MỞ ĐẦU Bê ̣nh máu hay còn go ̣ i là bê ̣nh của hê ̣ ta ̣o máu khiế n máu có tình tra ̣ng bấ t thường. Bê ̣nh máu có thể do nguyên phát (chức năng ta ̣o máu b ị khiế m khuyế t bẩ m sinh hoă ̣c thay đổ i ác tính trong thành phầ n tuỷ xương ) hoặc do thứ phát (thiế u dinh dưỡng, rố i loa ̣n trao đổ i chấ t , các yếu tố vật lý , hoá học, ô nhiễm…). Các rối loạn thường gă ̣p trong bê ̣nh máu là thiế u máu , xuấ t huyế t , bê ̣nh máu trắ ng , ung thư tuỷ xương, ung thư ha ̣ch và số lươ ̣ng các loa ̣i tế bào máu tăng lên hoă ̣ c giảm đi. Các bê ̣nh liên quan đế n hê ̣ t ạo máu là b ệnh phức tạp, khó chữa, có tỷ lệ tử vong cao, là một thách thức lớn cho ngành y học.
Sự tạo thành tế bào máu là một quá trình tăng sinh và biệt hoá của tế bào gốc tạo máu ở tuỷ xương theo cơ chế điều hoà phức tạp nhưng rất chặt chẽ, nhịp nhàng với sự tham gia của các yếu tố như tế bào gốc tạo máu, vi môi trường tạo máu và các yếu tố kích thích tạo máu bao gồm các cytokine. Những nghiên cứu gần đây cho thấy yếu tố vi môi trường là các yếu tố tác động gần, có vai trò trung gian tạo thuận lợi cho sự sinh máu. Sự có mặt các cytokine sẽ kích thích tế bào gốc tăng sinh và hướng biệt hoá theo định hướng cụ thể từng dòng. Trong bốn nhóm của cytokine là interferon, interleukin, yếu tố hoại tử khối u, yếu tố tăng trưởng, interleukin đóng vai trò trung gian trong việc liên kết với thụ thể đặc hiệu để điều khiển các hoạt động của tế bào như sự tăng sinh, biệt hóa, phân chia và chết.
Mỗi loại interleukin có vai trò khác nhau trong hệ miễn dịch, trong đó interleukin-11 (IL-11) kích thích sự biệt hóa của các tế bào gốc tạo máu và tế bào tiền mẫu tiểu cầu, đồng thời kích thích chúng trưởng thành để sản xuất tiểu cầu. Do đó, IL-11 được coi là một yếu tố tăng trưởng tạo máu và được làm dược phẩm điều trị các bệnh liên quan đến hệ tạo máu. Năm 1997, loại interleukin đầu tiên được Cục Quản lý Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) cấp phép điều trị bệnh thiếu hụt tiểu cầu và giảm bớt nhu cầu truyền tiểu cầu cho các bệnh nhân ung thư sau hoá trị liệu chính là IL-11 người tái tổ hợp dưới tên thương mại là Neumega (Kaye, 1998). Việc sản xuất protein có thể được cải thiện nếu như phương pháp biểu hiện protein ở trạng thái tan được phát triển đặc 2 biệt là ở những hệ biểu hiện đơn giản như vi khuẩn.
Tuy nhiên, IL-11 là một protein khó được biểu hiện dạng đơn phân tử ở tế bào Escherchia coli. Những công bố trên thế giới về loại cytokine này còn hạn chế và sản phẩm tạo ra chưa được đánh giá đặc tính sinh học một cách hệ thống. Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu trên đối tượng này không phổ biến và mới được triển khai tại Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học. Xuất phát từ mong muốn tạo ra IL-11 người tái tổ hợp giống với sản phẩm Neumega để có thể chủ động về mặt công nghệ sản xuất loại cytokine có giá trị sử dụng trong y dược, đề tài luận án với tên “Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế và bước đầu đánh giá đặc tính sinh học của Interleukin-11 người tái tổ hợp” được thực hiện với những mục tiêu sau: - Biểu hiện được protein IL-11 người tái tổ hợp ở tế bào Escherichia coli.
- Tinh chế protein IL-11 tái tổ hợp đáp ứng yêu cầu làm dược phẩm tiêm. - Bước đầu đánh giá đặc tính sinh học của IL-11 tái tổ hợp tạo ra. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Interleukin-11 và vai trò đối với hệ tạo máu 1.
