Luận văn thạc sĩ về hiệu quả liệu pháp huy động tế bào gốc nội sinh trị tổn thương gan trên chuột BDL

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu công nghệ sinh học khảo sát hiệu quả liệu pháp huy động tế bào gốc nội sinh trong điều trị tổn, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Lê Thị Ngọc Mỹ
• Người hướng dẫn: PGS. Trương Hải Nhung
• Trường học: Đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Khảo Sát Hiệu Quả Liệu Pháp Huy Động Tế Bào Gốc Nội Sinh Trong Điều Trị Tổn Thương Gan
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• MỞ ĐẦU
• Mục tiêu nghiên cứu cụ thể
• Nội dung nghiên cứu
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Bệnh hẹp đường mật ở trẻ sơ sinh
• 1.1.1. Sơ lược về gan và đường mật
• 1.1.2. Sơ lược về bệnh hẹp đường mật ở trẻ sơ sinh
• 1.1.3. Chuẩn đoán và điều trị bệnh bệnh hẹp đường mật
• 1.1.4. Tổn thương gan do bệnh hẹp đường mật
• 1.2. Mô hình động vật tổn thương gan do thắt ống dẫn mật
• 1.2.1. Nguyên tắc tạo mô hình
• 1.2.2. Đặc điểm mô hình chuột thắt ống dẫn mật
• 1.3. Nhân tố kích thích bạch cầu hạt (GCSF) và khả năng điều trị tổn thương gan
• 1.3.1. Giới thiệu về GSCF
• 1.3.2. Vai trò của tế bào gốc tạo máu trong điều trị tổn thương gan
• 1.3.3. Tình hình nghiên cứu và sử dụng GCSF điều trị tổn thương gan
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Đối tượng thí nghiệm
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3. Bố trí thí nghiệm
• 2.4. Phương pháp phẫu thuật thắt ống mật chủ (BDL)
• 2.5. Phương pháp tiêm GCSF
• 2.6. Phương pháp đánh giá mô hình chuột tổn thương gan do BDL
• 2.6.1. Sự thay đổi khối lượng cơ thể
• 2.6.2. Xác định chỉ số gan và lách
• 2.6.3. Đánh giá chỉ số bạch cầu
• 2.6.3.1. Số lượng bạch cầu tổng
• 2.6.3.2. Tỷ lệ bạch cầu trung tính
• 2.6.4. Phương pháp định lượng các chỉ số sinh hóa
• 2.6.4.1. Thu nhận huyết tương
• 2.6.4.2. Kiểm tra chỉ số sinh hoá ALT, AST
• 2.6.4.3. Đo nồng độ ALB trong huyết tương
• 2.6.5. Đánh giá mô học
• 2.6.5.1. Thu mẫu, bảo quản mẫu mô gan dùng cắt lát
• 2.6.5.2. Phương pháp nhuộm Hematoxylin và Eosin để đánh giá mức độ viêm và hoại tử trên mô gan
• 2.6.5.3. Phương pháp nhuộm sirius red và tính toán tỉ lệ phần trăm dương tính với thuốc nhuộm sirius red trên mô gan
• 2.7. Các phương pháp đánh giá hiệu quả điều trị tổn thương gan bằng GCSF trên mô hình chuột BDL
• 2.7.1. Sự thay đổi khối lượng cơ thể
• 2.7.2. Xác định chỉ số gan và lách
• 2.7.3. Đánh giá chỉ số bạch cầu
• 2.7.4. Định lượng các chỉ số sinh hóa
• 2.7.5. Đánh giá mô học
• 2.8. Đánh giá tác dụng của GCSF trong việc huy động tế bào gốc nội sinh trên chuôt tổn thương gan do phẫu thuật BDL
• 2.8.1. Đánh giá biểu hiện mRNA các gene tiền xơ trong mô gan
• 2.8.1.1. Thu mẫu, bảo quản mẫu mô gan trong tủ âm 800C
• 2.8.1.2. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
• 2.8.1.3. Đánh giá sự biểu hiện gene bằng phương pháp Realtime RT PCR
• 2.8.1.4. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR
• 2.8.2. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch
• 2.8.3. Phương pháp phân tích tế bào bằng kỹ thuật dòng chảy tế bào
• 2.8.3.1. Thu nhận tế bào đơn từ gan chuột
• 2.8.3.2. Chuẩn bị mẫu để phân tích quần thể tế bào CD3-, c-Kit+, Sca-1+
• 2.9. Xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
• 3.1. Xây dựng mô hình chuột tổn thương gan bằng phẫu thuật BDL
• 3.1.1. Sự thay đổi biểu hiện hình thái bên ngoài
• 3.1.2. Sự thay đổi khối lượng cơ thể
• 3.1.3. Sự thay đổi số lượng bạch cầu
• 3.1.4. Sự thay đổi các chỉ số sinh hóa
• 3.1.5. Sự thay đổi cấu trúc mô học
• 3.1.6. Tỷ lệ sống của chuột mô hình
• 3.2. Hiệu quả điều trị của GCSF trên mô hình chuột tổn thương gan do BDL
• 3.2.1. Kết quả huy động bạch cầu
• 3.2.2. Tỷ lệ sống chết
• 3.2.3. Thay đổi hình thái bên ngoài gan
• 3.2.4. Sự thay đổi chỉ số sinh hóa
• 3.2.5. Kết quả hình thái mô học
• 3.3. Tác dụng của GCSF trong việc huy động tế bào gốc nội sinh trên chuột tổn thương gan do phẫu thuật BDL
• 3.3.1. Kết quả biểu hiện mRNA các gen tiền xơ (tgf-β1, α-sma, col1α1)
• 3.3.2. Biểu hiện protein α-SMA ở mức độ mô học
• 3.3.3. Biểu hiện protein Cytokeratin-7 (Ck7) ở mức độ mô học
• 3.3.4. Đánh giá hiệu quả huy động tế bào gốc tạo máu của GCSF
• 3.4. Mô hình chuột nhắt trắng Mus Musculus giống Swiss thắt ống dẫn mật
• 3.5. Đánh giá hiệu quả điều trị giữa 2 liều GCSF 30μg/kg/ngày × 5 ngày và 60μg/kg/ngày × 5 ngày
• 3.6. Tác dụng của GCSF trong việc huy động tế bào gốc tạo máu và tác động lên hiệu quả điều trị tổn thương gan
• 4. PHẦN IV: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về tổn thương gan và liệu pháp huy động tế bào gốc

