MỞ ĐẦU Hiện nay, khi mức sống của ngƣời dân từng bƣớc đƣợc nâng cao thì vệ sinh an toàn thực phẩm đang trở thành vấn đề đƣợc quan tâm của toàn xã hội. Đặc biệt, khi Việt Nam gia nhập WTO thì đây là một thách thức to lớn. Vệ sinh an toàn thực phẩm không chỉ là rào cản khắc nghiệt đối với hàng hóa xuất khẩu mà còn làm giảm sức cạnh tranh tại thị trƣờng tiêu thụ nội địa. Trong khoảng 10 năm trở lại đây, các ngành nghề chăn nuôi đƣợc mở rộng, năng suất và sản lƣợng các sản phẩm chăn nuôi ngày càng cao, góp phần đáng kể vào việc cung cấp nguyên liệu cho xuất khẩu cũng nhƣ thị trƣờng nội địa, tạo công ăn việc làm, xóa đói giảm nghèo và nâng cao mức sống cho ngƣời dân.
Tuy nhiên, do sự phát triển mang tính tự phát, phân tán nhỏ lẻ, thiếu sự qui hoạch và kiểm soát môi trƣờng kém đã làm cho dịch bệnh diễn biến ngày một phức tạp. Trong điều kiện đó, cùng với sự thiếu hiểu biết, ý thức cộng đồng kém nên ngƣời chăn nuôi coi hóa chất và thuốc thú y là giải pháp duy nhất để tăng năng suất và sản lƣợng. Điều đó, đồng nghĩa với việc hóa chất và thuốc thú y đƣợc sử dụng thƣờng xuyên hơn. Trên thực tế điều tra cho thấy việc sử dụng kháng sinh không đúng nguyên tắc, lạm dụng quá mức trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản vẫn đang tiếp diễn (Phạm Kim Đăng, 2007, 2011).
Việc lạm dụng, sử dụng bất hợp pháp hoặc sử dụng sai nguyên tắc thuốc thú y nói chung và kháng sinh nói riêng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản có thể gây hiện tƣợng nhờn thuốc hoặc gây tồn dƣ trong sản phẩm ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe cộng đồng, môi trƣờng cũng nhƣ hiệu quả điều trị bệnh. Để tăng cƣờng kiểm soát dƣ lƣợng, các nƣớc phát triển đã có những qui định rất chặt chẽ và kiểm soát nghiêm ngặt. Chẳng hạn, EU đã ban hành quyết định số 2377/90 EC nay đƣợc thay bằng quyết định 37/2010 quy định giới hạn tồn dƣ cho phép thuốc thú y trong sản phẩm động vật (CE, 1990; 2010), theo đó các sản phẩm có nguồn gốc từ động vật phải đƣợc kiểm soát tuân thủ quy trình của chỉ thị số 96/23 EC (EU, 1996). 10 Vũ Thị Ngân LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Hóa học Những năm gần đây, vệ sinh an toàn thực phẩm là một chủ đề đƣợc Chính phủ, các bộ, ngành liên quan đặc biệt quan tâm và là một trong những vấn đề nóng đƣợc đƣa ra chất vấn và thảo luận trong các kỳ họp Quốc hội gần đây.
Chính vì thế, các bộ ngành liên quan đã liên tục hoàn thiện và ban hành các quy định và nhiều chỉ thị để hƣớng dẫn kiểm soát dƣ lƣợng, trong đó quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ngày 24/02/2005, số 26/2005/QĐ – BTS ngày 18/8/2005 của Bộ thủy sản (nay là bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, gần đây nhất là thông tƣ 69/2010/TT- BNNPTNT ngày 6/12/2010 liên quan đến danh mục hóa chất và kháng sinh cấm và hạn chế sử dụng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản. Tồn dƣ tối đa các hóa chất, thuốc thú y, độc tố trong thực phẩm đã đƣợc Bộ Y tế quy định bởi quyết định N046/2007/QĐ-BYT ngày 19/12/2007 [1, 2, 3, 4]. Để kiểm soát dƣ lƣợng hóa chất nói chung và kháng sinh nói riêng, đã có nhiều phƣơng pháp phân tích đƣợc khuyến cáo sử dụng. Nhƣng với những đặc điểm ƣu việt và độ chính xác nên chỉ các phƣơng pháp phân tích sắc ký khối phổ (GC- MS, LC-MS) đƣợc coi là phƣơng pháp phân tích khẳng định, có giá trị pháp lý để phát hiện và định lƣợng nồng độ các chất tồn dƣ, đặc biêt đối với nhóm chất cấm hoặc cần đƣợc kiểm soát ở lƣợng vết hay siêu vết.
