Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu tạo tế bào gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn

Luận án tiến sĩ nghiên cứu nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan từ tế bào gốc trung mô cuống rốn, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết, đề xuất giải pháp

• Trường học: Học Viện Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tế Bào Gốc Trung Mô Cuống Rốn Tạo Tế Bào Gan
• Loại tài liệu: Luận Án Tiến Sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 1.1. Nguồn tế bào gốc trung mô, tiềm năng biệt hóa và ứng dụng
• 1.1.1. Nguồn tế bào gốc trung mô
• 1.1.2. Tiềm năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô
• 1.1.3. Ứng dụng của tế bào gốc trung mô
• 1.2. Cấu tạo cuống rốn, ưu điểm của tế bào gốc trung mô từ cuống rốn
• 1.2.1. Cấu tạo cuống rốn
• 1.2.2. Ưu điểm của tế bào gốc trung mô từ cuống rốn
• 1.3. Tình hình nghiên cứu
• 1.3.1. Tình hình nghiên cứu tế bào gốc người
• 1.3.2. Tình hình nghiên cứu biệt hóa tạo tế bào gan
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu, hóa chất nghiên cứu
• 2.1.1. Hóa chất và các bộ kit sử dụng
• 2.1.2. Môi trường thao tác, nuôi cấy, bảo quản
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Thu nhận, phân lập và nhân nuôi tế bào
• 2.2.2. Phương pháp cấy chuyển tế bào
• 2.2.3. Phương pháp đông lạnh và giải đông tế bào
• 2.2.4. Phương pháp nhuộm nhiễm sắc thể
• 2.2.5. Phương pháp đánh giá tiềm năng biệt hóa của tế bào phân lập được
• 2.2.6. Phương pháp đánh giá đặc trưng tế bào gốc của tế bào phân lập được
• 2.2.7. Phương pháp đánh giá tốc độ tăng trưởng tế bào
• 2.2.8. Phương pháp biệt hóa tạo tế bào có chức năng gan
• 2.2.9. Phương pháp đánh giá các chỉ thị của tế bào sau xử lý biệt hóa
• 2.2.10. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thu nhận, phân lập, nhân nuôi in vitro TBGTM từ mẫu cuống rốn
• 3.1.1. Thu nhận, phân lập tế bào gốc từ mảnh mô cuống rốn
• 3.1.2. Nhân nuôi in vitro, bảo quản lạnh tế bào gốc cuống rốn
• 3.1.3. Đánh giá tốc độ tăng trưởng của tế bào
• 3.2. Đánh giá tính ổn định, tiềm năng biệt hóa và khả năng duy trì nguồn TBGTM trong điều kiện nuôi in vitro
• 3.2.1. Đánh giá tính ổn định di truyền của TBG phân lập được
• 3.2.2. Đánh giá tiềm năng biệt hóa của tế bào gốc
• 3.2.3. Đánh giá đặc trưng tế bào gốc trung mô
• 3.3. Biệt hóa TBGTM cuống rốn thành tế bào có biểu hiện các chỉ thị đặc trưng tế bào gan
• 3.3.1. Biệt hóa bằng DMSO
• 3.3.2. Biệt hóa bằng tổ hợp của HGF, DEX và OSM
• 3.3.3. Biệt hóa bằng tổ hợp HGF, TSA và OSM
• 3.3.4. Biệt hóa bằng chuyển gen HNF4α
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHIẾU TÌNH NGUYỆN THAM GIA NGHIÊN CỨU
• BẢN CUNG CẤP THÔNG TIN NGHIÊN CỨU
• DANH SÁCH CÁ NHÂN TÌNH NGUYỆN THAM GIA NGHIÊN CỨU
• PHỤ LỤC 4: THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
• MÔI TRƯỜNG DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU
• TRÌNH TỰ CDS CỦA GEN HNF4α

Tóm tắt

I. Giới thiệu

Nghiên cứu tế bào gốc trung mô cuống rốn (TBGTM) tạo tế bào gan là một lĩnh vực đang thu hút sự quan tâm lớn trong y học tái tạo. TBGTM có khả năng tự tái tạo và biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, trong đó có tế bào gan. Việc sử dụng TBGTM từ cuống rốn mang lại nhiều lợi ích, bao gồm khả năng cung cấp số lượng lớn tế bào và tiềm năng biệt hóa cao. Nghiên cứu này nhằm mục đích khám phá khả năng biệt hóa của TBGTM thành tế bào gan, từ đó mở ra hướng đi mới trong điều trị các bệnh lý gan. Các tác nhân như cytokine và các yếu tố tăng trưởng được sử dụng để kích thích quá trình này, trong đó có HGF, OSM, và DMSO. Việc hiểu rõ về cơ chế và điều kiện cần thiết cho sự biệt hóa này sẽ giúp phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn cho bệnh nhân mắc bệnh gan.

II. Nguồn tế bào gốc trung mô

TBGTM có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó cuống rốn là nguồn cung cấp dồi dào và ít xâm lấn. TBGTM từ cuống rốn có khả năng tăng sinh mạnh mẽ và tiềm năng biệt hóa cao hơn so với các nguồn khác như tủy xương hay mô mỡ. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng TBGTM từ cuống rốn có thể biệt hóa thành tế bào gan, tế bào mỡ, và nhiều loại tế bào khác. Việc phân lập và nuôi cấy TBGTM từ cuống rốn không chỉ giúp cung cấp nguồn tế bào cho nghiên cứu mà còn mở ra cơ hội cho các ứng dụng lâm sàng trong điều trị bệnh. TBGTM từ cuống rốn có thể được sử dụng để phát triển các mô hình thử nghiệm cho các loại thuốc mới và nghiên cứu các cơ chế bệnh lý liên quan đến gan.

III. Tiềm năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô

Tiềm năng biệt hóa của TBGTM là một trong những yếu tố quan trọng trong nghiên cứu tế bào gốc. Quá trình biệt hóa này liên quan đến việc điều chỉnh biểu hiện gen, cho phép tế bào chuyển đổi từ trạng thái chưa chuyên biệt sang trạng thái chuyên biệt. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng TBGTM có thể biệt hóa thành tế bào gan dưới tác động của các yếu tố tăng trưởng và cytokine. Các yếu tố như HGF, OSM, và DMSO đã được chứng minh là có tác dụng tích cực trong việc kích thích quá trình này. Việc hiểu rõ về cơ chế và điều kiện cần thiết cho sự biệt hóa sẽ giúp tối ưu hóa quy trình và nâng cao hiệu quả của các phương pháp điều trị tế bào gan trong tương lai.

IV. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp hiện đại để thu nhận, phân lập và nuôi cấy TBGTM từ cuống rốn. Các tế bào được nuôi cấy trong điều kiện in vitro và được đánh giá về khả năng tăng sinh, tiềm năng biệt hóa, và tính ổn định di truyền. Các phương pháp như nhuộm PAS, RT-PCR, và flow cytometry được sử dụng để đánh giá đặc điểm tế bào và khả năng biệt hóa thành tế bào gan. Kết quả cho thấy TBGTM có khả năng biệt hóa thành tế bào gan với sự biểu hiện của các chỉ số đặc trưng của tế bào gan, mở ra hướng đi mới trong nghiên cứu và điều trị bệnh gan.

V. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy TBGTM từ cuống rốn có khả năng biệt hóa thành tế bào gan dưới tác động của các yếu tố tăng trưởng và cytokine. Sự biểu hiện của các chỉ số đặc trưng của tế bào gan như albumin và alpha-fetoprotein được ghi nhận, chứng tỏ rằng TBGTM có thể phát triển thành tế bào gan chức năng. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng việc sử dụng các tác nhân như DMSO và tổ hợp HGF, DEX, OSM có thể nâng cao hiệu quả của quá trình biệt hóa. Những phát hiện này không chỉ có giá trị trong nghiên cứu cơ bản mà còn có thể ứng dụng trong lâm sàng, mở ra cơ hội mới cho việc điều trị các bệnh lý gan.

