Tổng quan luận án

Đề tài luận án tiến sĩ "Nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và đặc điểm các chủng vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập tại các tỉnh phía nam Việt Nam" được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Vũ Thị Lan Hương, chuyên ngành Vi sinh vật học (mã số: 9 42 01 07), dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Lê Thanh Bình và GS. Naoto Tanaka, bảo vệ tại Học viện Khoa học và Công nghệ thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào năm 2022.

Tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ chủ trương bảo tồn đa dạng sinh học theo Luật Đa dạng sinh học năm 2008 của Quốc hội Việt Nam, trong đó việc điều tra, thu thập, đánh giá nguồn gen và lưu giữ mẫu di truyền được khuyến khích nghiên cứu. Vi khuẩn acetic là nhóm vi sinh vật hiếu khí có vai trò truyền thống trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và hóa học. Nhóm vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật (plant growth-promoting rhizobacteria - PGPR) được phát hiện và nghiên cứu tại nhiều quốc gia nhiệt đới như Brazil, Ấn Độ và Indonesia nhằm cung cấp nguồn gen cho công nghiệp sản xuất phân bón vi sinh, hướng tới nền nông nghiệp xanh bền vững. Tại Việt Nam, vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật thường phân bố trên các cây trồng chủ lực như lúa, mía, ngô, dứa, cà phê. Tuy nhiên, trước thời điểm nghiên cứu, các công trình trong nước về vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật chủ yếu tập trung vào nấm Gibberella và các nhóm vi khuẩn cố định đạm truyền thống như Rhizobium, Azotobacter, Azospirillium. Mặc dù đã có thử nghiệm thực tế chứng minh hiệu quả làm phân bón vi sinh của Gluconacetobacter sp. trên cây lúa và mía ở các tỉnh phía Nam, nhưng chưa có nghiên cứu có hệ thống về thu thập nguồn gen, phân loại học, định danh và xác định các đặc tính sinh học của nhóm vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật bản địa.

Mục tiêu tổng quát của luận án là nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và đặc điểm các chủng vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập tại các tỉnh phía nam Việt Nam, nhằm khảo sát tính đa dạng của nhóm vi sinh vật này và góp phần xây dựng quỹ gen phục vụ phát triển nông nghiệp.

Các nội dung nghiên cứu cụ thể được xác định trong văn bản gồm 4 nội dung:

  1. Nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và định danh các chủng vi khuẩn acetic có tiềm năng kích thích sinh trưởng thực vật được phân lập và chọn lọc từ các mẫu thu thập tại khu vực canh tác lúa, mía ở phía nam Việt Nam.
  2. Nghiên cứu các đặc điểm kích thích sinh trưởng thực vật đối với loài Nguyenibacter vanlangensis, đơn vị phân loại được phát hiện đầu tiên ở Việt Nam.
  3. Phân loại và nghiên cứu đặc điểm chủng thu thập thuộc chi ít gặp Neoasaia, chủng VTH-Ai107 và chủng chuẩn Neoasaia chiangmaiensis.
  4. Nghiên cứu phân loại, xác định đặc điểm và đề xuất loài mới Acetobacter sacchari sp. nov. đối với hai chủng VTH-Ai14 và VTH-Ai15 phân lập từ cây mía ở tỉnh Bình Phước.

Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập mới (141 chủng) cùng các chủng chuẩn và chủng tham khảo đối chứng. Phạm vi nghiên cứu về không gian tập trung tại khu vực canh tác lúa và mía thuộc các tỉnh phía nam Việt Nam (trong đó có Bình Phước, Tây Ninh); phạm vi thời gian hoàn thành công trình và bảo vệ luận án là năm 2022 (trong đó phát hiện loài mới Acetobacter sacchari được công bố năm 2019).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Văn bản luận án điểm lại lịch sử phân loại và các hướng nghiên cứu họ vi khuẩn acetic (Acetobacteraceae Gillis và De Ley 1980, phân lớp Alphaproteobacteria Stackebrandt et al. 1988) từ các nghiên cứu kinh điển đến hiện đại:

  • Năm 1898, Beijerinck lần đầu mô tả chi Acetobacter với loài chuẩn Acetobacter aceti, xuất phát từ các mô tả vi sinh vật lên men giấm của Louis Pasteur.
  • Năm 1935, Asai phân chia vi khuẩn acetic thành hai chi Acetobacter (chu mao, oxy hóa mạnh ethanol, oxy hóa hoàn toàn acetate và lactate) và Gluconobacter (tiên mao ở cực, oxy hóa mạnh glucose, không oxy hóa acetate và lactate; loài chuẩn Gluconobacter oxydans công nhận năm 1961).
  • Năm 1984 và 1998, Yamada và cộng sự tách các chủng Acetobacter chứa ubiquinone chính UQ-10 thành chi phụ Gluconoacetobacter, sau đó nâng lên cấp chi Gluconacetobacter với loài chuẩn Gluconacetobacter liquefaciens.
  • Năm 2013, Yamada và cộng sự tách nhánh "Gluconacetobacter xylinus" thành chi mới Komagataeibacter (loài chuẩn Komagataeibacter xylinus) do khác biệt về di động, khả năng sinh 2,5-diketogluconate và sinh sắc tố tan.
  • Các chi vi khuẩn acetic hiếm gặp gồm 14 chi được ghi nhận: Acidomonas (Urakami et al. 1989; Yamashita et al. 2000), Kozakia (Lisdiyanti et al. 2002), Swaminathania (Loganathan và Nair 2004), Saccharibacter (Jojima et al. 2004), Neoasaia (Yukphan et al. 2006), Granulibacter (Greenberg et al. 2006), Tanticharoenia (Yukphan et al. 2008), Ameyamaea (Yukphan et al. 2010), Neokomagataea (Yukphan et al. 2011), Endobacter (Ramírez-Bahena et al. 2013), Nguyenibacter (Vu et al. 2013), Swingsia (Malimas et al. 2014), Bombella (Li et al. 2015), Commensalibacter (Roh et al. 2019).
  • Năm chi có nhiều loài gồm: Acetobacter (28 loài), Gluconobacter (14 loài), Gluconacetobacter (10 loài), Asaia (8 loài), Komagataeibacter (15 loài).

Về hướng nghiên cứu vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật, tài liệu ghi nhận 10 loài thuộc họ Acetobacteraceae có khả năng cố định đạm:

Chi Loài Nguồn phân lập Khả năng cố định đạm (ARA) Dữ liệu phân tử ghi nhận
Gluconacetobacter Ga. diazotrophicus Thân và rễ mía + Toàn bộ bộ gen (WGS)
Gluconacetobacter Ga. johannae Đất trồng và rễ cà phê + Trình tự nifH
Gluconacetobacter Ga. azotocaptans Đất trồng và rễ cà phê + Trình tự nifH
Asaia As. siamensis Hoa nhiệt đới + Trình tự nifH
Asaia As. bogorensis Hoa nhiệt đới, nếp lên men + Trình tự nifH
Swaminathania S. salitolerans Rễ, thân, lá lúa ngập mặn + Vạch khuếch đại gen nifD
Komagataeibacter Ko. kombuchae Váng dịch trà thủy sâm Không xác định Trình tự nifH
Komagataeibacter Ko. kakiaceti Dịch giấm trái hồng Không xác định Trình tự nifH trên NCBI
Acetobacter A. nitrogenifigens Váng dịch trà thủy sâm Không xác định Trình tự nifH
Acetobacter A. peroxydans Thân, rễ và đất lúa ngập mặn + (kết quả yếu) Vạch khuếch đại gen nifH

Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết là: thiếu hụt các dẫn liệu phân loại học đa pha và phân tích phát sinh loài đối với nhóm vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập từ hệ sinh thái nông nghiệp phía nam Việt Nam; chưa có nghiên cứu kiểm chứng thực nghiệm đầy đủ các đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật (cố định đạm, hòa tan lân, hòa tan kẽm, tổng hợp auxin, kích hoạt phản ứng kháng bệnh) của chi đặc hữu Nguyenibacter (Ng. vanlangensis); thiếu hụt dữ liệu phân loại học và đặc tính PGPR của các chủng thuộc chi hiếm gặp Neoasaia tại Việt Nam; và cần khám phá các đơn vị phân loại mới thuộc chi Acetobacter có năng lực thúc đẩy sinh trưởng thực vật từ cây mía.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án áp dụng cơ sở lý thuyết phân loại học đa pha (polyphasic taxonomy) đối với vi khuẩn, kết hợp phân tích đặc điểm kiểu hình (hình thái, sinh lý, sinh hóa), hóa phân loại (thành phần ubiquinone, acid béo, khối phổ protein) và kiểu gen (trình tự nucleotide, phát sinh loài, tương đồng DNA-DNA).

