Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong những năm gần đây, điều kiện kinh tế - xã hội phát triển và mức sống nâng cao đã thúc đẩy nhu cầu chăm sóc sức khỏe chủ động của người dân. Xu hướng sử dụng thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) để bổ sung vitamin, khoáng chất và dưỡng chất nhằm tăng cường chức năng cơ thể và phòng ngừa bệnh tật ngày càng gia tăng. Theo Nghị định số 15/2018/NĐ-CP, TPBVSK được định nghĩa là những sản phẩm dùng để bổ sung vào chế độ ăn uống hàng ngày nhằm duy trì, tăng cường, cải thiện các chức năng của cơ thể con người và giảm nguy cơ mắc bệnh.

Tuy nhiên, thị trường TPBVSK ghi nhận hiện tượng một số nhà sản xuất cố ý phối trộn trái phép các hormon sinh dục (đặc biệt là testosteron và các dẫn chất steroid) nhằm tạo hiệu quả tức thì cho sản phẩm, chẳng hạn như kích thích mọc tóc, phát triển cơ bắp, ngăn ngừa lão hóa da hoặc cải thiện sinh lý. Việc phơi nhiễm hormon sinh dục không kiểm soát qua đường thực phẩm tiềm ẩn nhiều nguy cơ sức khỏe nghiêm trọng. Các nghiên cứu dịch tễ học và độc học đã chỉ ra rằng dư lượng hormon ngoại sinh có liên quan mật thiết đến tình trạng dậy thì sớm ở trẻ em, suy giảm khả năng sinh sản, rối loạn chuyển hóa lipid, biến cố tim mạch và làm gia tăng tỷ lệ mắc các bệnh ung thư phụ thuộc hormon như ung thư vú, ung thư tử cung và ung thư tuyến tiền liệt.

Về mặt pháp lý, Bộ Y tế Việt Nam đã ban hành Thông tư số 10/2021/TT-BYT quy định danh mục chất cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh TPBVSK, trong đó testosteron là hoạt chất bị cấm tuyệt đối. Bên cạnh đó, theo Thông tư số 06/2017/TT-BYT, các hormon như testosteron, progesteron và methyltestosteron được xếp vào danh mục thuốc độc và nguyên liệu độc làm thuốc. Trên trường quốc tế, 17β-estradiol bị Chương trình Chất độc Quốc gia Hoa Kỳ liệt vào danh mục chất có khả năng gây ung thư; Chỉ thị 96/22/EC của Liên minh Châu Âu (EU) cũng nghiêm cấm sử dụng các hormon steroid cho mục đích thúc đẩy tăng trưởng trong chăn nuôi.

Để phục vụ công tác kiểm tra, giám sát chất lượng và phát hiện hành vi gian lận thương mại, khóa luận đặt ra hai nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

  1. Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích xác định đồng thời một số hormon sinh dục gồm progesteron (PG), testosteron (TS) và 17β-estradiol (E2) trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS).
  2. Ứng dụng quy trình đã thẩm định để khảo sát, định lượng các hormon sinh dục trong một số mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe đang lưu thông trên thị trường.

Đối tượng nghiên cứu bao gồm 3 chất phân tích chuẩn (progesteron, testosteron, 17β-estradiol) và nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe thuộc 3 dạng bào chế phổ biến: dạng viên cứng (viên nén, viên nang cứng), dạng nang mềm và dạng lỏng. Phạm vi thực nghiệm được triển khai tại Bộ môn Hóa phân tích và Kiểm nghiệm thuốc – Trường Đại học Dược Hà Nội phối hợp cùng Khoa Độc học Dị nguyên – Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia (NIFC), thực hiện khảo sát 16 mẫu TPBVSK thu thập ngẫu nhiên tại các nhà thuốc trên địa bàn thành phố Hà Nội và các sàn thương mại điện tử trong năm 2023.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên cơ sở hóa học phân tích hiện đại về các hợp chất steroid và kỹ thuật sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần (LC-MS/MS). Về mặt cấu trúc hóa học, hormon sinh dục thuộc nhóm steroid dẫn xuất từ nhân cyclopentanoperhydrophenanthren, có tính phân cực trung bình hoặc kém tan trong nước, tan tốt trong các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, acetonitril.

