Đặt vấn đề Vi khuẩn lactic (LAB) được sử dụng nhiều trong thực phẩm lên men như dưa muối, cà muối, lên men rượu, sữa chua, nem chua, phomai, bia [5]. Chúng có vai trò quan trọng trong đời sống như tăng cường miễn dịch, ức chế các vi sinh vật có hại, bổ sung các vi sinh vật có lợi, tác dụng kháng khuẩn… Và gần đây có nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng LAB có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là protein được tổng hợp ở riboxom từ các chuỗi peptit hoặc protein ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương [9]. Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào peptidoglycan làm suy yếu thành tế bào của vi khuẩn gây hại [7].
Vì vậy bacteriocin có rất nhiều ứng dụng, trong mỹ phẩm, xử lí môi trường, chế biến thức ăn chăn nuôi, trong y học và trong công nghệ thực phẩm [4]. Trong y dược, bacteriocin còn được ứng dụng như một chế phẩm sinh học để điều trị một số bệnh như viêm đường tiết niệu, hay nhiễm trùng đường tiêu hóa và còn sử dụng trong điều trị kháng sinh đồ [6]… Trong ngành mỹ phẩm, bacteriocin được sử dụng trong thành phần của một số loại mỹ phẩm chăm sóc da vì có tính diệt khuẩn và giữ ẩm. Trong công nghệ thực phẩm, bacteriocin được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong chế biến và bảo quản một số loại thực phẩm như phomat, xúc xích, sữa chua, một số loại sản phẩm thịt, rau quả đóng hộp [2]. Ở Việt Nam bacteriocin sử dụng trong công nghiệp thực phẩm được sản xuất chủ yếu bởi các công ty ở Châu Âu, Mỹ và gần đây ở Trung Quốc, có giá thành rất cao, trong khi ở nước ta có rất nhiều các sản phẩm lên men c 2 truyền thống như tương, chao, mắm tôm, dưa muối… Nhận thấy tiềm năng ứng dụng của Bacteriocin sản xuất từ vi khuẩn LAB nên em chọn tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin cao từ các sản phẩm lên men truyền thống”.
Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu, tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin cao từ các sản phẩm lên men truyền thống. Yêu cầu của đề tài - Từ các sản phẩm lên men tự nhiên phân lập chủng LAB có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. - Tuyển chọn một số chủng có khả năng sinh bacteriocin cao. - Nghiên cứu khả năng kháng vi khuẩn kiểm định (Staphylococcus aureus, Samonella, E coli) của chế phẩm bacteriocin thô.
Ý nghĩa của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học vào nghiên cứu khoa học. Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu và trình bày một bài báo cáo khoa học. Ý nghĩa thực tiễn Tuyển chọn được một số chủng LAB có khả năng sinh bacteriocin cao, giúp làm phong phú thêm bộ sưu tập chủng vi sinh vật sinh chất kháng khuẩn, tạo ra nhiều sự lựa chọn cho việc tuyển chọn chủng.
c 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Bacteriocin Nghiên cứu đầu tiên và lâu đời nhất về bacteriocin là công trình nghiên cứu của Gratia và cộng tác viên vào năm 1925 về khả năng kháng khuẩn của Escherichia coli (colicin V) và thuật ngữ bacteriocin không xuất hiện cho đến những năm 1950. Định nghĩa về bacteriocin đầu tiên đã dựa trên đặc tính của colicin, đó là một chất sinh tổng hợp gây tử vong, phổ hoạt động hẹp bị giới hạn ở những loài tương tự như vi khuẩn sản xuất. Ba chủng vi khuẩn Gram (+) được nghiên cứu cho việc sản sinh bacteriocin lúc bấy giờ là: Bacillus sp; Listeria sp và Staphylococcus sp.
Các nghiên cứu trong những năm 1980 đã cho thấy có sự gia tăng đáng kể về số lượng các công bố trên bacteriocin. Từ thời điểm này bắt đầu bùng nổ những nghiên cứu bacteriocin, định hướng như một chất kháng khuẩn an toàn trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm [14, 35]. Khái niệm Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là peptide hay protein được tổng hợp trên ribosome ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương để chống lại vi khuẩn khác có quan hệ gần gũi với chúng [35]. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó.
