuôi trồng thủy sản. Trong những năm gần đây, việc kiểm soát sinh học các dịch bệnh bằng các phương pháp thân thiện với môi trường như probiotic đã trở thành một đối tượng nghiên cứu quan trọng trong nuôi trồng thủy sản. Một số báo cáo đã mô tả chi tiết những tiến bộ khác nhau trong việc sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản mà đối tượng đề cập ở đây là tôm [26].
Trong đó vi khuẩn lactic được ứng dụng phổ biến nhất vào chế độ dinh dưỡng của tôm, chúng cạnh tranh chống lại các vi sinh vật gây hại, củng cố các cơ chế bảo vệ tự nhiên của vật nuôi. Phân loại Vi khuẩn lactic được phân loại về mặt hình thái gồm trực khuẩn (Lactobacillus sp. và Carnobacterium sp. ) và cầu khuẩn (các chi còn lại).
Tính chất quan trọng tiếp theo được sử dụng trong việc phân loại vi khuẩn lactic là kiểu lên men glucose dưới điều kiện tiêu chuẩn (không giới hạn việc cung cấp glucose, các yếu tố tăng trưởng như amino acid, vitamin và các chất tiền acid nucleic và giới hạn oxy sẵn có), ngoài ra, sự phân loại còn dựa vào các tiêu chuẩn của sinh học phân tử như giải mã trình tự rRNA và tạo ra các cây phát sinh loài nhằm xác định chính xác hơn về chủng loài, phân loại dưới loài và từ đó hiểu rõ hơn về sinh lý, khả năng trao đổi chất, các đặc tính quan trọng khác [27]. Vi khuẩn lactic có thể được chia thành hai nhóm là vi khuẩn lên men đồng hình và lên men dị hình [25] [28]. Trong đó, vi khuẩn lactic được phân ra gồm nhiều chi khác nhau như chi Lactobacillus, chi 6 Pediococcus, chi Leuconostoc, chi Lactococcus, chi Streptococcus, chi Bifidobacterium,… a. Chi Lactobacillus Lactobacillus là vi khuẩn Gram dương, hình que không sinh bào tử, thường không di động và đôi khi có khả năng làm giảm nitrate, không sinh catalase và phát triển trong môi trường giàu dinh dưỡng, như carbohydrate, acid amin, peptide, acid béo, muối, dẫn xuất của acid nucleic và vitamin.
Lactobacillus thường sử dụng glucose dể lên men thông qua con đường Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) và đường phân, hoặc lên men đồng hình, sản xuất hơn 85% acid lactic từ glucose, hoặc lên men dị hình, tạo ra acid lactic, CO2, ethanol và acid acetic. Các tế bào Lactobacillus có hình thái dài và mảnh, đôi khi que cong, ngắn, hoặc cầu khuẩn; thông thường các tế bào hình que xếp thành chuỗi và có độ dài và chiều rộng của chuỗi trong khoảng 0,5 – 1,2 x 1,0 – 10,0 µm. Lactobacillus tăng trưởng trong khoảng nhiệt độ từ 2 đến 53oC, và phạm vi pH trong một khoảng rộng từ 3 đến 8. Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu từ 30 – 40oC và pH tối ưu trong khoảng từ 5,5 đến 6,2 [29].
Chi Pediococcus Pediococci là một nhóm vi khuẩn lactic đa dạng. Các chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp ra một số chất chống lại vi sinh vật bao gồm các acid hữu cơ (acid lactic, acid acetic, acid formic, phenyllactic acid và acid caproic), carbon dioxide, hydrogen peroxide, diacetyl, ethanol và bacteriocin. Những chất này có khả năng ức chế hay khử vi khuẩn không mong muốn như Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus và Listeria monocytogenes [29]. Pediococci là cầu khuẩn Gram-dương, phân chia theo hai mặt phẳng, thường xuất hiện dạng song cầu, tứ cầu và những dạng khác, không di động và không bào tử.
Pediococci không khử nitrate, chúng cũng cần hầu hết các loại amino acid, 7 biotin, folinic acid, pantothenic acid, pyridoxine và riboflavin cho sự tăng trưởng. Pediococci lên men đồng hình trong điều kiện kỵ khí, chúng vận chuyển glucose bằng việc sử dụng phosphoenolpyruvate (PEP) thông qua hệ thống phosphotransferase (PTS), và chuyển hóa nó thông qua con đường Embden – Meyerhof – Parnas (EMP).