Luận án tiến sĩ nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng chống oxy hóa và độc tính tế bào của cây hồng quân flacourtia rukam zoll et mor

Luận án tiến sĩ hóa học nghiên cứu nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng chống oxy hóa và độc tính tế bào của cây hồng quân, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý

• Tác giả: Thái Thị Cẩm
• Người hướng dẫn: PGS. Huỳnh Ngọc Thụy
• Trường học: Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Dược Học Cổ Truyền
• Đề tài: Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Của Cây Hồng Quân (Flacourtia Rukam Zoll.) Theo Định Hướng Chống Oxy Hóa
• Loại tài liệu: Luận Án Tiến Sĩ Dược Học
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
• 1. MỞ ĐẦU
• 2. TỔNG QUAN VỀ CHI FLACOURTIA
• 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Cây Hồng Quân

Nền y học cổ truyền Việt Nam có bề dày kinh nghiệm sử dụng dược liệu bản địa. Bên cạnh đó, xu hướng sử dụng thuốc từ nguồn gốc thiên nhiên đang ngày càng phổ biến. Điều này thúc đẩy các nhà khoa học tìm kiếm tác dụng mới của cây thuốc nam và chứng minh hiệu quả của các bài thuốc dân gian. Cây Hồng quân ( Flacourtia rukam Zoll.) là một ví dụ điển hình. Đây là một loài cây ăn quả quen thuộc ở đồng bằng Sông Cửu Long và Nam Trung Bộ, thuộc chi Flacourtia, họ Liễu (Salicaceae). Theo kinh nghiệm dân gian, Hồng quân được dùng chữa viêm mi mắt, viêm khớp dạng thấp, gút, rễ chữa tiểu buốt, tiểu dắt, đặc biệt là điều trị phì đại tiền liệt tuyến. Tuy nhiên, việc khai thác triệt để đã gây ra tình trạng khan hiếm nguồn nguyên liệu và đẩy giá thành lên cao. Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định thành phần hóa học và tiềm năng chống oxy hóa của Flacourtia rukam mọc tại Việt Nam.

1.1. Giới thiệu chung về cây Hồng Quân Flacourtia rukam

Cây Hồng Quân (Flacourtia rukam Zoll.) là một loài cây thân gỗ, mọc hoang chủ yếu ở vùng nhiệt đới. Tại Việt Nam, cây Hồng quân được dân gian dùng chữa nhiều bệnh. Điều này dẫn đến tình trạng loài cây này đang bị khai thác triệt để trong dân gian. Trên thế giới, cây Hồng Quân đã được nghiên cứu về khả năng chống oxy hóa, tác dụng bảo vệ gan, hạ đường huyết, chống sốt rét và kháng khuẩn. Nghiên cứu này tập trung vào việc khai thác các đặc tính có lợi tiềm năng này của Flacourtia rukam ở Việt Nam.

1.2. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu thành phần hóa học

Việc nghiên cứu thành phần hóa học của Flacourtia rukam là vô cùng quan trọng. Nó giúp xác định các hoạt chất sinh học tiềm năng có thể ứng dụng trong y học. Từ đó, có thể phát triển các sản phẩm dược liệu mới, có hiệu quả hỗ trợ điều trị bệnh. Ngoài ra, việc xác định thành phần hóa học cũng giúp kiểm soát chất lượng dược liệu và đảm bảo an toàn cho người sử dụng. Nghiên cứu này hướng đến việc tìm kiếm các hợp chất có khả năng chống oxy hóa và độc tính tế bào.

II. Thách Thức Tìm Hoạt Chất Chống Oxy Hóa Từ Cây Hồng Quân

Bệnh gút và ung thư đang trở thành những vấn đề sức khỏe nghiêm trọng tại Việt Nam. Tỷ lệ mắc ung thư mới tăng lên đáng kể, trong đó ung thư gan, đại trực tràng, vú, dạ dày, phổi là những loại phổ biến nhất. Một trong những nguyên nhân của bệnh gút là do tăng acid uric máu, liên quan đến hoạt động của enzyme xanthin oxidase (XO). Do đó, việc tìm kiếm các hợp chất chống oxy hóa từ cây thuốc nam, có khả năng ức chế enzyme XO và có tác dụng độc tính trên các dòng tế bào ung thư, là một hướng đi đầy tiềm năng. Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá tiềm năng này của cây Hồng Quân (Flacourtia rukam).

2.1. Gút và vai trò của enzyme Xanthin Oxidase XO

Gút là một bệnh rất phổ biến trên thế giới, và một trong những nguyên nhân chính là do tăng acid uric máu. Enzyme Xanthin oxidase (XO) đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa acid uric. Vì vậy, việc tìm kiếm các cây thuốc có tác dụng ức chế enzyme XO có tiềm năng lớn trong việc hỗ trợ điều trị bệnh gút. Nghiên cứu này sẽ đánh giá khả năng ức chế XO của chiết xuất cây Hồng Quân.

2.2. Ung thư và nhu cầu tìm kiếm hoạt chất độc tế bào

Tỷ lệ mắc ung thư ở Việt Nam đang tăng lên nhanh chóng. Vì vậy, việc nghiên cứu tác dụng độc tính trên các dòng tế bào ung thư của các cây thuốc nam là rất cấp bách và khả thi. Kinh nghiệm dân gian sử dụng cây Hồng Quân trị bí tiểu, tiểu dắt, tiểu khó cũng đã được chứng minh có tác dụng điều trị u xơ lành tính tiền liệt tuyến. Nghiên cứu này sẽ mở rộng phạm vi nghiên cứu, đánh giá tác dụng độc tế bào của cây Hồng Quân trên các dòng tế bào ung thư khác nhau.

III. Phương Pháp Chiết Xuất Phân Lập và Xác Định Hợp Chất

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hợp chất hiện đại để phân tích thành phần hóa học của cây Hồng Quân. Các phương pháp chiết xuất sử dụng dung môi khác nhau để thu được các phân đoạn giàu các hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau. Các phương pháp sắc ký như sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng được sử dụng để phân lập các hợp chất tinh khiết. Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng các phương pháp phổ nghiệm như NMR, MS. Các hợp chất phân lập được sẽ được đánh giá về hoạt tính chống oxy hóa và độc tính tế bào.

3.1. Quy trình chiết xuất và phân đoạn dược liệu

Quy trình chiết xuất và phân đoạn dược liệu là bước đầu tiên quan trọng để thu được các phân đoạn giàu các hợp chất có hoạt tính sinh học. Quá trình này bao gồm việc sử dụng các dung môi khác nhau để chiết xuất các thành phần từ cây Hồng Quân. Sau đó, các chiết xuất này được phân đoạn để tách riêng các nhóm hợp chất khác nhau, tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân lập và xác định các hoạt chất tiềm năng.

3.2. Kỹ thuật sắc ký phân tích và phân lập hợp chất

Các kỹ thuật sắc ký như sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng đóng vai trò quan trọng trong việc phân lập các hợp chất tinh khiết từ các phân đoạn chiết xuất. Các kỹ thuật này dựa trên sự khác biệt về tính chất vật lý và hóa học của các hợp chất để tách chúng ra khỏi hỗn hợp. Các hợp chất tinh khiết sau đó sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo về cấu trúc và hoạt tính sinh học.

3.3. Xác định cấu trúc bằng phổ nghiệm NMR và MS

Các phương pháp phổ nghiệm NMR và MS là những công cụ mạnh mẽ để xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập. Phổ NMR cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc phân tử, bao gồm các liên kết, nhóm chức và vị trí của các nguyên tử. Phổ MS cung cấp thông tin về khối lượng phân tử và các mảnh ion, giúp xác định thành phần nguyên tố và công thức phân tử. Kết hợp hai phương pháp này, các nhà nghiên cứu có thể xác định cấu trúc chính xác của các hợp chất mới.

IV. Đánh Giá Hoạt Tính Chống Oxy Hóa và Độc Tính Tế Bào

Sau khi phân lập và xác định cấu trúc, các hợp chất được đánh giá về hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH và khả năng ức chế enzyme xanthin oxidase (XO). Hoạt tính độc tế bào được đánh giá trên các dòng tế bào ung thư khác nhau như MDA-MB-231 (ung thư vú), HepG2 (ung thư gan), RD (ung thư cơ vân). Kết quả sẽ cung cấp thông tin quan trọng về tiềm năng ứng dụng của cây Hồng Quân trong điều trị bệnh gút và ung thư. Các chỉ số IC50, % ức chế được sử dụng để đánh giá hoạt tính.

