Luận án tiến sĩ phân lập tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi thai thành tế bào dạng tiết dopamin

Luận án tiến sĩ nghiên cứu phân lập và biệt hóa tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi thai thành tế bào tiết dopamin, mở ra hướng điều trị mới.

• Tác giả: Nguyễn Phúc Hoàn
• Người hướng dẫn: Nguyễn Mạnh Hà
• Trường học: Trường Đại học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Mô phôi thai học
• Đề tài: Phân lập, tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi – thai thành tế bào dạng tiết dopamin
• Loại tài liệu: Luận án tiến sỹ y học
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Đặc điểm tế bào gốc thần kinh
• 1.2. Quá trình hình thành và biệt hóa nơron tiết dopamin in vivo
• 1.3. Tế bào gốc não giữa và nơron tiết dopamin: ứng dụng trong điều trị
• 1.4. Phân lập, nuôi cấy và bảo quản lạnh tế bào gốc sàn não giữa phôi
• 1.5. Nuôi cấy tế bào gốc thần kinh
• 1.6. Định danh tế bào gốc thần kinh và tế bào tiết dopamin
• 1.6.1. Định danh tế bào gốc thần kinh
• 1.6.2. Định danh tế bào tiết dopamin
• 1.7. Bảo quản lạnh tế bào gốc thần kinh và nơron tiết dopamin
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Các bước tiến hành
• 2.4.1. Các bước tiến hành trên phôi chuột
• 2.4.2. Các bước tiến hành trên phôi người
• 2.5. Chỉ tiêu nghiên cứu
• 2.6. Trang thiết bị, vật tư hóa chất dùng trong nghiên cứu
• 2.6.1. Trang thiết bị
• 2.6.2. Vật tư tiêu hao
• 2.6.3. Hóa chất, môi trường
• 2.7. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
• 2.7.1. Kỹ thuật hiển vi
• 2.7.2. Kỹ thuật siêu vi
• 2.7.3. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch
• 2.7.4. Kỹ thuật đếm tế bào TH
• 2.8. Xử lí số liệu nghiên cứu
• 2.9. Đạo đức nghiên cứu
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Phân lập, tăng sinh và bảo quản lạnh tế bào gốc ngoại bì thần kinh não giữa phôi chuột
• 3.2. Phân lập, nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc ngoại bì thần kinh sàn não giữa phôi chuột theo nhóm tuổi
• 3.3. Nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi chuột E12,5 – E13,5
• 3.4. Bảo quản lạnh tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi
• 3.5. Phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi người
• 3.5.1. Phân lập tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi người
• 3.5.2. Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc biểu mô ống thần kinh phôi người tạo nơron tiết dopamin
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc ngoại bì thần kinh não giữa phôi chuột
• 4.2. Xác định vị trí phẫu tích tế bào gốc ngoại bì thần kinh
• 4.3. Thử nghiệm nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh phân lập từ sàn não giữa trên phôi chuột từ 10,5 đến 14,5 ngày
• 4.4. Nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh não giữa phôi chuột cống trắng giai đoạn E12,5 – E13,5
• 4.5. Bảo quản lạnh tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi
• 4.6. Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi người
• 4.7. Thuận lợi và khó khăn trong quá trình thu thập phôi và phân lập tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi người
• 4.8. Cấu trúc của biểu mô ống thần kinh phôi người 6,5 - 7,5 tuần tuổi
• 4.9. Sự phát triển của các tế bào nuôi cấy và định danh các tế bào sau nuôi cấy
• 4.10. Hiệu quả nuôi cấy tạo nơron tiết dopamin
• 5. KHUYẾN NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi thai

Nghiên cứu về tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi thai đã mở ra nhiều triển vọng trong điều trị các bệnh lý thần kinh, đặc biệt là bệnh Parkinson. Tế bào gốc này có khả năng biệt hóa thành các nơron tiết dopamin, giúp khôi phục chức năng thần kinh bị tổn thương. Việc hiểu rõ về đặc điểm và tiềm năng của tế bào gốc này là rất quan trọng trong việc phát triển các phương pháp điều trị mới.

1.1. Đặc điểm của tế bào gốc ngoại bì thần kinh

Tế bào gốc ngoại bì thần kinh có khả năng tự tái tạo và biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau. Chúng có thể phát triển thành các nơron tiết dopamin, đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị bệnh Parkinson.

1.2. Quá trình hình thành nơron tiết dopamin

Quá trình hình thành nơron tiết dopamin bắt đầu từ tế bào gốc ngoại bì thần kinh, diễn ra qua nhiều giai đoạn phát triển phức tạp. Các yếu tố môi trường và tín hiệu nội bào ảnh hưởng đến sự biệt hóa của tế bào gốc này.

II. Thách thức trong nghiên cứu tế bào gốc và bệnh Parkinson

Mặc dù có nhiều tiềm năng, nhưng việc ứng dụng tế bào gốc trong điều trị bệnh Parkinson vẫn gặp nhiều thách thức. Các vấn đề như khả năng sống sót của tế bào sau khi cấy ghép, sự tương thích mô và nguy cơ phản ứng miễn dịch cần được giải quyết.

2.1. Khó khăn trong việc phân lập tế bào gốc

Phân lập tế bào gốc từ phôi thai là một quá trình phức tạp, đòi hỏi kỹ thuật cao và điều kiện môi trường nuôi cấy nghiêm ngặt. Điều này có thể ảnh hưởng đến chất lượng và số lượng tế bào gốc thu được.

2.2. Vấn đề tương thích mô trong điều trị

Sự tương thích giữa mô ghép và mô chủ là một yếu tố quan trọng quyết định thành công của liệu pháp tế bào gốc. Nguy cơ phản ứng miễn dịch có thể dẫn đến sự thất bại trong điều trị.

III. Phương pháp nghiên cứu tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi thai

Nghiên cứu sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để phân lập và nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh. Các phương pháp này bao gồm nuôi cấy tế bào trong môi trường đặc biệt và sử dụng các yếu tố tăng trưởng để kích thích sự phát triển của tế bào.

