Tổng quan luận án
Luận án tiến sĩ với đề tài "Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus Parvo type 2 (CPV2) gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của một số chủng CPV2 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam" do nghiên cứu sinh Võ Văn Hải thực hiện tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Bùi Trần Anh Đào và PGS. Lê Văn Phan. Công trình thuộc ngành Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi, mã số chuyên ngành 9 64 01 02, được bảo vệ và xuất bản năm 2023.
+-----------------------------------------------------------------------------------------------+
| THÔNG TIN TỔNG QUAN VỀ CÔNG TRÌNH LUẬN ÁN |
+--------------------------+--------------------------------------------------------------------+
| Tên luận án | Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy |
| | do virus Parvo type 2 (CPV2) gây ra và đặc điểm sinh học phân tử |
| | của một số chủng CPV2 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam |
| Tác giả thực hiện | Võ Văn Hải |
| Cán bộ hướng dẫn | PGS. Bùi Trần Anh Đào; PGS. Lê Văn Phan |
| Chuyên ngành & Mã số | Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi (Mã số: 9 64 01 02) |
| Cơ sở đào tạo | Học viện Nông nghiệp Việt Nam |
| Năm hoàn thành | 2023 |
| Hướng tiếp cận | Nghiên cứu hỗn hợp (bệnh lý học lâm sàng, mô bệnh học, |
| | hóa mô miễn dịch kết hợp sinh học phân tử và phân tích phả hệ) |
+--------------------------+--------------------------------------------------------------------+
Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu
Bệnh viêm ruột tiêu chảy do Canine Parvovirus type 2 (CPV2) là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ biến và nguy hiểm nhất trên loài chó, đặc trưng bởi tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong cao, có thể lên đến 90 - 100% nếu không được điều trị kịp thời. Bệnh gây tổn thương nghiêm trọng đường tiêu hóa và hệ thống miễn dịch, thường gặp ở chó dưới một năm tuổi và chó chưa được phòng bệnh bằng vắc xin. Kể từ khi xuất hiện lần đầu vào cuối thập niên 1970, CPV2 liên tục biến đổi di truyền nhanh chóng, hình thành các biến chủng kháng nguyên mới như CPV2a, CPV2b và CPV2c thay thế chủng gốc ban đầu.
Tại Việt Nam, sau ca bệnh đầu tiên được phát hiện vào năm 1994, cả ba biến chủng đã được ghi nhận lưu hành, trong đó CPV2c chiếm ưu thế trong các năm gần đây. Tuy nhiên, các nghiên cứu trong nước trước đây chủ yếu tập trung phân tích một phần vùng gen VP2 phục vụ phân loại chủng cục bộ. Nghiên cứu mang tính hệ thống kết hợp đồng thời giữa đặc điểm bệnh lý (lâm sàng, biến đổi sinh lý sinh hóa máu, tổn thương đại thể, vi thể), việc ứng dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch (IHC) để xác định mức độ phân bố kháng nguyên vi rút trong các cơ quan nội tạng và giải trình tự toàn bộ hệ gen (whole genome) của các chủng CPV2 đang lưu hành tại Việt Nam vẫn còn thiếu hụt. Đây chính là khoảng trống khoa học mà luận án xác định và giải quyết.
Mục tiêu nghiên cứu
- Mục tiêu tổng quát: Xác định các đặc điểm bệnh lý cơ bản của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do vi rút parvo gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của các chủng vi rút parvo phân lập được tại một số tỉnh Miền Bắc Việt Nam để định hướng công tác chẩn đoán, điều trị bệnh trên lâm sàng và chế tạo vắc xin phòng bệnh trong tương lai.
- Mục tiêu cụ thể:
- Mục tiêu 1: Xác định tỷ lệ mắc bệnh, đặc điểm sinh lý sinh hóa máu, triệu chứng, bệnh tích đại thể, bệnh tích vi thể của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do vi rút parvo gây ra, mức độ gây hại đến các cơ quan bộ phận của vi rút parvo trong cơ thể chó mắc bệnh, nhằm đưa ra các khuyến cáo cho công tác phòng trị bệnh.
- Mục tiêu 2: Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của vùng gen VP2 và trên toàn bộ bộ gen CPV2 phân lập được tại một số tỉnh Miền Bắc Việt Nam, từ đó cung cấp thông tin cập nhật về các chủng vi rút parvo đang lưu hành, làm căn cứ định hướng chế tạo vắc xin phòng bệnh.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Các cá thể chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 và các mẫu vi rút parvo phân lập được từ chó mắc bệnh mang đến khám và điều trị tại các phòng khám thú y.