VI. Kết luận

Nghiên cứu này đã chứng minh tiềm năng của TBGTM từ cuống rốn trong việc tạo ra tế bào gan chức năng. Việc hiểu rõ về cơ chế và điều kiện cần thiết cho sự biệt hóa của TBGTM sẽ giúp phát triển các phương pháp điều trị mới cho bệnh gan. Các kết quả đạt được từ nghiên cứu này có thể đóng góp vào việc phát triển các liệu pháp tế bào trong y học tái tạo, đồng thời mở ra hướng đi mới cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực này.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Tế bào gốc là những tế bào có năng lực tự làm mới và sở hữu tiềm năng biệt hóa thành nhiều dạng tế bào chuyên biệt trong cơ thể. Trong các nguồn tế bào gốc trưởng thành, tế bào gốc trung mô (TBGTM) thu nhận từ mô cuống rốn trẻ sơ sinh được đánh giá là nguồn vật liệu sinh học dồi dào, khả năng tăng sinh mạnh mẽ và không gặp phải các rào cản lớn về y đức như tế bào gốc phôi.

Tế bào có chức năng gan được biệt hóa từ tế bào gốc hiện là một định hướng thu hút nhiều sự quan tâm trong y học tái tạo và công nghệ sinh học. Nguồn tế bào này mang tiềm năng ứng dụng trong liệu pháp tế bào thay thế, thử nghiệm độc tính và sàng lọc hoạt chất dược phẩm dưới dạng tế bào đơn lẻ hoặc mô hình vi cơ quan (organoids). Tế bào gan tươi sơ cấp (primary hepatocytes) tuy được coi là tiêu chuẩn vàng trong các thử nghiệm chuyển hóa và độc tính thuốc nhưng lại rất khan hiếm, nhanh chóng suy giảm chức năng khi nuôi cấy in vitro. Ngược lại, các dòng tế bào ung thư gan (như Huh7.5, HepG2) tuy dễ nuôi cấy nhưng lại biểu hiện khiếm khuyết nhiều con đường tín hiệu và mức độ biểu hiện cytochrome P450 kém.

Để định hướng TBGTM thành tế bào có chức năng gan, các nghiên cứu trước đây thường bổ sung các phối tổ hợp cytokine, nhân tố tăng trưởng (HGF, OSM, bFGF, EGF, IGF) hoặc các hợp chất hóa học (DMSO, Dexamethasone). Tuy nhiên, các giao thức biệt hóa này vẫn tồn tại sự phân tán về hiệu quả và chưa đạt được mức độ thành thục chức năng đồng nhất. Về phương diện can thiệp di truyền, yếu tố phiên mã HNF-4α (Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha) được xác định là gen chi phối điều hòa khoảng 100 gen liên quan đến sự phát triển gan và chuyển hóa sinh học. Một số công trình trước đây áp dụng hệ thống lenti-virus để chuyển gen HNF-4α, song việc kiểm soát mức độ biểu hiện còn gặp nhiều giới hạn. Hệ thống Tet-On kiểm soát bằng Doxycycline sở hữu các đặc tính như điều hòa chặt chẽ, độ đặc hiệu cao, không gây độc tế bào và khả năng kích hoạt biểu hiện gen nhanh chóng. Do đó, luận án được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống về phương thức biệt hóa tế bào gan từ TBGTM cuống rốn thông qua việc đối sánh các tác nhân hóa học, cytokine và hệ thống cảm ứng biểu hiện gen HNF-4α điều khiển bởi Tet-On.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Phân lập và nhân nuôi in vitro thành công TBGTM thu từ cuống rốn làm vật liệu để biệt hóa tế bào và có thông tin về các điều kiện liên quan đến tính ổn định, tiềm năng biệt hóa và khả năng duy trì nguồn TBGTM trong điều kiện nuôi in vitro.
2. Biệt hóa TBGTM cuống rốn thành tế bào có biểu hiện một số chức năng của tế bào gan.

Câu hỏi và nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu của luận án được triển khai thành hai phần chính:

1. Thu nhận, phân lập và nhân nuôi in vitro TBGTM từ mẫu cuống rốn. Nghiên cứu đánh giá tính ổn định, tiềm năng biệt hóa và khả năng duy trì nguồn TBGTM trong điều kiện nuôi in vitro.
2. Nghiên cứu biệt hóa TBGTM cuống rốn thành tế bào có biểu hiện các chỉ thị đặc trưng tế bào gan bằng các tác nhân khác nhau trong điều kiện in vitro (DMSO; tổ hợp HGF + DEX + OSM; tổ hợp HGF + TSA + OSM; chuyển nạp gen HNF4α qua hệ thống Tet-On).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Tế bào gốc trung mô thu nhận từ mẫu cuống rốn của trẻ sơ sinh chào đời khỏe mạnh (thai kỳ đủ tháng, người mẹ có kết quả xét nghiệm âm tính với HIV, HBV, HCV, CMV và giang mai), có sự đồng thuận hiến tặng thông qua phiếu tình nguyện tham gia nghiên cứu.
• Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm thuộc Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 18 Hoàng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, thành phố Hà Nội. Đề tài kế thừa và phối hợp nguồn lực từ đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam mã số VAST.03/16-17 do TS. Nguyễn Văn Hạnh chủ trì.
• Thời gian hoàn thành: Luận án tiến sĩ chuyên ngành Công nghệ sinh học hoàn thành và bảo vệ vào năm 2024.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trong và ngoài nước

Trong phần tổng quan, tác giả đã hệ thống hóa các thành tựu và công bố khoa học trong lĩnh vực nghiên cứu tế bào gốc và biệt hóa tế bào gan:

• Đặc tính và nguồn gốc TBGTM: Tác giả điểm lại nguồn tế bào gốc tủy xương truyền thống cùng các nguồn mô trưởng thành khác như mô mỡ, máu ngoại vi, răng sữa, cuống rốn và màng ối. Dây rốn có cấu tạo gồm hai động mạch, một tĩnh mạch bao bọc bởi lớp mô thạch Wharton (Wharton’s Jelly - WJ) chứa các sợi collagen loại I, III, VI và proteoglycan. Nghiên cứu của Phan Toàn Thắng và cộng sự (2005) tại Đại học Quốc gia Singapore đã xác định khả năng phân lập TBGTM và tế bào gốc biểu mô từ màng dây rốn với tiềm năng cung cấp 6 tỷ tế bào từ diện tích bề mặt khoảng 330 cm² sau 3 tuần nuôi cấy, biểu hiện dương tính với CD13, CD44, CD90, CD166 và âm tính với CD14, CD34, CD45, HLA-DR.
• So sánh phương pháp phân lập: Nghiên cứu của Salehinejad và cộng sự (2012) phân lập TBGTM dây rốn qua 4 phương pháp (Trypsin, Collagenase/trypsin, Collagenase/hyaluronidase/trypsin và nuôi cấy mảnh mô nhỏ - Exp) cho thấy phương pháp nuôi mảnh mô duy trì khả năng tăng sinh kéo dài tới 60 ngày với hình thái nguyên bào sợi đồng nhất và biểu hiện CD73, CD90 vượt trội so với các phương pháp xử lý enzyme. Karahuseyinoglu và cộng sự (2007) ghi nhận khả năng thu nhận 4×10⁵ tế bào/mẫu hoặc từ 10×10⁵ đến 15×10⁵ tế bào trên 1 cm chiều dài cuống rốn.
• Tổng quan thử nghiệm lâm sàng: Dẫn liệu từ cơ sở dữ liệu clinicaltrials.gov tính đến năm 2020 ghi nhận hơn 1.000 thử nghiệm lâm sàng sử dụng TBGTM (pha I chiếm 30,79%, pha II chiếm 61,02%, pha III chiếm 7,53% và pha IV có 6 thử nghiệm chiếm 0,66%). Đối với bệnh lý gan, tổng hợp của Yang và cộng sự (2020) chỉ ra 23 thử nghiệm lâm sàng đã hoàn thành và 56 thử nghiệm đang tiến hành trong giai đoạn 2007–2018, phần lớn tập trung vào bệnh lý xơ gan.
• Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam: Nghiên cứu tế bào gốc bắt đầu từ năm 1995 trên dòng tủy xương. Hơn 750 ca ghép tế bào gốc tạo máu đã được thực hiện để điều trị các bệnh ác tính huyết học. Ghép TBGTM mô mỡ tự thân điều trị thoái hóa khớp gối được thử nghiệm tại Bệnh viện Vạn Hạnh và Bệnh viện Nguyễn Tri Phương trên khoảng 1.000 bệnh nhân. Trong hướng biệt hóa tế bào gan, Đoàn Chính Chung và cộng sự (2013) biệt hóa TBGTM màng cuống rốn thành tế bào gan biểu hiện ALB, AFP, CK18, CK19 và tích lũy glycogen sau 21 ngày; Nguyễn Thị Kim Nguyền và cộng sự (2014) biệt hóa tế bào gốc mô mỡ (ADSC) thành tế bào giống tế bào gan; Trương Thị Hải Nhung và cộng sự (2015) và Nguyễn Minh Thư và cộng sự (2021) ứng dụng TBGTM điều trị tổn thương xơ gan và tắc mật trên mô hình chuột; Đào Trường Giang và cộng sự (2021) tại Học viện Quân y và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 thử nghiệm ghép tế bào gốc tủy xương tự thân qua động mạch gan trên 29 bệnh nhân xơ gan mất bù do virus viêm gan B.
• Các phương pháp biệt hóa gan: Suzuki và cộng sự phân tích tác động của chất nền ngoại bào (ECM) và các nhân tố tăng trưởng (HGF, OSM); Pal và cộng sự (2012) khảo sát DMSO trong biệt hóa tế bào gốc phôi; Stecklum và cộng sự (2013) nghiên cứu mô hình đồng nuôi cấy TBG máu cuáng rốn với dòng tế bào gan chuột AML12; Roel Nusse và cộng sự (2015) phát hiện quần thể tế bào Tbx3 quanh tĩnh mạch trung tâm gan; Chen và cộng sự (2010) thiết kế các cặp mồi khảo sát biểu hiện gen chức năng gan và phân tích vai trò của HNF4α.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù đã có các công bố về biệt hóa TBGTM thành tế bào gan bằng cytokine hoặc hóa chất, sự kết hợp liều lượng và thời gian cảm ứng tối ưu vẫn chưa được chuẩn hóa đầy đủ. Bên cạnh đó, việc ứng dụng công nghệ chuyển gen điều hòa chủ động bằng hệ thống cảm ứng Tet-On nhằm kích hoạt biểu hiện quá mức gen phiên mã chủ đạo HNF4α trên đối tượng TBGTM cuống rốn người vẫn chưa được công bố trong các nghiên cứu trước đó. Luận án lựa chọn giải quyết khoảng trống này bằng việc thiết lập quy trình nuôi cấy ổn định nguồn TBGTM cuống rốn và triển khai hệ thống vector tái tổ hợp mang gen HNF4α điều khiển bởi Tet-On để đối sánh trực tiếp với các phương thức cảm ứng hóa chất và cytokine truyền thống.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án vận dụng lý thuyết phát triển phôi học và sinh học phân tử tế bào gốc:

• Tế bào gốc trung mô sở hữu tính đa tiềm năng, có khả năng biệt hóa ngang dòng thành tế bào thuộc lá mầm nội bì như tế bào nhu mô gan dưới tác động của các tín hiệu vi môi trường.
• Cơ chế biệt hóa tế bào gan in vitro mô phỏng quá trình tạo gan trong phôi sinh học: giai đoạn khởi đầu định hướng nội bì cần sự tham gia của HGF và các phân tử tín hiệu; giai đoạn thành thục chức năng chịu sự chi phối của Oncostatin M (OSM) và Dexamethasone (DEX) nhằm kích hoạt các enzyme chuyển hóa và tổng hợp albumin.
• Yếu tố phiên mã HNF4α đóng vai trò điều hòa thượng nguồn, kiểm soát biểu hiện của HNF1α, gen mã hóa Albumin, Cytochrome P450 (CYP3A4) và Alpha-fetoprotein (AFP).
• Hệ thống biểu hiện gen Tet-On dựa trên cơ chế operon kháng tetracycline ở vi khuẩn; cấu trúc promoter đáp ứng tetracycline (TRE) chỉ được kích hoạt phiên mã mạnh mẽ khi có sự hiện diện của Doxycycline (Dox), cho phép kiểm soát việc bật mở gen ngoại lai một cách chủ động.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

1. Thu nhận, phân lập và nhân nuôi tế bào

• Mẫu cuống rốn được xử lý trong vòng 4 giờ sau thu nhận; rửa sạch bằng dung dịch PBS chứa kháng sinh (100 IU/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 0,25 mg/mL amphotericin). Tách bỏ lớp mạch máu (2 động mạch, 1 tĩnh mạch), cắt nhỏ mô thành các mảnh 1–2 mm³.
• Mảnh mô được cấy vào đĩa 4 giếng (Nunc Ø15, 1,9 cm²/giếng) với mật độ 5–8 mảnh/giếng trong môi trường DMEM/F12 bổ sung 15% FBS, 10 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1X ITS và 2 mM L-glutamine; nuôi ở 37°C, 5% CO₂; thay môi trường định kỳ 3 ngày/lần.
• Cấy chuyển tế bào khi đạt độ phủ 60–80% bề mặt bằng Trypsin/EDTA 0,25%, gieo lại theo tỷ lệ 1:3 với mật độ 50.000 tế bào/mL.
• Bảo quản lạnh: tế bào lơ lửng trong DMEM/F12 + 10% DMSO, hạ nhiệt qua các bước (4°C trong 30 phút, 0°C trong 60 phút, -20°C trong 20–30 phút) trước khi đưa vào bình chứa nitơ lỏng -196°C. Đối với mẫu mô, đưa vào cryotube giữ ở -80°C qua đêm rồi chuyển sang nitơ lỏng.

2. Đánh giá tính ổn định và đặc trưng tế bào gốc

• Nhuộm nhiễm sắc thể: Xử lý tế bào bằng Colchicine Stock (5 μL/giếng) ở 39°C trong 10 phút, sốc nhược trương bằng dung dịch hypotonic ở 37°C trong 15 phút, cố định tế bào bằng methanol:acetic acid, nhỏ tiêu bản từ độ cao 50 cm và nhuộm Giemsa 5% trong 15 phút để phân tích bộ nhiễm sắc thể đồ ở các lần cấy chuyển P2, P10, P15.
• Tiềm năng biệt hóa đa dòng:
  • Biệt hóa tạo mỡ: Nuôi tế bào ở P5–P7 trong môi trường DMEM/F12 + 10% FBS bổ sung 0,1 µM Dexamethasone, 500 µM IBMX, 200 µM Indomethacin, 1 µM Insulin trong 21–28 ngày; phát hiện giọt mỡ bằng thuốc nhuộm Oil Red O.
  • Biệt hóa tạo nguyên bào xương: Nuôi trong môi trường DMEM + 10% FBS bổ sung 0,1 µM Dexamethasone, 100 µM AsAP và 10 mM β-glycerolphosphate trong 14–21 ngày; phát hiện tinh thể canxi bằng thuốc nhuộm Alizarin Red.
• Đánh giá dấu ấn bề mặt:
  • Flow cytometry: Sử dụng bộ kit MSC Phenotyping (Miltenyi Biotec) trên máy FACSCalibur, phần mềm CellQuest Pro. Các kênh đo: CD90-FITC (FL-2), CD105-PE (FL-3), CD73-APC (FL-6) và cocktail đối chứng âm CD14/CD20/CD34/CD45-PerCP (FL-4).
  • Kỹ thuật RT-PCR: Tách RNA tổng số bằng RNeasy Mini Kit (Qiagen), tổng hợp cDNA và khuếch đại bằng OneStep RT-PCR Kit (Qiagen) trên các thế hệ tế bào P5, P10, P15, P20.

Thành phần phản ứng RT-PCR	Thể tích	Nồng độ cuối
2X PCR Master Mix	25 µL	1X
Mồi xuôi (10 µM)	1 µL	0,4 mM
Mồi ngược (10 µM)	1 µL	0,4 mM
RNA khuôn	1 µL	1,0 – 2,0 µg
Nước không chứa RNase	22 µL	-
Tổng thể tích	50 µL	-

• Đánh giá tốc độ tăng trưởng:
  • Đếm tế bào sống bằng buồng đếm Neubauer với thuốc nhuộm Trypan blue 0,4% theo công thức $C = N \times 10^4/\text{mL}$.
  • Xác định tỷ lệ tế bào sống qua công thức: $\text{Tỷ lệ sống (%)} = (\text{Tổng số tế bào sống} / \text{Tổng số tế bào}) \times 100$.
  • Xác định thời gian nhân đôi ($PDt$): $PDt = t / PD$, trong đó $t = 36\text{ giờ}$ và $PD = [\log_{10}(NH) - \log_{10}(NI)] / \log_{10}2$.