3.1. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc bao gồm việc sử dụng môi trường nuôi cấy đặc biệt và các yếu tố tăng trưởng để tối ưu hóa sự phát triển và biệt hóa của tế bào gốc thành nơron tiết dopamin.

3.2. Phương pháp định danh tế bào gốc

Định danh tế bào gốc là bước quan trọng để xác định tính chất và khả năng biệt hóa của tế bào. Các phương pháp như nhuộm huỳnh quang và phân tích gen được sử dụng để xác định sự hiện diện của các marker tế bào.

IV. Ứng dụng thực tiễn của tế bào gốc trong điều trị bệnh Parkinson

Việc ứng dụng tế bào gốc ngoại bì thần kinh trong điều trị bệnh Parkinson đã cho thấy nhiều kết quả khả quan. Nghiên cứu lâm sàng cho thấy tế bào gốc có thể cải thiện triệu chứng và chất lượng cuộc sống của bệnh nhân.

4.1. Kết quả từ các nghiên cứu lâm sàng

Nhiều nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra rằng việc cấy ghép tế bào gốc ngoại bì thần kinh có thể cải thiện đáng kể triệu chứng của bệnh Parkinson, giúp bệnh nhân phục hồi chức năng thần kinh.

4.2. Tiềm năng trong tương lai

Nghiên cứu về tế bào gốc ngoại bì thần kinh vẫn đang tiếp tục phát triển. Các phương pháp mới có thể mở ra cơ hội điều trị hiệu quả hơn cho bệnh Parkinson và các bệnh lý thần kinh khác.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu tế bào gốc

Nghiên cứu về tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi thai đang mở ra nhiều triển vọng trong điều trị bệnh Parkinson. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp mới sẽ giúp nâng cao hiệu quả điều trị và cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu tế bào gốc

Nghiên cứu tế bào gốc không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh lý mà còn mở ra hướng đi mới trong điều trị các bệnh lý khó chữa như Parkinson.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc cải thiện kỹ thuật phân lập và nuôi cấy tế bào gốc, cũng như đánh giá hiệu quả lâu dài của liệu pháp tế bào gốc trong điều trị bệnh Parkinson.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ y học với đề tài "Phân lập, tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi – thai thành tế bào dạng tiết dopamin" do nghiên cứu sinh Nguyễn Phúc Hoàn thực hiện tại Trường Đại học Y Hà Nội (năm 2021), thuộc chuyên ngành Mô phôi thai học, ngành Khoa học y sinh (mã số: 9720101). Công trình được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Nguyễn Mạnh Hà và PGS. Nguyễn Thị Bình, là một phần kết quả thuộc đề tài khoa học và công nghệ cấp Nhà nước mã số ĐTĐL/2013 mang tên "Nghiên cứu ứng dụng quy trình phân lập, nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi chuột và người để điều trị bệnh Parkinson thực nghiệm".

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Bệnh Parkinson là một bệnh lý rối loạn thần kinh thoái hóa tiến triển đặc trưng bởi sự suy giảm chức năng và mất dần các nơron tiết dopamin tại vùng liềm đen của não giữa. Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh Parkinson chiếm khoảng 1,6% ở nhóm người trên 65 tuổi và có xu hướng gia tăng với tỷ lệ mắc mới ước tính khoảng 20/100.000 dân/năm. Các phương pháp điều trị nội khoa hiện hành chủ yếu sử dụng các tiền chất chuyển hóa của dopamin như Levodopa; tuy nhiên, hiệu quả điều trị bằng thuốc thường chỉ duy trì ổn định trong khoảng 5–10 năm trước khi xuất hiện hiện tượng dung nạp hoặc kháng thuốc.

Để giải quyết căn nguyên của bệnh, hướng tiếp cận cấy ghép tế bào nhằm thay thế các nơron thoái hóa đã được nghiên cứu từ những năm 1980. Trong số các nguồn tế bào thử nghiệm (tế bào gốc tủy xương, tế bào gốc vạn năng cảm ứng - iPSCs, tế bào gốc phôi), tế bào gốc ngoại bì thần kinh sàn não giữa phôi – thai (Mesencephalic Neuroepithelial Stem Cells - M-NECs) được đánh giá có tiềm năng ứng dụng cao do khả năng biệt hóa định hướng thành nơron tiết dopamin (mDA) in vitro và in vivo, đồng thời có độ hòa hợp mô tốt. Tuy nhiên, nguồn mô phôi thai đồng loại bị hạn chế về số lượng, đòi hỏi phải xây dựng quy trình phân lập chuẩn xác, nuôi cấy tăng sinh và bảo quản lạnh để chủ động nguồn tế bào trị liệu.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định 2 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Phân lập, tăng sinh, biệt hóa và bảo quản lạnh tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi chuột cống trắng thành tế bào dạng tiết dopamin.
2. Bước đầu phân lập, tăng sinh và biệt hóa được tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi – thai người thành tế bào dạng tiết dopamin.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu trên động vật: 776 phôi chuột cống trắng thuần chủng Wistar ở các độ tuổi từ 10,5 đến 14,5 ngày tuổi (E10,5 – E14,5). Trong đó, 186 phôi được dùng để nghiên cứu hình thái và cấu trúc não giữa theo tuổi; 590 phôi được sử dụng để phân lập và nuôi cấy tế bào gốc ngoại bì thần kinh.
• Đối tượng nghiên cứu trên người: 201 phôi người từ 6,0 đến 8,0 tuần tuổi (tuổi phôi tính từ ngày đầu của kỳ kinh cuối) thu thập từ các trường hợp giảm thiểu thai ở thai phụ đa thai can thiệp hỗ trợ sinh sản (IUI hoặc IVF) sau khi có sự đồng thuận của thai phụ và đã sàng lọc âm tính với các bệnh lây truyền (HIV, viêm gan B, giang mai).
• Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu thực nghiệm tại Labo nuôi cấy tế bào, Bộ môn Mô – Phôi, Trường Đại học Y Hà Nội và Phòng Kính hiển vi điện tử, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương trong giai đoạn từ tháng 10/2014 đến tháng 10/2018.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước đây