Phương pháp phân tích khối phổ hoạt động dựa trên nguyên tắc tách các ion phân tử trong pha khí theo tỷ số khối lượng trên điện tích ($m/z$). Hệ thống khối phổ ba tứ cực (Triple Quadrupole) sử dụng chế độ ion hóa phun điện tử (ESI) ở chế độ ion dương ($ESI^+$) kết hợp kỹ thuật theo dõi đa phản ứng (MRM - Multiple Reaction Monitoring). Tại tứ cực thứ nhất ($Q_1$), ion mẹ được chọn lọc; tại tứ cực thứ hai ($Q_2$), ion mẹ bị phân mảnh do va chạm với khí trơ ($N_2$) dưới tác dụng của thế va chạm (CID - Collision Induced Dissociation); tại tứ cực thứ ba ($Q_3$), các ion con đặc trưng được cô lập để đưa vào đầu dò, đảm bảo tính đặc hiệu tuyệt đối và loại trừ nhiễu nền từ các ma trận phức tạp.

Quy trình thẩm định phương pháp được thiết kế và đánh giá tuân thủ nghiêm ngặt theo các hướng dẫn chuẩn hóa quốc tế:

  • Hướng dẫn của Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thống: AOAC International (2016) - Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance Requirements.
  • Hướng dẫn của Hội nghị quốc tế về hài hòa hóa các thủ tục đăng ký dược phẩm: ICH Q2(R1) (2005) - Validation of Analytical Procedures.
  • Tiêu chí nhận dạng của Ủy ban Châu Âu (EC) về phân tích dư lượng bằng khối phổ (đáp ứng tối thiểu 4 điểm nhận dạng IP: 1 ion mẹ = 1 điểm, 2 ion con = 2 x 1,5 = 3 điểm; dung sai tỷ lệ ion $R_{diff}%$ nằm trong giới hạn cho phép).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

  • Tối ưu hóa thông số khối phổ: Khảo sát chế độ quét scan, SIM và MRM để tìm ion mẹ, 2 mảnh ion con (1 mảnh định lượng, 1 mảnh định tính) và năng lượng va chạm (CE) thích hợp cho từng hoạt chất.
  • Tối ưu hóa điều kiện sắc ký lỏng: Khảo sát 7 hệ pha động khác nhau trên cột pha đảo Symmetry® C18 ($150 \times 3,0\text{ mm}; 3,5\text{ }\mu\text{m}$) nhằm tối ưu hình dạng peak, độ đối xứng và cường độ tín hiệu ion hóa.
  • Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu: Thực nghiệm đơn biến khảo sát loại dung môi chiết (acetonitril, methanol, ethanol tuyệt đối), nhiệt độ siêu âm (nhiệt độ phòng, 40°C, 60°C, 80°C), thời gian siêu âm (5, 15, 30, 60, 120 phút) và chất hấp phụ làm sạch (than hoạt tính so với pha tĩnh C18).
  • Đánh giá ảnh hưởng nền mẫu ($ME%$): So sánh độ dốc đường chuẩn trong dung môi và trên 3 nền mẫu trắng (viên cứng, nang mềm, dạng lỏng) theo công thức: $$ME (%) = \frac{a_{\text{nền mẫu trắng}} - a_{\text{dung môi}}}{a_{\text{dung môi}}} \times 100%$$
  • Thẩm định toàn diện các chỉ tiêu: Độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu/chọn lọc, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), khoảng tuyến tính, độ đúng (thông qua độ thu hồi) và độ lặp lại ($RSD%$).

Nguồn dữ liệu của khóa luận là các kết quả đo thực nghiệm trực tiếp thu nhận trên hệ thống thiết bị LC-MS/MS Sciex Triple Quad 6500 đặt tại Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia.