Hệ tạo máu và con đường tạo tiểu cầu ở cơ thể người Máu là một loại dịch trong cơ thể lưu thông trong hệ tuần hoàn, gồm 2 thành phần chính là tế bào máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu) và huyết tương. Các loại tế bào máu trưởng thành thực hiện những chức năng chuyên môn cao như hồng cầu vận chuyển O2 và CO2; bạch cầu chống lại tác nhân lây nhiễm bằng việc tạo ra kháng thể, đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào và thực bào; tiểu cầu tham gia chức năng đông máu, khi số lượng tiểu cầu trong máu giảm sẽ xuất hiện tình trạng chảy máu (xuất huyết). Tất cả những loại tế bào máu đều có một nguồn gốc chung là tế bào gốc tạo máu. Cơ chế điều khiển quá trình biệt hóa đó liên quan đến một nhóm glycoprotein đặc hiệu có tên là các yếu tố tăng trưởng tạo máu hay còn gọi là cytokine.
Chúng có bản chất là protein tan trong nước với cách thức hoạt động theo kiểu tự tiết (autocrine), cận tiết (paracrine) và nội tiết (endocrine). Tùy vào nguồn gốc tổng hợp, chức năng và đích tác động, cytokine được chia làm các nhóm như yếu tố kích thích tạo cụm tế bào, interferon, yếu tố hoại tử khối u, lymphokine, monokine, chemokine (điều hòa các phân tử hóa hướng động) và interleukin. Cytokine có rất nhiều vai trò, nhất là với hệ miễn dịch của cơ thể như tăng sinh - phát triển - biệt hóa - apotosis và hóa hướng động (chemotaxis). Một cách cụ thể hơn, chúng điều hòa quá trình tạo máu, miễn dịch, viêm, sự phát sinh ung thư, sự hình thành và phát triển của tế bào thần kinh (Ishihara and Hirano, 2002; Zhang and Lodish, 2008).
Đối với quá trình tạo máu, cytokine đóng vai trò điều hòa sự tồn tại, tăng sinh và biệt hóa của các tế bào gốc tạo máu thành tế bào tiền thân và cuối cùng là tế bào máu trưởng thành (Hình 1. 4 Cụm mẫu tiểu cầu Tiểu cầu Mẫu tiểu cầu Bạch cầu ái kiềm Cụm mẫu bạch cầu ái kiềm Bạch cầu ái toan Tế bào gốc Cụm mẫu bạch cầu ái toan định hướng Bạch cầu trung tính dòng tủy Bạch cầu mono Cụm bạch cầu hạt-bạch cầu mono Hồng cầu lưới Cụm nguyên hồng cầu Hình 1.1: Ảnh hƣởng của các yếu tố tăng trƣởng đến quá trình biệt hóa tế bào máu (Nguồn: www.com) Cytokine truyền tín hiệu đến tế bào nhờ phức hợp các tiểu đơn vị thụ thể gồm có thụ thể gắn cytokine và thụ thể truyền tín hiệu. Chất điều hòa quan trọng của con đường truyền tín hiệu là chất truyền tín hiệu Janus kinase (Jaks) và chất hoạt hóa phiên mã STATs (Signal transducer and activators of transcription) (Ishihara and Hirano, 2002). Đầu tiên, cytokine bám vào thụ thể (chuỗi ) sau đó liên kết với thụ thể thứ hai (chuỗi ) để hình thành phức hợp hai tiểu đơn vị thụ thể ( và ) rồi hoạt hóa Jaks.
