MỞ ĐẦU Vệ sinh an toàn thực phẩm luôn là vấn đề được quan tâm của toàn xã hội, của mọi quốc gia trên toàn thế giới. Thực phẩm không đảm bảo vệ sinh không những ảnh hưởng đến sức khỏe con người mà còn liên quan chặt chẽ đến năng suất lao động, hiệu quả phát triển kinh tế, thương mại, du lịch và an sinh xã hội. Trong những năm gần đây sự xuất hiện dư lượng kháng sinh trong thủy hải sản và thịt gia súc, gia cầm đã ít nhiều ảnh hưởng đến sức khỏe của người dân. Tác hại của thực phẩm có tồn dư kháng sinh đối với sức khỏe con người đã được nhiều nghiên cứu chỉ ra như: tạo ra vi khuẩn kháng kháng sinh, gây dị ứng, gây quái thai, gây rối loạn nội tiết và gây ung thư ở người.
Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Việt Nam nằm trong danh sách các nước có có tỷ lệ sử dụng kháng sinh cao nhất thế giới hiện nay, không chỉ sử dụng cho con người, các chất kháng sinh còn được sử dụng rộng rãi trong ngành chăn nuôi. Quinolon (hay còn được gọi là fluoroquinolone) là một họ kháng sinh có phổ tác dụng diệt khuẩn rộng, hiệu quả cao nên chúng được sử dụng rộng rãi không chỉ để chữa bệnh cho người mà còn được dùng để chữa bệnh cho gia cầm và thủy sản trong công nghiệp. Hậu quả là giảm hiệu quả của các kháng sinh quinolon đối với các chủng vi khuẩn gây khó khăn và tốn kém trong điều trị cho người bệnh. Theo thông báo của WHO năm 1999 có tới 11.000 người bị nhiễm khuẩn Campylobacter đã kháng quinolon do ăn thịt gà có chứa quinolon (năm 1998 là 8.
Có nhiều phương pháp để xác định tồn dư kháng sinh nhóm quinolon như: phương pháp miễn dịch enzym (ELISA); phương pháp vi sinh vật (test vi sinh vật), phương pháp lý hóa. Phương pháp lý hóa sử dụng nhiều kỹ thuật khác nhau như sắc ký lỏng, điện hóa hòa tan, điện di mao quản, các phương pháp đều có độ chính xác, độ chọn lọc cao, phát hiện được một lượng nhỏ kháng sinh tồn dư trong thực phẩm. Phương pháp được sử dụng nhiều nhất là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng các loại detector như detector UV, detector huỳnh quang (FLD) và detector khối phổ (MS). Việc ứng dụng phương pháp HPLC phân tích nhóm quinlon trong các mẫu 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com môi trường và thực phẩm đã được làm nhiều trên thế giới nhưng ở Việt Nam sử dụng phương pháp HPLC với detector huỳnh quang vẫn còn hạn chế đặc biệt là tách đồng thời nhiều chất với Việt Nam hiện nay chưa có quy trình chính thống nào.
Xuất phát từ tình hình thực tế, trên cơ sở các nghiên cứu khoa học trong và ngoài nước đã được công bố, với mục đích gia tăng số lượng chất xác định, sử dụng thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định đồng thời một số kháng sinh nhóm quinolon trong tôm và nước nuôi tôm bằng phương pháp sắc lỏng hiệu năng cao”. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng I. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1. 1 Tổng quan về kháng sinh nhóm quinolon 1.1 Cấu tạo của kháng sinh nhóm quinolon Công thức cấu tạo chung của nhóm quinolon là hợp chất vòng thơm có chứa nitơ, vị trí thứ 4 có gắn nhóm keton, vị trí thứ 3 có gắn nhóm carboxylic.
Các dẫn xuất của quinolon gồm những hợp chất ở các vị trí 1, 2, 6, 8 được gắn thêm các nhóm thế. Vị trí 1: có thể gắn thêm nhóm alkyl hoặc aryl; Vị trí 6: có thể gắn thêm F; Vị trí 2, 6, 8 có thể gắn thêm một nguyên tử N [38, 39, 47, 52, 54].1: Công thức cấu tạo chung của quinolon Do có nhóm carboxylic ở vị trí số 3 nên các chất nhóm quinolon mang tính acid. Một số quinolon có thêm nhóm amin khác nên có thêm tính base. Chúng tan trong lipid và thấm được qua màng tế bào.