Luận án hệ thống hóa các mốc phát triển và các công trình khoa học trong và ngoài nước liên quan đến tế bào gốc thần kinh và nơron tiết dopamin:

• Lịch sử nghiên cứu tế bào gốc thần kinh: Tế bào gốc thần kinh được Altman và cộng sự mô tả lần đầu tiên vào năm 1962. Các nghiên cứu sau đó đã phân định rõ ba đặc tính cốt lõi của tế bào gốc thần kinh: khả năng tự làm mới (self-renewal), khả năng biệt hóa đa dòng (thành nơron, tế bào sao, tế bào ít nhánh) và khả năng tái tạo mô thần kinh.
• Thực nghiệm cấy ghép trên động vật:
  • Perlow và cộng sự (1979): Thực hiện ghép mảnh mô sàn não giữa phôi chuột vào thể vân của chuột mô hình Parkinson gây bởi 6-OHDA, ghi nhận 5/29 chuột giảm 70% số vòng quay sau 1 tháng.
  • Björklund và cộng sự (những năm 1980): Cải tiến kỹ thuật bằng cách sử dụng dịch treo tế bào gốc sàn não giữa (ủ trypsin 0,1% trong 30 phút, phân ly cơ học qua pipet) tiêm vào thể vân chuột Parkinson; kết quả cho thấy tế bào sống và di cư từ 0,5 đến 1,0 mm từ vị trí tiêm trên 11/15 mẫu.
• Thử nghiệm lâm sàng trên người:
  • Madrazo và cộng sự (1988): Báo cáo 2 ca ghép hỗn hợp tế bào gốc thần kinh giàu nơron tiết dopamin vào não bệnh nhân tình nguyện, ghi nhận cải thiện rối loạn vận động.
  • Lindvall và cộng sự (1990): Đánh giá hiệu quả ghép tế bào gốc phôi người trên lâm sàng bằng kỹ thuật chụp cắt lớp phát xạ positron (PET) với 6-L-[18F] fluorodopa (FDOPA), ghi nhận tăng tín hiệu huỳnh quang tại nhân bèo sau 5 tháng.
  • Olanow và cộng sự (1992): Thử nghiệm lâm sàng trên 34 bệnh nhân Parkinson (chia nhóm tiêm tế bào từ 1 phôi, 4 phôi và nhóm giả dược). Kết quả cho thấy nhóm bệnh nhân có điểm UPDRS ban đầu $\le 49$ có sự cải thiện ý nghĩa ($p = 0,005$) khi điều trị bằng tế bào từ 4 phôi. Khảo sát tử thiết sau 5 năm ở 5 bệnh nhân ghi nhận sự tăng biểu hiện của marker Tyrosine Hydroxylase (TH) ở nhóm tiêm 4 phôi.
• Các nghiên cứu về yếu tố tăng trưởng và vi môi trường:
  • Armelin (1973): Phát hiện yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FGF).
  • Bouvier và cộng sự (1995): Chứng minh bFGF giúp tăng sinh tế bào gốc thần kinh não giữa phôi chuột E12 và làm chậm biệt hóa đến 8 ngày, giúp lượng nơron tiết dopamin thu được tăng gấp 20 lần.
  • Grothe và cộng sự (2004): Báo cáo vai trò của FGF20 trong việc thúc đẩy tạo nơron mDA và giảm chết theo chương trình.
  • Nelson và cộng sự (2008): Khảo sát nồng độ EGF (20 ng/ml so với 100 ng/ml) trong nuôi cấy tế bào thần kinh.
• Phương pháp phân lập và nuôi cấy:
  • Phân tách tế bào bằng enzym (Trypsin/EDTA, Papain, DNase I) theo Maric và cộng sự (1998), Corver và Panchision.
  • Kỹ thuật nuôi cấy cụm dịch treo (neurosphere) do Reynolds và Weiss (1992) đề xuất so với nuôi cấy lớp đơn trên chất nền Poly-L-Lysine/Laminin theo Meyer và cộng sự (2012).
  • Kỹ thuật bảo quản lạnh tế bào thần kinh bằng DMSO (7–10%), tốc độ hạ nhiệt 1℃/phút, bảo quản cụm tế bào theo Rodriguez-Martinez và Drummond cùng cộng sự (2020).

Khoảng trống nghiên cứu luận án giải quyết

Tại Việt Nam, các nghiên cứu chuyên sâu về quy trình phẫu tích khu trú chính xác vùng sàn não giữa phôi, chuẩn hóa phương pháp enzyme - cơ học để phân ly tế bào M-NECs, phối hợp các yếu tố tăng trưởng (EGF, bFGF) và tối ưu hóa điều kiện bảo quản lạnh tế bào gốc thần kinh phôi chuột cũng như phôi người chưa được thực hiện đầy đủ. Luận án giải quyết khoảng trống này bằng việc thiết lập quy trình nuôi cấy in vitro tạo nơron dạng tiết dopamin phục vụ nghiên cứu thực nghiệm.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và các marker phân tử

Quá trình tạo nơron tiết dopamin não giữa (mDA) in vivo diễn ra tại tấm sàn não giữa:

• Cấu trúc ống thần kinh: Gồm 3 lớp: lớp nội tủy (lớp sinh sản chứa tế bào đầu dòng), lớp trung gian (nơi tế bào di cư) và lớp áo/màn rìa (nơi nơron trưởng thành cư trú).
• Yếu tố phiên mã và tín hiệu: Sự biệt hóa nơron mDA được kiểm soát bởi các gen $Lmx1a, Lmx1b, Foxa1, Foxa2, Msx1/2, Ngn2, Shh, En1/2$. Quá trình này xuất hiện từ ngày E8–E10,5 ở chuột và từ tuần thứ 5–6 ở người, đạt đỉnh ở tuần 6–8 và dừng ở tuần 10–11.
• Hệ thống marker định danh:
  • Tế bào gốc/tiền thân thần kinh: Nestin (xơ trung gian nhóm IV), Vimentin (xơ trung gian nhóm III), Musashi1 (Msi1), SOX (SOX1, SOX2, SOX3 nhóm B1), PAX6, CD133, CD15.
  • Nơron chưa trưởng thành: $\beta$III-tubulin (mã hóa bởi gen $TUBB3$), Doublecortin (DCX).
  • Nơron trưởng thành: Neurofilament (NF-L, NF-M, NF-H), MAP-2, NeuN (FOX3), Synaptophysin, Synapsin I.
  • Tế bào dòng đệm và phân loại nơron khác: GFAP (tế bào sao), O4 (tế bào ít nhánh), GABA, ChAT.
  • Tế bào tiết dopamin: Tyrosine Hydroxylase (TH - enzyme chuyển hóa L-tyrosine thành L-DOPA), Dopamine Transporter (DAT - protein vận chuyển màng).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Phương pháp phân lập và kỹ thuật xét nghiệm