- Phạm vi không gian: Hệ thống Thú y 2Vet và một số phòng khám thú y tại khu vực miền Bắc Việt Nam (gồm 4 tỉnh, thành phố: Hà Nội, Bắc Giang, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh); Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y và Bộ môn Bệnh lý thú y - Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Phạm vi thời gian: Công trình được thực hiện từ tháng 01 năm 2017 đến tháng 12 năm 2021.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Các hướng nghiên cứu trên thế giới
Vi rút parvo được phát hiện lần đầu vào năm 1967 (Binn & cs.) với tên gọi CPV-1 gây bệnh nhẹ hoặc không triệu chứng. Năm 1978, chủng CPV2 bùng phát tại Hoa Kỳ gây viêm ruột và viêm cơ tim nghiêm trọng (Appel & cs., 1979; Kelly, 1978; Parrish & cs., 1988). Sau đó, vi rút tiến hóa thành CPV2a (1979), CPV2b (1984) và CPV2c được phát hiện đầu tiên tại Ý năm 2000 (Buonavoglia & cs., 2001) với đột biến thay thế acid amin Asp-426-Glu trên protein vỏ VP2. Decaro & cs. (2006, 2007) đã chứng minh chủng CPV2c lưu hành tại Đức từ năm 1996 trước khi được công bố tại Ý.
Nghiên cứu về mối quan hệ phát sinh loài cho thấy CPV2 có nguồn gốc từ vi rút giảm bạch cầu ở mèo (FPV) hoặc vi rút từ động vật hoang dã thông qua đột biến cho phép liên kết với thụ thể transferrin của chó (TfR) type 1 (Truyen & cs.; Allison & cs.; Hueffer & cs.). Sự khác biệt giữa FPV và CPV2 được xác định tại các vị trí acid amin 93 (Lys sang Asn), 103 (Val sang Ala) và 323 (Asp sang Asn) trên protein VP2 (Chang & cs.; Parrish, 1991a).
Về mặt bệnh học và cận lâm sàng, các tác giả quốc tế như Hoskins (1997), Pollock & Carmichael (1982), Macartney & cs., Smith & cs. đã làm rõ cơ chế vi rút hướng tới các tế bào phân chia nhanh (biểu mô mầm ruột tại tuyến Lieberkühn, mô lympho, tủy xương), dẫn đến hoại tử tế bào mầm, teo lông nhung ruột và suy giảm bạch cầu nặng. Abhishek & Rajni (2017), Goddard & cs., Panda & cs., Otto & cs. (1997), Yilmaz & cs., Nappert & cs. đã mô tả chi tiết các hội chứng thiếu máu, giảm tiểu cầu, giảm protein máu, hạ kali máu, tăng enzym gan (AST, ALT), tăng ure máu và toan chuyển hóa. Các nghiên cứu dịch tễ phân tử tại Serbia (Milicevic & cs., 2021), Chile (Castillo & cs.), Ấn Độ (Raj & cs.; Nandi & Kumar, 2010) liên tục cập nhật sự phân bố và biến dị của các biến thể New CPV2a, CPV2b và CPV2c.
Các nghiên cứu trong nước
Tại Việt Nam, sau nghiên cứu của Nakamura & cs. (2004) xác định sự hiện diện của CPV2b, nhiều tác giả đã khảo sát đặc điểm dịch tễ và bệnh học:
- Nguyễn Văn Thanh & cs., Đặng Thị Mai Lan & cs., Trần Thị Hiếu Dân & cs. mô tả tỷ lệ chết 90 - 100%, triệu chứng tiêu chảy phân máu tanh nồng và tỷ lệ mắc cao ở lứa tuổi 2 - 3 tháng.
- Sử Thanh Long & cs. ghi nhận chó 6 - 12 tuần tuổi tại Hà Nội mắc bệnh cao nhất (53,29%), chó ngoại mẫn cảm hơn chó nội (91,42% so với 6,59%) và tỷ lệ khỏi bệnh tăng lên 70,83% khi bổ sung interferon.
- Trần Ngọc Bích & cs. (2013) tại Cần Thơ ghi nhận tỷ lệ nhiễm bằng kit test nhanh là 45,1%, chó bệnh có số lượng hồng cầu, hemoglobin và hematocrit giảm rõ rệt, enzym AST và ALT tăng lần lượt ở 72,2% và 63,8% số ca mắc.
- Trần Đức Hoàn & Giáp Thị Huệ (2020) phân tích các chỉ số AST, ALT, ure huyết và creatinin ở chó mắc bệnh.
