Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Việt Nam có điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa thuận lợi cho phát triển cây ăn trái với sản lượng dồi dào. Trong khi một số loại quả như thanh long, xoài cát, vú sữa, chuối, nhãn đã tiếp cận được các thị trường xuất khẩu lớn, một số loại quả khác dù đạt tiêu chuẩn VietGAP hoặc GlobalGAP vẫn gặp khó khăn trong tiêu thụ. Trái sơ ri (Malpighia glabra L), phân bố tập trung tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long (nổi bật tại Gò Công - Tiền Giang và Bình Phú - Bến Tre), là nguồn nguyên liệu có giá trị dinh dưỡng cao, đặc biệt là hàm lượng vitamin C (chiếm 4–4,5% khối lượng quả), vitamin A (408–1000 IU/100 g), vitamin nhóm B và khoáng chất.

Tuy nhiên, sơ ri có tính mùa vụ, hàm lượng nước cao (80–90%), vỏ mỏng, mô quả mềm nên rất dễ bị dập nát và hư hỏng sau thu hoạch, gây khó khăn cho bảo quản và làm suy giảm giá trị kinh tế của nông hộ. Việc nghiên cứu chế biến các dòng sản phẩm lên men có nồng độ cồn thấp từ dịch ép sơ ri là giải pháp công nghệ nhằm kéo dài thời gian bảo quản, hạn chế thất thoát sau thu hoạch và làm đa dạng hóa mặt hàng nước giải khát có nguồn gốc tự nhiên.

Đồ án đặt ra mục tiêu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men nước sơ ri nhằm đề xuất thông số công nghệ thích hợp cho quy trình sản xuất. Để hoàn thành mục tiêu, các nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể được xác định gồm:

  1. Xác định các chỉ tiêu hóa lý đặc trưng của dịch ép trái sơ ri nguyên liệu (nồng độ chất khô tan, pH, hàm lượng acid tổng số, độ nhớt động học).
  2. Khảo sát các yếu tố công nghệ ảnh hưởng đến quá trình lên men và chất lượng sản phẩm (nồng độ chất khô ban đầu, pH ban đầu, tỷ lệ cấy giống nấm men, thời gian lên men).
  3. Đề xuất quy trình công nghệ sản xuất nước uống lên men từ trái sơ ri.
  4. Đánh giá chất lượng sản phẩm thông qua đánh giá cảm quan và kiểm nghiệm chỉ tiêu vi sinh vật.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nguyên liệu: Trái sơ ri thu mua tại chợ Rạch Dừa, Phường 10, Thành phố Vũng Tàu, đạt độ chín kỹ thuật (màu hồng cam, quả nguyên vẹn, không dập nát hay hư hỏng).
  • Đối tượng vi sinh vật: Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae (chủng men nổi) dạng tiềm sinh do Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học – Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp.
  • Phạm vi thời gian và địa điểm: Đề tài thực hiện từ ngày 06/02/2017 đến ngày 19/06/2017 tại Phòng thí nghiệm Ngành Công nghệ thực phẩm, Viện Kỹ thuật – Kinh tế biển, Trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Đồ án dựa trên cơ sở lý thuyết về sinh hóa quá trình lên men rượu do nấm men Saccharomyces cerevisiae thực hiện trong điều kiện kỵ khí. Đường glucose và các loại đường có khả năng lên men trong dịch quả được nấm men hấp thu qua màng tế bào và chuyển hóa qua chuỗi phản ứng đường phân (EMP) tạo thành acid pyruvic, sau đó bị khử carboxyl thành ethanal và chuyển hóa thành ethanol cùng khí $CO_2$ theo phản ứng tổng quát:

$$C_6H_{12}O_6 + 2\text{ADP} + 2\text{H}_3\text{PO}_4 \rightarrow 2\text{C}_2\text{H}_5\text{OH} + 2\text{CO}_2 + 2\text{ATP} + 2\text{H}_2\text{O}$$