• Phẫu tích mô: Phẫu tích vi phẫu vùng não giữa phôi chuột theo quy trình của Jan Pruszak và cộng sự dưới kính hiển vi soi nổi.
• Tách tế bào: Kết hợp hóa chất/men phân giải (Trypsin 0,1% hoặc Papain phối hợp EDTA và DNase I) và phân ly cơ học bằng pipet hạn chế tổn thương.
• Nuôi cấy: Đĩa nuôi cấy đơn lớp có xử lý chất bám dính Poly-L-Lysine và Laminin; sử dụng môi trường DMEM/F-12 bổ sung các yếu tố tăng trưởng bFGF, EGF nồng độ 20 ng/ml.
• Bảo quản lạnh: Sử dụng dung dịch bảo quản chứa DMSO nồng độ 7–10%, hạ nhiệt độ có kiểm soát (1℃/phút) và lưu trữ trong nitơ lỏng; đánh giá tỷ lệ tế bào sống bằng phương pháp nhuộm loại trừ qua Trypan blue.
• Kỹ thuật hiển vi và hóa mô miễn dịch:
  • Nhuộm Hematoxyline - Eosine (H-E) quan sát hình thái vi thể.
  • Kỹ thuật hiển vi điện tử truyền qua (TEM) quan sát cấu trúc siêu vi (nhân, bào quan, sợi nhánh, synap, nón tăng trưởng).
  • Hóa mô miễn dịch huỳnh quang (HMMD) với kháng thể kháng Vimentin, Nestin và Tyrosine Hydroxylase (TH).
  • Đếm định lượng tế bào dương tính với TH trên các vi trường chuẩn.

Hạng mục dữ liệu	Mô hình chuột Wistar (Giai đoạn 1)	Mô hình phôi người (Giai đoạn 2)
Nguồn mẫu	776 phôi chuột (E10,5 – E14,5)	201 phôi người (6,0 – 8,0 tuần tuổi)
Mục đích	186 phôi khảo sát hình thái; 590 phôi phân lập/nuôi cấy	Phân lập, khảo sát cấu trúc ống thần kinh và nuôi cấy
Thời gian vận chuyển/xử lý	Xử lý ngay sau phẫu tích	Bảo quản môi trường HBSS ở 4℃, xử lý trong vòng 8 giờ
Kỹ thuật phân tích	Vi thể (H-E), Siêu vi (TEM), HMMD (Vimentin, TH), Đếm TH+	Vi thể (H-E), HMMD (Vimentin, TH), Đếm số lượng tế bào sống

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 tổng hợp các cơ sở lý luận về tế bào gốc thần kinh và ứng dụng trong điều trị thoái hóa thần kinh:

• Phân tích chi tiết đặc tính sinh học của tế bào gốc thần kinh: trạng thái chưa biệt hóa, cơ chế phân chia đối xứng (tăng kích thước quần thể) và bất đối xứng (vừa tự làm mới vừa sinh ra tế bào đầu dòng).
• Mô tả giải phẫu phát triển phôi học của tấm sàn não giữa in vivo, sự phân tầng 3 lớp (nội tủy, trung gian, áo) và sự tham gia của các yếu tố tín hiệu ($Shh, Wnt, FGF8$) cùng các yếu tố phiên mã ($Lmx1a, Foxa2$).
• Tổng kết các công trình cấy ghép tế bào trên mô hình động vật Parkinson (sử dụng độc chất 6-OHDA, MPTP) và các thử nghiệm lâm sàng ghép mô phôi người từ năm 1988 đến các năm 1990.
• Khảo sát các thông số kỹ thuật nuôi cấy in vitro: lựa chọn môi trường DMEM/F-12, vai trò của bFGF trong việc duy trì trạng thái chưa biệt hóa và kích thích phân chia, vai trò của EGF, tác động của hệ đệm (Bicarbonate natri so với HEPES) và phân áp oxy.
• Đánh giá các phương pháp bảo quản lạnh tế bào gốc thần kinh (đông lạnh chậm 1℃/phút so với thủy tinh hóa), ảnh hưởng của chất bảo vệ lạnh DMSO (7–10%) và sự khác biệt về khả năng biệt hóa giữa bảo quản tế bào đơn lẻ và bảo quản dạng cụm tế bào.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Trình bày thiết kế nghiên cứu thực nghiệm labo tiến hành từ 10/2014 đến 10/2018:

• Chuẩn bị động vật và tạo phôi: Chuột cống trắng Wistar đực và cái thuần chủng (2–3 tháng tuổi, 150–250g) được ghép đôi qua đêm; xác định ngày có thai E0,5 dựa vào sự hiện diện của tinh trùng trên phiến đồ âm đạo. Thu thập phôi tại các thời điểm E10,5; E11,5; E12,5; E13,5; E14,5.
• Thu thập phôi người: Phôi 6–8 tuần tuổi từ thủ thuật giảm thiểu thai đa thai tại các trung tâm hỗ trợ sinh sản; vận chuyển trong dung dịch HBSS ở 4℃ về labo trong vòng 8 giờ.
• Quy trình phẫu tích và phân lập: Phẫu tích não giữa dưới kính hiển vi soi nổi, bóc tách màng ối và màng não, tách rời sàn não giữa; xử lý enzyme Trypsin/EDTA hoặc Papain kết hợp DNase I; ly tâm loại bỏ chất nền, tạo dịch treo đơn bào.
• Quy trình nuôi cấy và biệt hóa: Nuôi cấy đơn lớp trên đĩa phủ Poly-L-Lysine/Laminin trong môi trường DMEM/F-12 có bổ sung bFGF và EGF.
• Kỹ thuật định danh: Nhuộm H-E, siêu cấu trúc qua kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), nhuộm hóa mô miễn dịch với các kháng thể kháng Vimentin và Tyrosine Hydroxylase (TH).