- Hussein Ali Mohammad Al-Bayati & cs. (2016) nghiên cứu tổn thương đại thể và vi thể ở dạ dày, ruột, lách, tim và ứng dụng hóa mô miễn dịch.
- Nguyễn Hương Quỳnh & Võ Tấn Đại (2015), Đoàn Thị Thanh Hương & cs. (2017), Hoàng Minh & cs. (2019), Trương Quang Lâm & cs. (2021) khảo sát tỷ lệ lưu hành của các biến chủng CPV2a, CPV2b và CPV2c.
- Nguyễn Mạnh Tường & cs. (2020) phân tích 59 mẫu dương tính tại Việt Nam, ghi nhận 58 mẫu là chủng CPV2c thuộc nhánh di truyền Asia-4, có sự tương đồng nucleotide từ 99,5% đến 99,8%.
Vị trí và khoảng trống luận án giải quyết
Luận án kế thừa các kết quả nghiên cứu dịch tễ và sinh học phân tử trong nước, đồng thời khắc phục khoảng trống nghiên cứu bằng việc thiết lập một công trình đồng bộ: khảo sát dịch tễ học lâm sàng, xét nghiệm huyết học - sinh hóa định lượng, giải phẫu bệnh tích đại thể và vi thể, lần đầu tiên áp dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch (IHC) để định vị kháng nguyên CPV2 trên 9 cơ quan nội tạng, giải trình tự đoạn gen VP2 (12 chủng) và giải mã toàn bộ hệ gen (8 chủng) nhằm xác định nguồn gốc phát sinh loài và sự truyền lây giữa các loài động vật ăn thịt tại miền Bắc Việt Nam.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Cơ sở lý thuyết và khung phân tích
- Phân loại sinh học: Canine Parvovirus thuộc chi Protoparvovirus, họ Parvoviridae, nằm trong loài Carnivore protoparvovirus 1.
- Cấu trúc bộ gen: Vi rút có bộ gen DNA sợi đơn dạng thẳng (~5,2 kb), gồm hai khung đọc mở (ORF): ORF1 mã hóa cho các protein phi cấu trúc (NS1, NS2; kích thước 2007 nt) và ORF2 mã hóa cho các protein cấu trúc (VP1, VP2; kích thước 2262 nt, trong đó gen VP2 có chiều dài 1755 nt). Capsid cấu tạo từ 60 tiểu đơn vị protein (VP1 chiếm 5 - 6 bản sao, VP2 chiếm 54 - 55 bản sao).
- Cơ chế bệnh sinh: Lây truyền qua đường phân - miệng trực tiếp hoặc gián tiếp. Vi rút nhân lên ban đầu tại các mô lympho vùng hầu họng, hạch lympho màng treo ruột và tuyến ức, sau đó vào máu (ngày 1 - 5 sau nhiễm) và hướng tới các tế bào phân chia nhanh ở gốc lông nhung ruột non (tuyến Lieberkühn) và tủy xương, phá hủy hàng rào niêm mạc ruột gây tiêu chảy xuất huyết, mất nước, mất chất điện giải và suy giảm miễn dịch nặng.
+----------------------------------------------------------------------------------------------------+
| KHUNG PHƯƠNG PHÁP VÀ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU TRONG LUẬN ÁN |
+--------------------------+------------------------------------+------------------------------------+
| Hạng mục nghiên cứu | Phương pháp / Kỹ thuật áp dụng | Công cụ / Thiết bị / Tiêu chuẩn |
+--------------------------+------------------------------------+------------------------------------+
| Chẩn đoán & Dịch tễ | Khám lâm sàng, dịch tễ học | Kit test nhanh CPV Ag; xét nghiệm |
| | Xét nghiệm xác nhận | PCR khuếch đại gen đặc hiệu |
+--------------------------+------------------------------------+------------------------------------+
| Huyết học & Sinh hóa | Phân tích chỉ số máu (n = 36) | Máy xét nghiệm máu tự động |
+--------------------------+------------------------------------+------------------------------------+
| Giải phẫu bệnh lý | Mổ khám đại thể | Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8402:2010 |
| | Làm tiêu bản mô bệnh học vi thể | Kỹ thuật nhuộm Haematoxylin - Eosin|
+--------------------------+------------------------------------+------------------------------------+
| Phân bố kháng nguyên | Hóa mô miễn dịch (IHC) | Kháng thể kháng CPV LS-C57655, |
| | | khử peroxidase, cơ chất DAB |
+--------------------------+------------------------------------+------------------------------------+
| Sinh học phân tử | Tách chiết DNA | Kit QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) |
| | Khuếch đại gen theo chuẩn OIE 2017 | Phản ứng PCR, điện di gel agarose |
| | Giải trình tự nucleotide | Phương pháp Sanger |
+--------------------------+------------------------------------+------------------------------------+
| Tin sinh học | Căn chỉnh chuỗi nucleotide & aa | Phần mềm Geneious Prime, BioEdit |
| | Xây dựng cây phả hệ phát sinh loài | Phần mềm MEGA X (Neighbor-Joining, |
| | | Bootstrap 1000 lần lặp) |
+--------------------------+------------------------------------+------------------------------------+
Nguồn tư liệu và dữ liệu nghiên cứu
- Mẫu bệnh phẩm thu thập từ các cá thể chó có biểu hiện viêm ruột tiêu chảy nghi nhiễm CPV2 tại Hà Nội, Bắc Giang, Vĩnh Phúc và Bắc Ninh trong giai đoạn 2017 - 2021.
