MỞ ĐẦU Việt Nam là một quốc gia nằm trong khu vực có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm mưa nhiều, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển đa dạng và phong phú các dược liệu có nguồn gốc từ thực vật. Tuy nhiên, nhiều cây thuốc mới chỉ được sử dụng chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian mà chưa được nghiên cứu một cách toàn diện. Chính vì vậy, việc nghiên cứu các cây thuốc rất cần thiết, nhằm đảm bảo được hiệu quả phòng và điều trị bệnh hiện nay. Trong y học cổ truyền, Hoàng bá nam (Cortex Oroxyli indici) là loại dược liệu được biết đến với rất nhiều lợi ích như: thanh can giải nhiệt, tiêu độc, sát trùng, nhuận phế, dị ứng mẩn ngứa, viêm họng, ho khản tiếng, đau dạ dày, lỵ, viêm đường tiết niệu [3],[10]…Với nguồn nguyên liệu phong phú và có tác dụng tốt đối với sức khỏe con người, nên Hoàng bá nam ngày càng được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như: sản xuất thuốc, thực phẩm chức năng.
Theo những nghiên cứu về thành phần hóa học của dược liệu Hoàng bá nam cho thấy flavonoid là thành phần có tác dụng chính. Một số hoạt chất flavonoid quan trọng có trong dược liệu này là: baicalein, baicalin, chrysin. Các hoạt chất này đã được chứng minh có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, ức chế tế bào ung thư, ức chế virus HIV-1, cải thiện chức năng thận,…[22],[13],[33]. Hoàng bá nam đã được qui định trong DĐVN V (2017).
Tuy nhiên, chuyên luận này mới chỉ đưa ra một số tiêu chí đánh giá chất lượng dược liệu là: mô tả, vi phẫu, soi bột, tạp chất mà chưa có chỉ tiêu định lượng hàm lượng hoạt chất chính bằng các phương pháp sắc ký hiện đại [1]. Do đó, việc áp dụng chuyên luận này trong đánh giá chất lượng dược liệu Hoàng bá nam còn nhiều hạn chế. Để góp phần nâng cấp tiêu chuẩn chất lượng dược liệu Hoàng bá nam, đề tài: ―Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời các flavonoid (dự kiến gồm baicalein, baicalin và chrysin) trong dược liệu Hoàng bá nam (Cortex Oroxyli Indici) bằng phương pháp HPLC-UV‖ được đề xuất thực hiện với các mục tiêu chính: - Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời các flavonoid trong dược liệu Hoàng bá nam (Cortex Oroxyli Indici) 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Áp dụng phương pháp xây dựng được để định lượng hàm lượng hoạt chất trong các mẫu Hoàng bá nam tại một số vùng khác nhau của Việt Nam. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.
TỔNG QUAN VỀ CÂY HOÀNG BÁ NAM Hoàng bá nam hay còn gọi là Vỏ Núc nác, Nam hoàng bá, có tên khoa học là Oroxylum indicum, họ Chùm ớt (Bignoniaceae). Vị thuốc là vỏ thân đã phơi hay sấy khô của cây Hoàng bá nam [3]. Cây Hoàng bá nam Dược liệu bộ phận vỏ Dược liệu bộ phận hạt Hình 1. Cây và dược liệu Hoàng bá nam 1.
Đặc điểm thực vật Cây nhỡ, cao 5-13 m. Thân nhẵn, ít phân cành, có những sẹo to do lá rụng để lại, vỏ cây màu xám tro, mặt trong màu vàng. Lá to, mọc đối, xẻ 2-3 lần lông chim, dài tới 1,5m tập trung ở ngọn thân, lá chét hình bầu dục, nguyên, dài 6,5-14 cm, rộng 3,5- 8 cm, gốc tròn, hơi lệch, đầu nhọn, mặt dưới nhẵn hoặc hơi có lông; cuống lá kép hình trụ, mập. Hoa màu nâu đỏ sẫm mọc thành chùm dài ở ngọn thân.