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Luận án trình bày các kết quả thực nghiệm thu được qua các bảng số liệu và biểu đồ:

• Khảo sát hình thái và vi cấu trúc não giữa phôi chuột:
  • Phôi E10,5 – E11,5: Thành não giữa chủ yếu là lớp biểu mô thần kinh nội tủy đang phân chia mạnh; trên hình ảnh siêu vi (TEM), tế bào có tỷ lệ nhân/bào tương lớn, bào quan nghèo nàn.
  • Phôi E12,5 – E13,5: Quan sát thấy sự phân lớp rõ rệt; xuất hiện các tế bào tiền thân tiết dopamin tại lớp trung gian và sàn não giữa; hình thành các nón tăng trưởng và nhánh bào tương tập trung thành nhóm.
• Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc não giữa phôi chuột:
  • Tỷ lệ trích thủ và phân lập thành công cao nhất ở nhóm tuổi E12,5 – E13,5.
  • Tế bào bám dính tốt trên đĩa phủ Poly-L-Lysine/Laminin, sau 6 ngày nuôi cấy xuất hiện các tế bào có hình thái nơron đa cực, phân nhánh dài.
  • Nhuộm HMMD ghi nhận tế bào dương tính mạnh với Vimentin (giai đoạn đầu) và tăng dần tỷ lệ biểu hiện TH sau quá trình biệt hóa.
• Hiệu quả bảo quản lạnh:
  • Tế bào gốc thần kinh sau rã đông từ môi trường chứa DMSO duy trì được tỷ lệ sống cao, giữ vững khả năng bám dính, tăng sinh và biệt hóa thành nơron TH dương tính khi nuôi cấy lại.
• Kết quả trên phôi người (6,0 – 8,0 tuần tuổi):
  • Đánh giá cấu trúc biểu mô ống thần kinh phôi người giai đoạn 6,5 – 7,5 tuần tuổi.
  • Phân lập thành công tế bào gốc biểu mô ống thần kinh; sau 8–10 ngày nuôi cấy in vitro, các tế bào phát triển kéo dài sợi nhánh, hình thành mạng lưới tế bào thần kinh và biểu hiện dương tính với marker TH trên nhuộm HMMD.

Chương 4: Bàn luận

Tác giả phân tích, so sánh các kết quả nghiên cứu với y văn thế giới:

• Vị trí và thời điểm phẫu tích: Khẳng định giai đoạn E12,5 – E13,5 ở phôi chuột là thời điểm tối ưu nhất để thu thập tế bào gốc sàn não giữa, do giai đoạn này quần thể tế bào tiền thân mDA đạt số lượng lớn và có khả năng tăng sinh, biệt hóa cao hơn so với giai đoạn E10,5 (chưa định hướng rõ) hoặc E14,5 (mô đã biệt hóa nhiều, khó tách đơn bào và giảm tỷ lệ sống).
• So sánh phương pháp tách tế bào: Đánh giá hiệu quả của việc phối hợp men và cơ học, kiểm soát thời gian ủ enzyme nhằm hạn chế tổn thương màng tế bào và bảo tồn các thụ thể bề mặt.
• Đặc điểm nuôi cấy đơn lớp so với tạo cụm (neurosphere): Bàn luận về việc nuôi cấy đơn lớp trên chất nền Laminin giúp tế bào tiếp xúc đồng đều với các yếu tố tăng trưởng bFGF/EGF, tạo điều kiện thuận lợi cho việc theo dõi động học biệt hóa và định lượng tế bào TH dương tính.
• Thực trạng và thách thức trên phôi người: Phân tích những thuận lợi và khó khăn khi thu thập mẫu phôi người từ thủ thuật giảm thiểu thai (yêu cầu thời gian vận chuyển $\le 8$ giờ, điều kiện vô trùng, tính pháp lý và đạo đức sinh học). Kết quả bước đầu tạo được nơron biểu hiện TH từ phôi người 6,5–7,5 tuần tuổi phù hợp với các mô tả phát triển phôi học kinh điển.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn

1. Xác định mốc phôi học tối ưu: Xác định được giai đoạn phôi E12,5 – E13,5 ở chuột cống trắng là thời điểm thích hợp nhất về mặt cấu trúc vi thể và tiềm năng sinh học để phân lập tế bào gốc ngoại bì thần kinh sàn não giữa tạo nơron tiết dopamin.
2. Chuẩn hóa quy trình kỹ thuật trên mô hình động vật: Xây dựng hoàn chỉnh quy trình gồm các bước: phẫu tích vi phẫu định vị sàn não giữa, phân tách tế bào bằng enzyme kết hợp cơ học, nuôi cấy tăng sinh đơn lớp với hệ bổ sung bFGF/EGF trên chất nền Poly-L-Lysine/Laminin, và bảo quản lạnh bằng DMSO (7–10%) duy trì được tỷ lệ sống và khả năng biệt hóa sau rã đông.
3. Thực hiện thành công bước đầu trên mô phôi người: Thu thập, phân lập và nuôi cấy thành công tế bào gốc ngoại bì thần kinh từ biểu mô ống thần kinh phôi người 6,0 – 8,0 tuần tuổi thu nhận từ can thiệp giảm thiểu thai; chứng minh tế bào nuôi cấy có khả năng tăng sinh và biệt hóa thành tế bào dạng nơron biểu hiện marker Tyrosine Hydroxylase (TH).

