Tổng quan luận án

Đái tháo đường, đặc biệt là đái tháo đường type 1, là bệnh lý đặc trưng bởi sự tổn thương hoặc suy giảm chức năng của các tế bào beta đảo tụy, dẫn đến tình trạng thiếu hụt insulin và rối loạn chuyển hóa glucose mạn tính. Mặc dù các phương pháp điều trị truyền thống như tiêm insulin ngoại sinh hoặc sử dụng thuốc hạ đường huyết có thể hỗ trợ kiểm soát đường huyết, chúng không thể phục hồi được khối lượng tế bào beta đã bị phá hủy. Liệu pháp tế bào nhằm thay thế và bổ sung tế bào beta tiết insulin được xem là hướng tiếp cận phục hồi chức năng nguyên căn. Tuy nhiên, việc sử dụng tế bào gốc phôi (ESCs) gặp phải rào cản đạo đức và nguy cơ sinh u, trong khi nguồn tế bào gốc trưởng thành từ tủy xương hay mô mỡ có hạn chế về số lượng và khả năng tăng sinh.

Màng ối người là một thành phần phụ sau sinh thường bị loại bỏ như rác thải sinh học. Các nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng tế bào có nguồn gốc từ màng ối (bao gồm tế bào biểu mô màng ối - HAE và tế bào trung mô màng ối - HAM) sở hữu nhiều đặc tính sinh học phù hợp cho y học tái tạo: tính vạn năng/đa tiềm năng (biểu hiện các dấu ấn phôi như Oct-4, Nanog), tính chống viêm, tính sinh miễn dịch thấp (biểu hiện HLA-G, không biểu hiện hoặc biểu hiện thấp các kháng nguyên hòa hợp mô lớp II), không gây hình thành khối u khi cấy ghép và không vướng phải các vấn đề tranh cãi về đạo đức. Tại Việt Nam vào thời điểm thực hiện nghiên cứu, các ứng dụng tế bào gốc chủ yếu tập trung vào nguồn tủy xương và máu cuống rốn; việc nghiên cứu một cách có hệ thống về hình thái cấu trúc màng ối và xây dựng quy trình phân lập, nuôi cấy, bảo quản cũng như định hướng biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào tiết insulin vẫn còn là khoảng trống cần được khảo sát thực nghiệm.

Luận án tiến sĩ y học của nghiên cứu sinh Nguyễn Bảo Trân, chuyên ngành Giải phẫu người (Mã số: 62 72 01 04), thực hiện tại Học viện Quân y năm 2018 dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Trần Ngọc Anh và PGS.TS. Phạm Văn Trân, được triển khai trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu khoa học cấp Nhà nước "Hợp tác nghiên cứu quy trình sản xuất một số chế phẩm sinh học từ tế bào gốc màng ối".

Luận án xác định 2 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Mô tả đặc điểm cấu trúc vi thể, siêu vi thể màng ối và tế bào gốc màng ối người.
  2. Phân lập, nuôi cấy và bước đầu đánh giá khả năng biệt hóa tế bào gốc màng ối người thành tế bào giống tế bào beta tụy nội tiết.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng: Màng ối người thu nhận từ các sản phụ mổ đẻ trên 18 tuổi, thai đủ tháng (> 37 tuần), nước ối bình thường tại Bệnh viện 103 - Học viện Quân y.
  • Cỡ mẫu và phạm vi thực nghiệm:
    • 30 mẫu màng ối làm tiêu bản mô học nhuộm Hematoxylin - Eosin (HE).
    • 10 mẫu màng ối quan sát hình thái siêu vi thể dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM).
    • 05 mẫu màng ối quan sát cấu trúc siêu vi thể dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM).
    • 10 mẫu màng ối tiến hành phân lập, nuôi cấy tăng sinh và thử nghiệm quy trình bảo quản đông lạnh.
    • Các mẫu tế bào gốc phân lập được dùng để đánh giá dấu ấn Oct-4 bằng hóa mô miễn dịch và định hướng biệt hóa thành tế bào giống tế bào beta tụy nội tiết.
  • Không gian và thời gian: Nghiên cứu thực hiện tại Học viện Quân y, Hà Nội, hoàn thành và nghiệm thu năm 2018.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án hệ thống hóa các tài liệu khoa học trong nước và quốc tế liên quan đến nguồn gốc phôi học, cấu trúc mô học, các đặc tính sinh học của màng ối, cũng như các thành tựu ứng dụng tế bào gốc trong điều trị đái tháo đường:

  • Nguồn gốc phôi thai và cấu trúc giải phẫu của màng ối:

    • Theo tài liệu phôi thai học của Đỗ Kính (2000), màng ối xuất phát từ lá phôi ngoài (ngoại bì phôi) của khối nội bào vào khoảng ngày thứ 8 sau thụ tinh. Khi phôi khép mình, khoang ối bao bọc toàn bộ phôi và màng ối phát triển áp sát vào màng đệm.
    • Về mặt giải phẫu vi thể, theo mô tả của Parry và cộng sự (chích dẫn từ nghiên cứu kinh điển), màng ối gồm 3 lớp chính: lớp biểu mô đơn (single epithelial layer), màng đáy dày (basement membrane) và lớp trung mô vô mạch (avascular mesenchyme). Màng ối không chứa mạch máu, thần kinh hay mạch bạch huyết, dinh dưỡng được thẩm thấu qua dịch ối và tuần hoàn thai.
    • Vùng rìa màng ối cách cuống rốn khoảng 10 cm chứa lớp biểu mô vuông đơn, có tính đàn hồi cao, thường được dùng để sản xuất màng ối đông khô ứng dụng trong nhãn khoa và điều trị bỏng.

  • Đặc tính sinh học của tế bào màng ối:

    • Tính vạn năng (Pluripotency): Miki và cộng sự (2005), Ilancheran và cộng sự (2007) ghi nhận tế bào biểu mô màng ối (HAE) và tế bào trung mô màng ối (HAM) biểu hiện các yếu tố phiên mã đặc trưng của tế bào gốc phôi như Oct-4, Nanog, GATA-4, HNF-3β và Nestin.
    • Tính chống viêm và ức chế miễn dịch: Hao và cộng sự ghi nhận tế bào màng ối biểu hiện các yếu tố kháng viêm như thụ thể đối kháng IL-1, các chất ức chế metalloproteinase mô (TIMP-1, -2, -3, -4) và IL-10. Phân tích của Akle và CS, Kubo và CS, Wang và CS chỉ ra rằng màng ối biểu hiện kháng nguyên không phân lớp HLA-G (class Ib), Fas ligand (FasL), TRAIL, TGF-β, giúp ức chế sự hoạt hóa của đại thực bào, bạch cầu đa nhân, lympho T và B, làm giảm hiện tượng thải ghép dị loại.
    • Độ an toàn sinh học: Các công trình của Akle và CS (1981), Robinson và CS (2002) cho thấy ghép tế bào màng ối không tạo khối u quái (teratoma) như tế bào gốc phôi.

  • Tiềm năng biệt hóa đa dòng:

    • Biệt hóa hướng thần kinh: Sakuragawa và CS, Yan và CS ghi nhận tế bào màng ối sản xuất acetylcholine, dopamine, GDNF, có khả năng biệt hóa thành tế bào giống neuron và tế bào thần kinh đệm.
    • Biệt hóa hướng gan: Marongiu và CS ghi nhận tế bào HAE biểu hiện albumin, α1-antitrypsin, cytokeratin 18, tyrosine aminotransferase (TAT) và cytochrome P450 khi nuôi cấy trong môi trường nền ngoại bào gan (L-ECM).
    • Biệt hóa hướng cơ tim: Zhao và CS, Kehat và CS xác định sự biểu hiện của GATA-4, Nkx2.5, α-MHC, cTnI, cTnT ở tế bào HAM khi có mặt của activin A hoặc FGF.
    • Biệt hóa hướng sụn: Nghiên cứu của Moriguchi và CS chứng minh tế bào HAM biểu hiện Sox-9, collagen type II, aggrecan khi kích thích bằng BMP-2.