Tổn thương gan là một vấn đề y tế nghiêm trọng, đặc biệt ở trẻ sơ sinh mắc bệnh hẹp đường mật. Bệnh này gây ra sự tắc nghẽn ống dẫn mật, dẫn đến hoại tử và xơ hóa gan. Phẫu thuật Kasai là phương pháp điều trị chính, nhưng không thể ngăn chặn hoàn toàn sự tiến triển của xơ gan. Do đó, việc tìm kiếm các liệu pháp mới như liệu pháp huy động tế bào gốc nội sinh trở nên cần thiết. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng tế bào gốc gốc có thể được huy động từ tủy xương thông qua nhân tố kích thích bạch cầu hạt (GCSF), giúp cải thiện chức năng gan và kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân. Việc sử dụng GCSF trong điều trị tổn thương gan đã cho thấy hiệu quả tích cực trong nhiều nghiên cứu lâm sàng.

1.1. Bệnh hẹp đường mật và tổn thương gan

Bệnh hẹp đường mật (Biliary Atresia) gây ra sự tắc nghẽn dẫn đến ứ mật trong gan, từ đó làm tổn thương tế bào gan. Nếu không được điều trị kịp thời, trẻ sơ sinh có thể tử vong trong vòng 2 năm. Phẫu thuật Kasai được thực hiện để khôi phục dòng chảy của mật, nhưng không ngăn chặn được sự phát triển của xơ gan. Các nghiên cứu cho thấy rằng việc điều trị bằng GCSF có thể giúp cải thiện tình trạng này bằng cách huy động tế bào gốc nội sinh, từ đó hỗ trợ phục hồi chức năng gan.

