Phân lập và đặc điểm nấm gây bệnh đốm lá trên cây nho tại Việt Nam

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu Isolation and characterization of fungus associated with leaf spot of grapevines in viet nam khóa, vận dụng lý thuyết vào thực tế, đề xuất giải

• Tác giả: Giap Thi Thuy Chi
• Người hướng dẫn: Dr. Pham Hong Hien
• Trường học: Vietnam National University of Agriculture
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Isolation and Characterization of Fungus Associated with Leaf Spot of Grapevines in Vietnam
• Loại tài liệu: Undergraduate thesis
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hanoi

Mục lục chi tiết

• COMMITMENT
• ACKNOWLEDGEMENTS
• ABSTRACT
• INDEX
• 1. GENERAL INTRODUCTION OF GRAPEVINES
• 1.1. Description of morphological characteristics of the grapevine
• 2. MATERIALS AND METHODS
• 2.1. Chemicals and medium components
• 2.2. Laboratory apparatuses and equipment
• 2.3. Research location and time
• 2.4. Isolation of fungus causing leaf spot disease on grapes (Chomnunti et al.)
• 2.5. Artificial infection (Jayawardena, Ruvishika S.)
• 2.6. The effects of some factors on fungal growth (culture medium, temperature, and pH)
• 2.7. Extracellular enzyme production of isolated fungal strain
• 2.8. DNA extraction, PCR amplification and Sequencing
• 3. RESULTS AND DISCUSSION
• 3.1. Isolation of fungal pathogens causing leaf spots from grapevines leaf
• 3.2. Morphological characteristics of SM strain
• 3.3. The effects of culture medium on SM strain growth
• 3.4. Effect of different temperatures on the growth of SM strain
• 3.5. Effect of different pH on the growth of SM strain
• 3.6. Testing extracellular enzyme activity
• 3.7. DNA extraction, PCR amplification and Sequencing and Phylogenetic analysis
• 3.8. DNA extraction, PCR amplification of SM strain
• 3.9. Phylogenetic analysis of SM strain
• 4. CONCLUSION AND SUGGESTION
• LIST OF ABBREVIATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES

Tóm tắt

I. Giới thiệu chung về nấm gây bệnh đốm lá trên cây nho

Nấm gây bệnh đốm lá là một trong những tác nhân chính ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng của cây nho tại Việt Nam. Cây nho (Vitis spp.) là một trong những loại cây ăn quả quan trọng, có giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên, sự xuất hiện của các bệnh do nấm, đặc biệt là bệnh đốm lá, đã gây ra thiệt hại lớn cho người trồng nho. Nghiên cứu này nhằm phân lập và xác định các đặc điểm của nấm gây bệnh đốm lá trên cây nho, từ đó đưa ra các biện pháp phòng ngừa hiệu quả. Theo thống kê, bệnh đốm lá do nấm Phomopsis viticola gây ra, đã được ghi nhận là nguyên nhân chính làm giảm năng suất nho tại các vùng trồng nho ở Hà Nội và Bắc Giang.

1.1. Tầm quan trọng của cây nho

Cây nho không chỉ có giá trị kinh tế mà còn có giá trị dinh dưỡng cao. Theo FAO, diện tích trồng nho toàn cầu đạt khoảng 8,485,000 ha, với sản lượng hàng năm lên tới 60 triệu tấn. Tại Việt Nam, nho được trồng chủ yếu ở Ninh Thuận, nơi có điều kiện khí hậu thuận lợi cho sự phát triển của cây nho. Tuy nhiên, năng suất nho tại Việt Nam vẫn thấp hơn so với các nước trong khu vực, chỉ đạt khoảng 11,2 tấn/ha/năm. Điều này cho thấy sự cần thiết phải nghiên cứu và phát triển các biện pháp phòng ngừa bệnh hại cho cây nho.

II. Phân lập nấm gây bệnh đốm lá

Quá trình phân lập nấm gây bệnh đốm lá được thực hiện từ các mẫu lá nho bị bệnh thu thập từ các vùng trồng nho khác nhau. Nghiên cứu đã sử dụng các phương pháp phân lập nấm truyền thống và hiện đại để xác định các chủng nấm gây bệnh. Kết quả cho thấy có hai chủng nấm được phân lập, trong đó chỉ có một chủng (SM) có khả năng gây bệnh trên lá nho. Chủng nấm SM có đặc điểm hình thái với sợi nấm phân nhánh mạnh mẽ, cho thấy khả năng thích nghi cao với điều kiện môi trường. Việc phân lập thành công nấm gây bệnh là bước quan trọng trong việc nghiên cứu các đặc điểm sinh học và sinh lý của nấm, từ đó tìm ra các biện pháp kiểm soát hiệu quả.

2.1. Phương pháp phân lập nấm

Phương pháp phân lập nấm được thực hiện bằng cách sử dụng môi trường nuôi cấy như MEA và PDA. Các mẫu lá nho bị bệnh được xử lý và cấy vào môi trường nuôi cấy để kích thích sự phát triển của nấm. Sau một thời gian ủ, các chủng nấm được quan sát và phân loại dựa trên các đặc điểm hình thái như màu sắc, hình dạng và tốc độ phát triển. Kết quả cho thấy chủng nấm SM có khả năng phát triển tốt trong điều kiện pH từ 5 đến 7 và nhiệt độ từ 20 đến 30 độ C.

III. Đặc điểm sinh học của nấm gây bệnh

Chủng nấm SM được xác định là Phomopsis viticola, có khả năng sản xuất các enzyme ngoại bào như chitinase, cellulase và pectinase. Những enzyme này đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh, giúp nấm xâm nhập vào mô thực vật và gây ra các triệu chứng bệnh lý. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng điều kiện môi trường như nhiệt độ, độ pH và loại môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của nấm. Việc hiểu rõ các đặc điểm sinh học của nấm gây bệnh sẽ giúp xây dựng các chiến lược phòng ngừa và kiểm soát bệnh hiệu quả hơn.