Sau khi được hoạt hóa, Jaks sẽ gắn phospho vào các vùng của thụ thể để tạo ra các vị trí có khả năng gắn với phân tử STATs. STATs gắn vào chuỗi rồi được phosphoryl hóa và tách khỏi thụ thể, hình thành dimer di chuyển đến nhân tế 5 bào, từ đó điều hòa quá trình phiên mã của gen đích (Hình 1. Bằng cơ chế hoạt động như trên , cytokine điều hòa các chức năng của tế bào như trạng thái không hoạt động, tự đổi mới, sự biệt hóa, sự phân chia và di chuyển của tế bào (Zhang and Lodish, 2008). Cytokine Dimer hóa thụ thể JAK Hoạt hóa JAK kinase và SH2 gắn phospho vào thụ thể STAT Gắn phospho vào STAT bởi JAK kinase Dimer hóa STAT DNA Phiên mã gen đặc hiệu Hình 1.2: Sơ đồ minh họa phức hợp cytokine và thụ thể truyền tín hiệu vào trong tế bào Cytokine bám vào thụ thể đặc hiệu dẫn đến dimer hóa các tiểu đơn vị thụ thể và hoạt hóa JAK kinase, gắn phospho vào thụ thể.
Các tín hiệu tạo ra từ cytokine và thụ thể được truyền tới nhân tế bào bằng các phản ứng của chất truyền tín hiệu. (Nguồn: http://www2.edu/~fpm/immunology/lectures/Chapter012.pdf) Mẫu tiểu cầu là những tế bào được biệt hóa chuyên biệt từ tế bào gốc tạo máu ở tủy xương để sản xuất tiểu cầu. Tế bào gốc sẽ lần lượt được biệt hóa thành 6 cụm mẫu tiểu cầu (CFU-Me), nguyên mẫu tiểu cầu, tiền mẫu tiểu cầu và mẫu tiểu cầu (Pang et al. Sau đó, mẫu tiểu cầu trưởng thành và bắt đầu quá trình sản xuất tiểu cầu (Italiano et al.
Cytokine tác động chủ yếu đến quá trình tạo mẫu tiểu cầu là thrombopoietin (TPO) và một số cytokine khác như IL-11, Gm- CSF, IL-3, IL-6, chemokine (SDF-1, FGF-4) (Avecilla et al. Quá trình tạo mẫu tiểu cầu có ý nghĩa quan trọng về mặt lâm sàng đối với những người bị thiếu hụt tiểu cầu đặc biệt là những trường hợp ung thư sau khi xạ trị và diệt tủy để cấy ghép tế bào gốc tạo máu vì hai phác đồ điều trị đều làm giảm tế bào mẫu tiểu cầu ở tủy xương. Những bệnh nhân đó cần nhanh chóng được phục hồi tiểu cầu ngoại vi và sự tăng sinh của mẫu tiểu cầu là giải pháp hiệu quả nhất để đáp ứng lượng tiểu cầu đã bị thiếu hụt. Truyền tiểu cầu chỉ là phương thức điều trị tạm thời nhằm cầm máu hoặc đề phòng biến chứng xuất huyết nặng.
Ngoài ra, tiểu cầu truyền vào chỉ sống được khoảng 3 – 4 ngày nên cần đợt truyền tiếp theo. Trong một số trường hợp, ở những người truyền nhiều lần, cơ thể có khả năng sinh ra kháng thể phá hủy tiểu cầu truyền vào. Hiện nay trên thế giới, có một loại thuốc được biết đến là thuốc sinh tiểu cầu (thrombopoietic agents), có bản chất là IL-11 tái tổ hợp với tên gọi là Neumega. Loại thuốc này giúp tăng trưởng và trưởng thành mẫu tiểu cầu, làm tăng số lượng tiểu cầu của bệnh nhân.
Thuốc sinh tiểu cầu mang lại chiến lược điều trị mới đầy hứa hẹn đối với bệnh xuất huyết giảm tiểu cầu do miễn dịch hoặc do giảm sinh tiểu cầu ở tủy xương. Đặc tính phân tử, cấu trúc và cơ chế hoạt động của Interleukin-11 Ở người, gen mã hóa IL-11 có kích thước 7 kb, định vị trên vai dài của nhiễm sắc thể số 19 tại vị trí 19q13.4, chứa 5 vùng exon và 4 vùng intron (McKinley et al. Mặc dù thuộc họ IL-6 nhưng gen il-11 và gen il-6 có sự tương đồng rất thấp với nhau. Một số vùng nucleotit ở đầu 5’ của gen il-11 giống đến 70% các gen mã hóa cho IL-2, IL-3, IL-9 và Gm-CSF.
Gen il-11 đã được đăng ký trên Genbank với mã số là NM_000641 gồm 3 phiên bản của 3 nhóm tác giả ký hiệu là NM_000641.