4.1. Thử nghiệm DPPH đánh giá khả năng dập gốc tự do

Thử nghiệm DPPH là một phương pháp phổ biến để đánh giá khả năng chống oxy hóa của các hợp chất. Nguyên tắc của thử nghiệm là dựa trên khả năng của các hợp chất chống oxy hóa trong việc dập tắt gốc tự do DPPH, làm giảm độ hấp thụ của dung dịch. Mức độ giảm độ hấp thụ tỷ lệ thuận với khả năng chống oxy hóa của hợp chất. Kết quả thử nghiệm DPPH sẽ cung cấp thông tin về khả năng của cây Hồng Quân trong việc bảo vệ tế bào khỏi tác hại của gốc tự do.

4.2. Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme Xanthin Oxidase XO

Enzyme Xanthin Oxidase (XO) đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa purin tạo thành acid uric. Việc ức chế hoạt động của enzyme này có thể làm giảm nồng độ acid uric trong máu, giúp hỗ trợ điều trị bệnh gút. Nghiên cứu này sẽ đánh giá khả năng ức chế enzyme XO của các chiết xuất và hợp chất từ cây Hồng Quân, từ đó xác định tiềm năng của cây trong việc điều trị bệnh gút.

4.3. Thử nghiệm độc tính tế bào trên các dòng tế bào ung thư

Thử nghiệm độc tính tế bào được thực hiện trên các dòng tế bào ung thư khác nhau như MDA-MB-231, HepG2, RD để đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư của các chiết xuất và hợp chất từ cây Hồng Quân. Kết quả thử nghiệm sẽ cung cấp thông tin về tiềm năng của cây trong việc phát triển các thuốc chống ung thư mới.

V. Kết Quả Nghiên Cứu và Tiềm Năng Ứng Dụng Dược Lý

Nghiên cứu này kỳ vọng sẽ xác định được các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa và độc tính tế bào từ cây Hồng Quân. Các kết quả này sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây Hồng Quân trong y học cổ truyền và hiện đại. Đặc biệt, các hợp chất có khả năng ức chế enzyme XO có thể được phát triển thành thuốc hỗ trợ điều trị bệnh gút. Các hợp chất có hoạt tính độc tế bào có thể là tiền chất cho các thuốc chống ung thư mới. Nghiên cứu này góp phần nâng cao giá trị sử dụng của cây thuốc nam và bảo tồn nguồn gen quý.

5.1. Phát hiện hợp chất tiềm năng chống oxy hóa mạnh

Việc phát hiện các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh từ cây Hồng Quân có ý nghĩa lớn trong việc bảo vệ tế bào khỏi tác hại của gốc tự do, giúp ngăn ngừa và điều trị các bệnh liên quan đến stress oxy hóa như bệnh tim mạch, ung thư, lão hóa. Các hợp chất này có thể được sử dụng để sản xuất các sản phẩm bổ sung dinh dưỡng, thực phẩm chức năng hoặc thuốc điều trị.

5.2. Xác định hợp chất có khả năng ức chế enzyme XO

Việc xác định các hợp chất có khả năng ức chế enzyme XO từ cây Hồng Quân mở ra tiềm năng phát triển các thuốc hỗ trợ điều trị bệnh gút hiệu quả và an toàn. Các hợp chất này có thể giúp làm giảm nồng độ acid uric trong máu, giảm các triệu chứng của bệnh gút và ngăn ngừa các biến chứng.

5.3. Tiềm năng ứng dụng trong phát triển thuốc chống ung thư

Các hợp chất có hoạt tính độc tế bào từ cây Hồng Quân có thể là tiền chất cho các thuốc chống ung thư mới. Việc nghiên cứu và phát triển các thuốc chống ung thư từ nguồn gốc thiên nhiên có nhiều ưu điểm như ít tác dụng phụ, khả năng tác động lên nhiều mục tiêu trong tế bào ung thư, giúp tăng hiệu quả điều trị và giảm nguy cơ kháng thuốc.

VI. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Phát Triển Cây Hồng Quân

Nghiên cứu này hướng đến việc làm sáng tỏ thành phần hóa học và tiềm năng dược lý của cây Hồng Quân (Flacourtia rukam). Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc khai thác và sử dụng bền vững nguồn dược liệu quý này. Các hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm: đánh giá hoạt tính sinh học trên các mô hình in vivo, nghiên cứu cơ chế tác dụng, phát triển các dạng bào chế phù hợp. Ngoài ra, cần có các nghiên cứu về độc tính và an toàn khi sử dụng cây Hồng Quân trong điều trị bệnh.

6.1. Tổng kết các kết quả nghiên cứu thành phần hóa học

Nghiên cứu này sẽ tổng kết các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Hồng Quân, bao gồm danh sách các hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc, hàm lượng của các hợp chất này trong các bộ phận khác nhau của cây, và các yếu tố ảnh hưởng đến thành phần hóa học như nguồn gốc địa lý, mùa vụ thu hoạch.

6.2. Đề xuất hướng nghiên cứu sâu hơn về tác dụng dược lý

Dựa trên các kết quả nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa và độc tính tế bào, nghiên cứu này sẽ đề xuất các hướng nghiên cứu sâu hơn về tác dụng dược lý của cây Hồng Quân, bao gồm đánh giá hoạt tính trên các mô hình in vivo, nghiên cứu cơ chế tác dụng, xác định các mục tiêu tác động trong tế bào, và đánh giá tiềm năng ứng dụng trong điều trị các bệnh khác nhau.

6.3. Hướng phát triển sản phẩm từ cây Hồng Quân bền vững

Nghiên cứu này sẽ đề xuất các hướng phát triển sản phẩm từ cây Hồng Quân một cách bền vững, bao gồm việc trồng và thu hoạch cây theo các tiêu chuẩn chất lượng, đảm bảo an toàn cho người sử dụng, và bảo tồn nguồn gen quý của loài cây này.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tình trạng gia tăng tỷ lệ mắc các bệnh mạn tính và nan y tại Việt Nam, đặc biệt là bệnh gút do rối loạn chuyển hóa acid uric và các bệnh ung thư (theo số liệu báo cáo năm 2021 tại Hội nghị khoa học phòng chống ung thư thường niên lần thứ 9 tại Huế, tỷ lệ mắc mới ung thư tại Việt Nam xếp thứ 90/185 quốc gia), đặt ra yêu cầu cấp thiết trong việc nghiên cứu và tìm kiếm các hoạt chất có nguồn gốc sinh học tự nhiên. Cây Hồng quân (Flacourtia rukam Zollinger et Moritzi), thuộc chi Flacourtia, họ Liễu (Salicaceae), là loài thực vật thân gỗ phân bố tự nhiên tại vùng Đông Nam Á cũng như khu vực đồng bằng sông Cửu Long và Nam Trung Bộ của Việt Nam.

