Nghiên Cứu Phương Pháp Đánh Giá Chất Lượng Kháng Nguyên Trong Quy Trình Sản Xuất Vắc Xin Cúm

Luận văn thạc sĩ HUS nghiên cứu phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên trong sản xuất vắc xin cúm, góp phần nâng cao hiệu quả vắc xin.

• Tác giả: Nguyễn Thị Kim Dung
• Người hướng dẫn: TS. Đỗ Tuấn Đạt
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắc xin cúm
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sỹ khoa học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Đặc điểm chung của vi rút cúm
• 1.2. Hình thái và cấu trúc hạt vi rút cúm
• 1.3. Cấu trúc hệ gen vi rút cúm và các protein mã hóa
• 1.4. Quá trình nhân lên của vi rút cúm
• 1.5. Sự phát triển của vi rút cúm trên tế bào. Kỹ thuật di truyền ngược
• 1.6. Dịch tễ học bệnh cúm
• 1.7. Sinh bệnh học
• 1.8. Một số quy trình sản xuất vắcxin cúm
• 1.9. Các phương pháp kiểm tra chất lượng kháng nguyên vắcxin cúm
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Mẫu thử nghiệm
• 2.2. Môi trường và hóa chất
• 2.3. Trang thiết bị và dụng cụ
• 2.4. PHƯƠNG PHÁP
• 2.4.1. Phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 (liều vi rút gây hủy hoại 50% tế bào)
• 2.4.2. Phương pháp chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu
• 2.4.3. Phương pháp xác định hàm lượng kháng nguyên HA bằng SRID
• 2.4.4. Phương pháp xác định hàm lượng protein tổng số
• 2.4.5. Phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE
• 2.4.6. Phương pháp kính hiển vi điện tử
• 2.4.7. Phân tích xu hướng
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Nghiên cứu xây dựng và áp dụng các phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên vắcxin trong quy trình sản xuất vắcxin cúm
• 3.2. Nghiên cứu xây dựng phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50
• 3.3. Kết quả kiểm tra chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm
• 3.4. Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm
• 3.5. Tiêu chuẩn hiệu giá vi rút cúm trong quy trình sản xuất vắcxin cúm
• 3.6. Tiêu chuẩn hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm
• 3.7. Tiêu chuẩn hàm lượng kháng nguyên HA bằng SRID
• 3.8. Tiêu chuẩn hàm lượng protein tổng số
• 3.9. Tiêu chuẩn điện di trên gel SDS-PAGE
• 3.10. Tiêu chuẩn kính hiển vi điện tử
• KẾT LUẬN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Phương Pháp Đánh Giá Chất Lượng Kháng Nguyên Vắc Xin Cúm

Bệnh cúm là một trong những bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng, gây ra bởi vi rút cúm. Việc sản xuất vắc xin cúm hiệu quả là rất cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắc xin cúm là một yếu tố quan trọng để đảm bảo tính an toàn và hiệu quả của vắc xin. Phương pháp đánh giá này không chỉ giúp xác định hàm lượng kháng nguyên mà còn đảm bảo rằng vắc xin đáp ứng các tiêu chuẩn chất lượng cần thiết.

1.1. Đặc Điểm Của Vi Rút Cúm Và Tầm Quan Trọng Của Vắc Xin

Vi rút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, có khả năng gây ra các đại dịch toàn cầu. Vắc xin cúm giúp giảm thiểu tỷ lệ mắc bệnh và tử vong. Việc hiểu rõ về đặc điểm của vi rút cúm là cần thiết để phát triển các phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên.

1.2. Các Tiêu Chuẩn Chất Lượng Kháng Nguyên Vắc Xin Cúm

Tiêu chuẩn chất lượng kháng nguyên vắc xin cúm bao gồm các yếu tố như hàm lượng kháng nguyên, độ tinh khiết và tính an toàn. Việc thiết lập các tiêu chuẩn này là cần thiết để đảm bảo rằng vắc xin đáp ứng yêu cầu của cơ quan quản lý.

II. Thách Thức Trong Đánh Giá Chất Lượng Kháng Nguyên Vắc Xin Cúm

Đánh giá chất lượng kháng nguyên trong sản xuất vắc xin cúm gặp nhiều thách thức. Các yếu tố như sự biến đổi của vi rút cúm, quy trình sản xuất phức tạp và yêu cầu về độ chính xác trong các phương pháp kiểm tra đều ảnh hưởng đến kết quả đánh giá. Việc phát triển các phương pháp mới và cải tiến quy trình hiện tại là cần thiết để vượt qua những thách thức này.