Ngoài ra không gây ra phản ứng dị ứng trong con người và vấn đề về sức khỏe, bị phân hủy nhanh bởi enzym proteinase, lipase [27]. Các chủng vi sinh vật sinh bacteriocin Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram âm hoặc vi khuẩn Gram dương với những đặc điểm : - Bacteriocin của vi khuẩn gram âm: gồm nhiều loại khác nhau về kích thước, nguồn gốc chủng vi sinh vật sản xuất, kiểu tác động và cơ chế miễn dịch. c 4 Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm yếu hơn bacteriocin của vi khuẩn Gram dương [27]. - Bacteirocin của vi khuẩn Gram dương: các bacteriocin này cũng nhiều như ở vi khuẩn gram âm.
Tuy nhiên chúng khác vi khuẩn gram âm ở chỗ là: việc tạo bacteriocin không cần thiết phải gây chết vi sinh vật chủ và sự sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn Gram dương cần nhiều gen hơn ở vi khuẩn Gram âm [15]. Những nghiên cứu trước đây về bacteriocin chủ yếu tập trung vào vi khuẩn Gram âm, điển hình là E. coli sinh tổng hợp colicin. Tuy nhiên những nghiên cứu về bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram dương cũng đã được tiến hành và đã có nhiều báo cáo cung cấp những thông tin về vấn đề này.
Ba chủng vi khuẩn Gram dương được nghiên cứu cho việc sản sinh bacteriocin lúc bấy giờ là Bacillus sp. và Staphylococcus sp [27]. Ngày nay thì các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin được nghiên cứu nhiều hơn, do tính ưu việt của bacteriocin này dùng trong bảo quản thực phẩm là an toàn với người sử dụng, không độc với tế bào nhân chuẩn, bị phân hủy bởi proteinase trong hệ tiêu hóa nên ít ảnh hưởng đến quần xã sinh vật trong ruột người [23]. Thêm vào đó chúng hoạt động trong khoảng pH rộng, chống lại nhiều vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm, cơ chế hoạt động dựa trên màng tế bào vi khuẩn nên không gây ra tính đề kháng chéo với các kháng sinh và được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid nên thuận tiện cho thao tác di truyền [23].
Vi khuẩn lactic từ lâu đã được sử dụng trong thực phẩm vì chúng có hoạt tính kháng các loại vi sinh vật khác. Đặc tính này là do vi khuẩn lactic sinh acid hữu cơ và sinh bacteriocin kháng khuẩn kháng nấm [32].3 Phân loại Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định, tuy nhiên việc phân loại các bacteriocin vẫn chưa được xác định rõ ràng và nó vẫn đang là vấn đề tranh cãi. Các bacteriocin thường được phân loại dựa trên các tiêu chí khác nhau. Những tiêu chí chính là họ vi khuẩn sản xuất, trọng lượng phân tử của chúng và cuối cùng là trình tự chuỗi amino acid [27].
Trong đó, phương pháp phân loại được chấp nhận và sử dụng phổ biến là bacteriocin được chia thành 4 lớp: lớp I, lớp II, lớp III và lớp IV. Hai nhóm bacteriocin lớp I và lớp II là đối tượng được tìm hiểu và nghiên cứu nhiều hơn hơn hai nhóm còn lại. Lớp I Bacteriocin lớp I hay còn gọi là Lanbiotic là những peptide nhỏ (<5 kDa), bền nhiệt và tác động lên cấu trúc màng. Một bacteriocin của nhóm này là nisin.
Các lantibiotic chia thành 2 phân lớp là Ia và Ib dựa trên sự tương đồng cấu trúc. Phân lớp Ia Phân lớp Ia gồm các peptide dạng thuôn dài, linh hoạt và tích điện dương, chúng hoạt động bằng cách kết hợp với các lipid mang điện tích âm hình thành các lỗ trong màng tế bào chất của các loài vi khuẩn nhạy cảm [42]. Nisin cũng thuộc nhóm này. Đây là một peptide được hình thành bởi 34 amino acid, các loại acid amin phổ biến có trong nisin là lanthionine (Lan), methyllanthionine (MeLan), didehydroalanine (DHA) và acid didehydro aminobutyric (Dhb).