Trong y học dân gian, rễ và thân cây Hồng quân được sử dụng để điều trị viêm khớp dạng thấp, bệnh gút, chứng tiểu buốt, tiểu dắt và u xơ lành tính tuyến tiền liệt. Đề tài "Nghiên cứu dịch chiết cao lỏng từ cây Bồ Quân ứng dụng điều trị u xơ lành tính tiền liệt tuyến" thực hiện tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên đã được Hội đồng Khoa học Bộ Y tế nghiệm thu năm 2002 xác nhận hiệu quả lâm sàng. Tuy nhiên, việc khai thác tự phát làm cạn kiệt nguồn nguyên liệu, cùng sự thiếu hụt các nghiên cứu chuyên sâu về thành phần hóa thực vật, tiêu chuẩn kiểm nghiệm và cơ chế tác dụng sinh học theo định hướng chống oxy hóa, ức chế enzyme xanthin oxidase (XO) và độc tính tế bào ung thư của loài Flacourtia rukam tại Việt Nam là khoảng trống nghiên cứu chính mà luận án hướng tới giải quyết.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm:

1. Xác định tên khoa học nguyên liệu nghiên cứu thông qua khảo sát đặc điểm hình thái thực vật, vi phẫu giải phẫu và định danh phân tử bằng kỹ thuật giải trình tự đoạn gen rbcL.
2. Khảo sát hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa và độc tính tế bào của thân cây Hồng quân: thực hiện chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất tinh khiết; đánh giá hoạt tính sinh học in vitro và in vivo (khả năng quét gốc tự do DPPH, năng lực khử sắt FRAP, ức chế enzyme xanthin oxidase in vitro, tác dụng hạ acid uric máu trên chuột thực nghiệm in vivo, thử nghiệm độc tế bào trên ba dòng tế bào ung thư người HepG2, MDA-MB-231, RD); xây dựng quy trình định lượng hợp chất điểm chỉ poliothrysosid trong thân cây Flacourtia rukam bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng đầu dò dãy diode quang (UPLC-PDA).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các bộ phận rễ, thân cành, lá và quả của cây Hồng quân (Flacourtia rukam Zollinger et Moritzi).
• Địa bàn thu mẫu và thời gian: Thu hái 15 mẫu Hồng quân tại các tỉnh thành gồm Quảng Bình (HQ232), Lâm Đồng (HQ263), Tây Ninh (HQ276), TP. Hồ Chí Minh (HQ28), Long An (HQ272), Bến Tre (HQ275), Vĩnh Long (HQ2701, HQ2702, HQ2703), Trà Vinh (HQ2941), An Giang (HQ2961, HQ2962, HQ2963, HQ2964) và Kiên Giang (HQ297). Mẫu nghiên cứu hóa học và chiết xuất lớn thu hái tại xã Sơn Đông, TP. Bến Tre (HQ275) và xã Nhị Trường, huyện Cầu Ngang, tỉnh Trà Vinh (HQ2941) vào tháng 10 năm 2017 (50 kg dược liệu tươi, sau phơi sấy thu 20,6 kg dược liệu khô). Mẫu khảo sát định lượng theo mùa thu hái vào tháng 1, 3, 6 năm 2019. Mẫu tiêu bản lưu trữ tại Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các công trình nghiên cứu về thực vật học, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của chi Flacourtia trên thế giới và tại Việt Nam:

• Về phân loại thực vật: Chi Flacourtia trước đây thuộc họ Flacourtiaceae theo hệ thống Cronquist (gồm 89 chi, hơn 800 loài), sau đó được hệ thống APG II (Angiosperm Phylogeny Group, 2010) chuyển sang họ Liễu (Salicaceae) thuộc bộ Sơ ri (Malpighiales). Chi Flacourtia gồm khoảng 15 loài nhiệt đới, tại Việt Nam ghi nhận các loài F. indica, F. inermis, F. jangomas, F. montana và F. rukam.
• Về thành phần hóa thực vật: Các hợp chất chuyển hóa thứ cấp thuộc nhóm phenolic, flavonoid, phenolic glycosid, dẫn chất acid quinic, coumarin, triterpenoid, steroid và limonoid được ghi nhận trong chi:
  • Nhóm flavon và flavonol: Apigenin phân lập từ F. cataphracta, chrysoeriol-7-O-β-D-glucopyranosid từ F. indica; Alakolanga (2014) xác định kaempferol, quercetin cùng các dẫn chất glycosid từ dịch chiết methanol quả F. inermis.
  • Nhóm phenolic glycosid: Sashidhara và cộng sự (2012, 2013) phân lập 2-(2-benzoyl-β-D-glucopyranosyloxy)-7-(1α,2α,6α-trihydroxy-3-oxocyclohex-4-enoyl)-5-hydroxybenzyl alcohol, poliothrysosid, mururin A từ lá và cành F. indica; Melanie Bourjot và cộng sự (2012) phân lập flacourtosid A–F, itosid H, xylosmin, scolochinenosid D từ vỏ thân F. ramontchi; Kaul và cộng sự (2010) phân lập pyrocatechol, homalosid D, poliothrysosid từ F. indica.
  • Nhóm triterpenoid, steroid, diterpen và limonoid: Limonin, jangomolid từ F. jangomas; 3β-acetoxy-D:A-friedo-oleanan-27,16α-lacton, acid betulinic 3β-caffeat, 21β-A’-neogammacer-22(29)-en-3-on từ F. ramontchi.
  • Đối với riêng loài Flacourtia rukam: Ragasa và cộng sự (2016) phân lập monogalactosyl diacylglycerol, β-sitosteryl-3β-glucopyranosid-6β-O-ester, β-sitosterol; Nguyễn Phúc Đảm và cộng sự (2016) phân lập (7S,8S)-4-O-methyl-syringylglycerol-8-O-β-glucopyranosid; Lê Phương Thảo và cộng sự (2018) phân lập poliothrysosid; Muharni và cộng sự (2019, 2021) phân lập friedelin, poliothrysosid, β-sitosteryl-3β-glucopyranosid và biphenyl-1,1',2,2'-tetraol từ vỏ thân F. rukam.
• Về tác dụng dược lý:
  • Khả năng chống oxy hóa: Jayasinghe Lalith và cộng sự (2011) khảo sát các dẫn chất ester quinic từ quả F. inermis; Tyagi và cộng sự khảo sát dịch chiết F. indica; dịch chiết F. sepiaria quét gốc DPPH với $IC_{50} = 1,82\ \mu\text{g/ml}$.
  • Tác dụng ức chế xanthin oxidase: Cao methanol từ F. sepiaria ức chế enzyme XO in vitro với $IC_{50} = 8,37 \pm 0,2\ \mu\text{g/ml}$ so với allopurinol ($IC_{50} = 4,18 \pm 0,17\ \mu\text{g/ml}$).
  • Hoạt tính độc tế bào ung thư: Cao methanol F. indica thể hiện độc tính trên dòng tế bào ung thư biểu mô đại tràng HCT116 ở nồng độ $500\ \mu\text{g/ml}$ thông qua cơ chế kích hoạt apoptosis; cao ethanol làm tăng thời gian sống của chuột mang khối u báng Ehrlich (EAC) theo nghiên cứu của Pachute và cộng sự (2011).

Khoảng trống nghiên cứu mà luận án xác định: Các nghiên cứu trước đây trên loài F. rukam phân bố tại Việt Nam chưa khảo sát toàn diện về giải phẫu thực vật học kết hợp mã vạch DNA, chưa nghiên cứu chiết tách hóa học kết hợp định hướng sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme XO, năng lực chống oxy hóa và độc tế bào, cũng như chưa có quy trình định lượng chuẩn hóa hợp chất chính bằng phương pháp UPLC-PDA.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án áp dụng phối hợp các phương pháp thực nghiệm trong thực vật học, sinh học phân tử, hóa học hợp chất thiên nhiên, phân tích kiểm nghiệm và dược lý thực nghiệm:

[Mẫu dược liệu Flacourtia rukam]