Đài hình ống, cứng, dày, có 5 khía nông. Tràng hình chuông, phình rộng, có 5 thùy hợp thành hai môi, 5 nhị, có chỉ nhị, có lông ở gốc. Đĩa mật có 5 thùy rõ, cao 4-5 mm, đường kính 12-14 mm. Quả thõng, dài 40-120 cm, rộng 5-10 cm, khi chín nứt làm hai mảnh, các mảnh vỏ hóa gỗ.
Hạt dài 4-9 cm, rộng 3-4 cm, kể cả cánh mỏng bao quanh, hạt rất nhiều, hình bầu dục cứng [3]. Phân bố và sinh thái của cây Hoàng bá nam Ở nước ta, cây mọc hoang ở rừng thường xanh, cây ưa mọc trên đất tơi xốp, có tầng đất mặt sâu và dễ thấm nước, có khi trong các quần hệ thứ sinh những vùng thấp ẩm ướt, tới độ cao 900 m. Cũng có nhiều nơi gây trồng. Trồng bằng hạt hoặc 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com bằng cành vào mùa xuân.
Hoa nở về đêm, thụ phấn nhờ dơi. Hoa và quả từng lúc quanh năm. Các quả chín vẫn ở trên cây khá lâu khi cây hết rụng lá. Chi Oroxylum Vent.
chỉ có một loài là Hoàng bá nam ở Việt Nam (Oroxylum indicum). Trên thế giới, Hoàng bá nam phân bố rộng rãi ở vùng nhiệt đới châu Á, bao gồm Srilanca, Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc, Lào, Việt Nam, Thái Lan, Philippin, đảo Selip và Timor của Indonesia. Nguồn Hoàng bá nam ở Việt Nam tương đối dồi dào. Các tỉnh có trữ lượng lớn hiện nay là Hà Giang, Yên Bái, Tuyên Quang, Hòa Bình, Thanh Hóa,…Ở mỗi tỉnh ước tính có thể khai thác hàng trăm tấn nguyên liệu [3],[10].
Bộ phận dùng Vỏ thân (Cortex Oroxyli ) và hạt (Oroxyli Semen). Vỏ thân thu hái khi cần thiết, phơi khô hoặc cạo lớp vỏ bần rồi thái phiến dài 2-5 cm, dầy 1-3 mm phơi khô. Khi dùng để nguyên hoặc sao nhỏ lửa cho vàng. Hạt thu hái ở quả chín vào mùa thu đông, phơi khô [10].
Thành phần hóa học Các nghiên cứu đã được công bố ở trong và ngoài nước chỉ ra rằng thành phần hóa học của Hoàng bá nam gồm các nhóm chất: flavonoid, stilbenoid, triterpenoid, naphthalen, sterol Trong đó, thành phần hóa học có tác dụng chính là flavonoid [16]. Nhóm flavonoid Flavonoid (hoặc bioflavonoid) là một loại chất chuyển hóa trung gian của thực vật. Flavonoid có màu vàng, xanh, tím đỏ và một số khác không có màu. Trong thực vật cũng có một số nhóm hợp chất khác không thuộc flavonoid nhưng lại có màu vàng như carotenoid, anthranoid, xanthon có thể gây nhầm lẫn.