- Tập hợp 12 chủng vi rút parvo phân lập được trong nghiên cứu: VNUA/C17, VNUA/C31, VNUA/C32, VNUA/C35, VNUA/CPV152-Hanoi, VNUA/CPV153-VP, VNUA/CPV175-BG, VNUA/CPV376-BN, VNUA/CPV379-VP, VNUA/CPV380-Hanoi, VNUA/CPV384-BN và VNUA/CPV385-HNa.
- Dữ liệu trình tự đối chiếu thu thập từ cơ sở dữ liệu GenBank (các chủng chuẩn quốc tế và các chủng phân lập tại Việt Nam, Ý, Trung Quốc).
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương này tổng hợp cơ sở lý thuyết và các công bố khoa học trong và ngoài nước về vi rút parvo trên chó:
- Trình bày đặc điểm sinh học, phân loại học, cấu tạo bộ gen, cấu trúc không gian 3 chiều của capsid và cơ chế tiến hóa chuyển đổi vật chủ từ mèo sang chó thông qua các đột biến liên kết thụ thể TfR.
- Phân tích dịch tễ học, cơ chế sinh bệnh học, triệu chứng lâm sàng thể đường ruột và thể cơ tim, cùng các biến đổi bệnh lý đại thể và vi thể trên các cơ quan.
- Đánh giá các phương pháp chẩn đoán (ELISA, HA, IHC, PCR, giải trình tự gen), các phác đồ hồi sức cấp cứu lâm sàng (truyền dịch Ringer Lactate, bổ sung kali clorua, glucose, dung dịch keo, huyết tương tươi đông lạnh FFP, thuốc chống nôn metoclopramide, kháng sinh, kháng viêm/giảm đau, interferon) và các quy trình phòng bệnh bằng vắc xin nhược độc (MLV).
Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Chương này mô tả chi tiết vật liệu, quy trình kỹ thuật và thiết bị thực nghiệm:
- Tiêu chuẩn thu thập mẫu bệnh phẩm và phương pháp thu thập số liệu dịch tễ trực tiếp tại các phòng khám thú y.
- Quy trình chẩn đoán nhanh bằng kit test CPV Ag và xác định mẫu dương tính bằng phản ứng PCR.
- Phương pháp phân tích các chỉ tiêu sinh lý máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hemoglobin, hematocrit) và sinh hóa máu (AST, ALT, ure, creatinin, protein toàn phần, albumin, globulin, các chỉ số điện giải Na+, K+, Ca2+) trên 36 cá thể chó bệnh.
- Quy trình mổ khám xác định tổn thương đại thể theo tiêu chuẩn TCVN 8402:2010; quy trình xử lý mô, đúc khối sáp, cắt lát và nhuộm Hematoxylin - Eosin (HE) tại Bộ môn Bệnh lý thú y.
- Kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC) sử dụng kháng thể đặc hiệu LS-C57655 (LSBio) và cơ chất màu DAB để xác định sự phân bố kháng nguyên vi rút trên 9 cơ quan (dạ dày, ruột non, hạch lympho màng treo, lách, gan, thận, phổi, tim, tuyến ức).
- Quy trình tách chiết DNA bằng kit QIAamp DNA Mini Kit, khuếch đại gen bằng PCR theo khuyến cáo của OIE (2017), điện di trên gel agarose, giải trình tự Sanger và phương pháp tin sinh học (Geneious Prime, BioEdit, MEGA X) để xây dựng cây phả hệ Neighbor-Joining.
Chương 3: Kết quả và thảo luận
1. Đặc điểm dịch tễ và bệnh lý lâm sàng
- Tỷ lệ mắc bệnh: Khảo sát tại các phòng khám ghi nhận tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 qua kit test nhanh đạt 15,86%. Lứa tuổi mắc bệnh tập trung cao nhất ở giai đoạn từ 2 đến 6 tháng tuổi. Tỷ lệ mắc cao nhất ở nhóm chó chưa được tiêm phòng vắc xin phòng bệnh.