• Phương pháp giải phẫu và thực vật học: Cắt lát vi phẫu rễ, thân, cuống lá, phiến lá, gân giữa; nhuộm kép carmin - lục iod; quan sát bột dược liệu qua rây 0,22 mm dưới kính hiển vi quang học.
• Phương pháp sinh học phân tử: Ly trích ADN tổng số bằng phương pháp CTAB (đệm CTAB 2%, Tris 100 mM pH 8,0, EDTA 20 mM pH 8,0, NaCl 1,4 M, 2-mercaptoethanol, chloroform : isoamyl alcohol 24:1, RNase). Khuếch đại đoạn gen lục lạp rbcL bằng phản ứng PCR (35 chu kỳ: 5 phút ở 95 °C; 30 giây ở 95 °C, 30 giây ở 40 °C, 30 giây ở 72 °C; kéo dài chuỗi 5 phút ở 72 °C). Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% (đệm TAE 1X, điện thế 85V trong 30 phút, thuốc nhuộm GelRed, thang chuẩn 1 kb plus). Giải trình tự gen theo phương pháp Sanger dideoxy chain-terminating inhibitors, phân tích đối chiếu chuỗi nucleotide bằng công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu NCBI với mẫu chuẩn đối chứng Flacourtia rukam (mã KP094960.1).
• Phương pháp hóa thực vật: Dược liệu khô thân cành (20,6 kg) được chiết xuất hồi lưu với ethanol 96%, thu cao toàn phần, sau đó phân bố lỏng - lỏng lần lượt với n-hexan, cloroform, ethyl acetat, n-butanol và nước. Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột cổ điển pha thuận (silica gel 60, cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm) kết hợp sắc ký lớp mỏng (silica gel 60 $F_{254}$, hiện màu bằng thuốc thử vanilin - acid sulfuric 5%). Xác định cấu trúc bằng phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS (Bruker MicrOTOF-Q II) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D-NMR (Bruker AVANCE 500 MHz cho $^1\text{H}$ và 125 MHz cho $^{13}\text{C}$, dung môi $\text{CDCl}_3$, $\text{DMSO-d}_6$).
• Phương pháp phân tích định lượng UPLC-PDA: Máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng Acquity UPLC H-Class (Waters), đầu dò PDA, cột pha đảo Acquity UPLC BEH C18 ($1,7\ \mu\text{m}$; $2,1 \times 50\ \text{mm}$). Thẩm định quy trình theo các tiêu chí: tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại và độ đúng (tỷ lệ thu hồi ở 3 mức nồng độ 80%, 100%, 120%).
• Phương pháp thử nghiệm sinh học:
  • Khả năng dập tắt gốc tự do DPPH: Đo quang phổ kế ở bước sóng 517 nm, chất đối chứng acid gallic.
  • Năng lực khử sắt: Đo độ hấp thu quang phổ phức hợp Fe(II) - Ferricyanid ở bước sóng 700 nm, chất đối chứng acid gallic.
  • Ức chế enzyme xanthin oxidase in vitro: Sử dụng enzyme XO từ sữa bò (Sigma X1875), cơ chất xanthin (Sigma X4002), đệm phosphat, đo quang phổ hấp thụ tạo thành acid uric ở bước sóng 295 nm, chất đối chứng allopurinol; tính toán $IC_{50}$ bằng mô hình hồi quy phi tuyến tính Sigmoidal 3 thông số ($f = a / (1 + \exp(-(x-x_0)/b))$).
  • Tác dụng hạ acid uric máu in vivo: Chuột nhắt trắng giống Swiss albino (5–6 tuần tuổi, trọng lượng 25–30 g do Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang cung cấp), mô hình gây tăng acid uric máu bằng kali oxonat tiêm phúc mạc, định lượng nồng độ acid uric huyết thanh bằng kit Human (Đức).
  • Hoạt tính độc tế bào in vitro: Thử nghiệm MTT trên tế bào ung thư vú MDA-MB-231, ung thư biểu mô tế bào gan HepG2 và ung thư cơ vân RD, nuôi cấy trong môi trường DMEM bổ sung 10% FCS, ủ ở 37 °C, 5% $\text{CO}_2$; chất đối chứng dương paclitaxel.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu về chi Flacourtia và loài Flacourtia rukam

Chương này trình bày chi tiết về vị trí phân loại, phân bố sinh thái, đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của chi Flacourtia nói chung và loài Flacourtia rukam nói riêng.

Luận án lập bảng so sánh hình thái chi tiết giữa 4 loài thuộc chi Flacourtia phổ biến tại Việt Nam (F. indica, F. jangomas, F. rukam, F. montana), chỉ ra đặc điểm nhận dạng đặc trưng của F. rukam: thân gỗ cao 4–15 m có gai đơn hoặc phân nhánh dài tới 10 cm, vỏ thân màu xám nâu dễ bong tróc; lá hình xoan bầu dục thuôn dài 6–18 cm, gân cấp ba xếp song song dạng mạng lưới dày; hoa đơn tính vô cánh, 3–4 lá đài hơi dính ở gốc; bầu noãn hình cầu 4–8 ô mang 2 noãn, 4–8 vòi nhụy rời xếp thành vòng quanh đỉnh bầu; quả mọng hình cầu đường kính 2–2,5 cm màu đỏ tối đến tím đen khi chín, hạt dẹp màu vàng phồng hai mặt.

Chương 1 cũng tổng kết 3 chế phẩm lưu hành trên thị trường có nguồn gốc từ chiết xuất cây Hồng quân phục vụ hỗ trợ điều trị phì đại và u xơ tiền liệt tuyến tại Việt Nam: Bảo An tiền liệt đơn (Công ty TNHH MTV Dược khoa – Trường Đại học Dược Hà Nội, chứa 500 mg cao đặc Hồng quân), TKS Prosteta (Công ty TNHH Y Học Bản Địa Việt Nam, chứa 250 mg cao rễ) và TKS Saman (Saman Pharm, chứa 250 mg cao rễ).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên liệu, mã hóa 15 mẫu nghiên cứu, hóa chất dung môi đạt tiêu chuẩn phân tích, danh mục trang thiết bị (hệ thống PCR GeneAmp 2700, máy đo NMR Bruker AVANCE 500 MHz, HR-ESI-MS Bruker MicrOTOF-Q II, hệ thống UPLC-PDA Waters Acquity H-Class, máy đọc ELISA Multiskan, tủ an toàn sinh học ESCO AC2-4E1), quy trình chiết xuất tách phân đoạn lỏng - lỏng, quy trình nuôi cấy và bảo quản các dòng tế bào từ ATCC tại Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh, cùng các phác đồ thử nghiệm dược lý trên mô hình động vật.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Kết quả khảo sát thực vật và định danh sinh học phân tử

• Vi phẫu rễ, thân, lá và bột dược liệu thể hiện đầy đủ các yếu tố mô học đặc trưng của họ Salicaceae: mạch gỗ xếp thành dãy phóng xạ, mô cứng phân tán, tinh thể calci oxalat hình cầu gai và khối đa diện, sợi kèm mô cứng, lỗ khí kiểu dị bào ở biểu bì dưới phiến lá.
• Điện di ADN tổng số và sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu gen rbcL cho vạch khuếch đại đơn, sắc nét tại kích thước khoảng 416 bp. Kết quả giải trình tự nucleotide và phân tích đối chiếu BLAST trên cơ sở dữ liệu NCBI cho thấy 12/15 mẫu Hồng quân thu thập có mức độ tương đồng 99–100% với trình tự Flacourtia rukam chuẩn (mã NCBI KP094960.1). Trình tự nucleotide của mẫu nghiên cứu tại Bến Tre đã được đăng ký thành công trên Ngân hàng gen quốc tế GenBank với mã số định danh MK088161.1.

Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học

Từ các phân đoạn cao chiết thân cành Flacourtia rukam, 11 hợp chất tinh khiết đã được phân lập và xác định cấu trúc hoàn chỉnh:

1. Hợp chất (1) [FRC11]: Rukamtenol.
2. Hợp chất (2) [FR1]: Acid chaulmoogric.
3. Hợp chất (3) [FRE12]: Poliothrysosid.
4. Hợp chất (4) [FRE13]: Koabursid (3,4,5-trimethoxyphenyl β-D-glucopyranosid).
5. Hợp chất (5) [FRCE11]: Daucosterol.
6. Hợp chất (6) [FRHC12]: 3α-Acetoxy-D:A-friedo-oleanan-27,16α-lacton.
7. Hợp chất (7) [FRE11]: 4-Formyl-2-hydroxyphenyl 6-O-benzoyl-β-D-glucopyranosid.
8. Hợp chất (8) [FRC12]: Acid vanillic.
9. Hợp chất (9) [FRCEA1]: Stigmasterol.
10. Hợp chất (10) [FRHC15]: β-sitosterol.
11. Hợp chất (11) [FRHC21]: Acid stearic.