3. Các quy trình biệt hóa tạo tế bào chức năng gan

• Biệt hóa bằng DMSO: Nuôi tế bào P3 trong môi trường bổ sung DMSO ở các nồng độ 0,01%, 0,1% và 1%; thay môi trường 3 ngày/lần; đánh giá ở các mốc 10, 20 và 30 ngày; đối chứng âm là tế bào không xử lý DMSO, đối chứng dương là dòng tế bào HepG2.
• Biệt hóa bằng tổ hợp HGF, DEX và OSM: Tế bào đạt mật độ 60–80% được nuôi trong môi trường cảm ứng I (DMEM/F12 + 15% FBS, 20 ng/mL hEGF, 10 ng/mL bFGF, 1X ITS, bổ sung 20 ng/mL HGF và 1 mM/L DEX) trong 2 tuần; sau đó chuyển sang môi trường cảm ứng II (bổ sung thêm 20 ng/mL OSM) trong các tuần tiếp theo.
• Biệt hóa bằng tổ hợp HGF, TSA và OSM: Quy trình 2 bước trên tế bào P3: bước 1 kéo dài 7 ngày trong môi trường DMEM + 10% FBS, 20 ng/mL IGF, 20 ng/mL HGF và $10^{-7}\text{ M/L}$ Trichostatin A (TSA); bước 2 bổ sung 10 ng/mL OSM và duy trì nuôi cấy đến ngày thứ 21.
• Biệt hóa bằng chuyển nạp gen HNF4α điều khiển bởi Tet-On:
  • Thiết kế các đoạn mồi mang vị trí cắt enzyme giới hạn: NheI-HNF4α-F, PacI-HNF4α-R, NsiI-Tet.On-F, PacI-Tet.On-R.
  • Nhân dòng CDS gen HNF4α, xử lý cắt bằng NheI và PacI, nối vào vector pTRE-tight-BI bằng T4 DNA ligase, biến nạp vào tế bào khả biến E. coli.
  • Cắt giải phóng đoạn gen HNF4α từ cấu trúc trung gian bằng NsiI và PacI, chuyển đoạn vào vector tiếp nhận pTet-DualON để tạo vector hoàn chỉnh pTRE-HNF4α-ON.
  • Chuyển nhiễm vào TBGTM cuống rốn bằng Lipofectamine LTX & PLUS; kích hoạt biểu hiện gen bằng Doxycycline.

Phản ứng cắt enzyme kép	Thành phần HNF4α	Thành phần pTRE-Tight-BI
Enzyme NheI	2,0 µL	2,0 µL
Enzyme PacI	2,0 µL	2,0 µL
NE Buffer 1.1	5,0 µL	5,0 µL
DNA khuôn mẫu (Template)	20,0 µL	20,0 µL
Nước khử nuclease	21,0 µL	21,0 µL
Tổng thể tích phản ứng	50,0 µL	50,0 µL

• Đánh giá tế bào sau biệt hóa: Quan sát sự biến đổi hình thái học dưới kính hiển vi đảo pha; kiểm tra sự phát huỳnh quang sau cảm ứng Doxycycline; đánh giá mức độ biểu hiện mRNA của các gen HNF4α, CYP3A4, ALB và AFP bằng RT-PCR và Real-time qPCR; nhuộm miễn dịch huỳnh quang; đánh giá khả năng tích lũy glycogen bằng bộ kit Periodic Acid-Schiff (PAS).

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan nghiên cứu

Chương này tập trung trình bày các dữ liệu tổng quan về đặc tính sinh học của tế bào gốc trung mô, cấu trúc giải phẫu - mô học của dây rốn và các hướng nghiên cứu biệt hóa gan trên thế giới và tại Việt Nam:

• Phân tích cấu trúc dây rốn với vùng chất nền thạch Wharton (WJ) bao quanh 2 động mạch và 1 tĩnh mạch. Tác giả chỉ ra rằng lớp WJ chứa các thành phần ECM phong phú (collagen I, III, VI và heparin sulfate proteoglycan laminin) cùng các tế bào đệm dạng nguyên bào sợi biểu hiện actin cơ trơn, desmin và vimentin.
• Tổng hợp các ưu điểm sinh học của TBGTM cuống rốn: tránh thủ thuật xâm lấn, tốc độ phân chia cao, tế bào ở trạng thái nguyên thủy ít chịu tác động bởi tuổi tác hay bệnh lý tích lũy của người cho. Về mặt miễn dịch, tế bào biểu hiện rất thấp kháng nguyên hòa hợp mô HLA lớp II và biểu hiện kháng nguyên hòa hợp mô thai nhi HLA-G có tác dụng ức chế miễn dịch, hạn chế nguy cơ thải ghép khi ứng dụng dị ghép.
• Đánh giá hiện trạng thử nghiệm lâm sàng: hơn 1.000 thử nghiệm TBGTM trên thế giới chủ yếu tập trung ở pha I (30,79%) và pha II (61,02%). Dữ liệu của Yang và cộng sự (2020) cho thấy phần lớn các thử nghiệm điều trị bệnh gan tập trung vào xơ gan.
• Tổng quan về các phương pháp biệt hóa gan: phân tích vai trò khởi đầu của HGF, vai trò thúc đẩy thành thục của Oncostatin M, tác dụng điều hòa của Dexamethasone, tác động thay đổi cấu trúc nhiễm sắc chất của TSA và cơ chế kích hoạt của DMSO. Đặc biệt, chương 1 nhấn mạnh vai trò trung tâm của yếu tố phiên mã HNF4α và ưu thế kiểm soát chặt chẽ của hệ thống biểu hiện gen Tet-On cảm ứng bởi Doxycycline.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết nguồn gốc vật liệu, hóa chất, thiết bị và quy trình thao tác thực nghiệm:

• Trình bày quy chuẩn tuyển chọn mẫu cuống rốn người từ các ca sinh đủ tháng khỏe mạnh theo đúng các cam kết y đức của đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST.03/16-17).
• Chi tiết hóa quy trình phân lập mảnh mô (explants) kích thước 1–2 mm³, môi trường nuôi cấy DMEM/F12 bổ sung 15% FBS, EGF, FGF, ITS và L-glutamine.
• Thiết lập quy trình đông lạnh giật cấp bảo quản tế bào và mẫu mô trong môi trường chứa 10% DMSO ở -196°C, cùng kỹ thuật giải đông nhanh ở 37°C.
• Quy chuẩn hóa các phương pháp đánh giá: kỹ thuật phân tích bộ nhiễm sắc thể đồ bằng Colchicine và Giemsa; quy trình biệt hóa tạo mỡ (nhuộm Oil Red O) và tạo xương (nhuộm Alizarin Red); phương pháp Flow cytometry trên hệ thống FACSCalibur với bộ kit MSC Phenotyping; quy trình ly trích RNA bằng cột lọc silica và kỹ thuật RT-PCR OneStep.
• Trình bày đầy đủ chiến lược tạo dòng phân tử: thiết kế 4 mồi đặc hiệu có bổ sung trình tự nhận biết của các enzyme cắt giới hạn NheI, PacI và NsiI; các bước cắt nối tạo vector pTRE-tight-BI-HNF4α và chuyển sang vector pTet-DualON để tạo plasmid hoàn chỉnh pTRE-HNF4α-ON; quy trình chuyển gen vào TBGTM bằng Lipofectamine LTX & PLUS và phương thức cảm ứng bằng Doxycycline.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương kết quả và thảo luận được triển khai qua 3 nhóm nội dung chính:

1. Thu nhận, phân lập, nhân nuôi in vitro TBGTM từ mẫu cuống rốn

• Quá trình phân lập bằng phương pháp nuôi cấy mảnh mô cho thấy tế bào bắt đầu di chuyển và mọc ra từ rìa mảnh mô sau một thời gian nuôi cấy, hình thành quần thể tế bào có hình thái đồng nhất dạng hình thoi kéo dài, tương tự như nguyên bào sợi.
• Đánh giá khả năng tăng sinh và tỷ lệ sống: tế bào từ cả mẫu mô tươi và mẫu mô sau rã đông đều có khả năng bám dính tốt, tăng sinh che kín bề mặt đĩa nuôi cấy ở lần cấy chuyển thứ 2 (P2). Tỷ lệ sống của tế bào sau giải đông đạt mức cao, đảm bảo chỉ tiêu tiếp tục cấy chuyển và duy trì ngân hàng tế bào.
• Đồ thị sinh trưởng theo dõi liên tục trong 7 ngày ở thế hệ P4 trước và sau đông lạnh cho thấy tế bào trải qua các pha tiềm phát, pha tăng số mũ và pha cân bằng tương đồng giữa hai nhóm thí nghiệm, chứng minh quy trình bảo quản lạnh không làm suy giảm khả năng tăng trưởng của TBGTM.