Các yếu tố công nghệ then chốt chi phối hoạt lực lên men gồm có: nồng độ cơ chất ban đầu (thích hợp trong khoảng 16–20 °Bx), nhiệt độ (tối ưu 28–30 °C), pH môi trường (khoảng 3,8–4,5 nhằm ức chế vi khuẩn tạp nhiễm), mật độ tế bào cấy ban đầu ($10^6 - 10^8$ tế bào/ml) và chế độ sục khí ban đầu để nhân sinh khối trước khi chuyển sang giai đoạn lên men yếm khí.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được tiến hành bao gồm:

  • Phương pháp vi sinh:
    • Tăng sinh nấm men trên môi trường lỏng Sabouraud cải tiến (10 g Peptone, 40 g Glucose, 10 g Agar pha trong 1000 ml nước cất, khử trùng ở 121 °C trong 20 phút, điều chỉnh pH 4–5).
    • Xác định mật độ tế bào bằng kính hiển vi quang học thông qua buồng đếm hồng cầu (Thoma/Neubauer) và pha loãng mẫu theo dãy thập phân với dung dịch NaCl 0,9%.
    • Xác định tỷ lệ tế bào sống/chết bằng phương pháp nhuộm màu xanh methylen 0,2% (tế bào chết bắt màu xanh, tế bào sống không bắt màu).
    • Huấn luyện giống nấm men bằng cách nuôi cấy thích nghi dần trong hỗn hợp môi trường Sabouraud và dịch ép sơ ri theo tỷ lệ thể tích 1:1.
  • Phương pháp hóa sinh:
    • Xác định nồng độ chất khô tan (°Bx) bằng khúc xạ kế đo độ Brix.
    • Xác định pH bằng máy đo pH điện tử (pH meter) đã hiệu chuẩn với dung dịch đệm chuẩn pH = 4.
    • Xác định acid tổng số bằng phương pháp chuẩn độ trung hòa dung dịch chiết mẫu với dung dịch chuẩn NaOH 0,1 N, chỉ thị phenolphtalein, kết quả biểu thị theo phần trăm khối lượng acid malic (hệ số chuyển đổi 0,0067).
    • Xác định độ nhớt động học ($\nu$, đơn vị cSt hay $\text{mm}^2/\text{s}$) bằng nhớt kế mao quản Ostwald với hằng số nhớt kế $C = 0,035\text{ mm}^2/\text{s}^2$ theo công thức $\nu = C \cdot t$.
    • Xác định độ cồn (%V) bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn cồn từ dịch lên men, thu hồi nước ngưng và đo độ cồn bằng khúc xạ kế chuyên dụng.
  • Phương pháp cảm quan: Đánh giá chất lượng cảm quan sản phẩm theo Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) theo phương pháp cho điểm thị hiếu kết hợp trọng số trên thang 20 điểm (thang 6 bậc từ 0 đến 5 điểm), do hội đồng 5 kiểm nghiệm viên thực hiện trên 3 chỉ tiêu: Vị (hệ số trọng số 2,0), Mùi (hệ số trọng số 1,2), Độ trong và màu sắc (hệ số trọng số 0,8).
  • Phương pháp xử lý số liệu: Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên đơn yếu tố, lặp lại 3 lần. Số liệu thu thập được xử lý thống kê mô tả, phân tích phương sai ANOVA và so sánh ý nghĩa sự khác biệt giữa các giá trị trung bình bằng kiểm định LSD (Least Significant Difference) ở mức ý nghĩa $p < 0,05$ trên phần mềm Statgraphics, vẽ đồ thị tương quan bằng Microsoft Excel.

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Phần mở đầu trình bày tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ nhu cầu thực tiễn về đa dạng hóa nước giải khát lên men tự nhiên, phân tích tiềm năng nguồn nguyên liệu sơ ri tại miền Nam và các hạn chế về công nghệ bảo quản quả tươi. Xác định rõ ràng mục tiêu nghiên cứu và 4 nhiệm vụ thực nghiệm cụ thể cần triển khai.