Flavonoid là nhóm hoạt chất chính có trong Hoàng bá nam. Các flavonoid có trong dược liệu này là chủ yếu là flavon. Ngoài ra còn có các flavonoid nhóm flavanon, flavanonol. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
Các nhóm flavonoid trong Hoàng bá nam Khung công thức Tài liệu Nhóm Chất cấu tạo tham khảo baicalein, chrysin; oroxylin A, apigenin, luteolin; [9] [18] chrysin 6-C-β-D-glucopyranosyl-8-O-β-D- [36] glucuronopyranosid; [5] [19] baicalein7-O-β-D-glucuronopyranosyl-(1→3)[ β-D- [51] glucopyranosyl-(1→6)]- β-D-glucopyranosid; scutellarein [45] [48] 7-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosid; chrysin-7-O-gentiobiosid; baicalein-7-O-diglucosid; flavon baicalein-7-O-glucosid; scutellarein-7-O-glucopyranosid; chrysin-7-O-glucuronid; baicalin; chrysin-6-C-β-D- glucopyranosyl-8-C-α-L-arabinopyranosid; baicalein-7-O- glucosid, baicalein-7-O-diglucosid (Oroxylin B); hispidulin; 8,8’’-bibaicalein; baicalein-7-O-caffeat; 6-hydroxyluteolin; 6-methoxyluteolin; 7-O-methyl chrysin, 5-hydroxy 4’,7- dimethoxy flavon; dihydro oroxylin A; baicalein-7-O- 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com gentiobiosid; baicalein-7-O-glucuronid; oroxylin A-7-O-β- D-glucuronid butyl ester; 6-methoxy-baicalein; oroxylin- A-7-O-glucosid; baicalein 6-methoxy-7-glucuronid; 2,5-dihydroxy-6,7-dimethoxy flavon; 3,7,3’,5’- tetramethoxy-4’-hydroxy flavon; 5,7-dihydroxy-3- methoxyflavon; 3,5,7-trihydroxyflavon; 5,7,4'-trihydroxy- 3-methoxyflavon; 3,5,7,4'-tetrahydroxy flavon; 5,7,4- trihydroxyflavon wogonin-7-O-β-D-glucuronide; 5,6,7-trimethoxyflavon-8- O-β-D-glucopyranosid; flavanon pinocembrin, pinobanksin, pinostrobin [18], [26] quercetin; quercetin-3-O-ara-binopyranoside; kaempferol; flavonol galangin; [54], [35] 3, 4, 5, 7-tetrahydroxy-flavonol 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Tính chất quang phổ của flavonoid Trên phổ UV của flavonoid chia ra 2 dải hấp thụ, dải I nằm trong vùng 290 nm trở lên, dải II nằm trong vùng 290 nm trở xuống. Trong dải I, flavon có đỉnh hấp thu cực đại trong vùng 310 – 350 nm, flavonol có 3-OH đã thế trong vùng 330 – 360 nm, flavonol có 3-OH tự do thì hấp thụ vùng 350 – 385 nm. Trong dải II, cả flavon, flavonol đều có đỉnh hấp thụ trong vùng 250 – 280 nm. Isoflavon do gốc phenyl đính ở C-3, không còn hiệu ứng liên hợp với nhóm carbonyl nên chỉ có dải hấp thụ chính ở 250 -270 nm [2].
Công thức cấu tạo của baicalin, baicalein, chrysin có trong Hoàng bá nam STT Tên chất CTCT Thông tin chất - CTPT: C15H10O5 - M (g/mol): 270,2369 - Nhiệt độ nóng chảy (0C): 264,5 1 Baicalein - λmax = 216, 277, 324 nm - Dung môi hòa tan: DMSO, aceton, ethanol, methanol - CTPT: C21H18O11 - M (g/mol): 446,364 - Nhiệt độ nóng chảy (0C): 202-205 2 Baicalin - λmax = 214, 278, 315 nm ± 2 nm - Dung môi hòa tan: methanol, ethanol 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - CTPT: C15H10O4 - M (g/mol): 254,2375 ± 0,0139 - Nhiệt độ nóng chảy (0C): 285,5 3 Chrysin - λmax = 212, 269, 315 nm Dung môi hòa tan: Ethanol, chloroform, ether 1. Nhóm stilbenoid Ngoài nhóm hoạt chất chính là flavonoid, trong cây Hoàng bá nam còn chứa các Stilben. Chúng thuộc nhóm chất lớn phenylpropanoid, có chung một cấu trúc mạch cacbon là C6-C2-C6. Một số stilben đã được tìm thấy trong thực vật và khẳng định hoạt tính đặc trưng của chúng như resveratrol (3,5,4’-trihydroxy-stilben) là một chất được phát hiện có trong vỏ quả nho giúp giảm nguy cơ các bệnh về tim.