Ký hiệu chất	Tên hợp chất xác định	Công thức / Nhóm cấu trúc	Phân đoạn phân lập
Hợp chất (1)	Rukamtenol	Dẫn chất phenolic	Cao cloroform (FRC11)
Hợp chất (2)	Acid chaulmoogric	Acid béo mạch vòng cyclopentenyl	Cao cloroform (FR1)
Hợp chất (3)	Poliothrysosid	Phenolic glycosid	Cao ethyl acetat (FRE12)
Hợp chất (4)	Koabursid	Phenyl glycosid	Cao ethyl acetat (FRE13)
Hợp chất (5)	Daucosterol	Steroid glycosid	Cao cloroform/EtOAc (FRCE11)
Hợp chất (6)	3α-Acetoxy-D:A-friedo-oleanan-27,16α-lacton	Triterpenoid friedelan lacton	Cao n-hexan/cloroform (FRHC12)
Hợp chất (7)	4-Formyl-2-hydroxyphenyl 6-O-benzoyl-β-D-glucopyranosid	Phenolic glycosid	Cao ethyl acetat (FRE11)
Hợp chất (8)	Acid vanillic	Acid phenolic	Cao cloroform (FRC12)
Hợp chất (9)	Stigmasterol	Phytosterol	Cao n-hexan/EtOAc (FRCEA1)
Hợp chất (10)	β-sitosterol	Phytosterol	Cao n-hexan/cloroform (FRHC15)
Hợp chất (11)	Acid stearic	Acid béo no mạch thẳng	Cao n-hexan/cloroform (FRHC21)

Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa

Thực nghiệm quét gốc tự do DPPH và năng lực khử sắt (FRAP) trên các cao phân đoạn và hợp chất phân lập cho thấy hoạt tính chống oxy hóa tập trung cao nhất ở phân đoạn ethyl acetat và các hợp chất phenolic glycosid:

Mẫu thử nghiệm	$IC_{50}$ Thử nghiệm DPPH ($\mu\text{g/ml}$)	$EC_{50}$ Năng lực khử sắt ($\mu\text{g/ml}$)
Cao toàn phần (TP)	279,02	74,80
Phân đoạn Cloroform ($\text{CHCl}_3$)	321,25	103,20
Phân đoạn Ethyl acetat (EtOAc)	172,01	31,41
Phân đoạn n-Butanol (n-BuOH)	235,80	68,85
Phân đoạn Nước	1139,28	251,99
Hợp chất (3) - Poliothrysosid	1080,92	18,61
Hợp chất (7) - FRE11	-	19,26
Hợp chất (6) - FRHC12	-	136,10
Hợp chất (1) - Rukamtenol	Không thể hiện ở dải đo	Không thể hiện ở dải đo
Acid gallic (Đối chứng dương)	6,00	2,13

Kết quả hoạt tính ức chế enzyme Xanthin Oxidase (XO) và hạ acid uric máu

• Thử nghiệm in vitro ức chế enzyme XO:
  • Hợp chất (3) Poliothrysosid thể hiện hoạt tính ức chế enzyme XO rất mạnh với giá trị $IC_{50} = 2,26\ \mu\text{g/ml}$ (tác dụng ức chế mạnh hơn chất đối chứng lâm sàng allopurinol có $IC_{50} = 3,51\ \mu\text{g/ml}$).
  • Hợp chất (7) FRE11 thể hiện tác dụng ức chế tốt với $IC_{50} = 8,40\ \mu\text{g/ml}$.
  • Hợp chất (6) thể hiện tác dụng với $IC_{50} = 92,00\ \mu\text{g/ml}$.
• Thử nghiệm in vivo trên chuột nhắt trắng gây tăng acid uric máu bằng kali oxonat chứng minh dịch chiết thân cây F. rukam làm giảm có ý nghĩa thống kê nồng độ acid uric trong huyết thanh so với lô chứng bệnh lý.

Kết quả khảo sát độc tính tế bào in vitro

Đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng tế bào ung thư người bằng thử nghiệm MTT:

• Trên dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231: Phân đoạn cloroform có $IC_{50} = 48,90\ \mu\text{g/ml}$; các phân đoạn khác và hợp chất đơn lẻ (FRC11, FRE11, FRE12) có tác dụng yếu ($IC_{50} > 100\ \mu\text{g/ml}$ hoặc $> 100\ \mu\text{M}$); đối chứng paclitaxel có $IC_{50} = 2,06\ \mu\text{M}$.
• Trên dòng tế bào ung thư gan HepG2: Cao toàn phần có $IC_{50} = 47,55\ \mu\text{g/ml}$; phân đoạn cloroform có $IC_{50} = 91,27\ \mu\text{g/ml}$; phân đoạn ethyl acetat có $IC_{50} = 12,27\ \mu\text{g/ml}$; đối chứng paclitaxel có $IC_{50} = 11,96\ \mu\text{M}$.
• Trên dòng tế bào ung thư cơ vân RD: Phân đoạn cloroform có $IC_{50} = 12,35\ \mu\text{g/ml}$; phân đoạn ethyl acetat có $IC_{50} = 65,89\ \mu\text{g/ml}$; hợp chất tinh khiết (7) FRE11 có $IC_{50} = 77,80\ \mu\text{M}$; đối chứng paclitaxel có $IC_{50} = 7,59\ \mu\text{M}$.

Kết quả xây dựng quy trình định lượng Poliothrysosid bằng UPLC-PDA

• Điều kiện chiết xuất tối ưu: Chiết hồi lưu mẫu dược liệu với dung môi methanol 50% ở nhiệt độ 95 °C trong thời gian 30 phút (cho diện tích pic đạt 383106, cao hơn phương pháp siêu âm ở 50 °C).
• Thẩm định quy trình phân tích:
  • Tính đặc hiệu: Pic poliothrysosid tách hoàn toàn khỏi các pic tạp chất trong mẫu dược liệu, phổ UV đồng nhất và đạt độ tinh khiết phổ.
  • Tính tương thích hệ thống: Hệ số phân giải, số đĩa lý thuyết và độ lặp lại diện tích pic đạt yêu cầu phân tích theo quy định.
  • Khoảng tuyến tính: Xây dựng đường chuẩn trong dải nồng độ từ 0,5 đến $100\ \mu\text{g/ml}$ với hệ số tương quan $R^2$ đạt tiêu chuẩn.
  • Độ đúng: Tỷ lệ phục hồi tại 3 mức nồng độ 80%, 100%, 120% nằm trong giới hạn cho phép.
• Ứng dụng định lượng trên các mẫu dược liệu:
  • Theo bộ phận dùng: Hàm lượng poliothrysosid tích lũy cao nhất ở thân và rễ, thấp hơn ở lá và quả non.
  • Theo thời điểm thu hái và địa lý: Hàm lượng hoạt chất biến thiên theo các tháng thu hái (tháng 1, 3, 6, 10) và giữa các vùng sinh thái thu thập (Bến Tre, Trà Vinh, Vĩnh Long, An Giang).

Chương 4: Bàn luận

Chương bàn luận phân tích mối liên hệ mật thiết giữa đặc điểm thực vật học, sinh học phân tử, cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học:

• Về mặt định danh: Khẳng định tính chính xác của việc kết hợp đặc điểm hình thái vi học và chỉ thị phân tử đoạn gen lục lạp rbcL trong việc phân biệt F. rukam với các loài Hồng quân khác dễ nhầm lẫn như F. indica, F. jangomas, F. montana.
• Về hóa học và hoạt tính sinh học: Sự hiện diện của các hợp chất phenolic glycosid (đặc biệt là poliothrysosid và dẫn chất 4-formyl-2-hydroxyphenyl 6-O-benzoyl-β-D-glucopyranosid) giải thích cơ chế chống oxy hóa thông qua năng lực khử ion sắt và bẫy gốc tự do. Đáng chú ý, kết quả chứng minh poliothrysosid có hoạt tính ức chế enzyme xanthin oxidase mạnh ($IC_{50} = 2,26\ \mu\text{g/ml}$) đã làm sáng tỏ cơ sở khoa học của kinh nghiệm dân gian sử dụng rễ và thân cây Hồng quân trong điều trị bệnh gút và các bệnh lý tăng acid uric máu.
• Về độc tính tế bào: Phân đoạn cloroform và phân đoạn ethyl acetat thể hiện độc tính chọn lọc trên các dòng tế bào ung thư cơ vân (RD) và ung thư gan (HepG2), mở ra hướng đi cho việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis).
• Về phương pháp UPLC-PDA: Chứng minh quy trình định lượng đạt độ tin cậy, thời gian phân tích ngắn, độ nhạy cao, phù hợp để áp dụng làm tiêu chuẩn kiểm nghiệm chất lượng nguyên liệu dược liệu Hồng quân.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

1. Đã thiết lập bộ dữ liệu toàn diện về đặc điểm hình thái, giải phẫu vi phẫu rễ, thân, lá và đặc điểm bột dược liệu của loài Flacourtia rukam Zollinger et Moritzi tại Việt Nam; cung cấp trình tự gen mã vạch rbcL chuẩn của loài được đăng ký chính thức trên Ngân hàng gen quốc tế GenBank với mã số MK088161.1.
2. Đã phân lập và xác định cấu trúc 11 hợp chất từ thân cành Flacourtia rukam, bổ sung dữ liệu phổ NMR và HR-MS chi tiết cho các hợp chất phenolic glycosid, triterpenoid friedelan lacton, acid béo cyclopentenyl và phytosterol từ loài này.
3. Lần đầu tiên chứng minh hoạt tính ức chế mạnh enzyme xanthin oxidase in vitro của hợp chất poliothrysosid ($IC_{50} = 2,26\ \mu\text{g/ml}$, vượt trội hơn allopurinol với $IC_{50} = 3,51\ \mu\text{g/ml}$) và dẫn chất phenolic glycosid (7) ($IC_{50} = 8,40\ \mu\text{g/ml}$), đồng thời xác nhận tác dụng hạ acid uric máu in vivo của dịch chiết dược liệu trên mô hình động vật thực nghiệm.
4. Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn chiết xuất và hợp chất tinh khiết trên ba dòng tế bào ung thư người (MDA-MB-231, HepG2, RD).