- Biểu hiện lâm sàng: Triệu chứng điển hình gồm sốt cao, ủ rũ, chán ăn hoặc bỏ ăn hoàn toàn, nôn mửa liên tục, tiêu chảy dữ dội với phân loãng lẫn máu màu hồng hoặc đỏ sẫm, phân chứa nhiều dịch nhầy niêm mạc ruột và có mùi tanh đặc trưng, dẫn đến tình trạng mất nước và sụt cân nhanh chóng.
+----------------------------------------------------------------------------------------------------+
| TỔNG HỢP BIẾN ĐỔI CHỈ TIÊU SINH LÝ VÀ SINH HÓA MÁU Ở CHÓ MẮC BỆNH (n = 36) |
+--------------------------+--------------------------------+----------------------------------------+
| Nhóm chỉ tiêu | Xu hướng biến đổi chính | Ý nghĩa bệnh lý / Cơ chế sinh lý bệnh |
+--------------------------+--------------------------------+----------------------------------------+
| Hồng cầu (RBC), Hb, HCT | Giảm mạnh so với bình thường | Thiếu máu cấp do xuất huyết đường ruột |
| | | và ức chế tủy xương |
| Bạch cầu tổng số, Lympho | Giảm nghiêm trọng | Vi rút phá hủy tế bào mầm lympho |
| | | tại tủy xương và hạch |
| Tiểu cầu (PLT) | Giảm | Suy giảm sản xuất hoặc tiêu thụ ngoại vi|
| Điện giải (Na+, K+, Ca2+)| Giảm mạnh | Mất dịch qua nôn mửa và tiêu chảy |
| Protein, Albumin máu | Giảm thấp | Thất thoát protein qua mao mạch ruột |
| AST, ALT | Tăng cao | Tổn thương hoại tử tế bào gan |
| Ure máu, Creatinin | Tăng | Mất nước nặng làm giảm tưới máu thận |
| Khí máu và cân bằng acid | Giảm pH và HCO3- | Phát triển toan chuyển hóa |
+--------------------------+--------------------------------+----------------------------------------+
2. Đặc điểm bệnh tích đại thể và vi thể
- Bệnh tích đại thể: Sung huyết và xuất huyết nghiêm trọng dọc theo ống tiêu hóa, rõ rệt nhất ở niêm mạc tá tràng và không tràng; thành ruột bào mỏng, mất độ trơn bóng; lòng ruột chứa đầy dịch nhầy, máu và hơi. Hạch màng treo ruột sưng to, sung huyết và xuất huyết. Lách biến dạng, hoại tử vùng rìa. Cơ tim giãn, có điểm xuất huyết rải rác.
- Bệnh tích vi thể: Hoại tử lan rộng biểu mô niêm mạc ruột non và phá hủy cấu trúc tuyến Liberkühn; lông nhung ruột bị teo, bào mòn, đứt nát; thâm nhiễm dày đặc tế bào viêm đơn nhân ở lớp dưới niêm mạc. Tại hạch và tuyến ức có hiện tượng tiêu hủy tế bào lympho hàng loạt. Thận biểu hiện teo tiểu cầu thận và giãn xoang Bowman. Cơ tim thoái hóa sợi cơ và phù nề gian bào.
- Phân bố kháng nguyên vi rút (IHC): Kháng nguyên CPV2 được phát hiện dương tính tại toàn bộ 9/9 cơ quan được mổ khám. Trong đó, 100% mẫu ruột non, hạch lympho và mô gan cho phản ứng dương tính mạnh với kháng thể đặc hiệu (tạo hạt màu nâu vàng rõ nét dưới kính hiển vi quang học).
3. Đặc điểm sinh học phân tử và phân tích phả hệ
- Phân tích đoạn gen VP2 (12 chủng):
- 9/12 chủng gồm VNUA/C17, VNUA/CPV152-Hanoi, VNUA/CPV153-VP, VNUA/CPV175-BG, VNUA/CPV376-BN, VNUA/CPV379-VP, VNUA/CPV380-Hanoi, VNUA/CPV384-BN và VNUA/CPV385-HNa nằm trong nhánh phát sinh loài của Canine Parvovirus trên chó.