2.1. Sự Biến Đổi Của Vi Rút Cúm Ảnh Hưởng Đến Đánh Giá

Vi rút cúm có khả năng biến đổi gen nhanh chóng, điều này làm cho việc đánh giá chất lượng kháng nguyên trở nên khó khăn. Các phương pháp hiện tại cần được điều chỉnh để phù hợp với các biến thể mới của vi rút.

2.2. Quy Trình Sản Xuất Vắc Xin Phức Tạp

Quy trình sản xuất vắc xin cúm bao gồm nhiều bước khác nhau, từ nuôi cấy tế bào đến tinh chế kháng nguyên. Mỗi bước đều có thể ảnh hưởng đến chất lượng kháng nguyên, do đó cần có các phương pháp kiểm tra hiệu quả tại từng giai đoạn.

III. Phương Pháp Kiểm Tra Chất Lượng Kháng Nguyên Vắc Xin Cúm Hiện Nay

Có nhiều phương pháp được sử dụng để kiểm tra chất lượng kháng nguyên trong sản xuất vắc xin cúm. Các phương pháp này bao gồm chuẩn độ hiệu giá vi rút, kỹ thuật ngưng kết hồng cầu và điện di trên gel. Mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng, và việc lựa chọn phương pháp phù hợp là rất quan trọng.

3.1. Phương Pháp Chuẩn Độ Hiệu Giá Vi Rút Cúm

Phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm (CCID50) là một trong những phương pháp phổ biến nhất để đánh giá chất lượng kháng nguyên. Phương pháp này giúp xác định liều vi rút cần thiết để gây hủy hoại 50% tế bào nuôi cấy.

3.2. Kỹ Thuật Ngưng Kết Hồng Cầu Trong Đánh Giá Kháng Nguyên

Kỹ thuật ngưng kết hồng cầu (HA) là một phương pháp quan trọng để xác định hàm lượng kháng nguyên HA trong vắc xin cúm. Phương pháp này dựa trên khả năng của kháng nguyên gắn kết với hồng cầu, từ đó giúp đánh giá chất lượng kháng nguyên.

3.3. Phương Pháp Điện Di Trên Gel SDS PAGE

Phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE được sử dụng để phân tích thành phần protein trong kháng nguyên. Phương pháp này giúp xác định độ tinh khiết và cấu trúc của kháng nguyên, từ đó đánh giá chất lượng vắc xin.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Các Phương Pháp Đánh Giá Chất Lượng Kháng Nguyên

Các phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên không chỉ giúp đảm bảo an toàn cho vắc xin mà còn hỗ trợ trong việc phát triển các sản phẩm mới. Việc áp dụng các phương pháp này trong quy trình sản xuất vắc xin cúm đã mang lại nhiều kết quả tích cực, giúp nâng cao chất lượng sản phẩm.

4.1. Kết Quả Nghiên Cứu Về Chất Lượng Kháng Nguyên

Nghiên cứu cho thấy rằng việc áp dụng các phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên đã giúp cải thiện đáng kể chất lượng vắc xin cúm. Các tiêu chuẩn đánh giá được thiết lập đã giúp đảm bảo rằng vắc xin đáp ứng yêu cầu của cơ quan quản lý.

4.2. Tác Động Đến Quy Trình Sản Xuất Vắc Xin

Việc áp dụng các phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên đã giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất vắc xin. Điều này không chỉ giúp tiết kiệm thời gian mà còn giảm thiểu chi phí sản xuất.

V. Kết Luận Về Phương Pháp Đánh Giá Chất Lượng Kháng Nguyên Vắc Xin Cúm

Phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên trong sản xuất vắc xin cúm là một yếu tố quan trọng để đảm bảo an toàn và hiệu quả của vắc xin. Việc phát triển và cải tiến các phương pháp này sẽ góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm, đáp ứng nhu cầu bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Tương lai của nghiên cứu trong lĩnh vực này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều tiến bộ mới.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Về Kháng Nguyên Vắc Xin

Nghiên cứu về kháng nguyên vắc xin cúm sẽ tiếp tục phát triển, với mục tiêu cải thiện chất lượng và hiệu quả của vắc xin. Các công nghệ mới sẽ được áp dụng để nâng cao khả năng đánh giá chất lượng kháng nguyên.