2. Đánh giá tính ổn định, tiềm năng biệt hóa và duy trì nguồn TBGTM

• Tính ổn định di truyền: Kết quả quan sát tiêu bản nhiễm sắc thể và phân tích nhiễm sắc thể đồ ở các thế hệ nuôi cấy P2, P10 và P15 khẳng định tế bào duy trì bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội bình thường của người ($2n = 46$), không ghi nhận các hiện tượng dị bội, đa bội hoặc đứt gãy nhiễm sắc thể qua quá trình cấy chuyển kéo dài.
• Tiềm năng biệt hóa đa dòng:
  • Khi nuôi trong môi trường cảm ứng tạo mỡ, các hạt mỡ nhỏ xuất hiện trong tế bào chất, bắt màu đỏ đặc trưng khi nhuộm với dung dịch Oil Red O ở cả nhóm mẫu tươi và mẫu đông lạnh.
  • Khi nuôi trong môi trường cảm ứng tạo xương, tế bào chuyển đổi hình thái và hình thành các đám khoáng hóa canxi bắt màu đỏ đậm với thuốc nhuộm Alizarin Red.
• Đặc trưng kiểu hình tế bào gốc:
  • Phân tích Flow cytometry tại lần cấy chuyển P2 và P4 cho thấy quần thể tế bào biểu hiện đồng nhất ở mức cao các dấu ấn bề mặt đặc trưng của tế bào gốc trung mô gồm CD73, CD90 và CD105, đồng thời không biểu hiện (tỷ lệ âm tính cao) với tổ hợp các chỉ thị tạo máu CD14, CD20, CD34 và CD45.
  • Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR qua các lần cấy chuyển P5, P10, P15 và P20 cho thấy các vạch sản phẩm khuếch đại của gen CD73, CD90, CD105 luôn xuất hiện rõ nét và ổn định, khẳng định tính toàn vẹn về kiểu hình phân tử của TBGTM trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro.

3. Biệt hóa TBGTM cuống rốn thành tế bào có biểu hiện chỉ thị tế bào gan

Tác giả đối sánh 4 phương thức biệt hóa:

• Biệt hóa bằng DMSO: Ở nồng độ DMSO 1% sau 30 ngày xử lý, tế bào biến đổi hình thái từ dạng thoi sang dạng đa diện gần giống tế bào gan; phân tích RT-PCR ghi nhận sự xuất hiện của các chỉ thị phân tử đặc trưng tế bào gan tương đồng với dòng tế bào đối chứng HepG2; phản ứng nhuộm PAS cho kết quả dương tính yếu thể hiện sự tích lũy glycogen.
• Biệt hóa bằng tổ hợp HGF, DEX và OSM: Hình thái tế bào thay đổi rõ sau 1 đến 2 tuần nuôi cấy; sau 4 tuần cảm ứng, kết quả RT-PCR cho thấy tế bào biểu hiện các gen chức năng gan và phản ứng nhuộm PAS ghi nhận sự hiện diện của glycogen nội bào.
• Biệt hóa bằng tổ hợp HGF, TSA và OSM: Sự phối hợp của chất ức chế histone deacetylase (TSA) cùng các cytokine HGF và OSM thúc đẩy tế bào chuyển dạng hình thái sau 1–2 tuần; sản phẩm RT-PCR ở tuần thứ 4 và kết quả nhuộm PAS xác nhận tế bào mang các đặc trưng chức năng gan.
• Biệt hóa bằng chuyển gen HNF4α qua hệ thống Tet-On:
  • Các phản ứng cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn xác nhận cấu trúc vector pTRE-HNF4α-ON được lắp ráp chính xác.
  • Sau khi chuyển nhiễm vào TBGTM và hoạt hóa bằng Doxycycline, sự phát huỳnh quang xuất hiện rõ trong tế bào chất sau 2 ngày, hình thái tế bào biến đổi nhanh chóng sang dạng đa diện.
  • Kết quả định lượng bằng Real-time qPCR tại các thời điểm khác nhau ghi nhận sự gia tăng vượt bậc về mức độ biểu hiện mRNA của các gen chủ đạo gồm HNF4α, Cytochrome P450 (CYP3A4), Albumin (ALB) và Alpha-fetoprotein (AFP).
  • Nhuộm PAS sau 2 tuần biệt hóa ở nhóm chuyển gen HNF4α cho màu hồng tím đậm đặc trưng, chứng minh tế bào có khả năng tổng hợp và tích lũy glycogen mạnh mẽ hơn so với các phương pháp cảm ứng hóa chất thông thường.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

Dựa trên các nội dung đã công bố trong văn bản, luận án mang lại những đóng góp cụ thể:

1. Hoàn thiện hệ thống dẫn liệu khoa học: Cung cấp bộ dữ liệu đầy đủ về quy trình thu nhận, phân lập bằng phương pháp nuôi cấy mảnh mô, nhân nuôi, bảo quản lạnh và giải đông TBGTM từ cuống rốn trẻ sơ sinh; chứng minh tính ổn định di truyền (bộ nhiễm sắc thể bình thường $2n = 46$ qua 15 lần cấy chuyển), duy trì ổn định các chỉ thị đặc trưng (CD73, CD90, CD105) và tiềm năng biệt hóa đa dòng (mỡ, xương) qua nuôi cấy kéo dài.
2. Ứng dụng hệ thống cảm ứng mới trong biệt hóa gan: Luận án là công trình nghiên cứu đầu tiên sử dụng hệ thống biểu hiện gen Tet-On cảm ứng bằng Doxycycline để kích hoạt biểu hiện quá mức yếu tố phiên mã HNF4α nhằm định hướng biệt hóa TBGTM cuống rốn thành tế bào có biểu hiện chức năng tế bào gan.
3. Đối sánh đa dạng các phương thức biệt hóa: Cung cấp thông tin thực nghiệm so sánh giữa việc sử dụng hợp chất hóa học (DMSO), các tổ hợp phối hợp cytokine/chất điều hòa biểu sinh (HGF + DEX + OSM; HGF + TSA + OSM) và can thiệp biểu hiện gen chủ động (HNF4α/Tet-On), tạo tiền đề cho việc lựa chọn tác nhân cảm ứng phù hợp cho các mục tiêu nghiên cứu tiếp theo.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Đề xuất áp dụng quy trình phân lập mảnh mô và bảo quản lạnh gián đoạn để xây dựng và lưu trữ ngân hàng tế bào gốc trung mô từ cuống rốn đạt tiêu chuẩn ổn định di truyền.
• Ứng dụng nguồn tế bào giống tế bào gan biệt hóa được (đặc biệt từ phương thức cảm ứng HNF4α/Tet-On) làm mô hình thử nghiệm in vitro nhằm đánh giá độc tính tế bào, sàng lọc hoạt chất sinh học và nghiên cứu chuyển hóa thuốc mới.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Nghiên cứu tập trung đánh giá trong điều kiện in vitro ở mô hình nuôi cấy hai chiều (2D), các tế bào thu được mới dừng ở mức tế bào mang một số đặc trưng và chức năng của tế bào gan (hepatocyte-like cells) chứ chưa đạt được mức độ thành thục chức năng hoàn toàn như tế bào nhu mô gan sơ cấp trong cơ thể sống.
• Các thử nghiệm chưa mở rộng đánh giá hiệu quả khu trú, tái cấu trúc mô và phục hồi chức năng gan trong điều kiện in vivo trên mô hình động vật thí nghiệm bị tổn thương hoặc suy gan.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Tiếp tục khảo sát sâu hơn các con đường tín hiệu chuyển hóa sinh học (chuyển hóa lipid, glucose và hoạt tính chi tiết của các phức hợp cytochrome P450) trên tế bào sau biệt hóa bằng gen HNF4α.
• Nghiên cứu phối hợp các tế bào biệt hóa trong cấu trúc giá thể hoặc chất nền ngoại bào 3D để tạo dạng vi cơ quan (organoids) nhằm nâng cao mức độ trưởng thành chức năng.
• Triển khai thử nghiệm ghép tế bào trên động vật mô hình nhằm đánh giá độ an toàn sinh học và khả năng hỗ trợ chức năng gan trước khi định hướng cho các thử nghiệm tiền lâm sàng.