Nisin có 2 biến thể của nisin được ghi nhận là nisin A và nisin Z.1: Cấu trúc của nisin ( Nguồn: Ruiz-Larrea và cộng sự, 2005) Loại bacteriocin này được sản xuất bởi một vài chủng Lactococcus lactic, được sử dụng như một chất phụ gia trong thực phẩm. Nó có phổ kháng khuẩn Gram (+) rộng, E. coli và các vi khuẩn Gram (-) khác chỉ bị ảnh hưởng bởi nisin khi màng ngoài của chúng bị phá hỏng. Nisin được cho là có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả đối với Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, các tế bào sinh dưỡng của Bacillus spp.
và Clostridium spp. Chúng được sử dụng chủ yếu trong các thực phẩm đóng hộp và các sản phẩm từ sữa, đặc biệt trong sản xuất phô mai, nhằm chống lại các vi sinh vật chịu nhiệt như Bacillus và Clostridium. Nisin cũng được ghi nhận có hiệu quả chống lại các bệnh viêm vú do vi khuẩn Gram (+) gây ra [11]. Phân lớp Ib Phân lớp Ib gồm các peptide có dạng hình cầu, cấu trúc không linh động, tích điện âm hoặc không tích điện.
Chúng thể hiện hoạt động bằng cách gây ức chế sinh tổng hợp peptidoglycan [12], gây nhiễu với các phân tử enzyme thiết yếu của vi khuẩn nhạy cảm. Chúng thường hoạt động trong các phản ứng lên men quan trọng của vi khuẩn. Nhóm này bao gồm các chất kháng khuẩn như mersacidine, actagardin, cinnamycin, mutacin A [27].1: Phân loại bacteriocin theo Jack [28] Khối lƣợng Amino Bacteriocin Vi sinh vật sản xuất phân tử acids (kDa) Lantibiotic Actagardine 1,9 19 Actinoplanes spp. Ancovenin 2,0 19 Streptomyces spp.
Cinnamycin 2,0 19 Streptomyces cinnamoneus Duramycin 2,0 19 Streptomyces cinnamoneus Epidermin 2,2 22 Staphylococcus epidermidis Gallidermin 2,2 22 Staphylococcus gallinarum Lanthiopeptin 2,0 19 Streptoverticullum cinnamoneum Mersacidin 1,8 19 Bacillus sp. Nisin 3,4 34 Lactococcus lactis Pep5 3,5 34 Staphylococcus epidermidis Subtilin 3,3 32 Bacillus subtilis Cystibiotics Pediocin AcH/PA1 4,6 44 Pediociccus acidilactici H/PAC 1.0 Leucocin A/UAL 187 3,9 37 Leuconostoc gelidium UAL 187 Mesentericin Y 105 3,8 37 Leuconostocmesenteroides Y 105 Sakacin A 4,3 41 Lactobacillus sake LB 706 Sakacin P 4,4 43 Lactobacillus sake LTH 674 Lactacin F 5,6 57 Lactobacillus acidophilus 11088 Carnobacteriocin A 5,1 53 Carnobacterium piscicola LV 17 A Carnobacteriocin BM1 4,5 43 Carnobacterium piscicola LV 17 B Carnobacteriocin B2 4,9 48 Carnobacterium piscicola LV 17 B Cerein 7/8 4,9 56 Bacillus cereus Bc7 Thiolbiotics Lactococcin B 5,3 47 Lactococcus lactic subsp. cremoris 9 B4 No cysteine Lactococcin A 5,8 54 Lactococcus lactis subsp. diacetylactis Lactococcin Ma 4,3 48 WM4 Lactococcin Na 4,4 47 L.
Lớp II Còn được gọi là lớp Non-Lanbiotic, bao gồm các bacteriocin có trọng lượng phân tử nhỏ hơn 10 kDa, bền nhiệt và không chứa lanthionine.