  • Ứng dụng tế bào gốc trong điều trị đái tháo đường:

    • Các nghiên cứu của Zhou và CS, Noguchi và CS chỉ ra vai trò của các yếu tố phiên mã Pdx-1, Ngn3, MafA trong việc tái lập chương trình biệt hóa tế bào gốc thành tế bào tiết insulin.
    • Nghiên cứu của Wei và CS (2003), Kim và CS (2007) cho thấy việc cấy ghép tế bào HAE biệt hóa có thể kiểm soát và hạ đường huyết trên mô hình động vật thí nghiệm bị gây đái tháo đường bằng streptozotocin (STZ).

  • Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và vị trí của luận án:

    • Tại Việt Nam, liệu pháp tế bào gốc tạo máu đã được thực hiện tại Bệnh viện Truyền máu - Huyết học TP.HCM (1995), Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, Bệnh viện TW Huế (2004), Bệnh viện TWQĐ 108 (2004), Bệnh viện Việt Đức (2007). Viện Bỏng Quốc gia nghiên cứu nuôi cấy nguyên bào sợi và tế bào biểu bì; Đại học Y Hà Nội nghiên cứu tấm màng ối làm giá thể nuôi cấy tế bào gốc rìa giác mạc; Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM khảo sát biệt hóa tế bào gốc máu cuống rốn thành tế bào tiết insulin.
    • Vị trí của luận án: Đây là công trình tại Việt Nam khảo sát đồng bộ từ hình thái cấu trúc vi thể (HE), siêu vi thể (SEM, TEM) của màng ối người theo các vùng giải phẫu (gần và xa cuống rốn), xây dựng quy trình phân lập bằng enzyme kết hợp cơ học, nuôi cấy, bảo quản đông lạnh và bước đầu tạo dẫn xuất tế bào có biểu hiện insulin định hướng điều trị đái tháo đường.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án kết hợp giữa phương pháp nghiên cứu mô tả hình thái học giải phẫu và phương pháp nghiên cứu thực nghiệm sinh học tế bào in vitro.

[Thu thập màng ối từ mổ đẻ (>37 tuần)]

1. Đối tượng và quy trình thu thập mẫu

  • Màng ối được lấy từ bánh rau của sản phụ mổ đẻ đủ tháng (> 37 tuần), không mắc các bệnh truyền nhiễm (HIV, viêm gan B, C, giang mai), nước ối trong.
  • Mẫu được thu nhận ngay sau sổ rau, đặt trong bình chứa dung dịch đệm phosphat (PBS) có bổ sung kháng sinh (penicillin, streptomycin), bảo quản ở 4°C không quá 4 giờ trước khi xử lý tại phòng thí nghiệm.
  • Bóc tách cơ học màng ối khỏi màng đệm trong buồng thao tác vô trùng, rửa sạch 4-6 lần bằng PBS vô khuẩn để loại bỏ máu đông.