Có thể chia nhóm quinolon thành hai loại dựa trên pKa: acidic quinolon (AQ) và piperazinyl quinolon (PQ) - Acidic quinolon: chỉ có một giá trị pKa trong khoảng 6,0 đến 6,9. Trong nước chúng tồn tại ở dạng trung hòa hoặc dạng anion. Thường AQ gồm những quinolon thuộc thế hệ thứ nhất. - Piperazinyl quinolon: có hai giá trị pKa, pKa1 khoảng 5,5–6,6 và pKa2 khoảng 7,2–8,9.
Trong nước chúng có thể tồn tại ở ba dạng khác nhau: dạng cation, dạng trung hòa và dạng anion; một số PQ là danofloxacin, difloxacin, norfloxacin, ofloxacin, benofloxacin, marbofloxacin, acid pipemidic.2: Cân bằng acid - base của nhóm acidic quinolon 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.3: Cân bằng acid base của nhóm piperazinyl quinolon Bảng 1.1: Công thức cấu tạo và pKa của các chất STT Tên chất Công thức cấu tạo pKa 1 Ciprofloxacin pKa1: 6,09 pKa2: 8,62 2 Danofloxacin pKa1: 6,20 pKa2: 9,40 3 Erofloxacin pKa1: 6,1 pKa2: 7,7 4 Sarafloxacin pKa1: 5,6 pKa2: 8,2 5 Difloxacin pKa1: 5,7 – 6,1 pKa2: 7,2 – 7.6 6 Oxolinic acid pKa: 6,9 7 Flumequine pKa: 6,5 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.2 Cơ chế tác dụng và độc tính Kháng sinh nhóm này phân bố đồng đều cả trong dịch nội và ngoại bào, phân bố hầu hết các cơ quan: phổi, gan, mật, xương, tiền liệt tuyến, tử cung, dịch não tủy. và qua được hàng rào nhau thai. Fluoroquinolon đào thải chủ yếu qua đường tiết niệu ở dạng còn nguyên hoạt chất và tái hấp thu thụ động ở thận [16, 52]. Cơ chế tác động của fluoroquinolon lên vi khuẩn là ức chế tổng hợp acid nucleic.
Sự nhân đôi DNA bắt đầu bằng phản ứng tách chuỗi DNA ra làm hai, mỗi bên là một khuôn để gắn nucleotid thích hợp theo nguyên tắc bổ sung. Enzym DNA polymeras xúc tác sự tổng hợp các liên kết giữa các nucleotid; enzym DNA gyrase nối các DNA trong quá trình tổng hợp và tạo thành các vòng xoắn. Các quinolon (nalidixic acid và các fluoroquinolon) ức chế mạnh sự tổng hợp DNA trong giai đoạn nhân đôi do ức chế enzym DNA gyrase. Cơ chế tác động này hiệu quả trên cả vi khuẩn gram dương và gram âm.
Nhưng cũng có thể do cơ chế ức chế tổng hợp acid nucleic này mà kháng sinh nhóm fluoroquinolon được cho là có nguy cơ gây đột biến gen, gây sẩy thai khi sử dụng cho động vật mang thai do đó khuyến cáo là không nên sử dụng kháng sinh nhóm fluoroquinolon cho động vật mang thai, động vật sinh sản và làm giống. Ngoài ra các nghiên cứu trên động vật còn non cho thấy các kháng sinh thuộc nhóm này gây hủy hoại các khớp sụn [34, 54] do đó các kháng sinh nhóm quinolon không được sử dụng trong điều trị bệnh cho trẻ em.3 Giới hạn cho phép kháng sinh nhóm quinolon Ngày 26/6/1990 Uỷ ban An toàn thực phẩm Châu Âu chính thức ban hành Quyết định 2377/1990[26] trong đó qui định mức giới hạn tối đa các chất kháng sinh trong thực phẩm có nguồn gốc động vật trong đó giới hạn nhóm quinolon trong các sản phẩm có nguồn gốc động vật bao gồm: 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.2: Giới hạn cho phép kháng sinh nhóm quinolon theo EEC No.2377/1990 Tên kháng sinh Lợn (ppb) Bò, dê, cừu(ppb) Gà(ppb) Danofloxacin 100 200 200 Difloxacin 400 400 300 