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về cây sơ ri và nấm men:

  • Phân loại thực vật, đặc điểm sinh trưởng và giá trị dinh dưỡng của hai giống sơ ri phổ biến tại Việt Nam: giống sơ ri chua Gò Công (năng suất cao, vị chua ngọt, phù hợp chế biến dịch ép) và giống sơ ri ngọt Bình Phú (vỏ bóng, hàm lượng đường cao).
  • Tổng hợp thành phần hóa học của quả sơ ri: hàm lượng nước cao (81,9–91,1%), glucid (6,98–14,0% gồm glucose 2,22%, fructose 3,21%, saccharose), acid hữu cơ (1–1,5% chủ yếu là acid malic, citric, tartaric), pectin (0,56–0,65%), cellulose (0,6–1,2%), vitamin C đạt tới 4500 mg/100 g phần ăn được.
  • Cơ sở phân loại, đặc điểm hình thái, chu trình tế bào và các đặc tính sinh lý của Saccharomyces cerevisiae, cơ chế biến dưỡng glucid thành ethanol và $CO_2$, ảnh hưởng của nồng độ đường, nhiệt độ, pH, oxy và cồn đối với hoạt lực nấm men.

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết nguồn nguyên liệu sơ ri, chủng giống nấm men thuần khiết, sơ đồ khối bố trí các bước thí nghiệm; quy trình thao tác phân tích vi sinh (đếm buồng đếm, nhuộm xanh methylen), phân tích hóa lý (đo Brix, đo pH, chuẩn độ acid tổng, đo độ nhớt Ostwald, chưng cất cồn); bảng mô tả chi tiết các bậc chất lượng cảm quan cho 3 chỉ tiêu Mùi, Vị, Màu sắc - Độ trong cùng công thức tính điểm và phương pháp phân tích thống kê ANOVA.

Chương 3. Kết quả và thảo luận

Chương kết quả và thảo luận trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được:

  • Động học sinh trưởng của S. cerevisiae: Xác định 4 pha sinh trưởng trong môi trường Sabouraud ở điều kiện 28–32 °C. Pha tiềm phát kéo dài từ 0 đến 12 giờ ($3,4 \times 10^7$ tế bào/ml); pha logarit từ 12 đến 24 giờ, mật độ đạt cực đại $3,4 \times 10^8$ tế bào/ml; pha ổn định kéo dài từ 24 đến 48 giờ ($2,23 \times 10^8$ tế bào/ml); pha tử vong xuất hiện sau 48 giờ (đến 72 giờ mật độ giảm còn $1,27 \times 10^8$ tế bào/ml). Thời điểm thu nhận sinh khối tối ưu được xác định ở khoảng 24–30 giờ (cuối pha log – đầu pha ổn định).
  • Chỉ tiêu hóa lý của dịch ép sơ ri nguyên liệu: Kết quả kiểm tra trên 3 lô mẫu qua các thời điểm nghiên cứu cho thấy tính ổn định cao của nguyên liệu: nồng độ chất khô tan dao động từ 8,167 đến 8,233 °Bx; pH dao động từ 3,790 đến 3,797; hàm lượng acid tổng số đạt từ 2,392 đến 2,480%; độ nhớt động học dao động trong khoảng 1,259–1,283 cSt. Với độ nhớt thấp, dịch ép sơ ri không bắt buộc phải qua công đoạn xử lý enzyme pectinase.
  • Ảnh hưởng của nồng độ chất khô tan ban đầu (18, 20, 22, 24 °Bx):
Nồng độ ban đầu (°Bx) Độ Brix còn lại sau 96h (°Bx) Độ cồn (%V) Điểm cảm quan trung bình
18 $5,767 \pm 0,058^\text{d}$ 3,0 $9,667 \pm 0,577^\text{b}$
20 $6,433 \pm 0,153^\text{c}$ 3,5 $12,667 \pm 0,577^\text{a}$
22 $7,100 \pm 0,100^\text{b}$ 4,0 $10,333 \pm 0,577^\text{b}$
24 $8,433 \pm 0,115^\text{a}$ 4,0 $10,000 \pm 1,000^\text{b}$

Mẫu 20 °Bx cho điểm cảm quan cao nhất (12,667), vị hài hòa giữa ngọt và chua nhẹ, độ cồn phù hợp nên được lựa chọn.