2. Phương pháp nghiên cứu hình thái vi thể và siêu vi thể

Phương pháp Quy trình xử lý kỹ thuật Thiết bị và phân tích
Mô học vi thể (HE) - Cắt mảnh 1x1 cm; cố định trong Glutaraldehyde 2.5%
- Khử nước qua cồn, chuyển đúc khối parafin
- Cắt lát mỏng độ dày 5 µm bằng máy cắt lạnh
- Nhuộm Hematoxylin (nhân bắt màu xanh tím) và Eosin 1% (bào tương bắt màu đỏ hồng)		 - Kính hiển vi quang học Nikon (Nhật Bản)
- Phần mềm chụp ảnh ACT-1
- Đo đạc kích thước và đếm số lượng tế bào bằng Image Pro Plus
Kính hiển vi điện tử quét (SEM) - Cố định ban đầu bằng Glutaraldehyde 2.5% trong 12 giờ ở 4°C
- Rửa đệm cacodylat 0.3M; cố định bổ sung bằng Axit osmic (OsO4) 1% trong 4-6 giờ ở 4°C
- Khử nước qua dãy cồn tăng dần (50°, 70°, 80°, 90°, 95°, 100°)
- Làm khô tại điểm tới hạn (CO2 lỏng thay thế isoamyl acetate)
- Gắn đế carbon, mạ phủ vàng		 - Máy mạ phủ mẫu JFC-1200 (JEOL)
- Kính hiển vi điện tử quét JSM-5410LV (JEOL - Nhật Bản)
Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) - Cắt mảnh mô kích thước 1x1x1 mm
- Cố định kép: Glutaraldehyde 2.5% (2 giờ) và Axit osmic 1% trong đệm cacodylat 0.3M (2 giờ)
- Khử nước bằng cồn, chuyển propylene oxide
- Đúc khối bằng chất đúc Epoxy (ủ nhiệt độ 35°C, 45°C và 60°C trong 24 giờ mỗi nấc)
- Cắt siêu mỏng (độ dày 50-90 nm) bằng máy cắt siêu mỏng (ultramicrotome)
- Vớt lát cắt lên lưới đồng 200 mesh có màng formvar
- Nhuộm đối quang bằng Uranyl acetate và Chì citrate (Lead citrate)		 - Kính hiển vi điện tử truyền qua JEM-1400 (JEOL - Nhật Bản)

3. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch xác định tính gốc

  • Cắt lát mô màng ối từ khối parafin, khử parafin bằng xylen và cồn.
  • Ức chế peroxidase nội bào bằng dung dịch H2O2 0.03% trong 20 phút.
  • Ủ với kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng Oct-3/4 trong 1 giờ; rửa bằng PBS.
  • Ủ với kháng thể thứ hai có gắn Biotin trong 1 giờ; ủ tiếp với phức hợp Streptavidin - Peroxidase trong 20 phút.
  • Hiện màu bằng cơ chất DAB (3,3'-diaminobenzidine), nhuộm nhân đối kháng bằng Hematoxylin. Mẫu dương tính biểu hiện màu vàng nâu tại vị trí có kháng nguyên.

4. Quy trình phân lập, nuôi cấy, bảo quản và định hướng biệt hóa tế bào

  • Phân lập tế bào: Áp dụng phương pháp phân cắt enzyme của Miki và cộng sự có cải tiến:
    • Chọn phần màng ối vùng trung tâm gần cuống rốn, cắt nhỏ thành các mảnh khoảng 1 cm².
    • Rửa sạch, ủ sơ bộ trong Trypsin 0.25% (Sigma) 5 phút ở 37°C.
    • Chuyển sang dung dịch Trypsin 0.25% mới, ủ 30-60 phút ở 37°C kết hợp lắc cơ học 20 dao động/phút.
    • Lọc huyền dịch qua màng lọc tế bào, ly tâm 1200 vòng/phút trong 5 phút để thu cặn tế bào.
    • Tinh sạch tế bào qua thang tỷ trọng phân tầng Percoll 40.8% và 50.8% (Sigma), thu lớp tế bào nằm ở phân lớp thứ 3 từ đáy ống nghiệm.
  • Nuôi cấy tăng sinh: Nuôi cấy trong môi trường DMEM bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (FBS), 50 U/ml penicillin, 50 µg/ml streptomycin, 2x10⁻³ M L-glutamin ở 37°C, 5% CO2. Cấy chuyển tế bào khi đạt độ che phủ 60-80% bề mặt đáy đĩa bằng Trypsin/EDTA 0.25%.
  • Bảo quản tế bào: Huyền phù tế bào sau thu hoạch đạt nồng độ 10⁶ tế bào/ml trong môi trường DMEM chứa 10% Dimethyl Sulfoxide (DMSO). Tiến hành hạ nhiệt độ theo chương trình: giữ ở -80°C trước khi chuyển lưu trữ lâu dài trong bình nitơ lỏng (-196°C). Kiểm tra tỷ lệ sống sau rã đông bằng phương pháp nhuộm loại trừ Trypan blue 0.4%.
  • Định hướng biệt hóa tế bào: Nuôi cấy tế bào gốc trong môi trường cảm ứng biệt hóa đảo tụy, đánh giá sự biểu hiện của mARN và protein Insulin (Biểu đồ 3.1).