Enrofloxacin 100 100 100 Flumequin 200 200 400 Marbofloxacin 150 150 Oxolinic acid (*) 100 100 (*) Giới hạn cho phép trong cá 100ppb Tại Việt Nam, Thông tư số 08/VBHN-BNNPTNT ngày 25 tháng 02năm 2014 quy định Danh mục các loại kháng sinh cấm sử dụng và hạn chế sử dụng [1], theo đó các kháng sinh fluoroquinolon bị cấm sử trong sản xuất, kinh doanh thuỷ sản xuất khẩu vào thị trường Mỹ và Bắc Mỹ, ciproxacin và ofloxacin bị cấm sử dụng trong chăn nuôi thú y, các chất nằm trong danh mục hạn chế sử dụng bao gồm: Bảng 1.3: Giới hạn hàm lượng kháng sinh quinolon theo Thông tư 08/VBHN-BNNPTNT Tên kháng sinh MRL (ppb) Tên kháng sinh MRL (ppb) Danofloxacin 100 Ciprofloxacin 100 Difloxacin 300 Oxolinic Acid 100 Flumequin 600 Sarafloxacin 30 Hiện nay, theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ngày 19 tháng 12 năm 2007 về quy định mức giới hạn ô nhiễm hóa học và vi sinh vật trong thực phẩm, Bộ Y tế cũng đã đưa ra mức giới hạn của 4 kháng sinh nhóm quinolon là danofloxacin, enrofloxacin, flumequine, sarafloxacin.4: Giới hạn hàm lượng kháng sinh quinolon theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT Tên kháng sinh ADI (μg/kg thể trọng/ngày) MRL (μg/kg) Danofloxacin 0 - 20 50 (gan lợn); 100 (thịt) Enrofloxacin 0-3 100 Flumequine 0 - 30 500 (thịt, gan, cá) Sarafloxacin 0 - 0,3 10 (thịt); 80 (gan, thận) 1.2 Tình hình sử dụng và tồn dƣ kháng sinh nhóm quinolon 1.1 Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trong nước Mặc dù các kháng sinh nhóm quinolon đã được các cơ quan chức năng quản lý chặt nhưng nhiều nghiên cứu đã chỉ ra thực phẩm trong nước và ngay cả thực 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com phẩm xuất khẩu vẫn bị phát hiện có chứa tồn dư loại kháng sinh này. Việc tồn dư kháng sinh ở hàm lượng cao cho thấy thực trạng sử dụng kháng sinh trong thời gian dài với hàm lượng lớn đồng thời người chăn nuôi không đảm bảo thời gian cách ly hợp lý đối với vật nuôi trước khi thu hoạch. Nhiều nghiên cứu trong nước đã khảo sát tình hình sử dụng các loại kháng sinh trong chăn nuôi, hầu hết các nghiên cứu đều cho thấy sự lạm dụng kháng sinh là rất phổ biến và tồn dư trong thực phẩm (kể cả đối với những chất đã bị cấm sử dụng) vẫn chiếm tỷ lệ đáng kể [4, 5, 6, 8, 9].
Người chăn nuôi sử dụng nó dưới nhiều hình thức khác nhau hoặc phối trộn trực tiếp vào trong thành phần của thức ăn hoặc đưa vào môi trường nuôi như một hình thức phòng bệnh. Theo nghiên cứu của Takahiro Yamaguchi đối với các mẫu lợn, bò, gà, tôm và cá nuôi thu thập tại các tỉnh Thái Bình, Hà Nội, Khánh Hòa, TP. HCM năm 2012-2013 của cho thấy có tới 7,7% số mẫu được kiểm nghiệm phát hiện nhiễm enrofloxacin (ERFX) với hàm lượng từ 12–77ppb điều này cho thấy mặc dù đã bị cấm nhưng bằng con đường nào đó các kháng sinh này vẫn đi vào mẫu thực phẩm để đến với người tiêu dùng [57]. Theo báo cáo của chính phủ Úc năm 2008, thủy sản nhập khẩu của Việt Nam vào thị trường nước này được giám sát rất chặt chẽ và đã phát hiện những lô hàng nhiễm kháng sinh quinolon bao gồm ERFX và ciprofloxacin (CPFX) với mức nhiễm lần lượt là 8,5 – 35 và 2,0 – 33ppb [12].