II. Phương pháp nghiên cứu và mô hình chuột thắt ống dẫn mật

Nghiên cứu này sử dụng mô hình chuột thắt ống dẫn mật (BDL) để đánh giá hiệu quả của GCSF trong việc điều trị tổn thương gan. Mô hình này được tạo ra bằng phương pháp phẫu thuật, sau đó chuột được chia thành bốn nhóm: nhóm đối chứng, nhóm BDL + giả dược, và hai nhóm BDL + GCSF với các liều khác nhau. Các chỉ số sinh hóa như ALT, AST, ALB được đo lường để đánh giá tình trạng gan. Kết quả cho thấy nhóm điều trị với GCSF có sự cải thiện rõ rệt về chức năng gan và tỷ lệ sống sót cao hơn so với nhóm đối chứng. Điều này chứng tỏ rằng liệu pháp huy động tế bào gốc có thể là một phương pháp điều trị hiệu quả cho tổn thương gan do bệnh hẹp đường mật.

2.1. Tạo mô hình chuột tổn thương gan

Mô hình chuột tổn thương gan được tạo ra thông qua phẫu thuật thắt ống dẫn mật, một phương pháp phổ biến để mô phỏng tình trạng ứ mật. Các chỉ số sinh hóa và mô học được sử dụng để đánh giá mức độ tổn thương gan. Kết quả cho thấy rằng sau phẫu thuật, chuột mô hình xuất hiện các triệu chứng như vàng da, tăng men gan, và tỷ lệ sống giảm. Điều này khẳng định tính khả thi của mô hình trong việc nghiên cứu hiệu quả của GCSF trong điều trị tổn thương gan.

III. Kết quả và thảo luận về hiệu quả của GCSF

Kết quả nghiên cứu cho thấy GCSF có tác dụng tích cực trong việc huy động tế bào gốc nội sinh, giảm viêm và hoại tử gan. Cụ thể, nhóm chuột được điều trị với GCSF 60µg/kg/ngày cho thấy tỷ lệ sống cao hơn và giảm các chỉ số viêm so với nhóm đối chứng. Sự cải thiện về chức năng gan được thể hiện qua các chỉ số sinh hóa như ALT, AST, và ALB. Điều này chứng minh rằng liệu pháp huy động tế bào gốc không chỉ cải thiện tình trạng gan mà còn kéo dài thời gian sống cho chuột mô hình. GCSF đã cho thấy là một lựa chọn tiềm năng trong điều trị tổn thương gan do bệnh hẹp đường mật.

3.1. Đánh giá hiệu quả điều trị của GCSF

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng GCSF không chỉ cải thiện các chỉ số sinh hóa mà còn làm giảm mức độ xơ hóa và hoại tử trong mô gan. Các chỉ số như mRNA của các gen tiền xơ cũng giảm ở nhóm chuột được điều trị với GCSF, cho thấy tác động tích cực của liệu pháp này. Việc huy động tế bào gốc tạo máu từ tủy xương đến gan là một cơ chế quan trọng giúp phục hồi chức năng gan, từ đó mở ra hướng đi mới trong điều trị tổn thương gan.

IV. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu khẳng định rằng liệu pháp huy động tế bào gốc nội sinh thông qua GCSF có hiệu quả trong điều trị tổn thương gan do bệnh hẹp đường mật. GCSF không chỉ giúp cải thiện chức năng gan mà còn kéo dài thời gian sống cho chuột mô hình. Kết quả này mở ra triển vọng cho việc áp dụng GCSF trong điều trị lâm sàng cho bệnh nhân bị tổn thương gan. Cần tiếp tục nghiên cứu để làm rõ cơ chế tác động của GCSF và tối ưu hóa liều lượng điều trị trong tương lai.