Đóng góp mới về mặt thực tiễn và ứng dụng

1. Xây dựng và thẩm định hoàn chỉnh quy trình định lượng hợp chất điểm chỉ poliothrysosid trong thân cây Hồng quân bằng kỹ thuật UPLC-PDA, phục vụ trực tiếp cho công tác tiêu chuẩn hóa, kiểm tra chất lượng và kiểm soát nguồn nguyên liệu dược liệu.
2. Cung cấp cơ sở khoa học thực nghiệm vững chắc để bảo tồn nguồn gen cây thuốc, ngăn ngừa tình trạng khai thác hủy diệt, hỗ trợ phát triển vùng trồng dược liệu và định hướng sản xuất các sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh gút, chống oxy hóa và u xơ tiền liệt tuyến từ cây Hồng quân.

Kiến nghị và đề xuất

• Kiến nghị tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phân tử tác động lên tế bào ung thư của phân đoạn cloroform và hợp chất (7) FRE11.
• Khảo sát độc tính bán trường diễn và trường diễn của các phân đoạn có hoạt tính cao nhằm đảm bảo tính an toàn trong ứng dụng lâu dài.
• Ứng dụng quy trình UPLC-PDA đã thẩm định vào việc xây dựng chuyên luận Dược điển cho dược liệu Hồng quân (Flacourtia rukam).

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế:
  • Nghiên cứu hóa học phân lập tập trung chủ yếu trên bộ phận thân cành, các bộ phận khác như lá, vỏ thân riêng biệt và rễ chỉ mới được khảo sát định lượng hoặc sàng lọc sơ bộ.
  • Các thử nghiệm độc tính tế bào ung thư mới dừng lại ở mức độ sàng lọc in vitro bằng phương pháp MTT, chưa đi sâu vào khảo sát các chỉ dấu phân tử của con đường apoptosis hoặc chu kỳ tế bào.
  • Thử nghiệm in vivo mới thực hiện trên mô hình gây tăng acid uric máu cấp tính bằng kali oxonat, chưa đánh giá trên mô hình bệnh gút mạn tính hoặc mô hình u xơ tiền liệt tuyến thực nghiệm.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Mở rộng chiết xuất phân lập các nhóm hoạt chất từ rễ và lá cây Hồng quân thu hái ở các thời điểm khác nhau.
  • Nghiên cứu cơ chế phân tử chi tiết của poliothrysosid và các dẫn chất phenolic trên thụ thể và con đường tín hiệu liên quan đến chuyển hóa acid uric và viêm khớp do gút.
  • Đánh giá độc tính trường diễn và nghiên cứu bào chế dạng thuốc chuẩn hóa hàm lượng poliothrysosid quy mô pilot.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao đối với:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Dược học, Hóa thực vật và Dược liệu học: Cung cấp phương pháp luận chuẩn xác về nghiên cứu hóa thực vật định hướng sinh học (bioassay-guided fractionation), kỹ thuật giải đoán phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D NMR của các hợp chất phenolic glycosid phức tạp và triterpenoid.
• Các nhà nghiên cứu thực vật và kiểm nghiệm dược liệu: Cung cấp cơ sở dữ liệu giải phẫu học, mã vạch DNA (rbcL) và quy trình phân tích UPLC-PDA để kiểm tra chất lượng, phân biệt các loài trong chi Flacourtia và định lượng hoạt chất.
• Các nhà khoa học dược lý và các đơn vị sản xuất dược phẩm: Cung cấp bằng chứng thực nghiệm về tác dụng ức chế enzyme XO, hạ acid uric máu và độc tính tế bào, làm tiền đề nghiên cứu phát triển các chế phẩm thuốc mới từ thảo dược thiên nhiên.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Cây Hồng quân nghiên cứu trong luận án có tên khoa học chính xác là gì và được định danh bằng phương pháp nào? Cây Hồng quân nghiên cứu có tên khoa học là Flacourtia rukam Zollinger et Moritzi, thuộc chi Flacourtia, họ Liễu (Salicaceae). Mẫu được định danh kết hợp giữa việc đối chiếu đặc điểm hình thái thực vật, cấu tạo vi giải phẫu và phân tích trình tự đoạn gen lục lạp rbcL (sản phẩm PCR 416 bp, mức độ tương đồng 99–100% với mẫu chuẩn NCBI KP094960.1). Trình tự gen của mẫu Bến Tre đã được công bố trên GenBank với mã số MK088161.1.

2. Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc được bao nhiêu hợp chất từ thân cây Hồng quân? Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của 11 hợp chất tinh khiết gồm: (1) Rukamtenol, (2) Acid chaulmoogric, (3) Poliothrysosid, (4) Koabursid (3,4,5-trimethoxyphenyl β-D-glucopyranosid), (5) Daucosterol, (6) 3α-Acetoxy-D:A-friedo-oleanan-27,16α-lacton, (7) 4-Formyl-2-hydroxyphenyl 6-O-benzoyl-β-D-glucopyranosid, (8) Acid vanillic, (9) Stigmasterol, (10) β-sitosterol và (11) Acid stearic.

3. Hoạt tính ức chế enzyme Xanthin Oxidase (XO) của các chất phân lập từ Flacourtia rukam thể hiện như thế nào so với chất đối chứng? Hợp chất (3) Poliothrysosid thể hiện hoạt tính ức chế enzyme xanthin oxidase in vitro rất mạnh với giá trị $IC_{50} = 2,26\ \mu\text{g/ml}$, vượt trội hơn chất đối chứng allopurinol ($IC_{50} = 3,51\ \mu\text{g/ml}$). Hợp chất (7) thể hiện tác dụng ức chế tốt với $IC_{50} = 8,40\ \mu\text{g/ml}$ và hợp chất (6) có $IC_{50} = 92,00\ \mu\text{g/ml}$.

4. Khả năng gây độc tế bào ung thư của các phân đoạn chiết xuất từ thân cây Hồng quân đạt kết quả ra sao? Phân đoạn cloroform thể hiện hoạt tính ức chế sinh trưởng mạnh trên dòng tế bào ung thư cơ vân RD ($IC_{50} = 12,35\ \mu\text{g/ml}$) và dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231 ($IC_{50} = 48,90\ \mu\text{g/ml}$). Phân đoạn ethyl acetat thể hiện hoạt tính ức chế mạnh trên dòng tế bào ung thư gan HepG2 ($IC_{50} = 12,27\ \mu\text{g/ml}$). Trong các chất tinh khiết, hợp chất (7) FRE11 ức chế dòng tế bào RD với $IC_{50} = 77,80\ \mu\text{M}$.

5. Quy trình định lượng hợp chất poliothrysosid trong dược liệu được tối ưu hóa như thế nào? Quy trình định lượng sử dụng kỹ thuật UPLC-PDA với cột pha đảo Acquity UPLC BEH C18 ($1,7\ \mu\text{m}$; $2,1 \times 50\ \text{mm}$). Mẫu dược liệu được chiết xuất tối ưu bằng phương pháp đun hồi lưu ở 95 °C trong 30 phút với dung môi methanol 50%. Quy trình đã được thẩm định đầy đủ về tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính (0,5–$100\ \mu\text{g/ml}$), độ lặp lại và độ đúng (thu hồi 80–120%).