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Chương 1 trình bày chi tiết về cấu trúc giải phẫu học và phôi thai học của màng ối; phân tích các cơ chế tế bào học liên quan đến tính vạn tiềm năng và tính mềm dẻo của các tế bào HAE và HAM. Tác giả phân tích cơ sở miễn dịch học giúp màng ối không bị cơ thể mẹ đào thải (sự hiện diện của HLA-G, FasL, TGF-β) và cơ chế chống viêm, chống sẹo thông qua ức chế con đường tín hiệu TGF-β của nguyên bào sợi cơ. Ngoài ra, chương này tổng quan các nghiên cứu quốc tế về khả năng biệt hóa của tế bào gốc màng ối thành tế bào thần kinh, biểu bì da, tế bào gan, cơ tim, sụn và đặc biệt là tế bào tiết insulin; đồng thời cập nhật bức tranh toàn cảnh về thực trạng nghiên cứu, lưu trữ và ứng dụng tế bào gốc tại các bệnh viện, viện nghiên cứu lớn tại Việt Nam.

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết toàn bộ quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa:

  • Quy chuẩn chọn mẫu màng ối vô khuẩn từ 30 sản phụ đẻ mổ tại Bệnh viện 103.
  • Các bước kỹ thuật cố định mẫu, cắt lát và nhuộm tiêu bản mô học HE phục vụ đo đạc trên kính hiển vi quang học Nikon và phần mềm Image Pro Plus.
  • Quy trình cố định kép, làm khô điểm tới hạn và mạ vàng để phân tích bề mặt trên kính hiển vi điện tử quét SEM (JSM-5410LV).
  • Kỹ thuật cắt siêu mỏng (50-90 nm), đúc khối epoxy và nhuộm uranyl acetate/lead citrate trên kính hiển vi điện tử truyền qua TEM (JEM-1400).
  • Quy trình phản ứng hóa mô miễn dịch xác định dấu ấn Oct-3/4.
  • Phương pháp phân tách enzyme Trypsin 0.25%, phân tầng mật độ Percoll 40.8% - 50.8%, công thức môi trường nuôi cấy DMEM + 10% FBS, kỹ thuật bảo quản lạnh trong dung dịch DMSO 10% và phương pháp định lượng sống còn bằng Trypan blue.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Chương 3 công bố các dữ liệu thực nghiệm thu được từ nghiên cứu hình thái và tế bào:

1. Đặc điểm cấu trúc vi thể và siêu vi thể của màng ối

  • Hình thái vi thể trên tiêu bản nhuộm HE:
    • Màng ối gồm lớp biểu mô đơn tựa trên màng đáy và lớp mô liên kết trung mô vô mạch phía dưới.
    • Độ dày của màng ối có sự khác biệt rõ rệt theo vị trí giải phẫu: vùng gần cuống rốn có độ dày màng ối, độ dày lớp biểu mô và lớp trung mô lớn hơn so với vùng xa cuống rốn (Bảng 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5).
    • Số lượng tế bào biểu mô và tế bào trung mô phân bố tại vùng gần cuống rốn cao hơn có ý nghĩa so với vùng ngoại vi xa cuống rốn (Bảng 3.6, 3.7, 3.8). Lớp biểu mô ở một số vị trí xuất hiện dạng biểu mô nhiều hàng tế bào (Hình 3.6).
  • Hình thái siêu vi thể dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM):
    • Bề mặt biểu mô màng ối có sự đa dạng về dạng sắp xếp tế bào: luận án phân loại thành 4 mô hình sắp xếp tế bào biểu mô (Hình 3.7, 3.8, 3.9, 3.10) và ghi nhận một số hình thái tế bào bề mặt khác thường (Hình 3.11).
    • Quan sát thấy các vi nhung mao (microvilli) phân bố dày đặc trên bề mặt cực ngọn của tế bào biểu mô, các kênh gian bào mở rộng và hệ thống liên kết liên tế bào chặt chẽ (Hình 3.16).
  • Hình thái siêu vi thể dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM):
    • Tế bào biểu mô liên kết chặt chẽ với màng đáy thông qua các thể bán liên kết (hemidesmosomes) (Hình 3.13).
    • Giữa các tế bào biểu mô lân cận có các thể liên kết (desmosomes) và các phức hợp liên kết liên bào (Hình 3.14).
    • Ghi nhận sự tồn tại của hai nhóm tế bào biểu mô có đậm độ điện tử khác nhau (tế bào sáng và tế bào tối) (Hình 3.15). Lớp trung mô chứa các tế bào giống nguyên bào sợi phân bố trong mạng lưới sợi collagen (Hình 3.17, Bảng 3.9).
  • Đặc tính biểu hiện dấu ấn gốc Oct-3/4:
    • Tiêu bản nhuộm hóa mô miễn dịch cho thấy tế bào biểu mô màng ối bắt màu vàng nâu đặc hiệu với kháng thể kháng Oct-3/4 trong nhân tế bào, khẳng định sự hiện diện của dấu ấn tính vạn năng (Hình 3.18, 3.19, 3.20, 3.24).