3.1. Đặc điểm hình thái và sinh lý

Chủng nấm SM có hình thái sợi nấm phân nhánh mạnh mẽ, cho thấy khả năng sinh trưởng tốt trong môi trường nuôi cấy. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nấm SM phát triển tốt nhất trên môi trường MEA và PDA, với nhiệt độ tối ưu từ 20 đến 30 độ C. Đặc biệt, nấm SM có khả năng sản xuất enzyme chitinase, cellulase và pectinase, cho thấy tiềm năng gây hại cao đối với cây nho. Những thông tin này rất quan trọng trong việc phát triển các biện pháp phòng ngừa bệnh hại cho cây nho.

IV. Kết luận và khuyến nghị

Nghiên cứu đã phân lập thành công nấm gây bệnh đốm lá trên cây nho tại Việt Nam, xác định được chủng nấm Phomopsis viticola là tác nhân chính gây bệnh. Kết quả nghiên cứu không chỉ cung cấp thông tin quan trọng về đặc điểm sinh học của nấm mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả. Để bảo vệ cây nho và nâng cao năng suất, cần có các nghiên cứu tiếp theo về các biện pháp sinh học và hóa học trong quản lý bệnh hại. Việc áp dụng các biện pháp này sẽ giúp bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và duy trì giá trị dinh dưỡng của nho.

4.1. Đề xuất nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát bệnh hại trên cây nho, bao gồm việc thử nghiệm các loại thuốc sinh học và hóa học. Ngoài ra, việc nghiên cứu các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm cũng cần được chú trọng. Những thông tin này sẽ giúp xây dựng các chiến lược quản lý bệnh hại hiệu quả hơn, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng nho tại Việt Nam.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây nho (Vitis vinifera L. thuộc họ Vitaceae) là một trong những loại cây ăn quả lâu năm có giá trị kinh tế và hàm lượng dinh dưỡng cao hàng đầu trên thế giới. Theo số liệu của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO), diện tích canh tác nho toàn cầu đạt khoảng 8,485 triệu hecta với tổng sản lượng trên 60,473 triệu tấn mỗi năm, đóng góp khoảng 17,5% tổng sản lượng trái cây toàn cầu. Trong cơ cấu sử dụng, khoảng 71% sản lượng nho được phục vụ cho ngành công nghiệp sản xuất rượu vang, 27% tiêu thụ ở dạng quả tươi và 2% dùng cho chế biến nho khô. Tại Việt Nam, cây nho đóng vai trò là cây trồng đặc sản chủ lực tại khu vực Duyên hải Nam Trung Bộ, tập trung chủ yếu ở tỉnh Ninh Thuận (khoảng 2.400 ha, chiếm 90% diện tích cả nước) và Bình Thuận (khoảng 250 ha, chiếm 9% diện tích). Mô hình canh tác nho đem lại nguồn thu nhập từ 200 đến 300 triệu đồng/ha/năm với năng suất trung bình tại Ninh Thuận đạt trên 30 tấn/ha/năm. Tuy nhiên, năng suất trung bình của cả nước chỉ đạt khoảng 11,2 tấn/ha/năm, thấp hơn mức trung bình 13,6 tấn/ha/năm của khu vực Châu Á - Thái Bình Dương.

Bên cạnh các yếu tố khí hậu, sự bùng phát của các loại bệnh hại do vi sinh vật là nguyên nhân chính gây suy giảm năng suất và chất lượng quả nho. Trong số các bệnh nấm nguy hiểm thường gặp như bệnh sương mai (Plasmopara viticola) hay phấn trắng (Uncinula necator), bệnh đốm lá do nấm gây ra là một trong những bệnh xuất hiện phổ biến, làm giảm diện tích quang hợp của lá, khiến lá biến vàng, hoại tử, rụng sớm và làm suy kiệt sức sống của giàn nho. Trên thực tế canh tác, biện pháp kiểm soát chủ yếu hiện nay vẫn là lạm dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học (như hỗn hợp Bordeaux, zineb, chlorothalonil, captan, benomyl). Việc sử dụng hóa chất liên tục trong thời gian dài đã và đang gây ra hiện tượng kháng thuốc ở nấm bệnh, làm mất cân bằng hệ sinh thái vi sinh vật và để lại dư lượng độc hại ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe người tiêu dùng. Nhằm tạo cơ sở khoa học cho việc phát triển các giải pháp phòng trừ sinh học an toàn, đề tài "Phân lập và đặc điểm nấm gây bệnh đốm lá trên cây nho" (Isolation and characterization of fungus associated with leaf spot of grapevines in Viet Nam) đã được thực hiện.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể bao gồm:

1. Phân lập các chủng nấm có liên quan đến triệu chứng bệnh đốm lá trên cây nho thu thập tại một số địa phương ở miền Bắc Việt Nam (Hà Nội và Bắc Giang).
2. Đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng nấm phân lập thông qua phương pháp lây nhiễm nhân tạo trên lá nho khỏe mạnh (theo nguyên lý giả thuyết Koch).
3. Khảo sát đặc điểm hình thái học đại thể (khuẩn lạc) và vi thể (khuẩn ty, vách ngăn, bào đài, bào tử) của chủng nấm gây bệnh được tuyển chọn.
4. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố sinh thái bao gồm loại môi trường nuôi cấy, nhiệt độ và độ pH đến động học sinh trưởng của chủng nấm bệnh.
5. Đánh giá hoạt tính sinh tổng hợp các enzyme ngoại bào phân giải thành tế bào thực vật (amylase, cellulase, protease, chitinase, pectinase).
6. Định danh chính xác chủng nấm gây bệnh ở mức độ loài bằng công cụ sinh học phân tử (tách chiết DNA, nhân bản đoạn gen ITS bằng phản ứng PCR, giải trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại).