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ dược học của tác giả Thái Thị Cẩm đã giải quyết trọn vẹn các mục tiêu nghiên cứu từ giám định phân loại thực vật, sinh học phân tử đến khảo sát hóa thực vật định hướng hoạt tính sinh học trên loài Flacourtia rukam tại Việt Nam. Công trình đã phân lập, xác định cấu trúc 11 hợp chất hóa học và lần đầu tiên phát hiện hoạt tính ức chế enzyme xanthin oxidase vượt trội của poliothrysosid so với allopurinol, minh chứng khoa học cho bài thuốc dân gian điều trị bệnh gút. Đồng thời, luận án đã xây dựng thành công quy trình định lượng UPLC-PDA cho hợp chất điểm chỉ poliothrysosid, tạo nền tảng kiểm nghiệm quan trọng cho việc bảo tồn và phát triển các sản phẩm dược liệu chuẩn hóa từ cây Hồng quân.

Trích đoạn nội dung tài liệu

đặt vấn đề “Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng chống oxy hóa và độc tính tế bào của cây Hồng quân (Flacourtia rukam Zoll.)” với những mục tiêu cụ thể sau: 1. Xác định tên khoa học nguyên liệu nghiên cứu qua khảo sát hình thái thực vật, vi phẫu và định danh mẫu bằng giải trình tự ADN. Khảo sát hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa và độc tính tế bào của thân cây Hồng quân.) TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. TỔNG QUAN VỀ CHI FLACOURTIA 1.

Thực vật học chi Flacourtia Flacourtia rukam Zollinger et Moritzi là một loài thực vật có hoa trong họ Liễu (Salicaceae), loài này được mô tả khoa học đầu tiên vào năm 1846 [20], [142]. Theo hệ thống phân loại dựa trên cơ sở phát sinh loài phân tử do Angiosperm Phylogeny Group thiết lập (2010), vị trí của họ Salicaceae được phân loại như sau: Giới (Plantae) (Kingdom) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) (Phylum) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) (Class) Bộ Sơ ri (Malpighiales) (Order) Họ Liễu (Salicaceae) (Family) Chi Flacourtia (Genus) Loài Flacourtia rukam (Species) Chi Flacourtia thuộc họ Flacourtaceae được phân loại theo hệ thống phân loại của A. Họ Mùng quân hay họ Bồ quân (Flacourtiaceae) là một họ thực vật có hoa trong hệ thống Cronquist và một vài hệ thống phân loại thực vật khác. Họ Flacourtiaceae rất đa dạng về chủng loại khi xem xét ở cấp độ họ.

Trong phân loại Cronquist, họ này bao gồm 89 chi và trên 800 loài, trong số này, nhiều chi kể cả chi điển hình Flacourtia hiện nay đã được chuyển sang họ Liễu (Salicaceae) trong phân loại dựa trên cơ sở phát sinh loài phân tử do Angiosperm Phylogeny Group thiết lập, được gọi là hệ thống APG II [137]. Trong hệ thống Cronquist cũ thì họ Salicaceae được xếp vào một bộ riêng của chính nó là bộ Liễu (Salicales) chỉ chứa có 3 chi là: Salix, Populus và Chosenia, nhưng APG II lại đưa họ này vào trong bộ Sơ ri (Malpighiales) gồm các chi Azara, Bennettiodendron, Dovyalis, Flacourtia, Idesia, Ludia, Xylosma thuộc họ Salicaeae [20],[137].) TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.) 5 Salicaceae gồm 55 chi và khoảng 1.210 loài, một số trong những loài này đã được sử dụng làm thuốc trong y học cổ truyền, các loài có quả ăn được như Flacourtia indica, Flacourtia inermis, Flacourtia jangomas, Flacourtia rukam. Các loài trong họ Salicaceae chủ yếu là cây thân gỗ thường rụng lá và một số cây bụi, phân bố ở vùng nhiệt đới đến ôn đới và vùng Bắc cực [77], [137]. Đặc điểm các loài thuộc chi Flacourtia tại Việt Nam Chi Flacourtia có một số loài sau: F.

zipelli [142] Chi Flacourtia gồm khoảng 15 loài của các vùng nóng châu Phi và châu Á. Cây nhỡ hay cây gỗ thường có gai nhất là lúc còn non. Lá mọc so le, đơn, thường có răng, gân lông chim, cuống ngắn. Lá kèm bên nhỏ, dễ rụng.

Cụm hoa chùm hay xim co, hoặc chùy nách tận cùng. Hoa đơn tính, ít khi đa tính, cỡ nhỏ. Có 4-6 lá đài, hơi dính ở gốc, lợp lên nhau. Không có cánh hoa, đĩa mật dạng vòng hoặc nhiều tuyến đối diện với các lá đài, bao quanh nhị và bầu.

Hoa đực có nhiều nhị, nhụy lép không có hoặc tiêu giảm. Hoa cái bầu trên 2 - 6 ô. Quả hạch dạng quả mọng có một đến nhiều hạt, hạt hơi dẹp, có vỏ cứng, phôi nhũ nạc bao bởi các hạt mỏng màu đỏ [3], [6]. Phân bố rộng ở các vùng nhiệt đới của châu Phi và châu Á: Campuchia, Lào, Việt Nam, Trung Quốc, Thái Lan, Ấn Độ, Myanma và Malaysia.

Ở Việt Nam, cây Hồng quân mọc từ Lai Châu, Bắc Kạn vào tới Ninh Thuận, Khánh Hòa, Lâm Đồng. Thường gặp ở những môi trường và độ cao thay đổi từ 0-1200 m, trong rừng thưa quanh các làng, gần các đường đi và các sông [3], [4]. Ở Việt Nam có các loài: Flacourtia indica, Flacourtia inermis, Flacourtia jangomas, Flacourtia rukam [6] .) TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Thân, lá, hoa, quả của Flacourtia indica “Nguồn: Võ Văn Chi, 2003 [3], Chatterjee Mousumi, 2015 [29] Hardik, 2010 [51], Lim T.

Lá, hoa, quả của Flacourtia jangomas “Nguồn: Võ Văn Chi, 2003 [3], Lim T. Thân, lá, hoa, quả của Flacourtia rukam “Nguồn: Võ Văn Chi, 2003 [3], Lim T. Thân, lá, hoa, quả của Flacourtia montana “Nguồn: Võ Văn Chi, 2003 [3]”.) TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Điểm khác biệt giữa các loài mang tên Hồng quân ở Việt Nam Flacourtia Flacourtia Flacourtia Flacourtia indica jangomas rukam montana Thân Cây nhỡ hay cây Cây bụi hay cây Cây nhỡ hay cây Cây gỗ nhỏ, gỗ đỏ, gỗ, có gai đơn hay nhỡ có gai đơn hay gỗ có gai chắc nhánh non có màu phân nhánh.

Vỏ phân nhánh. khỏe, đơn hay sét. thân màu nâu đỏ. phân nhánh có thể dài tới 10 cm.

Vỏ thân màu trắng xám, dễ bong tróc. Lá Lá nhẵn hay có Lá có hình xoan, Lá thuôn bầu dục, Lá có phiến dày, lông nhung ở cả nhọn dài ở đầu mép hơi lượn thành to, dài đến 20 cm, hai mặt, ngọn lá ngọn lá, mép lượn hình răng, gân con mép có răng to. xoan hình bầu dục, thành răng. thành mạng dày.

mép hơi lượn sóng. Hoa Hoa nhỏ màu vàng Hoa trắng hay Hoa nhỏ màu vàng Hoa không có cánh xanh, vàng hồng- trắng lục, cuống lục, đầu nhụy ít hoa. 30 - 50 nhị, đỏ, bầu phình to, ngắn, rất mảnh, 4 - xòe, hoa vô cánh, bầu có 7 vòi nhụy. đầu nhụy xòe ra, 5 lá đài dính nhau ở không mùi, cuống hoa vô cánh.

Hoa cái có đĩa ngắn, 3 - 4 lá đài có cuống ngắn, mật nguyên hay hơi dính ở gốc. Bầu lông mịn. Hoa đực chia thùy, bầu hình nhụy hình cầu có 4 có đĩa mật gồm cầu với 4 - 6 ô, 4 - - 7 giá noãn mang nhiều tuyến lượn 5 vòi nhụy, đầu 2 noãn, 4 - 7 vòi tai bèo, chỉ nhị có nhụy ngắn. nhụy, rời xếp thành chỉ mảnh.