Bên cạnh đó, hoạt chất này có mặt trong dâu, đậu phộng và rượu vang đỏ. Các hợp chất stilben được chứng minh có tác dụng sinh học như: tác dụng chống oxy hóa, điều hòa cân nặng, chống dị ứng [40],…Một số stilben có trong cây Hoàng bá nam: (E)-dihydropinosylvin-2-carboxyl-5-O-β-D-glucopyranosid và (E)- dihydropinosylvin-3-O-β-D-glucopyranosid;(E)-pinosylvin-3-O-β-D-glucopyranosid; dihydropinosylvin; pinosylvin [23]. Pinosylvin Dihydropinosylvin (E)-pinosylvin-3-O-β-D- glucopyranoside 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com (E)-dihydropinosylvin-2-carboxyl-5-O- (E)-dihydropinosylvin-3-O-β-D- β-D-glucopyranosid glucopyranosid Hình 1. Công thức cấu tạo của Stilbenoid có trong Hoàng bá nam 1.
Các nhóm chất khác Triterpenoid: Lupeol, lup-20(29)-en-2alpha, 3-beta-diol, 2α-hydroxyllupeol[18] Lupeol 3-beta-diol Hình 1. Công thức cấu tạo của một số có trong triterpenoid Hoàng bá nam Các hợp chất naphthalen: 2-(1-hydroxymethylethyl)-4H, 9H-naphtho[2,3-b]furan- 4,9-dion; (3R,4R)-3,4-dihydro-4-hydroxy-3-(3-methyl-2-butenyl)-1(2H)- naphthalenon; (3R,4R)-3,4-dihydro-4-hydroxy-3-(3-hydroxymethyl-(2Z)-butenyl)- 1(2H)-naphthalenon; (2S,3S,4R)-3,4-dihydro-3,4-dihydroxy-2-(3-methyl-2- butenyl)-1(2H)-naphthaleon; 2-acetyl-naphtho [2,3-b]-furan-4,9-dion [25]. Sterol bao gồm β-sitosterol và stigmasterol [42],[18] 1. Công dụng Theo y học dân gian, Hoàng bá nam được biết đến với rất nhiều lợi ích như: thanh can giải nhiệt, tiêu độc, sát trùng, nhuận phế…Vị thuốc Hoàng bá nam hay vỏ thân Hoàng bá nam được chỉ định chữa các chứng bệnh vàng da, dị ứng mẩn ngứa, viêm họng, ho khản tiếng, đau dạ dày, lỵ, viêm đường tiết niệu[10].
9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Tác dụng sinh học Tác dụng chống viêm Tác dụng chống viêm giảm đau của cao chiết dược liệu Hoàng bá nam phân đoạn n-butanol cho hiệu quả đáng kể với hàm lượng 100 và 300 (mg/kg; p. Tác dụng chống oxy hóa Đánh giá tác dụng chống oxy hóa trên mô hình dọn gốc tự do của vỏ thân Hoàng bá nam ở các phân đoạn khác nhau là: ether dầu hỏa, ethyl acetate và n-butanol. Dựa trên các phản ứng: mất màu gốc ABTS+, dọn gốc tự do nitric oxid (·NO), phản ứng màu khử ion Fe3+ bằng tác nhân khử ortho-phenanthroline và ức chế sự hình thành lipid peroxid.
Kết quả cho thấy cao phân đoạn n-butanol cho hoạt tính chống oxy hóa mạnh so với đối chứng dương là acid ascorbic [44]. Theo một nghiên cứu khác về mô hình dọn gốc tự do DPPH của vỏ thân Hoàng bá nam, cho thấy cao chiết phân đoạn ethyl acetat hoạt động chống oxy hóa mạnh nhất (giá trị IC50 là 0,76 mg/ml thấp nhất so với các cao chiết phân đoạn khác) [52].