Nội dung chính theo từng chương

Đặt vấn đề và Tổng quan

Chương tổng quan hệ thống hóa cơ sở lý thuyết về phân loại, cấu trúc hóa học và dược lý học của hormon steroid. Tác giả phân tích chuyên sâu vai trò sinh lý và các tác dụng không mong muốn nghiêm trọng khi cơ thể tiếp xúc với hormon sinh dục ngoại sinh kéo dài:

  • Progesteron ($C_{21}H_{30}O_2, M = 314,5\text{ g/mol}, \log P = 3,87$): Dư thừa gây rối loạn kinh nguyệt, tích lũy mỡ, xơ vữa động mạch.
  • Testosteron ($C_{19}H_{28}O_2, M = 288,4\text{ g/mol}, \log P = 3,32$): Lạm dụng gây teo tinh hoàn, giảm sản xuất tinh trùng ở nam giới; gây nam hóa, rậm lông, vô kinh ở nữ giới; gây ứ mật, vàng da và tăng huyết áp.
  • 17β-Estradiol ($C_{18}H_{24}O_2, M = 272,4\text{ g/mol}, \log P = 4,01$): Tăng nguy cơ ung thư nội mạc tử cung, ung thư vú, chứng vú to ở nam giới và rối loạn đông máu.

Chương này cũng tổng hợp các công trình phân tích hormon sinh dục trong và ngoài nước trên các nền mẫu sinh học, thực phẩm và môi trường. Các phương pháp như HPLC-UV/DAD hoặc GC-MS/MS bộc lộ nhiều hạn chế khi phân tích nền mẫu thực phẩm chức năng: HPLC-UV thiếu độ nhạy và tính chọn lọc ở hàm lượng vết, trong khi GC-MS/MS đòi hỏi quy trình tạo dẫn xuất phức tạp và tốn thời gian. Do đó, kỹ thuật LC-MS/MS được xác định là công cụ tối ưu nhờ độ chọn lọc cao, độ nhạy vượt trội và quy trình xử lý mẫu linh hoạt.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết các nguyên vật liệu, hóa chất và quy trình thực nghiệm:

  • Chất chuẩn: Testosteron (độ tinh khiết 99,33%), Progesteron (độ tinh khiết 99,85%), 17β-Estradiol (độ tinh khiết 95,88%). Hóa chất và dung môi đạt tiêu chuẩn phân tích LC-MS.
  • Thiết bị chính: Hệ thống khối phổ ba tứ cực LC-MS/MS Sciex Triple Quad 6500, cột sắc ký Symmetry C18 ($150\text{ mm} \times 3,0\text{ mm}, 3,5\text{ }\mu\text{m}$), cân phân tích Mettler Toledo.
  • Thiết kế khảo sát điều kiện sắc ký với 7 hệ pha động phối hợp giữa pha nước (chứa phụ gia acid formic, acid acetic, amoni format, amoni acetat) và pha hữu cơ (ACN, MeOH).
  • Thiết kế khảo sát xử lý mẫu: Cân 1,0 g mẫu, khảo sát dung môi chiết, điều kiện siêu âm và phương pháp làm sạch dịch chiết bằng kỹ thuật chiết phân tán pha rắn.
  • Quy trình thẩm định theo tiêu chuẩn AOAC và ICH: Đánh giá độ lặp lại và độ thu hồi tại 3 mức nồng độ với 6 lần lặp lại độc lập ($n=6$).

Thực nghiệm, kết quả và bàn luận

Chương thực nghiệm trình bày toàn bộ số liệu tối ưu hóa và kết quả thẩm định phương pháp:

1. Tối ưu hóa điều kiện khối phổ và sắc ký:

  • Thông số nguồn ion $ESI^+$: Điện thế ion hóa (IS) = 5500 V, nhiệt độ nguồn (TEM) = 400°C, áp suất khí rèm (CUR) = 35 psi, khí va chạm (CAD) = 7 psi, khí nguồn GS1 = 40 psi, GS2 = 40 psi.
  • Cặp ion phân mảnh MRM ($m/z$) và năng lượng va chạm (CE):
    • Progesteron: Ion mẹ $315 \rightarrow$ ion định lượng $97\text{ }m/z$ ($\text{CE} = 26\text{ eV}$), ion định tính $109\text{ }m/z$ ($\text{CE} = 30\text{ eV}$).
    • Testosteron: Ion mẹ $289 \rightarrow$ ion định lượng $97\text{ }m/z$ ($\text{CE} = 26\text{ eV}$), ion định tính $109\text{ }m/z$ ($\text{CE} = 26\text{ eV}$).
    • 17β-Estradiol: Ion mẹ $255 \rightarrow$ ion định lượng $173\text{ }m/z$ ($\text{CE} = 8\text{ eV}$), ion định tính $159\text{ }m/z$ ($\text{CE} = 20\text{ eV}$).
  • Lựa chọn pha động: Hệ pha động số 7 gồm pha A ($\text{HCOONH}_4\text{ }10\text{ mM} + \text{HCOOH }0,1%$ trong nước) và pha B ($\text{ACN}$) cho hình dạng peak cân đối nhất, diện tích peak cao nhất và thời gian lưu tối ưu (PG: 6,96 phút; TS: 6,06 phút; E2: 3,81 phút). Chương trình gradient dung môi vận hành trong 10 phút với tốc độ dòng 0,5 mL/phút, thể tích tiêm 10 $\mu\text{L}$.

2. Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu:

  • Dung môi chiết: Ethanol tuyệt đối cho tín hiệu diện tích peak cao nhất ($1,59 \times 10^5$), vượt trội hơn so với ACN ($1,36 \times 10^5$) và MeOH ($1,32 \times 10^5$).
  • Nhiệt độ siêu âm: 60°C cho hiệu suất chiết tối ưu ($3,63 \times 10^3$), tương đương mức 80°C ($3,59 \times 10^3$) nhưng hạn chế nguy cơ sinh tạp phân hủy.
  • Thời gian siêu âm: 30 phút cho đáp ứng tín hiệu cao nhất ($6,44 \times 10^3$).
  • Làm sạch dịch chiết: Sử dụng 100 mg chất hấp phụ C18 cho tín hiệu peak đạt $21,20 \times 10^4$, cao gấp hơn 5 lần so với than hoạt tính ($4,03 \times 10^4$) do than hoạt tính hấp phụ giữ lại cả chất phân tích.
  • Quy trình chuẩn hóa: Cân 1,0 g mẫu $\rightarrow$ thêm 20 mL EtOH tuyệt đối $\rightarrow$ vortex 1 phút $\rightarrow$ siêu âm ở 60°C trong 30 phút $\rightarrow$ ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút $\rightarrow$ gạn dịch và định mức thành 20 mL $\rightarrow$ lấy 1 mL dịch chiết vào ống chứa 100 mg C18 $\rightarrow$ vortex 1 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút $\rightarrow$ lọc qua màng 0,22 $\mu\text{m}$ trước khi tiêm LC-MS/MS.

3. Đánh giá ảnh hưởng nền và thẩm định phương pháp:

  • Ảnh hưởng nền ($ME%$): Nền mẫu gây tăng tín hiệu đối với PG (+21,26% đến +27,39%) và gây ức chế/tăng tín hiệu đối với TS (-13,24% đến +22,01%), ức chế mạnh đối với E2 (-23,77% đến -29,15%). Do $ME%$ vượt ngưỡng $\pm 20%$, tác giả kết luận bắt buộc phải sử dụng đường chuẩn pha trên nền mẫu trắng (matrix-matched calibration) để định lượng chính xác.
  • Thẩm định: Toàn bộ tiêu chí về độ phù hợp hệ thống ($RSD < 2%$), độ đặc hiệu (IP = 4 điểm, sai lệch tỷ số ion $R_{diff}%$ đạt chuẩn Châu Âu), khoảng tuyến tính ($R \ge 0,9986$), LOQ, LOD, độ thu hồi ($85,2% - 108,0%$) và độ lặp lại ($RSD% \le 5,17%$) đều đạt yêu cầu của AOAC và ICH.

4. Kết quả phân tích mẫu thực tế:

  • Phân tích 16 mẫu TPBVSK thương mại: phát hiện 3 mẫu dương tính với hormon sinh dục (chiếm tỷ lệ 18,75%).
    • Mẫu M2 (viên nang cứng hỗ trợ xương khớp): phát hiện PG với hàm lượng $0,75\text{ mg/kg}$.
    • Mẫu M5 (viên nén dưỡng da, bổ sung nội tiết): phát hiện testosteron (chất cấm) với hàm lượng vết khoảng $0,05\text{ mg/kg}$.
    • Mẫu M13 (viên nang cứng hỗ trợ xương khớp): phát hiện PG với hàm lượng $0,60\text{ mg/kg}$.