Hệ thống phương pháp thực tế được thực hiện như sau:

  1. Phương pháp tuyển chọn và nuôi cấy vi sinh vật:
  • Tăng sinh và phân lập sử dụng môi trường vô đạm LGI (do Cavalcante và Döbereiner đề xuất) nhằm định hướng thu nhận các chủng có khả năng cố định đạm.
  • Nuôi cấy kiểm tra đặc tính hòa tan CaCO3 và oxy hóa ethanol trên môi trường GECA (glucose, ethanol, calcium carbonate) và GYC (glucose, cao nấm men, calcium carbonate).
  • Khảo sát khả năng hòa tan phosphat khó tan trên môi trường thạch và dịch thể Pikovskaya bổ sung 0,1% hoặc 0,5% Ca3(PO4)2; khảo sát hòa tan kẽm trên môi trường LGI bổ sung 0,1% ZnO, ZnCO3, hoặc Zn3(PO4)2.
  1. Phương pháp khảo sát đặc điểm kiểu hình:
  • Quan sát hình thái tế bào, trạng thái nhuộm Gram, kiểu sắp xếp và cấu trúc di động (tiên mao ở cực hoặc chu mao) dưới kính hiển vi quang học.
  • Đánh giá khả năng sinh trưởng trong các điều kiện môi trường: nồng độ D-glucose (0,0%, 1,0%, 30,0%), nồng độ ethanol (0,0% đến 10,0%), dải pH (từ pH 3,5 đến môi trường trung tính), nồng độ NaCl và các dải nhiệt độ nuôi cấy khác nhau.
  • Thử nghiệm sinh lý, sinh hóa: khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic, oxy hóa vượt mức acetate và lactate thành CO2 và H2O; sinh sắc tố tan màu nâu; sinh hợp chất γ-pyrone từ D-glucose; sinh dihydroxyacetone (DHA) từ glycerol; sinh polysaccharide dạng levan từ sucrose; sinh acid và khả năng sử dụng các nguồn carbohydrate (D-glucose, D-galactose, D-mannose, D-xylose, D-sorbitol, D-mannitol, maltose, glycerol...); khả năng sinh enzyme catalase, oxidase; thủy giải cơ chất đại phân tử (tinh bột tan, casein).
  1. Phương pháp hóa phân loại:
  • Xác định thành phần ubiquinone (UQ-9, UQ-10) chính bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC).
  • Phân tích thành phần acid béo tế bào bằng phương pháp sắc ký khí.
  • Phân tích phổ khối protein tế bào bằng phương pháp sắc ký khối phổ giải hấp phụ/ion hóa bằng laser có sự hỗ trợ của cơ chất (MALDI-TOF MS).
  1. Phương pháp di truyền và phát sinh loài:
  • Tách chiết DNA tổng số; thực hiện phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) khuếch đại gen 16S rRNA và các gen giữ nhà (dnaK, groEL, rpoB).
  • Giải trình tự DNA và xử lý dữ liệu: so sánh đa trình tự bằng thuật toán MUSCLE; xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA dựa trên các phương pháp Neighbor-Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) và Maximum Likelihood (ML) với ma trận thử nghiệm lặp lại ngẫu nhiên bootstrap 1.000 lần.
  • Xác định độ tương đồng DNA-DNA bộ gen (DNA-DNA hybridization) và xác định tỷ lệ thành phần base guanine + cytosine (% G+C mol).
  1. Phương pháp đánh giá đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật:
  • Đánh giá khả năng cố định đạm bằng sinh trưởng qua các lần cấy chuyền trên môi trường LGI bán rắn và LGI đĩa thạch; đo hoạt tính khử acetylene (ARA) xác định enzyme nitrogenase; kiểm tra sự hiện diện của gen nif.
  • Xác định khả năng chuyển hóa lân và kẽm khó tan qua đường kính vòng tan trên đĩa thạch và định lượng hàm lượng phospho hòa tan trong môi trường lỏng Pikovskaya theo thời gian nuôi cấy (1 đến 5 ngày).
  • Định lượng khả năng sinh tổng hợp hormone auxin (IAA) sau 7 ngày nuôi cấy trong môi trường LGI bằng phương pháp đo màu quang phổ với thuốc thử Salkowski.
  • Đánh giá tính kích kháng bệnh ở thực vật thông qua thử nghiệm kích hoạt biểu hiện gen chỉ thị kháng bệnh pr-1 sử dụng hệ thống cây mô hình chuyển gen Arabidopsis thaliana PR1::GUS một tuần tuổi (nhuộm mô xác định hoạt tính enzym β-glucuronidase - GUS).