5.2. Định Hướng Phát Triển Các Phương Pháp Mới

Định hướng phát triển các phương pháp mới trong đánh giá chất lượng kháng nguyên sẽ giúp đáp ứng nhanh chóng với sự biến đổi của vi rút cúm. Việc này sẽ đảm bảo rằng vắc xin luôn đạt tiêu chuẩn chất lượng cao nhất.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu cho quá trình nhân lên của vi rút. Là thành phần protein chủ yếu của phức hợp RNP, chứa một 5 NP 56 101 1565 498 1000 trong các khàng nguyên đặc hiệu typ, phân biệt 3 typ cúm A,B,C. Phân tử có cấu trúc tetramer, thủy phân bằng protease, cho phép vi rút tiến qua lớp niêm mạc tới các tế bào của đƣờng hô hấp trong quá trình nhiễm trùng. 6 NA 50 087 1413 454 100 Loại bỏ phân tử axit sialic của phân tử HA từ các virion mới đƣợc tổng hợp, làm lộ HA ra ngoài, tăng khả năng nhiễm trùng.

M1: là kháng nguyên đặc hiệu M1 27 801 252 3000 typ, có chức năng ổn định vrrus, điều khiển hoạt tính ARN- 7 1027 protease và tham gia vào quá M2 11 010 97 20-60 trình lắp rắp vi rút (70%). Là protein không cấu trúc, kết NS1 26 815 230 20-60 thúc quá trình tổng hợp protein 8 890 130- của tế bào túc chủ, chỉ có trong NS2 14 216 121 tế bào nhiễm vi rút. 200 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Đoạn ARN đơn của vi rút cúm C mã hóa cho protein liên kết haemaglutinin- esteraza (HEF) có chức năng gắn dính vào thụ thể (receptor), hoạt động hòa mạng của HA và phá hủy thụ thể của NA, trong khi ở vi rút cúm A và B những đặc tính do các đoạn gen riêng biệt mã hóa. Chiều dài của các đoạn gen và các protein mã hóa đƣợc liệt kê trong bảng trên.

Đoạn gen ngắn không mã hóa ở mỗi đầu bao gồm chuỗi 11-13 nucleotit tại đầu 5’ và 9-12 nucleotit tại đầu 3’ có tính ổn định cao hơn so với các đoạn gen khác và giống nhau ở cả 3 loại vi rút A, B và C [44]. Ba gen lớn nhất mã hóa cho các thành phần của ARN polymeraza PB1, PB2 và PA của vi rút A và vi rút cúm B, C [66]. Đoạn gen 1 và 2 đều dài 2341 nucleotit mã hóa cho protein PB2 gồm 759 axit amin và PB1 757 axit amin. Đoạn gen 3 dài 2233 nucleotit mã hóa cho protein PA có 716 axit amin.

NP là protein cấu trúc chính tạo thành RNP. NP còn là kháng nguyên đặc hiệu typ, khác nhau giữa vi rút cúm A, B và C. NP đƣợc đoạn ARN 5 dài 1565 nucleotit mã hóa [64]. NP chứa 498 axit amin và có trọng lƣợng phân tử 56.

NP của vi rút cúm B chứa 560 axit amin và tƣơng đồng 47% so với vi rút cúm A trong khi NP của vi rút cúm C có 565 axit amin và có một số vùng tƣơng đồng với vi rút cúm A và B [28]. Tên gọi của protein HA (hemagglutinin) xuất phát từ khả năng gây ngƣng kết hồng cầu của vi rút bằng cách gắn với các thụ thể đặc biệt có chứa axit sialic. HA có 3 vai trò quan trọng trong quá trình sao chép vi rút: 1. HA gắn với thụ thể có chứa axit sialic trên bề mặt tế bào và tạo thành sự gắn kết giữa vi rút và tế bào.

10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. HA chịu trách nhiệm cho sự xâm nhập của vi rút vào tế bào bằng cách gián tiếp tạo nên sự hòa mạng endocytose của vi rút và màng nội bào làm cho nucleocapsit vi rút giải phóng vào trong bào tƣơng. HA là kháng nguyên chính tạo nên kháng thể trung hòa và các vụ dịch cúm đều liên quan đến sự thay đổi cấu trúc kháng nguyên. Đoạn ARN 4 có chiều dài 1.778 nucleotit và mã hóa cho 562 đến 566 axit amin.