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Tiếp tục tối ưu hóa môi trường biệt hóa in vitro bằng cách bổ sung phối hợp các yếu tố định hướng chuyên biệt như Sonic Hedgehog (Shh), FGF8 hoặc FGF20 nhằm nâng cao hơn nữa tỷ lệ tế bào biểu hiện TH và DAT.
• Ứng dụng quy trình bảo quản lạnh chuẩn hóa để xây dựng ngân hàng tế bào gốc thần kinh phục vụ các nghiên cứu tiền lâm sàng.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Đặc điểm nguồn mẫu phôi người: Số lượng mẫu phôi người phụ thuộc vào các ca lâm sàng giảm thiểu thai trong hỗ trợ sinh sản; thời gian từ lúc thu thập đến khi xử lý tại labo (tối đa 8 giờ) có thể ảnh hưởng phần nào đến độ sống tối ưu của tế bào so với xử lý tức thì.
• Phạm vi đánh giá chức năng: Nghiên cứu chủ yếu tập trung vào đặc điểm hình thái vi thể, siêu vi và biểu hiện kháng nguyên đặc hiệu (Vimentin, TH) bằng hóa mô miễn dịch in vitro; chưa thực hiện đo nồng độ dopamin chế tiết trực tiếp qua sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hoặc điện sinh lý tế bào (patch-clamp).
• Môi trường bảo quản lạnh: Vẫn sử dụng huyết thanh và chất bảo quản thẩm thấu DMSO truyền thống, chưa thay thế hoàn toàn bằng các môi trường bảo quản không chứa thành phần động vật (xeno-free) dùng cho lâm sàng.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Thực hiện cấy ghép dịch treo tế bào sau biệt hóa vào thể vân của chuột mô hình bệnh Parkinson (gây tổn thương bằng 6-OHDA) để đánh giá khả năng sống, mức độ tích hợp mô, sự di cư và khả năng phục hồi chức năng vận động in vivo.
• Nghiên cứu quy trình tinh sạch quần thể tế bào thần kinh tiết dopamin trước ghép bằng kỹ thuật phân tách tế bào dòng chảy huỳnh quang (FACS) hoặc từ tính (MACS).

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo trong các lĩnh vực:

• Nghiên cứu sinh và học viên sau đại học ngành Khoa học y sinh, Mô phôi thai học: Cung cấp quy trình chi tiết về phẫu tích vi phẫu vùng não phôi động vật và phôi người, phương pháp nuôi cấy tế bào gốc thần kinh đơn lớp và kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch kép.
• Các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực Y học tái tạo và Thần kinh học: Cung cấp số liệu thực nghiệm về động học phát triển của các nơron tiết dopamin, các hệ thống marker phân tử đánh giá từng giai đoạn biệt hóa (từ tế bào gốc Nestin+, Vimentin+ đến nơron TH+, DAT+).
• Phòng xét nghiệm và labo công nghệ sinh học y học: Tham khảo quy trình bảo quản lạnh tế bào thần kinh, kỹ thuật xử lý mô phôi và kiểm soát vi môi trường nuôi cấy.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao giai đoạn phôi chuột E12,5 – E13,5 lại được lựa chọn là thời điểm tối ưu để phân lập tế bào gốc sàn não giữa?

Giai đoạn E12,5 – E13,5 là thời điểm các tế bào đầu dòng và tiền thân tiết dopamin (mDA) tập trung với mật độ cao tại vùng sàn não giữa và đang trong quá trình chuẩn bị biệt hóa tích cực. Trước giai đoạn này (E10,5), các tế bào biểu mô thần kinh chưa được định hướng đầy đủ; sau giai đoạn này (từ E14,5 trở đi), mô não đã phát triển nhiều nhánh bào tương và liên kết mô chặt chẽ, khiến việc phân tách cơ học - enzyme dễ làm tổn thương tế bào và làm giảm tỷ lệ sống khi nuôi cấy.

2. Hai yếu tố tăng trưởng chính được sử dụng trong môi trường nuôi cấy của luận án là gì và có vai trò như thế nào?

Hai yếu tố tăng trưởng chính là bFGF (yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi cơ bản) và EGF (yếu tố tăng trưởng biểu mô), đều được sử dụng ở nồng độ 20 ng/ml. bFGF có vai trò kích thích sự tăng sinh của tế bào gốc thần kinh và làm chậm quá trình biệt hóa sớm, giúp gia tăng số lượng tế bào thu được. EGF hỗ trợ tăng sinh và duy trì khả năng sống của tế bào gốc trong các giai đoạn phân chia in vitro.

3. Phương pháp nào được sử dụng để định danh tế bào dạng tiết dopamin sau nuôi cấy?

Tế bào dạng tiết dopamin được định danh thông qua:

• Hình thái học: Quan sát hình thái nơron đa cực với thân tế bào tròn hoặc đa diện, nhân lớn và các sợi nhánh dài vươn ra tạo liên kết mạng lưới dưới kính hiển vi quang học và hiển vi điện tử (TEM).
• Hóa mô miễn dịch (HMMD): Xác định sự hiện diện của enzyme Tyrosine Hydroxylase (TH) – enzyme đặc hiệu xúc tác quá trình chuyển hóa L-tyrosine thành L-DOPA trong chu trình sinh tổng hợp dopamin.

4. Mẫu phôi người sử dụng trong nghiên cứu được thu thập từ nguồn nào và xử lý ra sao?

Mẫu phôi người (tuổi thai 6,0 – 8,0 tuần) được thu thập từ các trường hợp giảm thiểu thai ở thai phụ mang đa thai thông qua các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (IUI/IVF), được sự đồng ý của người bệnh và sàng lọc âm tính với HIV, viêm gan B, giang mai. Mẫu sau khi thu thập được bảo quản trong dung dịch HBSS ở 4℃ và chuyển về labo xử lý phân lập trong vòng 8 giờ.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Phúc Hoàn đã thiết lập thành công quy trình thực nghiệm phân lập, nuôi cấy tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc ngoại bì thần kinh phôi chuột cống trắng (tối ưu ở giai đoạn E12,5 – E13,5) thành tế bào dạng nơron tiết dopamin dương tính với marker Tyrosine Hydroxylase, đồng thời xây dựng được quy trình bảo quản lạnh tế bào bằng dung dịch DMSO giữ được tỷ lệ sống cao. Công trình cũng đã bước đầu ứng dụng thành công quy trình phân lập và nuôi cấy trên mô ống thần kinh phôi người giai đoạn 6,0 – 8,0 tuần tuổi, tạo ra quần thể tế bào có biểu hiện marker TH in vitro. Đây là công trình thực nghiệm cung cấp cơ sở phương pháp học quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo về liệu pháp tế bào trong điều trị bệnh lý thoái hóa thần kinh Parkinson.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Đặc điểm tế bào gốc thần kinh Tế bào gốc thần kinh được Atlman và cộng sự mô tả lần đầu tiên năm 1962. Rất nhiều nguồn gốc tế bào khác nhau đã được sử dụng để tạo nơron tiết dopamin, đầu tiên có thể kể đến như: tế bào gốc trung mô phân lập từ tủy xương hay tế bào vùng hành khứu ở vỏ não. Tuy nhiên những dòng tế bào này khá hạn chế trong việc tạo thành các nơron tiết dopamin trên thực nghiệm.