Nguồn tư liệu và dữ liệu gồm: 141 chủng vi khuẩn acetic phân lập từ đất vùng rễ, rễ và thân cây lúa, cây mía thu thập tại các tỉnh phía nam Việt Nam; các chủng chuẩn đối chứng quốc tế lưu trữ tại Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật Việt Nam (VTCC), Trung tâm Nghiên cứu Tài nguyên Sinh học Thái Lan (TBRC/BCC), Trung tâm Quốc gia về Tài nguyên Sinh học Nhật Bản (NBRC/NRIC) và các bộ sưu tập ATCC, DSM, LMG.

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1. Đặc điểm chung vi khuẩn acetic

Chương 1 tổng thuật chi tiết về cơ sở sinh học và phân loại của họ Acetobacteraceae. Vi khuẩn acetic gồm 19 chi và 101 loài, là các trực khuẩn hoặc tế bào hình elip Gram âm, kích thước 0,4-1,2 x 0,8-4,0 µm, hiếu khí bắt buộc, catalase dương, oxidase âm, có khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic và oxy hóa đường thành các acid hữu cơ tương ứng.

Chương này hệ thống hóa 14 chi hiếm gặp và nguồn phân lập đặc thù của chúng (chẳng hạn Acidomonas từ bùn thải, Swaminathania từ lúa ngập mặn, Saccharibacter từ phấn hoa, Granulibacter từ bệnh nhân u hạt, Nguyenibacter từ đất lúa, Bombella và Commensalibacter từ ruột côn trùng). Đối với 5 chi có nhiều loài, văn bản thống kê danh mục toàn bộ các loài: Acetobacter (28 loài), Gluconobacter (14 loài), Gluconacetobacter (10 loài), Asaia (8 loài) và Komagataeibacter (15 loài).

Chương 1 cũng tổng quan các hướng ứng dụng thực tiễn của vi khuẩn acetic: lên men giấm (chiếm 3,5-5% acid acetic); lên men thực phẩm truyền thống (thạch dừa, trà kombucha, hạt cacao, kefir, bia lambic); sản xuất màng cellulose vi khuẩn dùng trong y sinh (màng trị phỏng, băng vết thương, van tim nhân tạo); sản xuất các polysaccharide ngoại bào (levan, dextran); sản xuất vitamin C và acid gluconic từ D-sorbitol và D-glucose bởi Gluconobacter oxydans; và ứng dụng làm phân bón vi sinh trong trồng trọt. Tài liệu thống kê 10 loài vi khuẩn acetic cố định đạm đã biết, mô tả chi tiết các cơ chế tác động của Gluconacetobacter diazotrophicus (chủng PAl5^T) như hệ gen nif/fix, khả năng tiết 2,42 µg/mL IAA, tạo acid 5-ketogluconic hòa tan ZnO ức chế tuyến trùng Meloidogyne incognita trên rễ cà chua, và tiết lysozyme đối kháng vi khuẩn gây cháy lá mía Xanthomonas albilineans.

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

Chương 2 trình bày chi tiết danh mục vật liệu sinh học, hóa chất, thiết bị và các quy trình thực nghiệm. Văn bản mô tả danh mục các cặp mồi PCR chuyên biệt sử dụng để khuếch đại gen 16S rRNA và ba gen giữ nhà (dnaK, groEL, rpoB), cùng thành phần phản ứng khuếch đại và chu trình nhiệt chuẩn.

Quy trình phân lập vi khuẩn acetic định hướng kích thích sinh trưởng thực vật được thiết lập qua 4 bước nối tiếp: tăng sinh mẫu trong môi trường vô đạm LGI lỏng, phân lập trên môi trường LGI đĩa thạch, kiểm tra đặc tính làm tan CaCO3 trên môi trường thạch GECA và kiểm tra khả năng oxy hóa ethanol/lên men glucose. Bố trí thực nghiệm của luận án được phân định thành 4 nội dung thí nghiệm tương ứng với cấu trúc phân tích tại Chương 3:

  1. Thu thập, phân lập và phân loại phát sinh loài 141 chủng vi khuẩn acetic.
  2. Thí nghiệm khảo sát hoạt tính PGPR của chủng Nguyenibacter vanlangensis TN01LGI^T và VTH-AC01.
  3. Thí nghiệm phân loại phân tử và khảo sát đặc tính của chủng Neoasaia sp. VTH-Ai107 so với chủng chuẩn Neoasaia chiangmaiensis TBRC 1^T.
  4. Thí nghiệm phân loại đa pha đề xuất loài mới Acetobacter sacchari sp. nov. đối với hai chủng VTH-Ai14 và VTH-Ai15.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ – THẢO LUẬN