Kết luận và Đề xuất

Tóm tắt các mục tiêu đã hoàn thành, khẳng định phương pháp có độ tin cậy cao, quy trình xử lý mẫu kinh tế và đề xuất các hướng phát triển tiếp theo nhằm kiểm soát an toàn thực phẩm.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã xây dựng thành công một quy trình phân tích hoàn chỉnh, có độ tin cậy cao để định lượng đồng thời 3 hormon sinh dục (PG, TS, E2) trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe.

Thông số thẩm định Progesteron (PG) Testosteron (TS) 17β-Estradiol (E2) Tiêu chuẩn chấp nhận (AOAC/ICH)
Thời gian lưu ($t_R$, phút) $6,96 \pm 0,01$ ($RSD = 0,15%$) $6,06 \pm 0,01$ ($RSD = 0,17%$) $3,81 \pm 0,01$ ($RSD = 0,11%$) $RSD \le 2%$
Độ lặp lại diện tích peak ($RSD%$) $1,79%$ $1,11%$ $1,58%$ $RSD \le 2%$
Giới hạn phát hiện (LOD) $0,12\text{ mg/kg}$ $0,12\text{ mg/kg}$ $1,21\text{ mg/kg}$ $S/N \ge 3$ (tính từ $\text{LOQ}/3,3$)
Giới hạn định lượng (LOQ) $0,40\text{ mg/kg}$ $0,40\text{ mg/kg}$ $4,00\text{ mg/kg}$ $S/N = 10 - 20$
Khoảng tuyến tính $20 - 200\text{ ppb}$ $20 - 200\text{ ppb}$ $0,2 - 2,0\text{ ppm}$ $R \ge 0,995$
Hệ số tương quan ($R$) trên 3 nền mẫu $0,9988 - 0,9999$ $0,9986 - 0,9999$ $0,9990 - 0,9998$ Đạt yêu cầu ($R \ge 0,995$)
Độ thu hồi trên nền viên cứng $99,4% - 106,5%$ $99,0% - 108,0%$ $85,2% - 105,5%$ $80 - 110%$
Độ thu hồi trên nền nang mềm $99,4% - 106,5%$ $97,0% - 105,0%$ $94,1% - 106,0%$ $80 - 110%$
Độ thu hồi trên nền dạng lỏng $94,4% - 104,0%$ $98,0% - 107,0%$ $97,0% - 105,0%$ $80 - 110%$
Độ lặp lại ($RSD%$) trên 3 nền mẫu $0,60% - 2,71%$ $0,75% - 3,12%$ $1,39% - 5,17%$ $< 11%$ (với E2), $< 15%$ (với PG, TS)

Kết quả khảo sát 16 mẫu thực tế trên thị trường được tổng hợp chi tiết:

Ký hiệu mẫu Dạng bào chế Công dụng quảng cáo chính Kết quả phát hiện hoạt chất
M1, M3, M6 - M10 Viên nén Hỗ trợ xương khớp / Tăng cường sinh lý $< \text{LOQ}$
M2 Viên nang cứng Hỗ trợ giảm đau khớp, tái tạo sụn Dương tính: Progesteron ($0,75\text{ mg/kg}$)
M4, M12, M14, M15 Viên nang cứng Tăng cường nội tiết / Bổ khớp $< \text{LOQ}$
M5 Viên nén Làm đẹp da, chống lão hóa, bổ sung nội tiết nữ Dương tính: Testosteron ($\approx 0,05\text{ mg/kg}$) (Chất cấm)
M11 Viên nang mềm Bổ sung nội tiết tố $< \text{LOQ}$
M13 Viên nang cứng Giảm thoái hóa khớp, tăng dịch khớp Dương tính: Progesteron ($0,60\text{ mg/kg}$)
M16 Dạng lỏng Tăng cường sức khỏe sinh lý $< \text{LOQ}$

Đóng góp khoa học và thực tiễn của khóa luận:

  • Đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam công bố quy trình phân tích đồng thời 3 hormon sinh dục (PG, TS, E2) trên các dạng bào chế phức tạp của TPBVSK bằng kỹ thuật LC-MS/MS.
  • Đã tối ưu hóa được quy trình xử lý mẫu sử dụng dung môi thân thiện, sẵn có và kinh tế hơn (ethanol tuyệt đối) kết hợp kỹ thuật làm sạch phân tán bằng C18 trực tiếp trong ống ly tâm falcon. Quy trình này rút ngắn đáng kể thời gian chuẩn bị mẫu, giảm thiểu dung môi độc hại và tiết kiệm chi phí vận hành so với phương pháp chiết qua cột SPE nhiều giai đoạn trong các y văn trước đây.
  • Cung cấp dữ liệu thực nghiệm quan trọng chứng minh sự tồn tại của việc trộn trái phép hormon sinh dục (chất cấm testosteron và progesteron) trong các sản phẩm TPBVSK lưu hành tự do, đóng góp cơ sở dữ liệu cho các cơ quan quản lý nhà nước trong công tác hậu kiểm an toàn thực phẩm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

  • Thời gian chiết mẫu bằng siêu âm kéo dài (30 phút ở 60°C) để đảm bảo hòa tan hoàn toàn các hormon trong nền mẫu rắn/dầu.
  • Nền mẫu TPBVSK chứa nhiều thành phần tá dược và hoạt chất phức tạp gây ảnh hưởng nền ($ME%$) đáng kể, buộc phòng thí nghiệm phải chuẩn bị đường chuẩn trên nền mẫu trắng tương ứng của từng dạng bào chế, làm tăng khối lượng thao tác phân tích.
  • Số lượng mẫu khảo sát thực tế còn hạn chế (16 mẫu) và chỉ tập trung tại thị trường Hà Nội cùng các kênh bán lẻ trực tuyến.
  • Quy trình mới tập trung vào 3 hormon đại diện, chưa bao phủ toàn bộ các dẫn xuất hormon sinh dục hoặc steroid tổng hợp khác.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

  • Mở rộng phạm vi khảo sát với số lượng mẫu lớn hơn tại nhiều vùng địa lý và tỉnh thành trên cả nước, đặc biệt là các sản phẩm trôi nổi, không rõ nguồn gốc trên các nền tảng mạng xã hội.
  • Tiếp tục nghiên cứu cải tiến các bước làm sạch dịch chiết nhằm triệt tiêu tối đa ảnh hưởng nền ($ME%$), hướng tới khả năng định lượng trực tiếp bằng đường chuẩn dung môi.
  • Phát triển và mở rộng phương pháp phân tích đa dư lượng để phát hiện thêm các hormon sinh dục khác như estron, estriol và methyltestosteron trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe.

Giá trị tham khảo

Khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn cao đối với các đối tượng:

  • Cán bộ phân tích và kiểm nghiệm viên tại các viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm, trung tâm kiểm nghiệm dược phẩm - mỹ phẩm, các phòng thử nghiệm đạt chuẩn ISO/IEC 17025.
  • Giảng viên, học viên sau đại học và sinh viên chuyên ngành Hóa phân tích, Kiểm nghiệm thuốc, Dược học và Độc chất học thực phẩm đang thực hiện các đề tài về phân tích vết hợp chất hữu cơ bằng sắc ký lỏng khối phổ.
  • Các nhà quản lý thuộc Cục An toàn thực phẩm, Thanh tra Y tế tham khảo dữ liệu thực tế phục vụ xây dựng chính sách quản lý và chuyên đề thanh kiểm tra chất lượng TPBVSK.

Các nội dung có giá trị tham khảo kỹ thuật nổi bật trong khóa luận gồm: bộ thông số tối ưu hóa chế độ MRM và thế va chạm CE cho 3 hợp chất steroid; chương trình dung môi gradient sắc ký tối ưu; phương pháp đánh giá định lượng ảnh hưởng nền ($ME%$) và quy trình xử lý mẫu nhanh bằng chiết phân tán pha tĩnh C18.