- 3/12 chủng gồm VNUA/C31, VNUA/C32 và VNUA/C35 nằm trên nhánh phát sinh của vi rút parvo gây bệnh cho mèo (Feline Panleukopenia Virus - FPV), có mối quan hệ di truyền rất gần gũi với các chủng FPV phân lập trên mèo tại Trung Quốc (mã số truy cập GenBank: DQ474235, DQ474237, KY094114). Đây là bằng chứng cho thấy có sự lây nhiễm tự nhiên vi rút FPV từ mèo sang chó tại miền Bắc Việt Nam.
- Phân tích toàn bộ hệ gen (8 chủng):
- Hệ gen giải mã của 8 chủng có độ dài 4269 nucleotide, bao gồm ORF mã hóa gen phi cấu trúc (NS: 2007 nt) và ORF mã hóa gen cấu trúc (VP: 2262 nt, với vùng gen VP2 dài 1755 nt).
- Phân tích chuỗi nucleotide ghi nhận sự xuất hiện của các đột biến thay thế nucleotide trên cả vùng gen cấu trúc lẫn phi cấu trúc.
- Cây phả hệ toàn bộ hệ gen khẳng định cả 8 chủng CPV2 giải mã đều thuộc cùng nhánh phát sinh genotype Asia-4, cùng phân nhóm với các chủng phân lập tại Việt Nam giai đoạn 2017 - 2018 (mã GenBank: MT106228 – MT106237, theo Nguyen Manh & cs., 2020) và chủng CPV/IZSSI/2743/17 phân lập tại Ý năm 2017 (Mira & cs.).
Chương 4: Kết luận và kiến nghị
Chương này đúc kết toàn bộ các kết quả đạt được về tỷ lệ mắc dịch tễ, triệu chứng, chỉ tiêu máu, tổn thương giải phẫu bệnh, phân bố kháng nguyên và đặc tính di truyền phân tử của CPV2; đưa ra các kiến nghị ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng, phác đồ điều trị hỗ trợ và định hướng lựa chọn chủng vi rút lưu hành để sản xuất vắc xin phòng bệnh tại Việt Nam.
Kết quả và những đóng góp mới
Đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học
- Cung cấp dữ liệu nghiên cứu hệ thống đồng thời về đặc điểm bệnh lý học và giải mã toàn bộ hệ gen (whole genome) của các chủng CPV2 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam.
- Lần đầu tiên tại Việt Nam sử dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch (IHC) để chứng minh và định lượng sự phân bố kháng nguyên CPV2 trên 9 cơ quan nội tạng của chó mắc bệnh tự nhiên, xác nhận tỷ lệ dương tính 100% tại ruột, hạch lympho và gan.
- Cung cấp bằng chứng di truyền phân tử về sự lây truyền chéo của vi rút giảm bạch cầu ở mèo (FPV) sang chó (3/12 chủng nghiên cứu: VNUA/C31, VNUA/C32, VNUA/C35 có trình tự gen VP2 thuộc nhánh FPV có quan hệ gần với các chủng tại Trung Quốc).
- Xác định đặc tính hệ gen dài 4269 nt của 8 chủng CPV2 tại miền Bắc thuộc nhánh tiến hóa di truyền genotype Asia-4, đồng nhất với các chủng CPV2c ghi nhận ở Việt Nam giai đoạn 2017 - 2018 và chủng phân lập tại Ý năm 2017.
Đóng góp mới về mặt thực tiễn và ứng dụng
- Thiết lập cơ sở dữ liệu bệnh lý học thực chứng (huyết học, sinh hóa máu, giải phẫu đại thể - vi thể) giúp bác sĩ thú y nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán lâm sàng, chẩn đoán phân biệt và tiên lượng diễn tiến bệnh.
- Cung cấp thông tin di truyền chi tiết về các biến dị nucleotide và acid amin của các chủng CPV2 đang lưu hành, làm cơ sở khoa học phục vụ việc lựa chọn chủng giống để sản xuất vắc xin phòng bệnh phù hợp và chế tạo kháng thể, kháng nguyên đặc hiệu dùng cho các bộ kit chẩn đoán tại Việt Nam.
Kiến nghị và giải pháp đề xuất
- Áp dụng các quy trình chẩn đoán kết hợp giữa kit test nhanh và PCR nhằm phát hiện sớm ca bệnh, đặc biệt chú ý kiểm soát các cá thể chó ở lứa tuổi mẫn cảm từ 2 đến 6 tháng tuổi chưa được tiêm vắc xin.
- Trong điều trị, cần ưu tiên hồi sức tích cực bằng truyền dịch Ringer Lactate qua đường tĩnh mạch để bù nước và điện giải trong vòng 1 - 6 giờ đầu, theo dõi sát lượng kali và glucose máu, phối hợp thuốc chống nôn (metoclopramide, ondansetron), kháng sinh chống bội nhiễm vi khuẩn cơ hội và áp dụng dinh dưỡng đường ruột sớm qua ống thông mũi.