2. Phân lập, nuôi cấy, bảo quản và biệt hóa tế bào gốc màng ối

  • Quy trình phân tách Trypsin và phân tầng Percoll thu được khối tế bào biểu mô màng ối có độ tinh sạch cao, tế bào bám dính tốt sau 24 giờ nuôi cấy (Hình 3.21, 3.22, 3.23).
  • Động học tăng sinh: Tế bào phân chia mạnh sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và đạt độ che phủ 60-80% sau 7-10 ngày (Hình 3.25, 3.26, 3.27, 3.28, 3.31).
  • Đánh giá khả năng bảo quản: Tế bào sau khi trữ đông trong DMSO 10% ở -80°C và nitơ lỏng phục hồi hình thái tốt sau 24 giờ rã đông (Hình 3.29), tỷ lệ tế bào sống xác định qua nhuộm Trypan blue đạt mức cao (Hình 3.30).
  • Khảo sát biệt hóa: Sau khi cảm ứng biệt hóa, các cụm tế bào biến đổi hình thái và bước đầu biểu hiện mARN (A) cũng như protein (B) của Insulin (Biểu đồ 3.1).

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN

Chương bàn luận phân tích và so sánh các phát hiện của tác giả với các tài liệu công bố trong nước và quốc tế:

  • So sánh các thông số độ dày của màng ối, độ dày lớp biểu mô và màng đáy giữa các tác giả (Bảng 4.1, 4.2).
  • So sánh số lượng, mật độ tế bào biểu mô và tế bào trung mô giữa vùng trung tâm và vùng ngoại vi với các công trình quốc tế (Bảng 4.3).
  • Luận giải cơ chế sinh học phân tử của việc phân bố tế bào gốc tập trung nhiều ở vùng quanh cuống rốn so với vùng rìa bánh rau.
  • Phân tích hiệu quả của kỹ thuật phân tách enzyme kết hợp gradient nồng độ Percoll trong việc thu hồi tế bào sống so với các kỹ thuật bóc tách cơ học đơn thuần.
  • Thảo luận về khả năng duy trì tính gốc của tế bào qua biểu hiện Oct-4 và triển vọng ứng dụng dẫn xuất tế bào giống beta tụy trong kiểm soát chuyển hóa glucose.

Kết quả và những đóng góp mới

  1. Về mặt lý luận và khoa học hình thái:

    • Cung cấp bộ số liệu hình thái học giải phẫu vi thể và siêu vi thể của màng ối người Việt Nam dựa trên sự kết hợp của kính hiển vi quang học (HE), kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM).
    • Xác định được sự khác biệt có ý nghĩa về độ dày mô học, số lượng và mật độ tế bào biểu mô, trung mô giữa hai vùng giải phẫu: vùng gần cuống rốn có mật độ tế bào và độ dày lớn hơn rõ rệt so với vùng xa cuống rốn.
    • Mô tả chi tiết 4 dạng mô hình cấu trúc sắp xếp của tế bào biểu mô trên bề mặt màng ối dưới kính hiển vi SEM; phát hiện đặc điểm siêu cấu trúc về hai loại tế bào có đậm độ điện tử khác nhau (tế bào sáng và tế bào tối) cũng như các cấu trúc liên kết thể desmosome, hemidesmosome dưới kính hiển vi TEM.
    • Xác định được sự biểu hiện của dấu ấn tế bào gốc vạn năng Oct-3/4 trên tế bào biểu mô màng ối người bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch.