Tuy nhiên, do tích chất phức tạp, tính đặc hiệu của phƣơng pháp nên việc ứng dụng, vận hành ổn định và giá thành phân tích luôn là thách thức đối với ngƣời làm công tác phân tích. Để giảm thiểu chi phí phân tích xu hƣớng chung của các nƣớc là phát triển và chuẩn hóa các phƣơng pháp phân tích có khả năng phát hiện và định lƣơng đồng thời nhiều chất trong một lần phân tích. Vì vậy, để góp phần nâng cao năng lực phân tích và chiến lƣợc kiểm soát dƣ lƣợng kháng sinh ở nƣớc ta, việc nghiên cứu tối ƣu và chuẩn hóa các phƣơng pháp phân tích nói chung và phƣơng pháp khẳng định lý hóa nói riêng nhƣ phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ là rất cần thiết. Xuất phát từ thực tế đó, đề tài này đƣợc thực hiện nhằm tối ƣu hóa phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS có khả năng xác định đồng thời hai chất trong nhóm Phenicol (Chloramphenicol và Florfenicol) tồn dƣ trong một số thực phẩm tƣơi sống chính đƣợc bán trên thị trƣờng Hà Nội.
11 Vũ Thị Ngân LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Hóa học Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Kháng sinh và các vấn đề liên quan 1.1 Khái niệm và phân loại kháng sinh 1.1 Khái niệm kháng sinh Thuật ngữ kháng sinh đƣợc Vuillemin sử dụng từ năm 1889. Năm 1954, Turpin Velu định nghĩa: kháng sinh là chất hóa học do vi sinh vật tổng hợp hoặc hóa tổng hợp hữu cơ tạo ra, có hằng số hóa trị liệu cao, với liều lƣợng thấp có tác dụng điều trị thông qua ức chế một số quá trình sống của vi khuẩn và một số vi sinh vật đơn bào. Định nghĩa này quá rộng bao gồm cả một số Sunfamit, Sunfon, Isoniazit… một số Ancaloid và cả nhiều sát trùng [14]. Năm 1929, Fleming ở Anh lần đầu tiên thấy trong môi trƣờng nuôi cấy tụ cầu vàng, nếu có lẫn nấm penicilium notatum thì khuẩn lạc gần nấm sẽ không phát triển đƣợc.
Năm 1939, Florey và Chain đã chiết ra đƣợc từ nấm đó chất Peniciline dùng trong điều trị. Năm 1940, đã sản xuất thành công Peniciline thô và đã thử nghiệm trên động vật có kết quả tốt. Đến năm 1946, Peniciline kết tinh đã đƣợc sản xuất và tạo ra một bƣớc đột phá trong y học [7]. Kháng sinh tên quốc tế là Antibiotics.
Ngày nay kháng sinh đƣợc định nghĩa là: “Kháng sinh là chất do vi nấm hoặc vi khuẩn tạo ra , hoặc là chất tổng hợp hay bán tổng hợp có tác dụng điều trị đặc hiệu với liều lƣợng thấp do ức chế một số quá trình sống của vi sinh vật” [9, 12]. Cho đến nay đã có hàng nghìn chất kháng sinh đƣợc tìm ra nhƣng không phải tất cả đều có thể đƣợc sử dụng trong lâm sàng, vì có những chất đã tìm ra thƣờng gây các triệu chứng độc, có tác dụng phụ, có hại cấp tính hoặc do hoạt phổ kháng sinh quá hẹp hoặc do giá thành quá cao… 1.2 Phân loại thuốc kháng sinh [7] Theo sự phát triển của khoa học hiện đại, ngày nay có nhiều loại kháng sinh mới đã đƣợc tổng hợp. Để giúp cho việc định hƣớng lựa chọn kháng sinh có hiệu 12 Vũ Thị Ngân LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Hóa học quả trong nghiên cứu và điều trị, các nhà khoa học đã phân loại kháng sinh theo nhiều nhóm, có thể dựa theo nhiều cách: Phân loại theo nguồn gốc hoặc theo hoạt phổ kháng khuẩn, theo mức độ tác dụng hoặc theo cấu trúc hóa học. Trong đó cách phân loại theo cấu trúc hóa học đƣợc sử dụng rộng rãi nhất vì hoạt phổ tác dụng, mức độ, cơ chế và cấu trúc hóa học đều có liên quan tới nhau.