  • Ảnh hưởng của pH dịch lên men ban đầu (3,6; 3,8; 4,0; 4,2):
Mức pH ban đầu Độ Brix còn lại sau 96h (°Bx) Độ cồn (%V) Điểm cảm quan trung bình
3,6 $6,300 \pm 0,100^\text{b}$ 3,5 $12,333 \pm 0,577^\text{ab}$
3,8 $6,733 \pm 0,058^\text{a}$ 4,0 $13,667 \pm 1,155^\text{a}$
4,0 $6,600 \pm 0,436^\text{ab}$ 4,0 $13,000 \pm 1,000^\text{ab}$
4,2 $6,900 \pm 0,000^\text{a}$ 3,0 $11,333 \pm 1,528^\text{c}$

Mẫu có pH = 3,8 đạt điểm cảm quan vượt trội (13,667), tạo điều kiện ức chế vi sinh vật tạp nhiễm và tạo hương vị cân đối.

  • Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống nấm men (1%, 3%, 5%, 7% v/v với mật độ $2 \times 10^7$ tế bào/ml):
Tỷ lệ giống cấy (%) Độ Brix còn lại sau 96h (°Bx) Độ cồn (%V) Điểm cảm quan trung bình
1 $10,100 \pm 0,100^\text{a}$ 2,5 $11,000 \pm 1,000^\text{b}$
3 $9,333 \pm 0,058^\text{b}$ 3,5 $13,667 \pm 1,155^\text{ab}$
5 $7,200 \pm 0,100^\text{c}$ 4,0 $15,667 \pm 2,082^\text{a}$
7 $6,467 \pm 0,115^\text{d}$ 3,5 $14,000 \pm 1,732^\text{a}$

Nghiệm thức bổ sung 5% giống cho điểm cảm quan cao nhất (15,667 điểm) và độ cồn đạt chuẩn 4,0%V.

  • Ảnh hưởng của thời gian lên men (24h, 48h, 72h, 96h):
Thời gian lên men (giờ) Nồng độ chất khô tan (°Bx) Độ cồn (%V) Điểm cảm quan trung bình
24 $14,667 \pm 0,056^\text{a}$ 0,000 $10,000 \pm 1,000^\text{c}$
48 $10,000 \pm 0,010^\text{b}$ 2,633 $11,667 \pm 0,577^\text{b}$
72 $7,267 \pm 0,289^\text{c}$ 3,200 $13,000 \pm 1,000^\text{a}$
96 $6,700 \pm 0,100^\text{d}$ 4,033 $12,000 \pm 0,577^\text{b}$

Thời điểm 72 giờ cho điểm cảm quan cao nhất (13,000 điểm), độ cồn nhẹ đạt 3,2%V, giữ được hương thơm đặc trưng của sơ ri và giúp rút ngắn chu kỳ sản xuất so với mốc 96 giờ.

  • Đề xuất quy trình công nghệ: Dựa trên các kết quả khảo sát, quy trình sản xuất nước uống lên men từ trái sơ ri được xác lập gồm các công đoạn: Quả sơ ri $\rightarrow$ Phân loại $\rightarrow$ Làm sạch $\rightarrow$ Ép lấy dịch $\rightarrow$ Lọc dịch (tách bã) $\rightarrow$ Phối chế điều chỉnh dịch lên men (đưa chất khô về 20 °Bx bằng đường saccharose, điều chỉnh pH về 3,8 bằng $\text{NaHCO}_3$/acid citric) $\rightarrow$ Cấy giống nấm men S. cerevisiae đã qua huấn luyện (tỷ lệ 5% v/v, mật độ $2 \times 10^7$ tế bào/ml) $\rightarrow$ Lên men chính (72 giờ, nhiệt độ phòng 28–30 °C) $\rightarrow$ Lắng lọc tách cặn men $\rightarrow$ Chiết rót $\rightarrow$ Thành phẩm.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã xây dựng thành công bộ thông số kỹ thuật tối ưu phục vụ sản xuất nước uống lên men từ trái sơ ri ở quy mô phòng thí nghiệm:

Thông số công nghệ Giá trị tối ưu xác lập
Thời điểm thu nhận sinh khối S. cerevisiae 24–30 giờ (cuối pha log, đầu pha cân bằng)
Nồng độ chất khô tan ban đầu của dịch lên men 20 °Bx
pH ban đầu của dịch lên men 3,8
Tỷ lệ cấy giống nấm men 5% thể tích (mật độ $2 \times 10^7$ tế bào/ml)
Thời gian lên men chính 72 giờ (ở 28–30 °C)
Độ cồn sản phẩm thu được 3,2–4,0%V
Nồng độ chất khô tan dư trong sản phẩm 6,7–7,267 °Bx

Đóng góp của đồ án thể hiện ở các điểm sau:

  • Cung cấp dữ liệu thực nghiệm toàn diện về đặc tính hóa lý của dịch ép trái sơ ri tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu, chứng minh dịch quả có độ nhớt thấp (1,259–1,283 cSt) nên không cần xử lý qua enzyme pectinase, giúp giảm chi phí phụ gia trong sản xuất.
  • Xác định cụ thể chế độ phối chế và thời gian lên men tối ưu (72 giờ), đảm bảo sản phẩm đạt chất lượng cảm quan cao nhất trong khi vẫn duy trì được độ cồn nhẹ (3,2%V), phù hợp với tiêu chuẩn đồ uống giải khát lên men không qua chưng cất.
  • Tạo tiền đề kỹ thuật để giải quyết bài toán tiêu thụ nông sản sau thu hoạch, nâng cao giá trị thương phẩm cho trái sơ ri địa phương.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế:
    • Nghiên cứu chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm với thể tích lên men nhỏ (bình tam giác dung tích 100–150 ml), chưa tiến hành thử nghiệm trên hệ thống pilot hoặc thiết bị lên men bán công nghiệp (bioreactor).
    • Chưa định lượng sự biến đổi và tỷ lệ hao hụt của hàm lượng vitamin C trong suốt quá trình lên men và sau khi lắng lọc.
    • Chưa đánh giá độ ổn định chất lượng và thời hạn sử dụng của sản phẩm theo các phương pháp thanh trùng hay bảo quản khác nhau.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Khảo sát các chế độ thanh trùng/tiệt trùng và chất chống oxy hóa nhằm duy trì tối đa hàm lượng vitamin C tự nhiên và màu sắc đặc trưng của dịch sơ ri.
    • Nghiên cứu công nghệ làm trong và lọc tinh (sử dụng màng lọc hoặc chất trợ lắng) để nâng cao độ trong thương phẩm.
    • Đánh giá khả năng mở rộng quy mô lên men ở thể tích lớn hơn và phân tích hiệu quả kinh tế - kỹ thuật của quy trình.

Giá trị tham khảo

Đồ án là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên ngành Công nghệ thực phẩm, Công nghệ sinh học và Kỹ thuật sinh học, đặc biệt trong các học phần Công nghệ chế biến đồ uống lên men, Vi sinh thực phẩm và Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm.