4.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Cần mở rộng nghiên cứu để đánh giá hiệu quả của GCSF trên các mô hình động vật khác và trong các thử nghiệm lâm sàng. Hơn nữa, việc tìm hiểu cơ chế phân tử của GCSF trong việc huy động tế bào gốc nội sinh sẽ giúp tối ưu hóa liệu pháp điều trị, từ đó nâng cao hiệu quả và tính an toàn cho bệnh nhân.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh hẹp đường mật bẩm sinh ở trẻ sơ sinh (Biliary Atresia - BA) là một trong những bệnh lý tắc mật ngoại gan tiến triển nguy hiểm nhất, dẫn tới ứ đọng acid mật, hoại tử tế bào gan và gây xơ gan mật thứ cấp. Tỷ lệ mắc bệnh tại các quốc gia Châu Á dao động từ 1/2.700 đến 1/3.500 ca sinh sống, cao hơn đáng kể so với tỷ lệ 1/5.000 đến 1/19.000 tại Châu Âu và Bắc Mỹ. Hiện nay, phẫu thuật Kasai là phương pháp điều trị ngoại khoa tiêu chuẩn đầu tay nhằm tái lưu thông dòng chảy của mật; tuy nhiên, khoảng 68% đến 80% bệnh nhân vẫn tiếp tục phát triển quá trình xơ hóa tiến triển sau phẫu thuật. Ghép gan là giải pháp triệt để duy nhất cho các trường hợp suy gan giai đoạn cuối, chiếm tới 75% tổng số ca ghép tạng ở trẻ em dưới 2 tuổi, nhưng đang gặp phải rào cản nghiêm trọng do sự khan hiếm nguồn tạng hiến tặng, chi phí y tế đắt đỏ và nguy cơ thải ghép miễn dịch phức tạp.

Trước thách thức lâm sàng cấp bách đó, đề tài luận văn thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ Sinh học tại Trường Đại học Bách Khoa và Viện Tế Bào Gốc thuộc Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh (hoàn thành tháng 01/2021) đã tập trung khảo sát hiệu quả của liệu pháp sử dụng nhân tố kích thích dòng bạch cầu hạt (Granulocyte Colony-Stimulating Factor - G-CSF, sản phẩm thương mại Filgrastim) nhằm huy động tế bào gốc tạo máu nội sinh từ tủy xương đến gan tổn thương trên mô hình chuột thắt ống dẫn mật (Bile Duct Ligation - BDL). Đề tài giải quyết mục tiêu chứng minh khả năng giảm viêm, ức chế quá trình xơ hóa mô học, phục hồi chỉ số sinh hóa chức năng gan và nâng cao tỷ lệ sống sót từ 77,78% ở nhóm không điều trị lên 100% ở nhóm điều trị liều tối ưu. Nghiên cứu tạo tiền đề khoa học thực nghiệm vững chắc, mở ra hướng tiếp cận y học tái tạo bổ trợ giúp kéo dài thời gian sống chờ ghép gan cho bệnh nhân nhi.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên ba trụ cột lý thuyết sinh học hiện đại:

1. Lý thuyết bệnh sinh xơ gan do ứ mật và phản ứng chuyển dạng tế bào: Dịch mật ứ đọng gây áp lực nội bào, kích hoạt phản ứng viêm và kích thích tế bào Kupffer tiết cytokine tiền viêm (đặc biệt là TGF-β1). Tế bào hình sao tại gan (Hepatic Stellate Cells - HSCs), vốn chiếm khoảng 15% tổng số tế bào gan và lưu trữ vitamin A ở trạng thái nghỉ, bị kích hoạt chuyển dạng thành nguyên bào sợi cơ (myofibroblasts). Quá trình này kích thích biểu hiện mạnh mẽ protein sợi cơ trơn alpha (α-SMA) và tăng tích lũy collagen loại I (Col1α1), làm biến dạng cấu trúc tiểu thùy gan và xoang mao mạch. Đồng thời, tế bào biểu mô đường mật trải qua quá trình chuyển dạng biểu mô - trung mô (EMT) và phản ứng tăng sinh ống mật bù trừ (được đánh dấu bằng Cytokeratin-7 - CK7).