  2. Về mặt thực tiễn và công nghệ sinh học y học:

    • Xây dựng thành công quy trình phân lập tế bào gốc biểu mô màng ối người bằng enzyme Trypsin 0.25% kết hợp phân tầng tỷ trọng Percoll (40.8% và 50.8%), đảm bảo thu được lượng tế bào có tỷ lệ sống cao.
    • Thiết lập quy trình nuôi cấy tăng sinh in vitro và quy trình bảo quản đông lạnh tế bào trong dung dịch DMSO 10% ở -80°C và nitơ lỏng, cho phép phục hồi tế bào sống sau rã đông.
    • Bước đầu định hướng biệt hóa thành công tế bào gốc màng ối người thành các cụm tế bào giống tế bào beta tụy nội tiết, có khả năng biểu hiện mARN và protein của Insulin.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của luận án:

    • Cỡ mẫu thực nghiệm siêu vi thể TEM (05 mẫu) và SEM (10 mẫu) ở mức vừa đủ để mô tả hình thái học định tính và bán định lượng.
    • Quá trình đánh giá sự biệt hóa thành tế bào giống beta tụy mới dừng lại ở bước đầu (in vitro) thông qua biểu hiện mARN và protein insulin, chưa tiến hành đánh giá đáp ứng tiết insulin động học dưới kích thích của các nồng độ glucose khác nhau (glucose-stimulated insulin secretion assay).
    • Chưa tiến hành thử nghiệm cấy ghép in vivo trên mô hình động vật thí nghiệm bị gây bệnh đái tháo đường để kiểm tra hiệu quả hạ đường huyết và khả năng tồn tại lâu dài của tế bào sau ghép.

  • Hướng nghiên cứu tiếp theo:

    • Nghiên cứu hoàn thiện quy trình biệt hóa chức năng đa bước để tạo ra tế bào beta tụy trưởng thành có khả năng tự điều tiết tiết insulin tương đương tế bào đảo tụy sinh lý.
    • Triển khai thử nghiệm ghép tế bào đã biệt hóa trên mô hình động vật đái tháo đường (chuột STZ) nhằm đánh giá khả năng kiểm soát đường huyết, tính an toàn miễn dịch và khả năng sinh u trong thời gian dài.
    • Mở rộng ứng dụng bảo quản và xây dựng ngân hàng tế bào gốc màng ối phục vụ ghép mô và kỹ thuật tạo tấm mô tái tạo trong điều trị bỏng, giác mạc và các bệnh lý suy chức năng cơ quan khác.

Giá trị tham khảo

  • Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học ngành Y - Dược: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình kỹ thuật chuẩn bị tiêu bản mô học vi thể, quy trình thao tác kính hiển vi điện tử quét (SEM) và truyền qua (TEM), cũng như các phương pháp phân lập tế bào bằng enzyme và ly tâm thang tỷ trọng Percoll.
  • Đối với các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ tế bào gốc và y học tái tạo: Cung cấp cơ sở dữ liệu về đặc tính giải phẫu, vị trí thu thập tế bào tối ưu trên màng ối (khu vực gần cuống rốn) và phương pháp đánh giá dấu ấn Oct-3/4.
  • Đối với các cơ sở y tế và ngân hàng sinh học: Cung cấp dữ liệu nền tảng phục vụ việc xây dựng quy trình thu gom, xử lý vô khuẩn, lưu trữ và bảo quản tế bào từ nguồn rác thải sinh học sau sinh (bánh rau và màng ối).