---

Giá trị tham khảo

Đối tượng thụ hưởng

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên: Thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Sinh học phân tử, Y sinh học và Y học tái tạo có thể sử dụng luận án làm tài liệu tham khảo chuyên khảo về tế bào gốc trung mô và công nghệ biệt hóa tế bào.
• Cán bộ nghiên cứu và kỹ thuật viên: Làm việc tại các ngân hàng tế bào gốc, trung tâm lưu trữ mô học và các phòng thí nghiệm nuôi cấy tế bào động vật.
• Các nhà phát triển dược phẩm và độc chất học: Các nhóm nghiên cứu tìm kiếm mô hình sàng lọc thuốc in vitro có nguồn gốc từ người nhằm giảm thiểu chi phí và thời gian thử nghiệm tiền lâm sàng.

Các nội dung có giá trị tham khảo cao

• Quy trình chuẩn trong việc thu nhận, xử lý mảnh mô cuống rốn và kỹ thuật bảo quản lạnh giật cấp bảo đảm tỷ lệ sống và tính ổn định di truyền của TBGTM.
• Trình tự oligonucleotide của các cặp mồi RT-PCR và Real-time qPCR dùng để định danh tế bào gốc (CD73, CD90, CD105) và đánh giá các chỉ thị chức năng gan (HNF4α, CYP3A4, ALB, AFP).
• Chiến lược thiết kế vector tái tổ hợp pTRE-HNF4α-ON sử dụng các enzyme giới hạn kép (NheI, PacI, NsiI) và quy trình vận hành hệ thống cảm ứng Tet-On điều khiển bằng Doxycycline trên tế bào nhân thực.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao cuống rốn trẻ sơ sinh được coi là nguồn thu nhận tế bào gốc trung mô có nhiều ưu điểm so với tủy xương?

Theo nội dung luận án, cuống rốn là nguồn mô liên kết dồi dào, việc thu nhận hoàn toàn không xâm lấn, không gây đau đớn hay nguy cơ nhiễm trùng cho người hiến và không vướng phải các tranh cãi y đức như tế bào gốc phôi. TBGTM từ cuống rốn là tế bào còn rất non nên có khả năng phân chia mạnh mẽ và số lượng tế bào thu được sau tăng sinh in vitro rất lớn. Về mặt miễn dịch học, các tế bào này có tính sinh miễn dịch thấp do biểu hiện rất ít kháng nguyên hòa hợp mô HLA lớp II, đồng thời biểu hiện kháng nguyên HLA-G của thai nhi có tác dụng ức chế miễn dịch, giúp giảm thiểu hiện tượng đào thải khi cấy ghép dị thân.

2. Các chỉ thị nào được sử dụng để khẳng định đặc tính tế bào gốc trung mô của tế bào phân lập từ cuống rốn?

Tác giả đã sử dụng kỹ thuật Flow cytometry (với bộ kit MSC Phenotyping) và RT-PCR để kiểm tra các chỉ thị bề mặt. Tế bào được khẳng định là TBGTM khi:

• Dương tính mạnh với các dấu ấn: CD73, CD90 và CD105.
• Âm tính với tổ hợp các dấu ấn tạo máu và miễn dịch: CD14, CD20, CD34 và CD45. Các chỉ thị này được duy trì ổn định qua nhiều lần cấy chuyển (P2, P4, P5, P10, P15, P20).

3. Cấu trúc vector hoàn chỉnh pTRE-HNF4α-ON được tạo thành thông qua các enzyme cắt giới hạn nào?

Quá trình tạo dòng vector tái tổ hợp được tiến hành qua hai bước:

• Đoạn gen CDS của HNF4α được cắt và nối vào vector tách dòng pTRE-tight-BI bằng hai enzyme cắt giới hạn là NheI và PacI với sự xúc tác của enzyme T4 DNA ligase.
• Tiếp theo, đoạn DNA plasmid chứa gen HNF4α được cắt giải phóng bằng cặp enzyme NsiI và PacI, sau đó chuyển đoạn gắn vào vector tiếp nhận pTet-DualON để tạo thành cấu trúc vector cuối cùng mang tên pTRE-HNF4α-ON.

4. Hệ thống Tet-On mang lại những ưu thế gì khi chuyển gen HNF4α vào tế bào gốc trung mô?

Hệ thống Tet-On là hệ thống biểu hiện gen được kiểm soát chặt chẽ bằng Doxycycline (Dox) dựa trên cơ chế operon kháng tetracycline ở vi khuẩn. Hệ thống này sở hữu nhiều ưu điểm so với các hệ thống biểu hiện khác:

• Sự điều hòa biểu hiện gen diễn ra rất chặt chẽ, không bị rò rỉ phiên mã khi chưa có chất cảm ứng.
• Tính đặc hiệu cao, thời gian đáp ứng kích hoạt nhanh chóng.
• Mức độ biểu hiện tuyệt đối của gen đích đạt mức cao khi có mặt Doxycycline.
• Không gây độc cho tế bào chủ, an toàn hơn so với việc sử dụng các hệ thống mang gen lenti-virus không điều hòa.

5. Những phương pháp thực nghiệm nào đã được tác giả sử dụng để chứng minh tế bào sau biệt hóa mang chức năng của tế bào gan?

Tác giả đã kết hợp nhiều kỹ thuật sinh học phân tử và tế bào học bao gồm:

• Quan sát biến đổi hình thái tế bào dưới kính hiển vi đảo pha (từ dạng thoi sang dạng đa diện).
• Kiểm tra phát huỳnh quang tế bào sau chuyển gen và cảm ứng Doxycycline.
• Phân tích bán định lượng bằng RT-PCR và định lượng mức độ biểu hiện mRNA bằng Real-time qPCR đối với các gen chức năng gan chủ đạo: HNF4α, Cytochrome P450 (CYP3A4), Albumin (ALB) và Alpha-fetoprotein (AFP).
• Kỹ thuật nhuộm Periodic Acid-Schiff (PAS) nhằm xác định khả năng tổng hợp và tích lũy glycogen nội bào.
• Kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh quang tế bào.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của nghiên cứu sinh Đỗ Trung Kiên đã hoàn thành việc thiết lập quy trình phân lập, nuôi cấy và bảo quản nguồn tế bào gốc trung mô từ cuống rốn trẻ sơ sinh bảo đảm tính ổn định di truyền và đặc tính sinh học qua nuôi cấy kéo dài. Tác giả đã khảo sát toàn diện các phương thức biệt hóa tế bào gan bằng hóa chất (DMSO), tổ hợp cytokine (HGF, DEX, OSM, TSA) và can thiệp di truyền. Công trình là nghiên cứu đầu tiên ứng dụng hệ thống Tet-On cảm ứng Doxycycline để kích hoạt biểu hiện gen HNF4α trên TBGTM cuống rốn, tạo ra tế bào có hình thái đa diện, biểu hiện mạnh mẽ các gen gan chức năng (ALB, CYP3A4, HNF4α, AFP) và có khả năng tích lũy glycogen. Kết quả nghiên cứu đóng góp cơ sở dữ liệu thực nghiệm quan trọng cho lĩnh vực công nghệ sinh học tế bào và tạo nguồn vật liệu sinh học tiềm năng phục vụ thử nghiệm thuốc in vitro.