Đối tượng nghiên cứu là các mẫu mô lá nho mang triệu chứng bệnh đốm lá và các chủng nấm phân lập được từ các mẫu bệnh này. Phạm vi không gian của nghiên cứu bao gồm các vườn nho tại Hà Nội và Bắc Giang (nơi thu thập mẫu bệnh) kết hợp với hệ thống phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ sinh học Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Phạm vi thời gian thực hiện đề tài diễn ra từ tháng 10 năm 2021 đến tháng 04 năm 2022.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận được xây dựng dựa trên cơ sở bệnh học thực vật hiện đại, vi sinh học thực nghiệm và phân loại học nấm phân tử. Về mặt lý thuyết bệnh học, các enzyme phân giải thành tế bào thực vật (Cell Wall-Degrading Enzymes - CWDEs) như pectinase và cellulase đóng vai trò then chốt giúp sợi nấm xâm nhập qua lớp biểu bì và mô thực vật. Về mặt phân loại học, trình tự vùng gen khoảng đệm phiên mã nội phần chất nhân (Internal Transcribed Spacer - ITS) bao gồm ITS1, 5.8S rRNA và ITS2 được sử dụng làm mã vạch phân tử chuẩn (molecular barcode) để định danh các loài nấm sợi.

Hệ thống phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được triển khai đồng bộ qua các bước kỹ thuật sau:

• Phương pháp thu thập và xử lý mẫu bệnh: Mẫu lá nho nhiễm bệnh có vết đốm màu nâu, dạng tròn hoặc bất định được thu thập tại Hà Nội và Bắc Giang, bảo quản trong túi vô trùng có bông ẩm. Mẫu mô bệnh được khử trùng bề mặt bằng dung dịch ethanol 70% trong 1 phút, rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng, cắt thành các miếng nhỏ kích thước 5x5 mm rồi cấy lên môi trường thạch thấu khoai tây - dextrose (Potato Dextrose Agar - PDA), ủ ở 30°C trong 3–5 ngày để phát triển hệ sợi. Chủng thuần khiết được làm sạch qua kỹ thuật cấy đầu khuẩn ty.
• Phương pháp kiểm tra khả năng gây bệnh (Lây nhiễm nhân tạo): Thực hiện theo quy trình của Jayawardena et al. (2016). Lá nho khỏe mạnh được khử trùng bề mặt bằng NaClO 5% trong 1 phút, rửa sạch bằng nước cất vô trùng. Dùng dao vô trùng tạo vết rạch chữ thập ở mặt dưới lá, đặt miếng thạch khuẩn ty (5x5 mm từ đĩa thạch 3 ngày tuổi) úp mặt sợi nấm vào vết thương. Đặt lá vào đĩa Petri lót giấy lọc ẩm (độ ẩm duy trì ~95%), ủ ở 30°C và theo dõi triệu chứng hoại tử trong 3 ngày liên tục. Đĩa đối chứng sử dụng miếng thạch PDA vô trùng không chứa sợi nấm.
• Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái: Nuôi cấy nấm trên môi trường dịch thể PDB (Potato Dextrose Broth) lắc ở 30°C trong tối 5 ngày. Đặt lam kính nghiêng góc 30–45° trên đĩa thạch để theo dõi sự phát triển của hệ sợi, sự hình thành vách ngăn, bào đài và bào tử vô tính dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 40x và 100x theo chu kỳ 4 giờ/lần.
• Phương pháp đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng:
  • Môi trường dinh dưỡng: Đánh giá trên 6 loại môi trường thạch gồm PDA, CDA (Czapek Dox Agar), SDA (Sabouraud Dextrose Agar), ISP2 (International Streptomyces Project 2), MEA (Malt Extract Agar) và WA (Water Agar) ở 30°C trong 5 ngày.
  • Nhiệt độ: Nuôi cấy trên PDA ở các dải nhiệt độ 15°C, 20°C, 30°C, 37°C và 45°C.
  • Độ pH: Khảo sát trên dải pH từ 4 đến 10 (hiệu chỉnh bằng dung dịch HCl 0,1M và NaOH 0,1M) trên môi trường PDA ở 30°C. Chỉ tiêu theo dõi là đường kính tản nấm (mm) và mật độ khuẩn ty sau 5 ngày nuôi cấy.
• Phương pháp xác định hoạt tính enzyme ngoại bào: Sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch (agar well diffusion) theo Abdel-Raheem (2002). Dịch enzyme thô được thu nhận từ dịch nuôi cấy PDB 3 ngày tuổi sau khi ly tâm 6.000 vòng/phút trong 15 phút. Tra 100 µl dịch enzyme vào các giếng thạch chứa cơ chất đặc hiệu: tinh bột 1% (khảo sát amylase), CMC 1% (cellulase), gelatin 0,5% (protease), chitin 1% (chitinase) và pectin 0,5% (pectinase). Đĩa thạch được ủ ở 4°C trong 2 giờ để khuếch tán, sau đó chuyển sang 30°C trong 24 giờ. Nhuộm hiện màu bằng thuốc thử Lugol 1% (đối với tinh bột, CMC, chitin, pectin) và Black amino 10B 0,1% (đối với gelatin). Hoạt tính enzyme được đánh giá định tính và đo lường thông qua đường kính vòng phân giải $D - d$ (mm), trong đó $D$ là đường kính vòng phân giải và $d$ là đường kính giếng thạch.
• Phương pháp sinh học phân tử và phân tích phát sinh loài: Tách chiết DNA bộ gen tổng số trực tiếp từ hệ sợi nấm bằng phương pháp CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide). Khuếch đại vùng gen ITS bằng cặp mồi chuẩn ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) và ITS4 (5’-TCCTCCGCTTTATTGATATG-3’) trên máy chu trình nhiệt GeneAmp PCR System (Applied Biosystems). Chu trình nhiệt: 94°C trong 5 phút; 35 chu kỳ gồm 98°C/15 giây, 50°C/30 giây, 72°C/2 phút; kết thúc ở 72°C trong 5 phút. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%, sau đó gửi giải trình tự. Trình tự nucleotide được xử lý bằng phần mềm BioEdit v5.1, so sánh độ tương đồng bằng công cụ BLASTn trên ngân hàng gen NCBI GenBank, căn chỉnh đa trình tự bằng ClustalX v1.83 và xây dựng cây phát sinh loài theo thuật toán Maximum Likelihood (ML) bằng phần mềm MEGA X.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu (General Introduction and Literature Review)