- Tiếp tục thực hiện các nghiên cứu giám sát dịch tễ phân tử định kỳ trên diện rộng đối với cả đàn chó và mèo để theo dõi chiều hướng tiến hóa của genotype Asia-4 và hiện tượng lây truyền vi rút parvo liên loài.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của nghiên cứu
- Phạm vi thu thập mẫu bệnh phẩm dịch tễ và phân lập vi rút tập trung chủ yếu tại một số tỉnh và thành phố thuộc khu vực miền Bắc Việt Nam (Hà Nội, Bắc Giang, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh), chưa bao quát toàn bộ các vùng sinh thái trên phạm vi cả nước.
- Số lượng chủng được giải trình tự toàn bộ hệ gen dừng lại ở 8 chủng trong tổng số 12 chủng phân lập được do giới hạn kỹ thuật và nguồn lực nghiên cứu.
- Các khảo sát biến đổi huyết học và sinh hóa máu được thực hiện trên cỡ mẫu lâm sàng gồm 36 cá thể chó bệnh.
- Chưa thực hiện các thử nghiệm gây nhiễm thực nghiệm trên động vật sạch mầm bệnh trong điều kiện phòng thí nghiệm đối với các chủng FPV phân lập được từ chó để đánh giá độc lực và cơ chế biến đổi tương tác thụ thể.
Hướng nghiên cứu tiếp theo
- Mở rộng quy mô giải mã toàn bộ hệ gen các chủng CPV2 thu thập tại miền Trung và miền Nam nhằm xây dựng bản đồ dịch tễ phân tử hoàn chỉnh của CPV2 tại Việt Nam.
- Nghiên cứu sâu hơn về đặc tính gây bệnh của các biến chủng FPV lây nhiễm trên chó thông qua các mô hình thực nghiệm in vivo và nuôi cấy tế bào in vitro.
- Ứng dụng các chủng vi rút CPV2 thuộc genotype Asia-4 phân lập được vào quy trình nghiên cứu, thử nghiệm chế tạo vắc xin tái tổ hợp và sinh phẩm chẩn đoán đặc hiệu phục vụ thực tiễn ngành thú y.
Giá trị tham khảo
+----------------------------------------------------------------------------------------------------+
| GIÁ TRỊ THAM KHẢO CỦA CÔNG TRÌNH THEO ĐỐI TƯỢNG VÀ LĨNH VỰC |
+--------------------------+------------------------------------+------------------------------------+
| Nhóm đối tượng | Lĩnh vực ứng dụng chính | Nội dung chuyên mục giá trị |
+--------------------------+------------------------------------+------------------------------------+
| Nghiên cứu sinh, | Bệnh lý học thú y, | Cơ sở lý luận về tổn thương vi thể,|
| Học viên, Giảng viên | Sinh học phân tử vi rút học | kỹ thuật hóa mô miễn dịch (IHC) và |
| | | phương pháp phân tích phả hệ MEGA X|
+--------------------------+------------------------------------+------------------------------------+
| Bác sĩ thú y lâm sàng | Khám chữa bệnh thú nhỏ, | Dữ liệu biến đổi huyết học, |
| | Hồi sức cấp cứu thú cưng | sinh hóa máu (n=36), triệu chứng |
| | | lâm sàng và phác đồ can thiệp |
+--------------------------+------------------------------------+------------------------------------+
| Cơ sở sản xuất sinh phẩm,| Nghiên cứu phát triển vắc xin, | Dữ liệu trình tự toàn bộ hệ gen |
| Doanh nghiệp vắc xin | Chế tạo kit chẩn đoán kháng nguyên | 4269 nt và cấu trúc nhánh Asia-4 |
| | | để lựa chọn chủng đích phù hợp |
+--------------------------+------------------------------------+------------------------------------+
| Cơ quan dịch tễ thú y | Giám sát dịch bệnh truyền nhiễm | Bằng chứng lây truyền liên loài |
| | trên động vật cảnh | giữa mèo (FPV) và chó (CPV) |
+--------------------------+------------------------------------+------------------------------------+
Câu hỏi thường gặp
1. Tỷ lệ nhiễm bệnh CPV2 trên chó tại khu vực nghiên cứu được xác định là bao nhiêu và lứa tuổi nào có nguy cơ mắc bệnh cao nhất?