Vì vậy ngày nay, các nhà khoa học thường tập trung vào một số dòng tế bào khác có tiềm năng lớn hơn tạo nơron tiết dopamin như: tế bào gốc não giữa phôi, tế bào gốc phôi giai đoạn sớm (khối tế bào nội phôi của phôi nang), tế bào gốc vạn năng cảm ứng (iPSCs) (Hình 1. Các nguồn tế bào khác nhau trong điều trị bệnh Parkinson [6] Mọi loại tế bào gốc thần kinh đều có ích trong nghiên cứu y học, nhưng mỗi dòng tế bào lại có triển vọng phát triển cũng như giới hạn riêng. Nếu như tế bào gốc thần kinh ở phôi và thai đóng vai trò quan trọng trong hình thành LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 4 các cấu trúc thần kinh thì tế bào gốc thần kinh ở cơ thể trưởng thành lại có nhiệm vụ chính như một hệ thống tái tạo, sửa chữa mô, tạo ra các tế bào có chức năng thay thế cho các tế bào bị thiếu hụt sinh lý cũng như bệnh lý ở các mô biệt hóa. Khi nghiên cứu về tế bào gốc, có ba khái niệm cần phải phân biệt rõ đó là thuật ngữ “tế bào gốc” (Stem cell), “tế bào đầu dòng” (progenitor cell) và “tế bào tiền thân” (precursor cell).

Về cơ bản, trong mô thần kinh, tế bào gốc thần kinh phải đáp ứng được ba đặc tính: Khả năng tự đổi mới (self-renewal); Khả năng biệt hóa thành ba dòng tế bào thần kinh (nơron, tế bào ít nhánh và tế bào sao) và cuối cùng là khả năng tái tạo mô thần kinh. Khi một tế bào bị hạn chế khả năng tự đổi mới và đã cam kết số phận biệt hóa cụ thể, chúng trở thành các tế bào đầu dòng (progenitor cell), trong khi đó thuật ngữ “tiền thân” là chỉ những tế bào ở giai đoạn trung gian của quá trình phát triển.  Tế bào gốc thần kinh là những tế bào chưa biệt hóa Một trong những đặc tính căn bản của tế bào gốc là không có cấu trúc đặc hiệu mô. Đây là những cấu trúc mà đó tế bào có thể thực hiện các chức năng chuyên biệt.

Tế bào gốc thần kinh là những tế bào chưa phát triển những cấu trúc giúp cho việc dẫn truyền xung động thần kinh như hệ thống ống siêu vi vận chuyển hóa chất trung gian hóa học, các synap…[7].  Tế bào gốc thần kinh có thể tự tái tạo Cũng giống như các tế bào gốc khác, tế bào gốc thần kinh có khả năng tăng sinh bằng cách gián phân và tự đổi mới (self-renewal) mà vẫn giữ được đặc tính không biệt hóa trong suốt quá trình tồn tại của mô, cơ thể. Quá trình tự làm mới có thể thông qua cả hai cách phân chia đối xứng và phân chia bất đối xứng. Nếu như phân chia đối xứng tạo ra hai tế bào gốc, điều này giúp làm tăng quần thể tế bào gốc thì phân chia bất đối xứng tạo ra 1 tế bào bắt đầu LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 5 quá trình biệt hóa đồng thời tạo ra một tế bào vẫn giữ nguyên tính gốc như ban đầu.

Quá trình này rất quan trọng giúp duy trì quần thể tế bào gốc thần kinh tồn tại trong suốt đời sống cá thể.  Tế bào gốc thần kinh có khả năng biệt hóa Quá trình tế bào gốc chuyển thành các tế bào có chức năng riêng biệt được gọi là quá trình biệt hóa. Quá trình này xảy ra khi tế bào gốc nhận được các tín hiệu từ bên trong và bên ngoài tế bào, đáp ứng với các tín hiệu này. Các tế bào gốc thần kinh có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau thông qua kích thích của môi trường nội và ngoại sinh [8].

Chúng phân chia tế bào bất đối xứng, một biệt hóa, một vẫn giữ tính gốc của nó. Tế bào gốc thần kinh chủ yếu biệt hóa thành các nơron, tế bào hình sao và tế bào ít nhánh. Quá trình hình thành và biệt hóa nơron tiết dopamin in vivo Trong quá trình phát triển phôi vị, khi máng thần kinh mới khép, thành ống thần kinh là biểu mô gồm một hàng tế bào gọi là biểu mô thần kinh. Không giống những vùng khác có sự tăng sinh và biến đổi phức tạp, não giữa phát triển đơn giản.

Thành não chỉ dày lên do sự tăng sinh mạnh các tế bào biểu mô này. Ban đầu, thành ống có dạng biểu mô trụ giả tầng. Bào tương tế bào trải khắp chiều dầy thành ống và nhân tế bào ở các mức độ cao thấp khác nhau. Những nhân tế bào đang phân chia nằm ở lớp sâu trong thành ống tạo thành lớp sinh sản.