Chương 1 hệ thống hóa các tư liệu khoa học về nguồn gốc, phân loại thực vật học, giá trị dinh dưỡng và tình hình sản xuất cây nho trên quy mô toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Tác giả phân tích chi tiết triệu chứng và tác nhân của ba nhóm bệnh nấm nguy hiểm hàng đầu trên cây nho gồm bệnh sương mai (Plasmopara viticola), bệnh phấn trắng (Uncinula necator) và bệnh đốm lá (Phomopsis viticola). Tổng quan nhấn mạnh rằng nấm Phomopsis viticola có khả năng tấn công tất cả các bộ phận màu xanh của cây nho (lá, cành non, cuống cụm hoa, quả), tồn tại qua đông dưới dạng sợi nấm hoặc hạch nấm trong vỏ cành già. Đồng thời, chương này chỉ ra tình trạng phụ thuộc quá mức vào các loại thuốc diệt nấm hóa học trong sản xuất nho hiện nay và sự cần thiết phải phân lập, xác định chính xác đặc tính của tác nhân gây bệnh bản địa để phục vụ công tác quản lý dịch hại tổng hợp.

Chương 2: Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu (Materials and Methods)

Chương 2 trình bày chi tiết danh mục hóa chất, thành phần môi trường nuôi cấy (PDA, SDA, ISP2, MEA, CDA, WA và các môi trường thử enzyme), trang thiết bị phân tích (kính hiển vi, máy đo pH, máy ly tâm lạnh, tủ cấy vô trùng, máy luân nhiệt PCR). Toàn bộ các quy trình thao tác chuẩn từ khâu thu thập mẫu bệnh tại Hà Nội và Bắc Giang, quy trình phân lập, kỹ thuật lây nhiễm nhân tạo kiểm tra tính gây bệnh trên lá tách rời, phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố sinh lý sinh thái, kỹ thuật đục lỗ thạch xác định hoạt tính enzyme ngoại bào đến quy trình tách DNA bằng CTAB và điều kiện chạy PCR phân tích gen ITS đều được mô tả chuẩn xác, có tính lặp lại thực nghiệm cao.

Chương 3: Kết quả và Thảo luận (Results and Discussion)

Chương 3 tập trung phân tích các dữ liệu thực nghiệm thu được qua các nội dung:

• Kết quả phân lập và lây nhiễm nhân tạo: Từ các mẫu lá bệnh thu thập, nghiên cứu đã phân lập được 02 chủng nấm sợi ký hiệu là SM và HV. Sau 3 ngày tiến hành thử nghiệm tái lây nhiễm nhân tạo trên lá nho khỏe mạnh, chỉ có chủng SM tái hiện chính xác triệu chứng bệnh đốm lá tự nhiên với các vết hoại tử màu nâu, hình tròn đến bất định, đường kính 2–4 mm và có viền nâu sẫm rõ rệt. Trong khi đó, chủng HV gây hiện tượng đốm đen thối nhũn lan rộng (không tương đồng với vết bệnh ban đầu). Do đó, chủng SM được xác định là tác nhân gây bệnh và được lựa chọn cho toàn bộ các nghiên cứu chuyên sâu tiếp theo.
• Đặc điểm hình thái học của chủng SM: Khuẩn lạc chủng SM trên môi trường PDA phát triển dạng sợi, mép dạng sợi (filiform), bề mặt gồ ghề lượn sóng, mặt trước ban đầu có màu trắng sau chuyển sang vàng nhạt, mặt sau màu trắng với tâm màu vàng. Quan sát vi thể cho thấy hệ sợi nấm phân nhánh đơn trục (monopodial branching), sợi nấm không màu và có vách ngăn hình thành khi thành thục. Sau 32 giờ nuôi cấy, bào đài (conidiophores) bắt đầu xuất hiện và sau 40 giờ thì bào đài sản sinh các bào tử phân sinh (conidia), hoàn toàn phù hợp với các mô tả hình thái của chi Phomopsis.
• Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sinh trưởng: Chủng SM sinh trưởng tốt nhất trên môi trường PDA (đường kính tản nấm lớn nhất đạt 89,50 mm sau 5 ngày), tiếp theo là môi trường MEA (87,67 mm), và hầu như không phát triển trên môi trường thạch nước WA. Về nhiệt độ, chủng SM phát triển tối ưu ở 30°C (sau đó là 20°C), sinh trưởng rất yếu ở 15°C và bị ức chế hoàn toàn ở 37°C và 45°C. Về pH, nấm phát triển mạnh nhất ở pH = 5,0, sinh trưởng yếu ở pH 4,0 và pH 9,0, và ngừng sinh trưởng ở pH = 10,0.
• Khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào: Chủng SM thể hiện hoạt tính phân giải rõ rệt đối với 3 loại cơ chất gồm CMC (chứng minh khả năng sinh cellulase), chitin (sinh chitinase) và pectin (sinh pectinase với đường kính vòng phân giải đạt 5 mm). Chủng không có khả năng sinh amylase và protease. Khả năng tiết cellulase và pectinase giải thích cơ chế nấm xâm nhiễm và phá hủy cấu trúc thành tế bào lá cây chủ.
• Kết quả định danh phân tử: Phản ứng PCR khuếch đại vùng gen ITS của chủng SM cho một băng DNA duy nhất, rõ nét và kích thước đồng nhất trên gel agarose 1%. Kết quả giải trình tự và so chiếu BLASTn cho thấy đoạn gen ITS dài 550 bp của chủng SM đạt độ tương đồng 98,73% (543/550 bp) với loài Phomopsis viticola trên GenBank (mã số truy cập No.1) với hệ số tin cậy bootstrap đạt 97% trên cây phát sinh loài.