Câu hỏi thường gặp

1. Điều kiện sắc ký và pha động nào được lựa chọn tối ưu để phân tích đồng thời 3 hormon trong nghiên cứu? Hệ thống sử dụng cột sắc ký pha đảo Symmetry® C18 ($150\text{ mm} \times 3,0\text{ mm}; 3,5\text{ }\mu\text{m}$). Hệ pha động tối ưu là hệ số 7 gồm pha A ($\text{HCOONH}_4\text{ }10\text{ mM} + \text{HCOOH }0,1%$ trong nước) và pha B (acetonitril), chạy theo chương trình gradient trong 10 phút ở tốc độ dòng 0,5 mL/phút, thể tích tiêm 10 $\mu\text{L}$.

2. Tại sao tác giả lựa chọn ethanol tuyệt đối và chất làm sạch C18 thay vì các dung môi và chất hấp phụ khác? Thực nghiệm khảo sát cho thấy ethanol tuyệt đối cho cường độ tín hiệu phân tích cao nhất ($1,59 \times 10^5$), cao hơn acetonitril ($1,36 \times 10^5$) và methanol ($1,32 \times 10^5$) do độ hòa tan của các hormon steroid trong ethanol tốt hơn. Đối với chất làm sạch, pha tĩnh C18 cho tín hiệu peak đạt $21,20 \times 10^4$, trong khi than hoạt tính chỉ đạt $4,03 \times 10^4$ do than hoạt tính có diện tích bề mặt lớn đã hấp phụ giữ lại cả chất phân tích, làm thất thoát hàm lượng trong dịch chiết.

3. Hiện tượng ảnh hưởng nền mẫu (Matrix Effect) trong nghiên cứu biểu hiện như thế nào và được khắc phục bằng cách nào? Ảnh hưởng nền ($ME%$) dao động từ -29,15% đến +27,39%, vượt quá ngưỡng cho phép $\pm 20%$ của AOAC. Nền mẫu gây tăng tín hiệu đối với PG trên cả 3 dạng bào chế và TS trên nền lỏng/nang mềm; đồng thời gây ức chế tín hiệu đối với E2 trên cả 3 nền và TS trên nền viên cứng. Để loại trừ sai số do hiệu ứng nền, tác giả đã áp dụng phương pháp lập đường chuẩn trên chính nền mẫu trắng (matrix-matched calibration curve) tương ứng với từng dạng bào chế khi tính toán kết quả.

4. Giới hạn định lượng (LOQ) và giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp trên các nền mẫu đạt mức bao nhiêu? Quy trình phân tích đạt giới hạn định lượng LOQ là $0,40\text{ mg/kg}$ đối với progesteron và testosteron; LOQ đối với 17β-estradiol là $4,00\text{ mg/kg}$. Giới hạn phát hiện LOD tương ứng đạt $0,12\text{ mg/kg}$ cho progesteron và testosteron; $1,21\text{ mg/kg}$ cho 17β-estradiol.

5. Kết quả kiểm tra 16 mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe thực tế trên thị trường đã phát hiện những vi phạm cụ thể nào? Trong 16 mẫu khảo sát, phát hiện 3 mẫu dương tính (18,75%): 2 mẫu viên nang cứng hỗ trợ xương khớp (M2 và M13) chứa progesteron với hàm lượng lần lượt là $0,75\text{ mg/kg}$ và $0,60\text{ mg/kg}$; 1 mẫu viên nén quảng cáo làm đẹp da và bổ sung nội tiết tố nữ (M5) chứa chất cấm testosteron với hàm lượng vết khoảng $0,05\text{ mg/kg}$.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ của tác giả Đặng Thị Kim Hằng đã xây dựng và thẩm định thành công quy trình phân tích đồng thời 3 hormon sinh dục (progesteron, testosteron, 17β-estradiol) trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng phương pháp LC-MS/MS. Phương pháp đạt độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng và độ lặp lại cao theo đầy đủ các tiêu chuẩn quốc tế của AOAC và ICH trên cả 3 dạng bào chế viên cứng, nang mềm và chất lỏng. Kết quả ứng dụng thực tế trên 16 mẫu thương mại đã phát hiện 3 mẫu chứa hormon sinh dục (trong đó có chất cấm testosteron), cung cấp bằng chứng thực nghiệm quan trọng cảnh báo nguy cơ gian lận hoạt chất trong thực phẩm chức năng và đóng góp một công cụ kiểm nghiệm tin cậy cho công tác giám sát y tế công cộng.