HA do đoạn ARN 4 mã hóa và đƣợc tổng hợp nên ribosom gắn màng và di chuyển vào lumen của lƣới nội chất (ER) tế bào bị nhiễm nhƣ là polypeptit đơn HA0 (trọng lƣợng phân tử 76. Phụ thuộc vào phân typ vi rút, loại tế bào chủ và điều kiện nuôi cấy HA tồn tại cả 2 dạng: Dạng tiền thân không phân tách HA0 hoặc dạng phân tách với hai chuỗi có cầu nối disulfit (HA1 có trọng lƣợng 47.000 dalton và HA2- 29. Quá trình phân tách là điều kiện quyết định để vi rút có khả năng lây nhiễm và do vậy liên quan đến độc tính và khả năng lây truyền [42]. HA chính là đoạn gen đầu tiên của vi rút cúm đƣợc xác định trình tự.

HA1 có từ 319 đến 326 axit amin và HA2 có từ 221 đến 222 axit amin. Tùy thuộc vào các phân typ HA, số lƣợng các axit amin bị phân tách giữa HA1 và HA2 là 1 đến 6. HA nguyên vẹn có thể tách chiết từ hạt virion vi rút cúm hoặc từ tế bào bị nhiễm bằng chất tẩy hòa tan màng, khi chất tẩy bị loại bỏ, vùng transmembrane kỵ nƣớc kết hợp lại và tạo thành HA hình hoa thị. Tuy nhiên, xử lý vi rút bằng promelin sẽ giải phóng ra HA bảo toàn tính kháng nguyên và cấu trúc ba chiều, có khả năng hòa tan trong nƣớc và chứa toàn bộ HA1 cùng với 175 axit amin đầu tiên trong số 221 axit amin của HA2 [61].

Vị trí gắn thụ thể HA nằm ở vùng ngoại biên của các tiểu đơn vị phân tử. Cấu trúc vị trí đó có tính đồng dạng cao giữa các phân typ (Tyr- 98, Tyr – 153, His – 183, Glu – 190, Leu – 194) [41, 63]. Bởi vì tính đặc hiệu gắn thụ thể khác nhau giữa khí quản ngƣời (α 2, 3) và khí quản lợn (α 2, 3 và α 2, 6), số lƣợng các phân tử có thể chuyển từ loài này sang loài khác và có thể bị giới hạn [18]. Sự phân tác HA0 thành HA1 và HA2 là cần thiết để chuyển dạng pH thấp và do vậy cần thiết đối với hoạt tính gây nhiễm của vi rút.

Những HA đó đều chứa chuỗi R-X-K-/R-R ở cầu nối peptit và đƣợc phân tách trong tế bào bằng furin, một 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] proteaza của mạng trans-Golgi [25, 43]. HA chỉ có arginnine đơn ở cầu nối peptit không bị phân tách khi nuôi cấy trên tế bào (trừ chủng A/WSN/33) nhƣng sẽ bị phân tách bởi tpypsin ngoại sinh. Khi nuôi cấy trên trứng gà có phôi, HA có arginine đơn ở cầu nối peptit sẽ bị phân tách do proteaza [25]. Nhiều nghiên cứu cho rằng vị trí phân tách có liên quan đến độc tính vi rút và chủng vi rút độc lực có chứa kiểu nhận biết furin trong khi chủng vi rút không độc lực chỉ chứa arginine đơn [22, 25, 42].

Tuy nhiên cũng có một số chủng cúm H5 không độc lực có vị trí nhận biết furin. Những chủng không độc lực này có chuỗi oligosaccharit ở gần vị trí phân tách, điều này có ảnh hƣởng đến hoạt tính của proteaza khi phân tách và chuỗi này không tìm thấy ở những chủng H5 độc lực [21, 22]. Trong các chủng vi rút cúm ngƣời chỉ có A/WSN/33 có khả năng nuôi cấy trên nhiều loại tế bào mà không cần có trypsin và các nghiên cứu về hệ gen đã cho thấy NA của WSN cần thiết cho sự phân tách HA của WSN. NA là glycoprotein thứ hai đặc hiệu cho phân typ của vi rút cúm A, B.