Chương 4: Kết luận và Đề xuất (Conclusion and Suggestion)

Chương này tổng kết toàn bộ các phát hiện cốt lõi: khẳng định chủng nấm SM phân lập từ lá nho tại Việt Nam là loài Phomopsis viticola; làm rõ các đặc điểm hình thái vi thể, điều kiện sinh lý tối ưu (nhiệt độ 20–30°C, pH 5, môi trường giàu đường PDA/MEA) và phổ hoạt tính enzyme ngoại bào của chủng nấm. Tác giả đưa ra kiến nghị tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế sinh bệnh học ở cấp độ phân tử và thử nghiệm các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh trên đồng ruộng.

---

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã cung cấp những dẫn liệu thực nghiệm khoa học có hệ thống về tác nhân nấm gây bệnh đốm lá trên cây nho tại miền Bắc Việt Nam:

Bảng 1: Tổng hợp đặc điểm sinh lý, sinh hóa và định danh của chủng nấm gây bệnh SM

Chỉ tiêu nghiên cứu	Đặc điểm / Kết quả thực nghiệm của chủng SM
Hình thái khuẩn lạc	Dạng sợi, mép filiform, mặt trước trắng chuyển vàng nhạt, tâm mặt sau màu vàng
Đặc điểm vi thể	Khuẩn ty phân nhánh đơn trục, có vách ngăn, hình thành bào đài sau 32h, sinh bào tử sau 40h
Môi trường sinh trưởng tối ưu	PDA (đường kính 89,50 mm/5 ngày), MEA (đường kính 87,67 mm/5 ngày)
Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu	30°C (dải thích hợp 20–30°C; ức chế hoàn toàn ở 37°C và 45°C)
Độ pH tối ưu	pH = 5,0 (ức chế hoàn toàn ở pH = 10,0)
Khả năng sinh enzyme ngoại bào	Cellulase (+), Chitinase (+), Pectinase (+, vòng phân giải 5 mm); Amylase (-), Protease (-)
Kích thước đoạn gen ITS	Băng PCR rõ nét ~550 bp
Mức độ tương đồng phân tử	Đồng nhất 98,73% với Phomopsis viticola trên NCBI GenBank (Bootstrap 97%)
Tên khoa học xác định	Phomopsis viticola

Bảng 2: So sánh đặc tính hình thái và khả năng gây bệnh giữa hai chủng nấm phân lập

Đặc tính quan sát	Chủng SM	Chủng HV
Màu sắc mặt trước (ngày 5-7)	Trắng đến vàng nhạt	Trắng chuyển đen thẫm
Màu sắc mặt sau	Trắng, trung tâm vàng	Trắng chuyển đen thẫm
Bề mặt khuẩn lạc	Nhám ráp, phát triển lượn sóng	Nhám ráp
Kết quả lây nhiễm nhân tạo	Gây vết đốm lá nâu viền sẫm 2–4 mm (bệnh đốm lá)	Gây đốm đen thối nhũn và hoại tử rộng
Khả năng gây bệnh đốm lá	Dương tính (+) - Tác nhân chính	Âm tính (-) - Không phải tác nhân đốm lá điển hình

Đóng góp khoa học và thực tiễn của khóa luận:

• Lần đầu tiên cung cấp dẫn liệu đầy đủ kết hợp giữa phương pháp vi sinh truyền thống và sinh học phân tử chuẩn xác để xác định loài Phomopsis viticola gây bệnh đốm lá trên cây nho thu thập tại khu vực Hà Nội và Bắc Giang.
• Làm sáng tỏ các yếu tố sinh thái then chốt điều khiển sự phát triển của nấm (ưa nhiệt độ ấm 20–30°C, môi trường acid nhẹ pH 5,0), đồng thời chứng minh vai trò của phức hệ enzyme phân giải vách tế bào (pectinase, cellulase) trong cơ chế xâm nhiễm. Các dữ liệu này là cơ sở trực tiếp phục vụ công tác dự tính, dự báo diễn biến bệnh trong điều kiện thời tiết thực tế và định hướng phát triển các biện pháp phòng trừ sinh học hoặc chất ức chế enzyme nhằm thay thế thuốc hóa học.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận còn một số điểm hạn chế do giới hạn về nguồn lực và thời gian thực hiện của một đề tài tốt nghiệp đại học:

• Phạm vi lấy mẫu: Nghiên cứu mới chỉ thu thập và phân lập mẫu bệnh đốm lá tại hai tỉnh phía Bắc (Hà Nội và Bắc Giang), chưa mở rộng khảo sát và lấy mẫu tại các vùng chuyên canh nho trọng điểm phía Nam như Ninh Thuận và Bình Thuận để so sánh tính đa dạng di truyền nội loài của nấm Phomopsis viticola.
• Quy mô thử nghiệm: Thí nghiệm kiểm chứng độc lực và khả năng gây bệnh mới chỉ dừng lại ở quy mô in vitro trên lá nho tách rời trong phòng thí nghiệm, chưa tiến hành thử nghiệm lây nhiễm trực tiếp trên cây nho nguyên vẹn trong điều kiện nhà lưới hay ngoài đồng ruộng.
• Phân tích enzyme: Các chỉ tiêu enzyme ngoại bào mới chỉ dừng lại ở mức độ định tính và bán định lượng qua đường kính vòng phân giải trên đĩa thạch, chưa định lượng hoạt độ riêng (U/mg protein) bằng phương pháp quang phổ.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất:

• Tiếp tục mở rộng phạm vi thu thập mẫu nấm trên diện rộng tại các vùng trồng nho toàn quốc.
• Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tương tác giữa nấm bệnh và cây chủ ở cấp độ sinh học phân tử.
• Tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng (như Bacillus, Trichoderma, Streptomyces) hoặc các hoạt chất sinh học có khả năng ức chế sinh trưởng của nấm Phomopsis viticola nhằm xây dựng quy trình quản lý bệnh hại tổng hợp (IPM) bền vững cho cây nho.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu tham khảo có giá trị học thuật và thực tiễn cho nhiều đối tượng:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh: Thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Bảo vệ Thực vật, Vi sinh vật học, Nông học và Trồng trọt có thể tham khảo trực tiếp quy trình thực nghiệm chuẩn mực về phân lập nấm sợi, phương pháp lây nhiễm nhân tạo kiểm chứng giả thuyết Koch, và quy trình định danh nấm bằng kỹ thuật PCR-ITS kết hợp phần mềm MEGA X.
• Cán bộ kỹ thuật và cán bộ khuyến nông: Nắm bắt được các đặc điểm sinh thái (nhiệt độ phát triển 20–30°C, pH 5,0) và triệu chứng đặc thù của nấm Phomopsis viticola để chẩn đoán chính xác bệnh hại trên đồng ruộng, từ đó đưa ra khuyến cáo phòng ngừa kịp thời cho người nông dân trong các giai đoạn thời tiết thuận lợi cho nấm phát sinh.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao trong hai chủng nấm phân lập được (SM và HV), tác giả chỉ lựa chọn chủng SM để nghiên cứu sâu?
Sau khi phân lập được hai chủng nấm từ mẫu lá bệnh, tác giả đã tiến hành thử nghiệm lây nhiễm nhân tạo trên lá nho khỏe mạnh (theo nguyên lý giả thuyết Koch). Kết quả sau 3 ngày cho thấy chỉ có chủng SM tái hiện chính xác triệu chứng bệnh đốm lá tự nhiên (vết hoại tử hình tròn đến bất định, đường kính 2–4 mm với viền nâu sẫm đặc trưng), trong khi chủng HV gây ra vết thối nhũn và hoại tử lan rộng màu đen. Do đó, chủng SM được chứng minh là tác nhân thực sự gây bệnh đốm lá và được chọn để nghiên cứu tiếp.

2. Điều kiện môi trường, nhiệt độ và pH tối ưu cho sự sinh trưởng của chủng nấm SM là gì?
Chủng SM sinh trưởng tốt nhất trên môi trường PDA (đường kính tản nấm đạt 89,50 mm sau 5 ngày) và MEA (87,67 mm); nhiệt độ tối ưu là 30°C (dải thích hợp từ 20–30°C, bị ức chế hoàn toàn ở 37°C và 45°C); độ pH tối ưu là pH = 5,0 (sinh trưởng yếu ở pH 4,0 và 9,0, ngừng phát triển hoàn toàn ở pH = 10,0).

3. Chủng nấm SM có khả năng sinh tổng hợp những loại enzyme ngoại bào nào và điều này có ý nghĩa gì đối với tính gây bệnh?
Chủng SM có khả năng sinh tổng hợp 3 loại enzyme ngoại bào gồm cellulase, chitinase và pectinase (đường kính vòng phân giải pectin đạt 5 mm), đồng thời không sinh amylase và protease. Việc tiết ra cellulase và pectinase giúp nấm phân giải cellulose và pectin (hai thành phần cấu trúc chính của thành tế bào thực vật), tạo điều kiện cho sợi nấm đâm xuyên qua lớp biểu bì và mô lá để xâm nhiễm và gây hoại tử mô.

4. Phương pháp sinh học phân tử nào đã được sử dụng để xác định tên loài của chủng nấm SM?
Tác giả đã sử dụng kỹ thuật tách chiết DNA bằng CTAB, nhân bản đoạn gen khoảng đệm phiên mã nội phần chất nhân (ITS) bằng phản ứng PCR với cặp mồi ITS1/ITS4, sau đó giải trình tự nucleotide. Trình tự thu được được phân tích bằng BLASTn trên cơ sở dữ liệu NCBI GenBank, cho kết quả tương đồng 98,73% (543/550 bp) với loài Phomopsis viticola với chỉ số bootstrap đạt 97% trên cây phát sinh loài xây dựng bằng phần mềm MEGA X.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Giáp Thị Thùy Chi đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu xác định tác nhân gây bệnh đốm lá trên cây nho tại Hà Nội và Bắc Giang. Bằng việc kết hợp chặt chẽ giữa các phương pháp kiểm chứng lây nhiễm nhân tạo, phân tích hình thái vi học, khảo sát sinh lý sinh thái và sinh học phân tử, nghiên cứu đã định danh chính xác chủng nấm gây bệnh SM là loài Phomopsis viticola. Đồng thời, các dẫn liệu về sự sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 20–30°C, pH 5,0 và khả năng tiết enzyme phân giải thành tế bào (pectinase, cellulase) đã cung cấp luận cứ khoa học quan trọng cho việc nghiên cứu các giải pháp phòng trừ sinh học an toàn và hiệu quả đối với bệnh đốm lá hại nho tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE FACULTY OF BIOTECHNOLOGY ----------  ---------- THESIS TITLE: ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF FUNGUS ASSOCIATED WITH LEAF SPOT OF GRAPEVINES IN VIET NAM HANOI – 2022 1 VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE FACULTY OF BIOTECHNOLOGY ----------  ---------- UNDERGRADUATE THESIS ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF FUNGUS ASSOCIATED WITH LEAF SPOT OF GRAPEVINES IN VIET NAM Student’s name : Giap Thi Thuy Chi Student’s code : 620429 Class : K62-CNSHE Supervisor : Dr. PHAM HONG HIEN MSc. NGUYEN THANH HUYEN HA NOI – 2022 COMMITMENT I hereby declare that all the data and the results that I have provided in this thesis are truthful, accurate, and not used in any other reports. I also assure you that any help in this thesis has been greatly appreciated thankful and the information cited has been acknowledged.