Các nội dung có giá trị tham khảo cao trong đồ án gồm:

  • Quy trình chuẩn bị môi trường Sabouraud, kỹ thuật đếm mật độ tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu kết hợp phương pháp nhuộm sống/chết bằng xanh methylen.
  • Phương pháp luận huấn luyện giống vi sinh vật thích nghi từng bước với cơ chất dịch quả trước khi đưa vào lên men chính.
  • Phương pháp xây dựng thang điểm đánh giá cảm quan 20 điểm có trọng số (TCVN) chuyên biệt cho đồ uống lên men từ trái cây.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao đồ án không sử dụng enzyme pectinase để xử lý dịch ép sơ ri trước khi lên men?
Kết quả đo độ nhớt động học của dịch ép sơ ri qua 3 thời điểm khảo sát dao động từ 1,259 đến 1,283 cSt (rất thấp). Độ nhớt này cho thấy hàm lượng pectin hòa tan gây cản trở dòng chảy không đáng kể, do đó không cần thiết phải xử lý bổ sung enzyme pectinase mà vẫn đảm bảo hiệu suất tách dịch và lên men.

2. Thời điểm nào thích hợp nhất để thu nhận sinh khối Saccharomyces cerevisiae làm giống cấy?
Dựa trên đường cong sinh trưởng, thời điểm thu nhận sinh khối tối ưu là từ 24 đến 30 giờ (cuối pha Logarit đến đầu pha Ổn định). Tại thời điểm này, mật độ tế bào đạt trạng thái cân bằng cao ($2,23 \times 10^8 - 3,4 \times 10^8$ tế bào/ml), tế bào có hoạt lực trao đổi chất mạnh nhất, giúp tăng hiệu suất chuyển hóa đường thành cồn.

3. Tại sao mức pH ban đầu được chọn là 3,8 thay vì các mức pH cao hơn?
Mức pH = 3,8 cho điểm cảm quan trung bình cao nhất ($13,667 \pm 1,155$), độ cồn đạt 4,0%V và nồng độ chất khô tan dư ở mức vừa phải ($6,733 ^\circ\text{Bx}$). Ngoài ra, môi trường pH < 4,0 tạo điều kiện tối ưu cho nấm men phát triển và ức chế hầu hết các loại vi khuẩn tạp nhiễm trong dịch lên men.

4. Vì sao thời gian lên men được chọn là 72 giờ thay vì kéo dài đến 96 giờ?
Mặc dù ở 96 giờ độ cồn đạt 4,033%V, điểm cảm quan ở mốc 72 giờ đạt cao nhất ($13,000 \pm 1,000$ điểm so với $12,000 \pm 0,577$ điểm ở 96 giờ) nhờ giữ được hương vị hài hòa đặc trưng của quả sơ ri. Việc dừng ở 72 giờ giúp rút ngắn chu kỳ lên men và tiết kiệm chi phí năng lượng trong sản xuất.

5. Tỷ lệ cấy giống nấm men tối ưu được xác lập trong đồ án là bao nhiêu?
Tỷ lệ cấy giống tối ưu là 5% thể tích dịch ép với mật độ nấm men ban đầu $2 \times 10^7$ tế bào/ml (tương đương mật độ $10 \times 10^7$ tế bào/ml trong dịch lên men), giúp sản phẩm đạt điểm cảm quan cao nhất ($15,667 \pm 2,082$) và độ cồn đạt 4,0%V sau quá trình lên men.

Kết luận

Đồ án tốt nghiệp của tác giả Phạm Thị Yến đã hoàn thành việc khảo sát và xác lập quy trình sản xuất nước uống lên men nồng độ cồn thấp từ trái sơ ri Malpighia glabra L bằng chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae. Kết quả nghiên cứu khẳng định điều kiện công nghệ tối ưu gồm: dịch ép phối chế đạt 20 °Bx, pH = 3,8, tỷ lệ cấy giống 5% (mật độ $2 \times 10^7$ tế bào/ml) và thời gian lên men 72 giờ ở nhiệt độ phòng, tạo ra sản phẩm có độ cồn 3,2–4,0%V với chất lượng cảm quan tốt. Đề tài đóng góp giải pháp kỹ thuật có giá trị thực tiễn nhằm đa dạng hóa sản phẩm đồ uống và nâng cao giá trị sử dụng cho nguồn nông sản sơ ri tại Việt Nam.