Những tế bào đã hoàn thành sự phân chia di cư ra vùng ngoại vi của thành ống nông hơn, xếp thành từng tầng, cao thấp không đều để tiếp tục phân chia. Một số tế bào vẫn ở lại lớp sinh sản duy trì tính gốc của nó (Hình 1.2) Sau khi não giữa được hình thành, các tế bào ở sàn não giữa tăng sinh và phân lớp tạo thành 3 lớp: lớp nội tủy, lớp áo và lớp màn rìa. Một số tế bào ở lớp nội tủy vẫn còn giữ tính gốc của tế bào thần kinh trong khi hầu hết các tế bào sẽ di chuyển ra khỏi vùng sinh sản, ngừng phân chia tế bào và bắt đầu quá trình biệt hóa. Các tế bào đầu dòng của não giữa nhờ các tín hiệu (yếu tố LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 6 phiên mã và yếu tố chế tiết) sẽ tiếp tục được định hướng để biệt hóa thành các dòng tế bào khác nhau.

Sự tăng sinh tế bào ở ống thần kinh [9] A: Biểu mô thần kinh; B: Tăng sinh tế bào của biểu mô thần kinh I: Lớp nội tủy II: Lớp áo 1- Nguyên bào thần kinh; 2- Nguyên bào xốp thần kinh; 3- Nhánh bào tương của tế bào xuyên tâm. Các tế bào đầu dòng tiết dopamin ở não giữa cũng tập trung chủ yếu ở vùng sinh sản, những tế bào này biểu hiện Lmx1a, Lmx1b, Foxa2, Msx1/2, Ngn2 và ở giai đoạn sớm là Shh. Ở giai đoạn này, các tế bào đầu dòng mDA sẽ phát triển theo hướng chuyên biệt, phân chia và bắt đầu những bước cuối cùng của quá trình biệt hóa xảy ra ở kì sau của tế bào. Sau đó các tế bào đầu dòng tiết dopamin tiếp tục biệt hóa trở thành các tế bào tiết dopamin chưa trưởng thành (immature dopaminergic neurons).

Các tế bào mDA bắt đầu xuất hiện trong khoảng E10.5 ở chuột, trong khi ở người chúng bắt đầu xuất hiện vào tuần thứ 5 – 6 sau thụ thai, đạt cao nhất ở tuần 6 – 8 và dừng ở tuần 10 – 11 [10]. Các nguyên bào thần kinh của nơron dopamin bắt đầu rời khỏi vùng sinh sản dọc theo các nhánh của tế bào thần kinh xuyên tâm để xâm nhập vào vùng trung gian (lớp áo). Trong suốt quá LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 7 trình di cư từ lớp nội tủy ra bề mặt lồi của não giữa các nguyên bào thần kinh tiết dopamin tiếp tục biệt hóa để trở thành các tế bào mDA trưởng thành. Ngoài việc bắt đầu biểu hiện các gen mới trong suốt quá trình di cư và biệt hóa chúng tiếp tục duy trì biểu hiện các gen mà có vai trò quan trọng trong quá trình biệt hóa như Foxa1/2, Lmx1a/b, En1/2.

Các lớp của lá đáy não giữa và sự biểu hiện các gen liên quan đến sự phát triển của tế bào mDA. Lá đáy não giữa gồm 3 lớp: Lớp sinh sản (nơi có các tế bào đầu dòng mDA), lớp trung gian (các tế bào mDA chưa trưởng thành di cư qua) và lớp áo (nơi các tế bào mDA trưởng thành biểu hiện các gen liên quan đến sinh tổng hợp dopamine) [11]. Nói tóm lại, quá trình hình thành và phát triển của tế bào tiết dopamin được bắt đầu từ khoảng ngày thứ 8 ở chuột và tuần thứ 5 sau thụ tinh ở người. Các tế bào xuất hiện ban đầu ở vùng sàn não giữa, sau đó trải qua hàng loạt các bước phát triển và biệt hóa để di cư đến những vị trí nhất định: liềm đen, vùng dưới đồi, hành khứu, võng mạc.

Những kiến thức về lĩnh vực này đã tăng đáng kể trong những năm gần đây. Chính những hiểu biết này đã giúp LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 8 ích rất nhiều cho việc ứng dụng trong việc tìm kiếm những dòng tế bào tối ưu phục vụ điều trị bệnh Parkinson. Tế bào gốc não giữa và nơron tiết dopamin: ứng dụng trong điều trị Những hiểu biết về quá trình phát triển và biệt hóa của nơron tiết dopamin đã giúp các nhà khoa học định khu được vị trí của các tế bào gốc tiết dopamin. Do đó mô sàn não giữa ngoại bì ống thần kinh phôi là một trong những loại mô đầu tiên được các tác giả sử dụng vì tại đây có các tế bào tiết dopamin cũng như các tế bào đầu dòng đã được định hướng để biệt hóa thành nơron tiết dopamin.

Năm 1979, tác giả Perlow và cộng sự đã tiến hành ghép những mảnh mô sàn não giữa phôi chuột vào thể vân chuột đã được gây Parkinson bằng 6- OHDA. Kết quả cho thấy sự cải thiện về triệu chứng lâm sàng của chuột sau ghép 1 tháng. Bằng chứng là có 5/29 chuột giảm 70% số vòng quay so với nhóm chứng [12]. Tuy có được thành công bước đầu như vậy xong kỹ thuật ghép mảnh mô chứa tế bào gốc vào não bộc lộ nhiều hạn chế như: tỷ lệ động vật sống sau ghép thấp; tỷ lệ cải thiện triệu chứng ở các lô nghiên cứu không đồng nhất hay chỉ ghép được ở một vài vị trí nhất định trong mô não.

Những hạn chế này có thể liên quan tới việc kém nuôi dưỡng vì các tế bào trong mô ghép ít được tiếp xúc với mạch máu cũng như dịch não tủy hoặc do hạn chế phát triển các sợi trục của tế bào ra những vùng xung quanh [13]. Đến những năm 1980, thay vì sử dụng mảnh nhỏ mô sàn não giữa để ghép vào thể vân, nhóm tác giả Bjorklund và cộng sự đã sử dụng dạng dịch treo tế bào gốc sàn não giữa để tiêm vào thể vân. Khoảng 10 mảnh mô 2mm2 được các tác giả ủ trong enzym trypsin 0,1%; 30 phút ở nhiệt độ phòng.