Hoa có vòng ở đỉnh bầu. đĩa mật hầu như nguyên, bầu hình cầu với 4 - 6 giá noãn 2 noãn, 4 - 6 vòi nhụy. Quả Quả mọng. Hạt Quả nạc, có cạnh.

Hạt Quả hạch. Hạt dẹp màu vàng nâu Hạt vàng nâu, hình thận, dẹp, màu vàng phồng hai mặt, vân nhám màu vàng có vân nhám nổi rõ hai mờ. mặt, có rìa và đuôi nhọn. Nhận xét: Có sự khác biệt rõ rệt về hình thái lá, hoa, quả và hạt giữa các loài Flacourtia nên có thể dựa vào đặc điểm hình thái để nhận dạng các loài Hồng quân.

Thành phần hóa học chi Flacourtia Thành phần hóa học chính của các loài thuộc chi Flacourtia chủ yếu chứa các hợp chất chuyển hóa thứ cấp như terpenoid, steroid và các hợp chất phenolic như (LUAN.) TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.) 8 flavonoid, coumarin, lignan, phenolic glycosid. Báo cáo cho thấy các chất chuyển hóa tập trung chủ yếu ở các loài F. Dẫn xuất phenol Các dẫn xuất phenol thực vật bao gồm các flavonoid, stilben, các lignan, các acid phenolic, tannin. Nhóm Flavonoid Flavonoid là thành viên của nhóm phenol thực vật, thể hiện hoạt tính chống oxy hóa nhờ vào khả năng loại bỏ gốc tự do [24].

Flavon: mới chỉ tìm thấy có 2 báo cáo về sự hiện diện nhóm flavon trong 2 cây F. indica là apigenin được phân lập từ cao cloroform vỏ thân F. cataphracta và chrysoeriol-7-O-β-D-glucopyranosid được phân lập từ dịch chiết ethanol lá và cành F. Flavon được phân lập từ các loài thuộc chi Flacourtia STT Tên hợp chất R1 R2 Tên loài TLTK 1 Apigenin H H F.

cataphracta [117] 2 Chrysoeriol-7-O-β-D-glucopyranosid OMe Glu F. indica [113] Flavonol Năm 2014 nhóm nghiên cứu của Alakolanga đã phân tích và xác định được các flavonol là kaempferol, quercetin và các dẫn xuất từ dịch chiết methanol quả của F.) TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Flavonol được phân lập từ các loài thuộc chi Flacourtia STT Tên hợp chất R1 R2 Tên loài TLTK 1 Kaempferol H H F. cataphracta [117] 2 Kaempferol 3-O-galactosid H Gal F.

inermis [14] 3 Kaempferol 3-O-glucosid H Glu F. inermis, 4 Kaempferol 3-O-rutinosid H Rut [14], [28] F. inermis, 5 Rutin OH Rut [14], [28] F. ramontchi 6 Quercetin OH H F.

inermis [14] 7 Quercetin 3-O-galactosid OH Gal F. inermis [14] 8 Quercetin 3-O-glucosid OH Glu F. inermis [14] Gal = galactopyranose; Glu = glucopyranose; Rut = rutinose Flavanol Sashidhara K. và cộng sự (2012) đã phân lập từ cao ethanol lá và cành Flacourtia indica thu được một phenolic glycosid mới là 2-(2-benzoyl-β-D- glucopyranosyloxy)-7-(1α, 2α, 6α-trihydroxy-3-oxocyclohex-4-enoyl)-5- hydroxybbenzyl alcol cùng với 5 hợp chất đã công bố là poliothrysosid, catechin- [5,6-e]-4-β-(3,4-dihydroxyphenyl) dihydro-2-(3H)-pyranon, 2-(6-benzoyl-β-D- glucopyranosyloxy)-7-(1α, 2α, 6α-trihydroxy-3-oxocyclohex-4-enoyl)-5- hydroxybbenzyl alcol, chrysoeriol 7-O-β-D-glucopyranosid, mururin A [113].

(+)-Catechin [80] Catechine-[5,6-e]-4β-(3,4- Mururin A [113] dihydroxyphenyl) dihydro- 2(3H)-pyranon [113] Chalcon Hợp chất 4,4’-dihydroxychalcon được phân lập từ lá và vỏ thân F.) TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.) 10 4,4’-Dihydroxychalcon [117] Nhóm Coumarin Từ dịch chiết ether lá F. jangomas phân lập được chất ostruthin [11] và chất esculin từ quả F. Ostruthin [11] Esculin [14] Nhóm Phenolic glycosid Nhiều hợp chất glucose được tìm thấy trong chi Flacourtia chủ yếu là este phenolic và phenylpropan, hoặc heterosid phenolic glucopyranose. Năm 1987, (-) flacourtin được phân lập từ phân đoạn EtOAc vỏ thân F.

Đây là một ester glycosid mới có cấu trúc 3-hydroxy-4-hydroxymethylphenyl-6-O- benzoyl-β-D-glucopyranosid [22]. Năm 2007, nhóm nghiên cứu đã phân lập cao n-butanol dịch chiết quả thu được một chất mới là flacoursid (4-oxo-2-cyclopentenylmethy 6-O-(E)-p-coumaroyl β-D- glucopyranosid) cùng với hai chất đã được công bố là methyl 6-O-(E)-p-coumaroyl glucopyranosid và 6-O-(E)-p-coumaroyl glucopyranosid [15]. Năm 2010, Kaul và cộng sự đã phân lập từ dịch chiết nước của thân, cành, lá F. indica được 3 hợp chất là pyrocatechol, homalosid D và poliothrysosid [63].

Năm 2012, từ cao chiết EtOAc của vỏ thân Flacourtia ramontchi nhóm nghiên cứu của Melanie Bourjot và cộng sự đã phân lập được 6 hợp chất phenolic glycosid mới, đặt tên là flacourtosid A-F và các hợp chất phenolic khác như itosid H, xylosmin, scolochinenosid D, poliothrysosid và betulinic acid 3-β-caffeat [26].) TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Sashidhara và cộng sự (2013) khảo sát và phân lập từ cao ethanol lá, cành F. indica thu được một phenolic glycosid mới là 2-(2-benzoyl-β-D- glucopyranosyloxy)-7-(1α, 2α, 6α-trihydroxy-3-oxocyclohex-4-enoyl)-5- hydroxybbenzyl alcol cùng với 5 chất đã được công bố là poliothrysosid, catechin- [5,6-e]-4-β-(3,4-dihydroxyphenyl) dihydro-2-(3H)-pyranon, 2-(6-benzoyl-β-D- glucopyranosyloxy)-7-(1α, 2α, 6α-trihydroxy-3-oxocyclohex-4-enoyl)-5- hydroxybbenzyl alcol, chrysoeriol 7-O-β-D-glucopyranosid, mururin A [113]. và cộng sự (2009) đã phân lập được một hợp chất phenolic glucosid mới từ vỏ thân F.

Năm 2011, từ dịch nước ép quả phân lập được một phenolic glucosid ít gặp là (rel)-6-benzoyloxy-1,2-dihydroxy-5-oxocyclohex-3-encarboxylic acid 2-(6-O- benzoyl-D-glucopyranosyloxy)-5-hydroxybenzyl ester [58]. Năm 2019, Muharni và cộng sự phân lập từ cao ethyl acetat vỏ thân F. rukam được 3 hợp chất: Friedelin, poliothrysosid và β-sitosteryl-3β- glucopyranosid [88].) TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Các hợp chất phenolic glycosid STT Tên hợp chất R1 R2 R3 R4 Tên loài TLTK F.

1 6-O-p-coumaroyl-β-glucose H H H A2 [14], [15] inermis F. 2 6-O-caffeoyl-β-glucose H H H A3 [14], [15] inermis Methyl 6-O-(E)-p-coumaroyl 3 Me H H A2 F. indica [15] glucopyranosid 4 Flacourtosid B A4 H H A1 F. ramonchi [14] trimethoxybenzen 13 Flacoursid A12 H H A2 F.) TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.