Trích đoạn nội dung tài liệu

i Bà GIÁO DĀC VIàN HÀN LÂM KHOA HàC VÀ ĐÀO T¾O VÀ CÔNG NGHà VIàT NAM HâC VIàN KHOA HâC VÀ CÔNG NGHà ----------------------------- Đæ TRUNG KIÊN NGHIÊN CĄU BIàT HÓA T¾O T¾ BÀO CÓ CHĄC NNG GAN TĆ T¾ BÀO GàC TRUNG MÔ CUàNG RàN LUÀN ÁN TI¾N SĨ CÔNG NGHà SINH HâC Hà Nội - Năm 2024 iii MĀC LĀC Trang LàI CAM ĐOAN .ii LàI CÀM ¡N. iii DANH MĀC CÁC KÝ HIàU, CÁC CHĀ VI¾T TÂT. vi DANH MĀC CÁC BÀNG .vii DANH MĀC CÁC HÌNH VẼ, Đâ THà. TäNG QUAN NGHIÊN CĄU.

Nguãn t¿ bào gác trung mô, tiÁm nng biát hóa và ąng dāng. Nguồn tế bào gác trung mô. Tiềm năng biát hóa cÿa tế bào gác trung mô. Āng dāng cÿa tế bào gác trung mô.

CÃu t¿o cuáng rán, °u điểm căa t¿ bào gác trung mô tć cuáng rán. Cấu t¿o cuáng rán. ¯u điểm cÿa tế bào gác trung mô từ cuáng rán. Tình hình nghiên cąu.

Tình hình nghiên cāu tế bào gác ng°ßi. Tình hình nghiên cāu biát hóa t¿o tế bào gan. VÀT LIàU VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĄU. VÁt liáu, hóa chÃt nghiên cąu.

Hóa chất và các bá kit sử dāng. Môi tr°ßng thao tác, nuôi cấy, bÁo quÁn. Ph°¢ng pháp nghiên cąu. Thu nhận, phân lập và nhân nuôi tế bào.

Ph°¡ng pháp cấy chuyển tế bào. Ph°¡ng pháp đông l¿nh và giÁi đông tế bào. Ph°¡ng pháp nhuám nhißm sắc thể. Ph°¡ng pháp đánh giá tiềm năng biát hóa cÿa tế bào phân lập đ°ÿc.

Ph°¡ng pháp đánh giá đặc tr°ng tế bào gác cÿa tế bào phân lập đ°ÿc. Ph°¡ng pháp đánh giá tác đá tăng tr°áng tế bào. Ph°¡ng pháp biát hóa t¿o tế bào có chāc năng gan. Ph°¡ng pháp đánh giá các chỉ thß cÿa tế bào sau xử lý biát hóa.

Ph°¡ng pháp xử lý sá liáu. K¾T QUÀ VÀ THÀO LUÀN. Thu nhÁn, phân lÁp, nhân nuôi in vitro TBGTM tć m¿u cuáng rán. Thu nhận, phân lập tế bào gác từ mÁnh mô cuáng rán.

Nhân nuôi in vitro, bÁo quÁn l¿nh tế bào gác cuáng rán. Đánh giá tác đá tăng tr°áng cÿa tế bào. Đánh giá tính ån đánh, tiÁm nng biát hóa và khÁ nng duy trì nguãn TBGTM trong điÁu kián nuôi in vitro. Đánh giá tính ổn đßnh di truyền cÿa TBG phân lập đ°ÿc.

Đánh giá tiềm năng biát hóa cÿa tế bào gác. Đánh giá đặc tr°ng tế bào gác trung mô. Biát hóa TBGTM cuáng rán thành t¿ bào có biểu hián các chß thá đặc tr°ng t¿ bào gan. Biát hóa bằng DMSO.

Biát hóa bằng tổ hÿp cÿa HGF, DEX và OSM. Biát hóa bằng tổ hÿp HGF, TSA và OSM. Biát hóa bằng chuyển gen HNF4α. 73 K¾T LUÀN VÀ KI¾N NGHà.

92 DANH MĀC CÔNG TRÌNH CÔNG Bà LIÊN QUAN Đ¾N LUÀN ÁN. 94 DANH MĀC TÀI LIàU THAM KHÀO. PHI¾U TÌNH NGUYàN THAM GIA NGHIÊN CĄU. BÀN CUNG CÂP THÔNG TIN NGHIÊN CĄU.

DANH SÁCH CÁ NHÂN TÌNH NGUYàN THAM GIA NGHIÊN CĄU&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&116 PHĀ LĀC 4. THI¾T Bà NGHIÊN CĄU. MÔI TR¯àNG DÙNG TRONG NGHIÊN CĄU. TRÌNH TĂ CDS CĂA GEN HNF4α.

124 vi DANH MĀC CÁC KÝ HIàU, CÁC CHĀ VI¾T TÂT Tć Ti¿ng Anh Ti¿ng Viát vi¿t tÃt AFP Alpha-fetoprotein ALB Albumin BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò DEX Dexamethasone DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO Dimethyl sulfoxide Dox Doxycycline ECM Extra Cellular Matrix Chất nền ngo¿i bào Yếu tá tăng tr°áng tế bào biểu EGF Epidermal Growth Factor bì FBS Fetal Bovine Serum Huyết thanh thai bò Yếu tá tăng tr°áng nguyên bào FGF Fibroblast Growth Factor sÿi GF Grow Factor Yếu tá tăng tr°áng HGF Hepatocyte Growth Factor Yếu tá tăng tr°áng tế bào gan HNF Hepatocyte Nuclear Factors Những yếu tá nhân tế bào gan HNF-4 Hepatocyte nuclear factor 4 HNF-4α Hepatocyte nuclear factor 4 alpha OSM Oncostatin M PAS Periodic Acid-Schiff Bá kit Periodic Acid-Schiff PBS Phosphate Buffered Saline TBG Tế bào gác TBGTM Tế bào gác trung mô TGF Transforming Growth Factor Yếu tá tăng tr°áng chuyển d¿ng TSA Trichostatin A Lớp mô đám th¿ch Wharton cÿa WJ Wharton’s Jelly dây rán vii DANH MĀC CÁC BÀNG BÁng 2. Thành phần phÁn āng RT-PCR&&&&&&&&&&&&&& 34 BÁng 2. Trình tự oligonucleotide các mồi đ°ÿc sử dāng để đánh giá đặc tr°ng TBG và chỉ thß chāc năng tế bào gan &&&&&&&&&. Các cặp mồi đ°ÿc thiết kế để chuẩn bß vector mang gen HNF4α.

Tỷ lá thành phần phÁn āng cắt cÿa HNF4α và pTRE-Tight-BI bằng 2 enzyme NheI và PacI. Tỷ lá thành phần phÁn āng cắt cÿa pTRE-Tight-BI-HNF4α và 38 pTet-DualON bằng 2 enzyme NsiI và PacI. Các đo¿n mồi đ°ÿc sử dāng trong qPCR&&&&&&&&&&. Kết quÁ đếm tế bào và tỷ lá sáng tế bào&&&&&&&&&&&.

Sự tăng sinh TBGTM cÿa mẫu mô cuáng rán t°¡i và mô cuáng rán đông l¿nh từ giai đo¿n cấy chuyển 2 đến giai đo¿n cấy chuyển 5. Biểu hián cÿa các chỉ thß TBGTM qua các lần cấy chuyển&&. Tỷ lá tế bào biểu hián các chỉ thß TBG tr°ớc và sau đông l¿nh&&. Kết quÁ đo mật đá quang (OD) cÿa các mẫu RNA tách chiết&.

Biểu hián các chỉ thß bề mặt trong quá trình nuôi in vitro…………… 61 BÁng 3. Biểu hián cÿa các chỉ thß phân tử á tế bào sau biát hóa bằng DMSO&&&. 64 viii DANH MĀC CÁC HÌNH VẼ, Đâ THà Hình 1. Tiềm năng biát hóa cÿa TBGTM &&&&&&&&&&& 4 Hình 1.