NA/PR/8/34 đoạn gen ARN 6 có 1413 nucleotit mã hóa cho 453 axit amin. Đoạn ARN thứ bảy mã hóa cho 2 protein M1 và M2. Đoạn có 1027 nucleotit mã hóa cho M1 có 252 axit amin, trọng lƣợng phân tử 27. M1 là kháng nguyên đặc hiệu typ của vi rút cúm và có tính ổn định giữa các phân typ của vi rút cúm và có tính ổn định giữa các phân typ [28].

Protein M2 có hoạt động kênh trao đổi ion nhờ hoạt hóa pH. Kênh này đƣợc chặn đặc hiệu bởi thuốc kháng vi rút cúm amantadin. Hoạt động của kênh ion cần thiết cho việc bỏ lớp ngoài của vi rút trong khoang nội bào của tế bào bị nhiễm. Đột biến của vùng M2 liên quan đến việc kháng amantadin [16].

Đoạn ARN 8 của vi rút cúm A, B và đoạn ARN 7 của vi rút cúm C mã hóa cho 2 loại protein NS1 và NS2. NS1 protein có trọng lƣợng phân tử 26. NS1 là protein đa chức năng trong chu trình sống của vi rút cúm. NS2 protein có trọng lƣợng phân tử 11.000 tồn tại trong virion (130-200 phân tử) và tạo thành phức hợp với M1.

Quá trình nhân lên của vi rút cúm 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Trƣớc hết gai H của vi rút gắn vào thụ thể có chứa axit neuraminic của tế bào chủ, rồi tiến hành nhập bào tạo endosom. Tiếp đó, xảy ra quá trình dung hợp giữa vỏ ngoài của vi rút với màng endosom. Điều này thực hiện đƣợc nhờ gai H chồi lên khi pH trong endosom thấp. Sau khi dung hợp ribonucleprotein và ARN- polymeraza chui vào tế bào chất.

Việc “cởi áo” làm hoạt hóa ARN- polymeraza của vi rút. Phân tử mARN đƣợc phiên mã trong nhân từ các chuỗi ARN khuôn đơn, (-) của vi rút khi sử dụng mồi là đoạn 10 – 13 nucleotit cắt ra tử đầu 5’ của mARN có gắn mũ của vật chủ, sau đó đƣợc gắn đuôi PolyA cũng lấy từ mARN của tế bào chủ. Enzym cắt mồi là endonucleaza do vi rút mang theo. Phân tử mARN mới hoàn thiện của vi rút ra khỏi nhân, vào tế bào chất để tiến hành sao chép genom trong nhân.

Kết quả quá trình phiên mã từ 8 đoạn ARN genom (-) tạo ra 10 phân tử mARN, bởi vì đoạn 7 và 8 mỗi đoạn phiên mã tạo ra 2 phân tử mARN. 6 phân tử (1 – 6) dịch mã cho ra 6 protein, còn 2 phân tử (7 – 8) do có 2 khung đọc nên mỗi phân tử tạo ra 2 phân tử protein. Điều này đƣợc thực hiện không phải do sử dụng mARN đa gen (polycistronic) thật sự nhƣ ở prokaryota, bởi vì riboxom ở eukaryote chỉ nhận diện bộ ba khởi đầu AUG nằm sát đầu 5’ của mARN. Nhƣ vậy từ 1 ARN đã cho ban đầu, chúng chỉ tạo ra đƣợc 1 protein.

Hai đoạn 7 và 8 tiến hành phiên mã cho ra 2 mARN có chiều dài đủ. Mỗi trƣờng hợp tổng hợp một loại protein bổ sung cho dịch mã từ mARN đã đƣợc chế biến nhờ bộ máy cắt ghép (splicing) của tế bào chủ. Giống nhƣ các gen chồng lớp, một lần nữa đây là ví dụ cho thấy các vi rút ARN đã tận dụng tối đa genom nhỏ bé của mình nhƣ thế nào. Khác với đa số vi rút ARN, protein cấu trúc sau khi đƣợc tổng hợp lại đƣợc chuyển vào nhân và quá trình lắp rắp ribonucleoprotein xảy ra trong nhân.

Các glycoprotein HA và NA đƣợc tổng hợp trên mạng lƣới nội chất hạt sau đó đƣợc di chuyển tới các vùng chuyên biệt trên màng sinh chất. Protein M cũng di chuyển đến màng và liên kết với màng nhờ gai HA và NA.