Hanoi, May, 2022 Student Giap Thi Thuy Chi i ACKNOWLEDGEMENTS First and foremost, I have to thank the Vietnam National University of Agriculture for giving me a chance to study in a professional environment that provided me the sufficient knowledge throughout four and a half academic years. In doing my thesis, many people helped me bring this work into existence, but the most influential and inspiring person I would like to extend thanks to is my supervisor, MSc. Nguyen Thanh Huyen without her assistance and dedicated involvement in every step throughout the thesis, this thesis would have never been accomplished. I would like to express my deep gratitude to all teachers from the Faculty of Biotechnology, who encouraged me to enhance my knowledge and help me get orientation for my thesis.

Getting through my undergraduate thesis required more than academic support, and I have many, many people to thank for listening to and, at times, having to tolerate me, thank all my friends, who were with me up until this point, simultaneously motivate me to accomplish more. Last but not least, I would like to thank myself, and my parents who endured this long process, for always supporting and assisting me during the process of completed graduate thesis. Ha Noi, May, 2022 Student Giap Thi Thuy Chi ii ABSTRACT Grapevine (Vitis spp.) is among the most widely grown fruit crops worldwide and plays a significant role in its commercial value in Vietnam as well as having an excellent source of nutrition. However, recently many diseases appeared and affected the yield and quality such as downy mildew (Plasmopara viticola), powdery mildew (Uncinula necator), and leaf spot (Phomopsis viticola).

Among them, leaf spot disease is a fairly common disease and causes a significant reduction in the yield of Grapevines. The thesis was conducted in leaf spots of grapevines collected from different places in Ha Noi and Bac Giang, Vietnam in 2021. The fungus was Isolated from leaf spot disease on grapevines, and the fungus was selected and then used for artificial infection into healthy grapevine leaves. The fungal strains causing the grape leaf spots will be selected to study the morphological and biochemical characteristics, as well as the conditions affecting the growth of the fungus.

Then, these fungal strains are identified by molecular tools. Research results show that 2 strains (SM and HV) of fungi have been isolated, but after re-infection, only one strain (SM) is capable of causing leaf spot disease on grape leaves, SM strain has mycelium that is profusely branched (monopodial branching). Studying the growth conditions of fungal strains proves that SM grows well on MEA and PDA, at around the temperature range of 20-30°C with pH from 5. SM strain has the ability to produce chitinase, cellulase, and pectinase.

The causal fungus strain (SM) was identified as Phomopsis viticola. iii INDEX COMMITMENT. iii LIST OF ABBREVIATIONS. vi LIST OF TABLES.

vii LIST OF FIGURES. General introduction of grapevines. Description of morphological characteristics of the grapevine. MATERIALS AND METHODS.

Chemicals and medium components. Laboratory apparatuses and equipment. Research location and time. Isolation of fungus causing leaf spot disease on grapes (Chomnunti et al.

Artificial infection (Jayawardena, Ruvishika S. The effects of some factors on fungal growth (culture medium, temperature, and pH ). Extracellular enzyme production of isolated fungal strain. DNA extraction, PCR amplification and Sequencing.

RESULTS AND DISCUSSION. Isolation of fungal pathogens causing leaf spots from grapevines leaf. Morphological characteristics of SM strain. The effects of culture medium on SM strain growth.

Effect of different temperatures on the growth of SM strain. Effect of different pH on the growth of SM strain. Testing extracellular enzyme activity. DNA extraction, PCR amplification and Sequencing and Phylogenetic analysis.

DNA extraction, PCR amplification of SM strain. Phylogenetic analysis of SM strain. CONCLUSION AND SUGGESTION. 37 v LIST OF ABBREVIATIONS Abbreviations Explanations PDA Potato Dextrose Agar SDA Sabouraud Dextrose Agar MEA Malt Extract Agar CDA Czapek Dox Agar WA Water Agar ISP International Streptomyces Project et al Et alia CWDEs cell wall-degrading enzymes CMC Carboxymethyl cellulose vi LIST OF TABLES Table 2.

Nutrition of Grapes. Experimental materials for detecting extracellular enzymes. Morphological characterization of two isolated fungal strains. The ability of extracellular enzyme production of SM.

31 vii LIST OF FIGURES Figure 2. One grapevine garden in Ninh Thuan. Symptoms of powny mildew disease. Symptoms of powdery mildew disease.

Symptoms of leaf spot disease. Leaf samples with leaf spot disease. Fungal strains isolated from infected grape leaves. Re-infection of isolated fungal strains (HV, SM) in grapevine leaf and control sample on the 3rd days.

Microscopic observation of the selected fungus strain-SM. Growth of SM strain in different media on the 5th days. Growth of SM strain in different temperatures on the 5th days. Growth of SM strain in different pH on the 5th days.