Triển váng āng dāng cÿa công nghá tế bào gác&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&. Āng dāng cÿa TBGTM đ°ÿc thử nghiám trên lâm sàng (phân lo¿i theo ca bánh)&&&&&&&&&&&&&&&&& 8 Hình 1. Āng dāng cÿa TBGTM đ°ÿc thử nghiám trên lâm sàng (phân lo¿i theo pha)&&&&&&&&&&&&&&&. Sá l°ÿng và tỷ lá các thử nghiám lâm sàng về điều trß TBGTM cho bánh gan&&&&&&&&&&&&&&.

Mặt cát ngang cấu trúc cÿa dây rán&&&&&&&&&&. Mô hình sử dāng tế bào gan biát hóa từ tế bào gác&&&. Các phân tử nhß t¿o tế bào có chāc năng gan hoặc thúc đẩy sự tr°áng thành cÿa tế bào giáng với tế bào gan&. Cấu trúc vector pTRE-HNF4α-ON.

Phân lập tế bào gác cuáng rán từ mÁnh mô&&&&&&&. Tế bào mác sau khi phân lập bằng ph°¡ng pháp nuôi mÁnh mô. Quá trình phát triển in vitro cÿa tế bào phân lập đ°ÿc. Ành h°áng cÿa nhiát đá bÁo quÁn TBGTM đến khÁ năng tăng tr°áng cÿa tế bào sau giÁi đông&&&&&&&&&&&.

Tế bào tr°ớc khi đông l¿nh (P4) (trái) và sau khi giÁi đông (P6) (phÁi)&&&&&&&&&&&&&&&&&&&. Các tế bào phát triển từ mô cuáng rán t°¡i (A) và mô cuáng rán đông l¿nh (C), TBGTM che kín bề mặt đĩa nuôi á giai đo¿n cấy chuyển lần 2 từ mô t°¡i (B) và mô đông l¿nh (D). Biểu đồ tác đá tăng tr°áng cÿa tế bào P4 tr°ớc đông l¿nh và tế bào P4 sau đông l¿nh. Tổng sá tế bào tăng sinh đ°ÿc ghi l¿i mßi ngày trong 7 ngày nuôi cấy á 2 nhóm thí nghiám: mô cuáng rán t°¡i và mô cuáng rán đông l¿nh&&&&&&&&&&&&&&&& 50 Hình 3.

Quan sát nhißm sắc thể trên kính hiển vi (A) và nhißm sắc thể đồ (B) cÿa tế bào nuôi á lần cấy chuyển thā 2&&&&&&. Quan sát nhißm sắc thể trên kính hiển vi và nhißm sắc thể đồ cÿa tế bào nuôi á lần cấy chuyển thā 10 (A), (B) và thā 15 (C),(D)&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&. Kết quÁ biát hóa TBGTM thành tế bào mỡ&&&&&&& 53 Hình 3. Các tế bào giát mỡ bắt màu đß khi nhuám với thuác nhuám Oil red xuất hián sau biát hóa á nhóm mô cuáng rán t°¡i (A) và mô cuáng rán đông l¿nh (B)&&&&&&&&&.

Kết quÁ biát hóa TBGTM thành nguyên bào x°¡ng&&&. Các tế bào bắt màu đß khi nhuám với thuác nhuám Alizarin red á nhóm mô cuáng rán t°¡i (A) và mô cuáng rán đông l¿nh (B)&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&. Biểu hián các chỉ thß bề mặt TBGTM cÿa mẫu tế bào phân lập từ mô cuáng rán á lần cấy chuyển 4 phân tích bằng flow cytometry&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 56 Hình 3. Tỷ lá tổ hÿp các chỉ thß đặc tr°ng không biểu hián trong TBGTM cÿa các mẫu á lần cấy chuyển 4 phân tích bằng flowcytometry&&&.

Biểu hián các chỉ thß bề mặt TBGTM cÿa mẫu cuáng rán t°¡i á lần cấy chuyển 2.18 Biểu hián các chỉ thß bề mặt TBGTM cÿa mẫu cuáng rán đông l¿nh á lần cấy chuyển 2 &&&&&&&&&&&& 57 Hình 3. Kết quÁ đián di với các chỉ thß á lần cấy chuyển 20&&&&&&&&&&&&&&&&&&&. Kết quÁ đián di với các chỉ thß CD105, CD90, CD73 cÿa mẫu tế bào tr°ớc đông l¿nh, nuôi cấy sau 33 ngày và 21 ngày từ lúc phân lập (A), mẫu tế bào sau giÁi đông (B)&&&&&& 63 x Hình 3. Hình thái cÿa tế bào tr°ớc và khi xử lý bằng DMSO 1% sau 30 ngày và so sánh với tế bào HepG2&&&&&&&&& 64 Hình 3.

Biểu hián chỉ thß phân tử cÿa tế bào biát hóa bằng DMSO 1% sau 30 ngày và so sánh với tế bào HepG2&&&&&&&& 65 Hình 3. Kết quÁ nhuám PAS&&&&&&&&&&&&&&&& 67 Hình 3. Hình thái tế bào biát hóa bằng tổ hÿp HGF, DEX và OSM sau 1 tuần (A) và 2 tuần (B)&&&&&&&&&&&&&. Kết quÁ sÁn phẩm RT-PCR tế bào nuôi cấy 4 tuần sau biát hóa bằng tổ hÿp cÿa HGF, DEX và OSM&&&&&&&.

Kết quÁ nhuám PAS&&&&&&&&&&&&&&&& 69 Hình 3. Hình thái tế bào xử lý biát hóa bằng tổ hÿp HGF, TSA và OSM sau 1 tuần (A) và 2 tuần (B)&&&&&&&&&&& 70 Hình 3. Đián di đồ RT-PCR mẫu nuôi cấy 4 tuần sau biát hóa bằng tổ hÿp cÿa HGF, TSA và OSM&&&&&&&&&&&. Kết quÁ nhuám PAS&&&&&&&&&&&&&&&& 72 Hình 3.

Đián di đồ kiểm tra sÁn phẩm PCR khuếch đ¿i CDS gen HNF4α&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 73 Hình 3. Kết quÁ tinh s¿ch sÁn phẩm HNF4α và pTRE-Tight-BI cắt bằng enzyme NheI và PacI. Đĩa biến n¿p sÁn phẩm nái pTRE-Tight-BI-HNF4α vào E. Kết quÁ sÁn phẩm cắt pTRE-Tight-BI-HNF4α bằng NheI và PacI.

Kết quÁ cắt vector pTet-DualON bằng 2 enzyme NsiI và PacI&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&. Kết quÁ tinh s¿ch sÁn phẩm cắt pTRE-Tight-BI-HNF4α và sÁn phẩm cắt pTet-DualON bằng 2 enzyme NsiI + PacI&&&&&&. Đĩa biến n¿p sÁn phẩm nái pTRE-HNF4α-ON vào E. Kết quÁ kiểm tra sÁn phẩm cắt plasmid pTRE-HNF4α-ON bằng enzyme&&&&&&&&&&&&&&&&&&.

Tác đá tăng tr°áng cÿa TBGTM sau khi đ°ÿc chuyển nhißm. Biểu đồ sinh tr°áng cÿa tế bào sau chuyển gen ho¿t hóa bằng Doxycycline&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 81 Hình 3. Sự phát huỳnh quang xuất hián trong tế bào chất cÿa tế bào 2 ngày sau chuyển gen và ho¿t hóa bằng Doxycycline &&&. Trong quá trình chuyển gen hình thái tế bào có sự biến đổi&.

Biểu hián cÿa các chỉ thß tr°ớc và sau khi chuyển gen&&. Hình Ánh tế bào nhuám mißn dßch huỳnh quang sau 2 tuần biát hóa&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&. Kết quÁ qPCR xác đßnh māc đá biểu hián mRNA cÿa các gen HNF4α (A), CYP3A4 (B), ALB (C) và AFP (D) t¿i các thßi điểm khác nhau&&&&&&&&&&&&&&&&&& 87 Hình 3. Kết quÁ nhuám PAS cÿa nhóm tế bào chuyển gen HNF4α sau 2 tuần.

90 1 Mâ ĐÄU Lý do chãn đÁ tài: Tế bào gác (TBG) là những tế bào có khÁ năng tự t¿o mới và có tiềm năng biát hoá thành nhiều lo¿i tế bào khác nhau. Khác với các tế bào khác, TBG ch°a có chāc năng chuyên môn hóa cā thể.