Câu hỏi thường gặp

1. Vị trí giải phẫu nào của màng ối có mật độ tế bào gốc cao nhất và thích hợp cho việc phân lập tế bào?
Kết quả khảo sát mô học và đo đếm tế bào trong luận án cho thấy vùng màng ối nằm gần cuống rốn (vùng trung tâm) có độ dày màng ối, độ dày lớp biểu mô và mật độ số lượng tế bào biểu mô, trung mô cao hơn đáng kể so với vùng ngoại vi xa cuống rốn. Do đó, phần màng ối gần cuống rốn được chọn làm nguồn nguyên liệu tối ưu để phân lập tế bào gốc, trong khi phần rìa màng ối xa cuống rốn (khoảng cách 10 cm) có độ đàn hồi tốt, phù hợp cho việc chế tạo tấm màng ối đông khô.

2. Quy trình phân lập tế bào gốc màng ối trong nghiên cứu được thực hiện bằng kỹ thuật nào?
Nghiên cứu sử dụng phương pháp enzyme kết hợp cơ học cải tiến từ quy trình của Miki và cộng sự: màng ối được xử lý phân cắt bằng enzyme Trypsin 0.25% ở 37°C kết hợp lắc cơ học 20 dao động/phút, sau đó lọc và ly tâm phân tầng mật độ bằng dung dịch Percoll 40.8% và 50.8% để thu lấy lớp tế bào tinh sạch ở phân tầng thứ 3 từ đáy ống nghiệm.

3. Tế bào phân lập từ màng ối được chứng minh tính gốc (tính vạn năng) bằng dấu ấn nào?
Tính gốc của tế bào biểu mô màng ối được xác định thông qua kỹ thuật hóa mô miễn dịch với kháng thể đặc hiệu kháng Oct-3/4 (Octamer-binding transcription factor-4). Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên - kháng thể bắt màu vàng nâu của cơ chất DAB trong nhân tế bào khẳng định tế bào duy trì dấu ấn đặc trưng của tế bào gốc vạn năng.

4. Bằng chứng nào chứng minh tế bào gốc màng ối có khả năng biệt hóa thành tế bào giống beta tụy?
Sau khi nuôi cấy trong môi trường cảm ứng biệt hóa đảo tụy, sự thành công của quá trình chuyển hướng tế bào được ghi nhận thông qua sự thay đổi hình thái tế bào và sự biểu hiện dương tính của mARN cũng như protein Insulin (được thể hiện qua Biểu đồ 3.1 trong luận án).

5. Vì sao tế bào gốc màng ối được xem là nguồn tế bào tiềm năng trong cấy ghép thay thế?
Tế bào gốc màng ối thu được từ bánh rau sau sinh không làm tổn hại đến mẹ và bé, không vướng phải rào cản đạo đức như tế bào gốc phôi; có khả năng tăng sinh và biệt hóa đa dòng; có tính chống viêm, ức chế miễn dịch (biểu hiện HLA-G, không biểu hiện HLA-DR, tiết TGF-β, FasL) giúp giảm nguy cơ thải ghép; đồng thời không có nguy cơ hình thành khối u quái khi cấy ghép.

Kết luận

Luận án tiến sĩ y học của tác giả Nguyễn Bảo Trân đã mô tả một cách có hệ thống các đặc điểm giải phẫu vi thể, siêu vi thể bề mặt (SEM) và siêu cấu trúc nội bào (TEM) của màng ối người theo các vùng giải phẫu khác nhau, khẳng định vùng gần cuống rốn có mật độ tế bào gốc cao nhất. Công trình đã chuẩn hóa quy trình kỹ thuật phân lập, nuôi cấy, bảo quản đông lạnh tế bào gốc màng ối biểu hiện dấu ấn Oct-3/4 và bước đầu thử nghiệm thành công việc biệt hóa các tế bào này thành tế bào giống tế bào beta tụy tiết insulin. Kết quả của luận án đóng góp cơ sở dữ liệu giải phẫu - mô học quan trọng và tạo tiền đề thực nghiệm cho việc phát triển các liệu pháp sinh học từ màng ối người phục vụ y học tái tạo tại Việt Nam.