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm thu được qua các hợp phần:

  1. Thu thập và định danh 141 chủng vi khuẩn acetic: Từ các mẫu đất và mô thực vật tại các vùng canh tác lúa, mía phía nam Việt Nam, luận án đã phân lập và tuyển chọn được 141 chủng vi khuẩn acetic mang đặc trưng làm tan CaCO3 trên thạch GECA, tế bào Gram âm, hiếu khí. Phân tích phát sinh loài dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rRNA định danh 141 chủng phân lập thuộc 6 chi khác nhau: Acetobacter, Gluconacetobacter, Nguyenibacter, Asaia, Neoasaia và Tanticharoenia. Toàn bộ trình tự gen 16S rRNA của 141 chủng đã được đăng ký và cấp mã truy cập chính thức trên ngân hàng dữ liệu quốc tế GenBank/EMBL/DDBJ.

  2. Xác định đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật của loài Nguyenibacter vanlangensis: Nghiên cứu trên chủng chuẩn Ng. vanlangensis TN01LGI^T và chủng phân lập VTH-AC01 đã chứng minh các đặc tính PGPR:

  • Cố định đạm: Cả hai chủng phát triển ổn định qua các lần cấy chuyền trên môi trường LGI bán rắn và LGI thạch, tạo sinh khối màu vàng cam đặc trưng.
  • Chuyển hóa khoáng lân và kẽm: Cả hai chủng tạo vòng tan lân rõ nét trên đĩa thạch Pikovskaya bổ sung 0,1% Ca3(PO4)2 ở ngày nuôi cấy thứ 3; trong môi trường lỏng Pikovskaya chứa 0,5% Ca3(PO4)2, hàm lượng phospho hòa tan tăng dần qua 5 ngày theo dõi. Cả hai chủng cũng tạo vòng tan kẽm trên môi trường thạch chứa 0,1% ZnO ở ngày thứ 3.
  • Sinh tổng hợp auxin: Chủng TN01LGI^T và VTH-AC01 đều có khả năng sinh tổng hợp hormone IAA tiết vào môi trường nuôi cấy.
  • Tăng cường biểu hiện gen kháng bệnh ở thực vật: Thử nghiệm trên cây mô hình Arabidopsis thaliana PR1::GUS một tuần tuổi ghi nhận cả hai chủng TN01LGI^T và VTH-AC01 đều kích hoạt mạnh sự biểu hiện của gen chỉ thị gus, chứng minh khả năng kích ứng tính kháng bệnh ở thực vật thông qua kích hoạt gen pr-1.

  1. Định danh và khảo sát đặc tính của chủng Neoasaia sp. VTH-Ai107: Phân tích phát sinh loài trình tự 16S rRNA (chiều dài 1.393 base) theo 3 phương pháp NJ, MP, ML và kết quả lai tương đồng DNA-DNA bộ gen khẳng định chủng VTH-Ai107 thuộc loài Neoasaia chiangmaiensis (tương đồng cao với chủng chuẩn AC28^T = TBRC 1^T). Nghiên cứu đã ghi nhận các phát hiện sinh học mới về loài này: tế bào có chu mao giúp di động (khác với công bố ban đầu), có khả năng tổng hợp polysaccharide dạng levan tạo màng nhầy từ sucrose ở ngày nuôi cấy thứ 3 và thứ 5, và tiết sắc tố tan màu nâu ra môi trường. Cả hai chủng VTH-Ai107 và TBRC 1^T đều có khả năng sinh trưởng trên môi trường vô đạm LGI và sinh tổng hợp IAA sau 7 ngày nuôi cấy.

  2. Mô tả và đề xuất loài mới Acetobacter sacchari sp. nov.: Nghiên cứu phân loại đa pha đối với hai chủng VTH-Ai14 và VTH-Ai15 phân lập từ cây mía tại tỉnh Bình Phước:

  • Vị trí phát sinh loài: Cây phát sinh loài gen 16S rRNA và cây phát sinh loài tổ hợp một phần ba gen giữ nhà (dnaK, groEL, rpoB) xếp hai chủng VTH-Ai14 và VTH-Ai15 vào một nhánh độc lập trong chi Acetobacter, có quan hệ họ hàng gần nhất với Acetobacter nitrogenifigens TBRC 15^T và Acetobacter aceti NBRC 14818^T.
  • Tương đồng DNA-DNA và tỷ lệ % G+C: Mức độ tương đồng DNA-DNA bộ gen giữa VTH-Ai14/VTH-Ai15 với A. nitrogenifigens TBRC 15^T và A. aceti NBRC 14818^T đều thấp hơn ngưỡng định danh loài (dưới 70%), chứng minh đây là một loài mới riêng biệt.
  • Đặc điểm kiểu hình và hóa phân loại: Tế bào hình que Gram âm, di động nhờ chu mao (nghiên cứu đồng thời ghi nhận lại chủng chuẩn A. nitrogenifigens TBRC 15^T cũng di động bằng chu mao chứ không phải tiên mao ở cực như mô tả trước đây). Chủng VTH-Ai14 và VTH-Ai15 sinh trưởng tốt ở pH 3,5, sinh trưởng trong môi trường chứa 0,35% acid acetic, oxy hóa mạnh acetate và lactate, sinh dihydroxyacetone (DHA) từ glycerol, sinh hợp chất γ-pyrone từ D-glucose. Thành phần ubiquinone chính là UQ-9. Dữ liệu phổ khối protein MALDI-TOF MS và thành phần acid béo tế bào thể hiện sự sai khác rõ rệt so với các loài lân cận.
  • Đặc tính kích thích sinh trưởng: Cả hai chủng VTH-Ai14 và VTH-Ai15 đều duy trì sinh khối trên môi trường vô đạm LGI qua 4 lần cấy chuyền, tạo vòng hòa tan muối Ca3(PO4)2 trên thạch Pikovskaya, tạo vòng tan ZnO trên thạch LGI bổ sung 1% glucose và 1% sucrose, và sinh tổng hợp hormone auxin IAA sau 7 ngày nuôi cấy trong môi trường LGI.
  • Đề xuất loài mới: Hai chủng được định danh là loài mới Acetobacter sacchari sp. nov. (Vu et al. 2019), với chủng chuẩn là VTH-Ai14^T. Chủng chuẩn và chủng tham khảo VTH-Ai15 đã được cấp chứng nhận lưu trữ chính thức tại 4 bộ sưu tập giống chuẩn: VTCC (Việt Nam), BCC và TBRC (Thái Lan), NRIC (Nhật Bản).

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án xác định 4 đóng góp mới về mặt khoa học lý luận và thực tiễn:

  1. Là công trình đầu tiên nghiên cứu đa dạng vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật tại Việt Nam, thiết lập cơ sở dữ liệu phân tử và nguồn gen vi sinh vật bản địa cho nhóm này.
  2. Là công trình đầu tiên phát hiện và chứng minh thực nghiệm các đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật ở loài Nguyenibacter vanlangensis (thuộc chi đơn loài Nguyenibacter), bao gồm khả năng cố định đạm, hòa tan phospho và kẽm khó tan, sinh tổng hợp auxin IAA và kích hoạt biểu hiện gen chỉ thị kháng bệnh pr-1 ở thực vật.
  3. Định danh chính xác chủng phân lập VTH-Ai107 thuộc chi hiếm gặp Neoasaia là loài Neoasaia chiangmaiensis mang các đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật; đồng thời phát hiện và đính chính các đặc điểm nhận diện loài này: có khả năng sinh chất nhầy levan và tế bào di động nhờ chu mao, khác biệt với mô tả công bố ban đầu.
  4. Phát hiện, mô tả và công bố quốc tế một loài vi khuẩn acetic mới kích thích sinh trưởng thực vật là Acetobacter sacchari sp. nov. (Vu et al. 2019) với chủng chuẩn VTH-Ai14^T; đồng thời bổ sung các đặc trưng sinh lý sinh hóa cho loài Acetobacter nitrogenifigens và xác định lại đặc điểm tế bào di động nhờ chu mao thay vì tiên mao ở cực như y văn trước đây ghi nhận.

Về mặt ứng dụng và kiến nghị:

  • Luận án cung cấp bộ sưu tập 141 chủng vi khuẩn acetic bản địa đã được lưu giữ và định danh phân tử, đóng góp trực tiếp vào ngân hàng gen vi sinh vật phục vụ nông nghiệp sinh học.
  • Đề xuất tiếp tục nghiên cứu thử nghiệm hiệu lực sinh học của các chủng Acetobacter sacchari (VTH-Ai14^T, VTH-Ai15), Nguyenibacter vanlangensis (TN01LGI^T, VTH-AC01) và Neoasaia chiangmaiensis VTH-Ai107 trên quy mô nhà lưới và ngoài đồng ruộng đối với cây mía, cây lúa.
  • Khai thác tiềm năng sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh đa năng kết hợp khả năng cố định đạm, giải lân, giải kẽm và phòng vệ sinh học nhằm giảm thiểu phân bón hóa học trong canh tác nông nghiệp.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án:

  • Phạm vi thu mẫu thực địa chỉ tập trung tại các vùng canh tác mía và lúa ở một số tỉnh phía nam Việt Nam, chưa bao quát toàn diện các vùng sinh thái nông nghiệp khác trên toàn quốc.
  • Các đánh giá về khả năng kích hoạt phản ứng kháng bệnh thực vật của chủng Nguyenibacter vanlangensis mới chỉ thực hiện trên hệ thống cây mô hình chuyển gen trong điều kiện phòng thí nghiệm (Arabidopsis thaliana PR1::GUS), chưa tiến hành đánh giá trên cây trồng nông nghiệp thực tế bị lây nhiễm mầm bệnh ngoài tự nhiên.
  • Dữ liệu di truyền của đa số các chủng phân lập chủ yếu dựa trên trình tự gen 16S rRNA và một số gen giữ nhà đại diện, chưa giải mã toàn bộ bộ gen (Whole Genome Sequencing - WGS) cho tất cả các chủng thu thập.

Hướng nghiên cứu tiếp:

  • Mở rộng phạm vi điều tra, thu thập vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật từ các cây trồng khác (cà phê, ngô, cây ăn trái) tại miền Trung và miền Bắc Việt Nam.
  • Giải trình tự toàn bộ bộ gen của các chủng chuẩn mới (Acetobacter sacchari VTH-Ai14^T) và các chủng PGPR tiềm năng nhằm làm sáng tỏ toàn bộ cụm gen chức năng liên quan đến hoạt tính nitrogenase, tổng hợp IAA và các con đường truyền tín hiệu kích kháng.
  • Nghiên cứu công nghệ lên men thu sinh khối lớn, công thức phối trộn chất mang và đánh giá thời hạn bảo quản chế phẩm vi sinh để ứng dụng sản xuất phân bón sinh học thương phẩm.

Giá trị tham khảo

Luận án có giá trị tham khảo chuyên môn đối với các nhóm đối tượng:

  1. Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Vi sinh vật học, Công nghệ sinh học và Di truyền học: Luận án cung cấp quy trình phân loại học đa pha mẫu mực đối với vi khuẩn, kết hợp giải phẫu kiểu hình, hóa phân loại (HPLC ubiquinone, sắc ký acid béo, MALDI-TOF MS) và phân tích phát sinh loài đa locus (dnaK, groEL, rpoB, 16S rRNA) theo đúng chuẩn mực quốc tế về mô tả loài mới.
  2. Các nhà khoa học trong lĩnh vực Nông nghiệp sinh học và Nông học: Luận án cung cấp các quy trình thí nghiệm chuẩn hóa nhằm đánh giá hoạt tính kích thích sinh trưởng thực vật của vi sinh vật nội sinh và vùng rễ (cố định đạm vi hiếu khí, định lượng lân/kẽm hòa tan, đo phổ sắc ký IAA, và thử nghiệm cảm ứng gen kháng bệnh pr-1 với mô hình chuyển gen).
  3. Doanh nghiệp sản xuất phân bón vi sinh và nhà quản lý tài nguyên sinh học: Cung cấp nguồn gen vi khuẩn bản địa có lý lịch phân loại học rõ ràng, đã đăng ký tại các bộ sưu tập chuẩn quốc tế (VTCC, TBRC, NRIC), hỗ trợ công tác bảo tồn đa dạng sinh học theo luật định và mở ra hướng phát triển sản phẩm phân bón hữu cơ sinh học thay thế hóa chất.

Phần đáng tham khảo nhất trong văn bản là Chương 2 (các quy trình sàng lọc PGPR trên môi trường LGI và hệ thống mồi PCR) và Chương 3 (bảng đối chiếu kiểu hình, hóa học và mức độ tương đồng DNA-DNA giữa loài mới Acetobacter sacchari với các loài họ hàng gần).

Câu hỏi thường gặp

  1. Loài mới được phát hiện trong luận án có tên là gì và chủng chuẩn được phân lập từ đâu? Loài vi khuẩn acetic mới được phát hiện và công bố là Acetobacter sacchari sp. nov. (Vu et al. 2019). Chủng chuẩn của loài là VTH-Ai14^T, được phân lập từ mẫu cây mía thu thập tại tỉnh Bình Phước, Việt Nam. Chủng chuẩn này cùng chủng tham khảo VTH-Ai15 đã được đăng ký và cấp mã lưu trữ tại 4 bộ sưu tập giống vi sinh vật: VTCC (Việt Nam), BCC và TBRC (Thái Lan), NRIC (Nhật Bản).