Chitinase activity of the SM strain. Cellulase activity of the SM strain. Pectinase activity of the SM strain. PCR product of SM strain on gel agarose.

Phylogenetic tree of SM strain. Introduction Grapevine (Vitis sp., Vitaceae) is one of the most important fruit crops cultivated around the globe and has a high nutritional value in many countries. According to FAO data (2014), the global grape-growing area has 8,485,000 hectares and is increasing at a pace of 2% per year, with yearly production reaching 60,473 million tons, accounting for 17.5 percent of total global fruit production. Approximately 71% of grapes are utilized as raw materials for wine production, 27% are consumed fresh, and 2% are dried (seedless grapes).

Currently, vines are grown on all five continents in climates that are conducive to their growth. Spain (1,175,000 ha), Russia, Italy, France, Turkey, Portugal, and the United States are the countries with the largest grape areas in the world. Over 60% of the world's grape output has been produced in Europe. In recent years, grape acreage and production have expanded in Asia.

The entire area is currently around 1. China, India, Japan, Korea, Pakistan, Thailand, and Vietnam are Asian countries having substantial grape acreage (FAO, 2014). According to the conference on grape production in Asia Pacific countries, which included eight countries: China, India, Korea, Japan, Myanmar, Thailand, and Vietnam, the grape area of the participating countries is 393,725 ha, with a yield of 5.432 million tons and an average grape yield of 13.6 tons per ha per year. The grape output in Vietnam is lower than the regional average, at only 11.2 tons per hectare per year (caytrong, 2019).

In Viet Nam, there are also many grape growing regions, of which Ninh Thuan is the most planted with about 2,400 hectares in Ninh Thuan (accounting for 90%) and 250 hectares in Binh Thuan (accounting for 9% of the total grape growing area of the country) (Le Quang Quyen et al. The results of a random survey of 50 vineyards with different planting ages in 2014 showed that 1 the average grape yield in Ninh Thuan was over 30tons/ha/year. Growing grapes can make a profit of over 200-300 million VND/ha/year (Tran Ngoc Tu et al. Although it has great economic value, currently the yield and quality of vines are reduced due to several diseases such as downy mildew (Plasmopara viticola (Berk.

& MA Curtis) Berl. Currently, there are many measures to control diseases on grapevines, but measures Using chemical drugs are widely applied because of their quick effect. However, the long-term use of chemical drugs causes serious health consequences. For the above reasons, the topic " Isolation and characterization of fungus associated with leaf spot of grapevines in Viet Nam " was carried out.

This study was undertaken for the evaluation of the characteristics of pathogenic fungal strains and will provide useful information to find solutions. Effective disease prevention while maintaining the nutritional value of grapes without affecting the health of the user. Research purpose - Isolation of fungal strains causing leaf spot disease on grapes in Vietnam. - Determination of the morphological, and biochemical characteristics of the pathogenic fungus causing grape leaf spot spots Vietnam.

Requirement - Isolation and selection of fungus associated with leaf spots in grapevine leaves - Pathogenicity test on healthy grapevine leaves. - Characterization of fungal strain causing leaf spot in grapevine leaves: morphology colony, mycelium, and spore of fungus. General introduction of grapevines The grapevine (Vitis vinifera) belongs to the Vitaceae family, which includes approximately 60 inter-fertile wild Vitis species found in Asia, North America, and Europe under subtropical, Mediterranean, and continental– temperate climatic conditions. It is the single Vitis species that has gained significant economic interest and is a commercially valuable plant over time, which can be used as a rich source of nutrients in multiple industries (Xu et al.

2017; Chitarrini et al., 2017), for example, the North American, are used as breeding rootstock due to their resistance against grapevine pathogens, such as Phylloxera, Oidium and mildews. Indeed, a great majority of cultivars are widely cultivated for fruit, juice, and mainly for wine which was classified as Vitis vinifera L. Vinifera (or Sativa), derive from wild forms (Vitis vinifera L. sylvestris (Gmelin) Hegi] ((Rossetto, McNally et al., 2002); (Sefc, Steinkellner et al., 2003); (Crespan, 2004, This, Jung et al.

According to Nikolai Ivanovich Vavilov (1926), a Russian botanist work of prominent, the highest biodiversity of a crop is usually its center of origin. In 1938, his disciple Aleksandr Mikhailovich Negrul observed that the highest biodiversity in cultivated grapes was in today’s Georgia, Armenia, Azerbaijan, Turkey, and Iran, which makes them the best candidates for being the cradle(s) of viticulture. Analysis of morphological similarities between wild and cultivated grapes from all over Eurasia generally supports a Near Eastern origin for grape domestication. The closest genetic relationship was discovered between local wild grapevines and traditionally cultivated grape varieties from southern Anatolia, Armenia, and Georgia.

This suggests that the headwaters of the Tigris and Euphrates rivers in the Taurus Mountains are the most likely location for the first domestication of the grapevine (Arroyo‐García, R. 2 Grapevine was domesticated (Vitis vinifera, sometimes called V. sativa) and was one of the most important fruit species in the classic Mediterranean world, and it is the most important economic fruit species in the modern world today. As in the ancient past, sun-loving grapevines are today cultivated to produce fruits, which are eaten fresh (as table grapes) or dried (as raisins), and, most especially, to make wine, a drink of great economic, cultural, and symbolic value (K.

The Vitis family consists of about 60 inter-fertile species that exist almost exclusively in the Northern Hemisphere: of those, V. vinifera is the only one extensively used in the global wine industry. Approximately 10,000 cultivars of V. vinifera exist today, although the market for wine production is dominated by only a handful of them.

Cultivars are typically classified according to whether they produce wine grapes, table grapes, or raisins (K. Domesticated grapevine (Vitis vinifera, also known as V.