Theo kết quả điều tra tại các phòng khám thú y được trình bày trong luận án, tỷ lệ chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 được chẩn đoán xác định bằng kit test nhanh kháng nguyên là 15,86%. Lứa tuổi mắc bệnh phổ biến nhất là chó con trong giai đoạn từ 2 đến 6 tháng tuổi, và phần lớn các cá thể mắc bệnh đều thuộc nhóm chưa được tiêm phòng vắc xin đầy đủ.
2. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch (IHC) trong luận án đã ghi nhận sự phân bố của kháng nguyên CPV2 tại những cơ quan nào?
Kỹ thuật hóa mô miễn dịch sử dụng kháng thể đặc hiệu LS-C57655 và cơ chất DAB đã phát hiện kháng nguyên CPV2 tại toàn bộ 9/9 cơ quan nội tạng được lấy mẫu kiểm tra từ chó mắc bệnh. Trong đó, tỷ lệ phát hiện dương tính đạt 100% tại các mẫu mô ruột non, hạch lympho và gan, chứng minh bản chất của CPV2 là gây nhiễm trùng toàn thân nghiêm trọng.
3. Phân tích cây phả hệ vùng gen VP2 của 12 chủng phân lập mang lại phát hiện quan trọng nào về nguồn gốc vi rút?
Phân tích phả hệ dựa trên gen VP2 cho thấy trong 12 chủng nghiên cứu, có 9 chủng thuộc nhánh Canine Parvovirus truyền thống trên chó, nhưng có 3 chủng (VNUA/C31, VNUA/C32 và VNUA/C35) lại nằm trên nhánh phát sinh của vi rút giảm bạch cầu ở mèo (FPV) và có quan hệ gần gũi với các chủng FPV phân lập tại Trung Quốc (mã GenBank: DQ474235, DQ474237, KY094114). Đây là bằng chứng khẳng định sự lây nhiễm tự nhiên của vi rút từ mèo sang chó tại thực địa.
4. Cấu trúc toàn bộ hệ gen của các chủng CPV2 được giải mã trong nghiên cứu có đặc điểm gì?
Toàn bộ hệ gen của 8 chủng CPV2 giải mã có chiều dài 4269 nucleotide, gồm hai khung đọc mở (ORF): gen phi cấu trúc NS dài 2007 nt và gen cấu trúc VP dài 2262 nt (trong đó gen VP2 dài 1755 nt). Cả 8 chủng đều thuộc cùng nhánh tiến hóa genotype Asia-4, đồng nhánh với các chủng phân lập tại Việt Nam giai đoạn 2017 - 2018 và chủng CPV/IZSSI/2743/17 phân lập tại Ý năm 2017.
5. Những chỉ tiêu huyết học và sinh hóa máu nào có sự biến đổi rõ rệt nhất ở chó mắc bệnh?
Kết quả phân tích trên 36 cá thể chó bệnh ghi nhận sự suy giảm đồng loạt của số lượng hồng cầu (RBC), hemoglobin (Hb), hematocrit (HCT) (biểu hiện thiếu máu nặng), giảm số lượng bạch cầu tổng số và tế bào lympho (suy giảm miễn dịch), giảm tiểu cầu, sụt giảm protein huyết tương, albumin và các chất điện giải (Na+, K+, Ca2+). Đồng thời, các enzym nội bào AST, ALT và chỉ số ure máu tăng cao rõ rệt.
Kết luận
Luận án tiến sĩ của tác giả Võ Văn Hải là công trình khoa học toàn diện về bệnh viêm ruột tiêu chảy do Canine Parvovirus type 2 trên chó tại khu vực miền Bắc Việt Nam giai đoạn 2017 - 2021. Luận án đã làm sáng tỏ các đặc điểm dịch tễ lâm sàng, sự biến đổi chỉ tiêu huyết học - sinh hóa máu, các tổn thương mô bệnh học đại thể, vi thể và lần đầu tiên chứng minh sự hiện diện của kháng nguyên vi rút trên 9/9 cơ quan bằng phương pháp hóa mô miễn dịch. Về mặt sinh học phân tử, nghiên cứu đã giải mã trình tự vùng gen VP2 (12 chủng) và toàn bộ hệ gen dài 4269 nt (8 chủng), xác định các chủng CPV2 lưu hành thuộc genotype Asia-4, đồng thời phát hiện bằng chứng di truyền về sự truyền lây của vi rút FPV từ mèo sang chó. Các kết quả này đóng vai trò là cơ sở khoa học quan trọng cho công tác chẩn đoán, xây dựng phác đồ điều trị và định hướng tuyển chọn chủng phục vụ sản xuất vắc xin phòng bệnh tại Việt Nam.