Với cơ sở này, kháng sinh đƣợc chia làm các nhóm chính sau: 1) Nhóm Beta-lactams: a) Phân nhóm các Penicilline Penicillin G (Benzine – Penicillin) và các dẫn xuất của Penicilline G đƣợc chiết xuất từ môi trƣờng nuôi cấy nấm Penicillium notatum. Penicillin M (Methicilline) bao gồm các thuốc: Methicilline, Dieloxacilline, Oxacilline, Choxacilline, Nafcilline. Penicilline có hoạt phổ kháng sinh rộng, nó có tác dụng khá mạnh đối với trực khuẩn Gram âm và Proteus. Phân nhóm Cephalosporine Phân nhóm này đƣợc chiết xuất từ các chủng Cephalosporium, bao gồm các thế hệ sau: Thế hệ thứ nhất (Cephazocine, Cephalecine, Cephaloridine, Cephathine…): có phổ tác dụng gần giống Ampicilline và Methicilline, có tác dụng đối với các cầu khuẩn Gram dƣơng, trực khuẩn Gram âm, nhóm trực khuẩn đƣờng ruột và Heamophilus.
Thế hệ thứ hai (Cefamandole, Cefotetane, Cefuroximeacetyl, Cefuroxime, Cefocitine…): so với thế hệ thứ nhất thì thế hệ thứ hai có khả năng chống chiụ với Penicillinaza của vi khuẩn tốt hơn, phổ tác dụng rộng và mạnh hơn với vi khuẩn Gram âm, Heamophilus influenzae và Pseudomonas. 13 Vũ Thị Ngân LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Hóa học Thế hệ thứ ba (Cefotaxime, Cefoperazone, Ceftriaxone, Ceftizoxime, Ceftazidime, Ceficime,…): Đối với các cầu khuẩn Gram dƣơng thì tác dụng yếu hơn các Penicilline và Cephalosporine thế hệ một, còn với cầu khuẩn Gram âm thì tác dụng với lậu cầu mạnh hơn thế hệ một và hai. Thế hệ thứ tƣ: mới chỉ đƣợc sử dụng trong nhân y còn thú y chƣa đƣợc sử dụng. 2) Nhóm Aminoglycosides Trong cấu trúc phân tử của các thuốc kháng sinh này có các gốc đƣờng đính theo các nhóm amin.
Cơ chế tác dụng của nhóm này là ức chế tổng hợp protein ở mức Ribosom. Aminoglycoside tự nhiên chiết từ dịch nuôi cấy vi sinh vật, có nguồn gốc từ Streptomyces (streptomycin, kanamycin, neomycin, gentamycin, fortimycin) từ Micromonospora Aminoglycoside tổng hợp là các kháng sinh có sự thay đổi cấu trúc hoá học của Aminoglycoside tự nhiên. 3) Nhóm Macrolides Là nhóm có cấu trúc aglycon, nhân lacton, vòng gồm 12 đến 19 nguyên tử cacbon, có gắn với 1-2 ose đặc hiệu bằng liên kết glycoside. Đƣợc chiết xuất từ nấm và gồm có hai nhóm: - Macrolides thực thụ gồm : Erythromycin, Oleandomycin, Spiramycin… - Macrolides có nhiều đƣờng nối đôi, có bốn vòng lacton lớn: các kháng sinh chống nấm.
- Macrolides họ hàng, trong phân tử có vòng lớn, chứa nhân thơm: Rifamycine các thuốc trong nhóm này ức chế protein vi khuẩn. Nhóm Macrolid là những chất đại phân tử, có tính kìm khuẩn đối với cầu khuẩn gram (+) cũng nhƣ đối với Mycoplasma. Thuốc đào thải qua mật. Nhóm thuốc này đối kháng với nhóm tetracycline (ở tụ cầu, liên cầu).
4) Nhóm Licosamides 14 Vũ Thị Ngân LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Hóa học Cấu trúc phân tử khác với Macrolides, không có vòng lacton. Phổ tác dụng và cơ chế tác dụng rất giống nhóm Macrolides. Gồm Lincomicin và Clindamycin. 5) Nhóm Phenicols Chloramphenicol đƣợc chiết ra từ môi trƣờng nuôi cấy streptomyces venezuelae.
Trong cấu trúc phân tử của CAP có hai cacbon bất đối xứng nên có bốn đồng phân lập thể, chỉ có đồng phân D (-) Threo có tác dụng kháng sinh. Hiện nay, đã tổng hợp đƣợc Thiamphenicol và Azdamphenicol.