  2. Loài Nguyenibacter vanlangensis thể hiện những đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật cụ thể nào? Qua thực nghiệm trên chủng chuẩn TN01LGI^T và chủng VTH-AC01, loài Nguyenibacter vanlangensis biểu hiện đồng thời 4 đặc tính PGPR: (1) sinh trưởng trên môi trường vô đạm LGI qua nhiều lần cấy chuyền (cố định đạm); (2) tạo vòng tan lân và làm tăng phospho hòa tan trong môi trường chứa Ca3(PO4)2; (3) tạo vòng tan kẽm trên môi trường chứa ZnO; (4) sinh tổng hợp hormone auxin IAA; và (5) kích hoạt mạnh sự biểu hiện của gen kháng bệnh pr-1 (thông qua chỉ thị enzym GUS) trên cây mô hình Arabidopsis thaliana PR1::GUS một tuần tuổi.

  3. Luận án đã ghi nhận phát hiện mới hoặc đính chính đặc điểm tế bào nào ở hai loài Neoasaia chiangmaiensis và Acetobacter nitrogenifigens? Đối với loài Neoasaia chiangmaiensis (chủng VTH-Ai107 và chủng chuẩn TBRC 1^T), nghiên cứu phát hiện loài này có khả năng sinh polysaccharide levan tạo chất nhầy và tế bào di động nhờ chu mao (khác biệt với các mô tả công bố trước đó). Đối với Acetobacter nitrogenifigens (chủng chuẩn TBRC 15^T), luận án đính chính đặc điểm tế bào của loài này là di động bằng chu mao, bác bỏ mô tả trong y văn trước đây cho rằng loài này di động nhờ tiên mao ở cực.

  4. Trong 19 chi vi khuẩn acetic đã biết, những chi nào được văn bản xếp vào nhóm hiếm gặp và chi nào có số lượng loài lớn nhất? Theo luận án, có 14 chi vi khuẩn acetic được xếp vào nhóm hiếm gặp (thường chỉ có 1 đến 2 loài đã công bố), bao gồm: Acidomonas, Kozakia, Swaminathania, Saccharibacter, Neoasaia, Granulibacter, Tanticharoenia, Ameyamaea, Neokomagataea, Endobacter, Nguyenibacter, Swingsia, Bombella và Commensalibacter. Ngược lại, chi có số lượng loài lớn nhất trong họ Acetobacteraceae là Acetobacter với 28 loài, tiếp theo là Komagataeibacter (15 loài) và Gluconobacter (14 loài).

  5. Tổng số chủng vi khuẩn acetic thu thập trong nghiên cứu là bao nhiêu và dữ liệu di truyền được quản lý như thế nào? Luận án đã thu thập, phân lập và chọn lọc được 141 chủng vi khuẩn acetic từ khu vực canh tác lúa và mía ở các tỉnh phía nam Việt Nam. Toàn bộ 141 chủng này đã được phân tích giải trình tự gen 16S rRNA và đăng ký nộp dữ liệu, được cấp mã truy cập chính thức trên các ngân hàng dữ liệu di truyền quốc tế GenBank/EMBL/DDBJ. Riêng các chủng tiềm năng thuộc loài mới và chi hiếm gặp được phân tích bổ sung ba gen giữ nhà (dnaK, groEL, rpoB) và lưu giữ tại các bảo tàng giống chuẩn quốc tế.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Vũ Thị Lan Hương là công trình nghiên cứu hệ thống về phân loại học đa pha và phát sinh loài của nhóm vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập tại miền Nam Việt Nam. Nghiên cứu đã xây dựng cơ sở dữ liệu cho 141 chủng vi khuẩn bản địa, phát hiện các đặc tính kích thích sinh trưởng và kích kháng bệnh thực vật ở chi đặc hữu Nguyenibacter, bổ sung và đính chính các đặc điểm sinh học của chi hiếm gặp Neoasaia. Thành tựu khoa học nổi bật của luận án là việc phát hiện, mô tả và công bố quốc tế loài mới Acetobacter sacchari sp. nov., đóng góp nguồn gen vi sinh vật hữu ích cho phát triển phân bón sinh học và bảo tồn đa dạng sinh học nông nghiệp.