2. Lý thuyết huy động tế bào gốc tạo máu nội sinh (HSC mobilization): G-CSF là glycoprotein gồm 175 acid amin, hoạt động thông qua việc gắn kết với thụ thể đặc hiệu GCSFR trên màng tế bào tủy xương. G-CSF kích thích sản sinh bạch cầu trung tính, giải phóng các enzyme protease nội tạng giúp cắt đứt các cầu nối kết dính của tế bào gốc tạo máu (CD34+ ở người hoặc CD3- c-Kit+ Sca-1+ ở chuột) với mô đệm tủy xương, giải phóng chúng vào tuần hoàn máu ngoại vi để di cư đến các cơ quan tổn thương.

3. Cơ chế tái tạo và giải xơ hóa của tế bào gốc tại gan: Các tế bào gốc từ tủy xương khi di cư vào nhu mô gan tổn thương sẽ kích thích giải phóng các enzyme phân giải chất nền ngoại bào (Matrix Metalloproteinases - MMPs), ức chế chất ức chế mô của metalloproteinase (TIMP-1), đồng thời biệt hóa hỗ trợ phục hồi tế bào nhu mô gan và tế bào biểu mô ống mật.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng cỡ mẫu gồm 75 chuột nhắt trắng đực Mus musculus chủng Swiss (6 – 7 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 35g) được nuôi thích nghi trong điều kiện phòng thí nghiệm tiêu chuẩn chu kỳ sáng/tối 12 giờ. Phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên phân tầng được áp dụng để chia thành các nhóm thử nghiệm độc lập: nhóm chuột khỏe mạnh (n=5), nhóm đối chứng phẫu thuật giả mở ổ bụng không thắt mật (Sham, n=5), nhóm mô hình BDL đối chứng tiêm giả dược Glucose 5% (n=15), nhóm BDL tiêm G-CSF liều 30 µg/kg/ngày (n=15) và nhóm BDL tiêm G-CSF liều 60 µg/kg/ngày (n=15).

Quy trình phẫu thuật thắt ống mật chủ (BDL) được thực hiện dưới kính vi phẫu phóng đại 2,5 lần, sử dụng chỉ không tiêu polypropylene 7-0 để tạo 2 nút thắt tại vị trí cuống gan và tá tràng. Thuốc G-CSF được tiêm dưới da liên tục trong 5 ngày (từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 11 sau phẫu thuật). Các phương pháp phân tích đa tầng được lựa chọn có hệ thống:

• Đánh giá huyết học và sinh hóa: Đếm bạch cầu tổng và nhuộm Giemsa xác định tỷ lệ bạch cầu trung tính; đo hoạt độ men gan Alanine Aminotransferase (ALT), Aspartate Aminotransferase (AST) và nồng độ Albumin (ALB) bằng hệ thống đo quang học đa bước sóng DTX 880 Multidetector.
• Đánh giá mô bệnh học và hóa mô miễn dịch: Nhuộm Hematoxylin & Eosin (H&E) chấm điểm mức độ viêm theo thang điểm Ishak Modified HAI (0-4 điểm) và đo diện tích hoại tử; nhuộm Picrosirius Red F3B xác định mật độ lắng đọng collagen qua phần mềm ImageJ 1.48; nhuộm hóa mô miễn dịch xác định mức độ dương tính của kháng nguyên CK7 và α-SMA.
• Sinh học phân tử và đếm dòng tế bào: Tách chiết RNA tổng số, tổng hợp cDNA và thực hiện định lượng biểu hiện mRNA của các gen tgf-β1, α-sma, col1α1 bằng phương pháp Real-time RT-PCR (LightCycler 480 II, áp dụng thuật toán Livak 2^-ΔΔCt); phân tích quần thể tế bào gốc CD3- c-Kit+ Sca-1+ tại mô gan bằng kỹ thuật đếm dòng chảy tế bào (Flow Cytometry) tại mốc 12 ngày sau BDL. Toàn bộ timeline nghiên cứu được theo dõi chặt chẽ tại các mốc ngày 7, 12, 19 và 26 sau phẫu thuật.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình thực nghiệm đã thu được các phát hiện định lượng then chốt, phản ánh rõ rệt diễn tiến tổn thương và hiệu quả điều trị phục hồi:

• Tạo thành công mô hình xơ gan ứ mật BDL cấp và bán cấp: Sau 7 ngày thắt ống mật, chuột xuất hiện triệu chứng vàng da và nước tiểu sậm màu. Bạch cầu tổng trong máu tăng gấp 6,5 lần (từ 323 lên 2.125 tế bào/ml, p < 0,001), tỷ lệ bạch cầu trung tính tăng từ 17,2% lên 29,7% (p < 0,05). Hoạt độ men gan AST và ALT tăng vọt từ 13 đến 18 lần so với nhóm đối chứng (p < 0,0001). Mật độ nhuộm Sirius Red biểu thị xơ hóa tăng gấp 7,5 lần (từ 0,06% lên 0,45%, p < 0,001). Tỷ lệ sống sót tự nhiên của chuột mô hình sau 7 ngày đạt 85,45% (47/55 chuột) và giảm xuống 76,36% (42/55 chuột) tại ngày 30.
• Hiệu lực huy động tế bào gốc vượt bậc của G-CSF: Sau 5 liều tiêm G-CSF liên tiếp, lượng bạch cầu tổng ở nhóm điều trị tăng gấp hơn 3 lần so với nhóm dùng giả dược (đạt 5.868 và 6.157 tế bào/ml so với 1.975 tế bào/ml, p < 0,0001). Phân tích Flow Cytometry tại ngày 12 xác nhận tỷ lệ tế bào gốc tạo máu nội sinh CD3- c-Kit+ Sca-1+ di cư đến nhu mô gan ở nhóm BDL + G-CSF 60 µg/kg/ngày tăng cao hơn so với nhóm BDL dùng giả dược.
• Cải thiện rõ rệt chức năng gan và tỷ lệ sống sót: Tại thời điểm 26 ngày sau phẫu thuật, tỷ lệ sống sót tích lũy ở nhóm BDL + G-CSF 60 µg/kg/ngày đạt 100% và nhóm BDL + G-CSF 30 µg/kg/ngày đạt 93,75%, vượt trội so với mức 77,78% ở nhóm BDL + giả dược. Hoạt độ men gan AST ở cả hai nhóm điều trị giảm có ý nghĩa thống kê (p < 0,01 và p < 0,001), đồng thời nồng độ Albumin huyết tương phục hồi cao hơn đáng kể (p < 0,05 và p < 0,01).
• Thoái lui xơ hóa mô học và ức chế biểu hiện gen tiền xơ: Hình thái học nhuộm H&E và Sirius Red ghi nhận vùng hoại tử nhu mô gan thu hẹp rõ rệt, mật độ collagen xơ hóa giảm mạnh (p < 0,0001). Tại ngày 19, mức độ phiên mã mRNA của ba gen tiền xơ chủ đạo gồm tgf-β1, α-sma và col1α1 ở nhóm tiêm G-CSF đều giảm có ý nghĩa (p < 0,05). Biểu hiện hóa mô miễn dịch của CK7 (tăng sinh ống mật) và α-SMA (hoạt hóa tế bào hình sao) ở nhóm điều trị đều thuyên giảm rõ rệt.

Thảo luận kết quả

Khi tổng hợp các dữ liệu thực nghiệm trên các đồ thị so sánh và bảng điểm mô học, có thể thấy rõ sự đảo chiều của quá trình bệnh lý. Biểu đồ đường Kaplan-Meier biểu diễn tỷ lệ sống sót qua 26 ngày cho thấy nhánh điều trị G-CSF 60 µg/kg/ngày duy trì đường ngang phẳng tuyệt đối (100%), trong khi nhánh giả dược sụt giảm liên tục từ ngày thứ 14 do hoại tử gan lan tỏa và kiệt quệ chuyển hóa. Biểu đồ cột phân tích sinh hóa phản ánh xu hướng phục hồi nồng độ Albumin song song với sự suy giảm hoạt độ AST, chứng minh tính toàn vẹn của màng tế bào gan đang được tái thiết lập.

Cơ chế điều trị thành công này được giải thích bởi khả năng can thiệp đa mục tiêu của tế bào gốc tạo máu nội sinh được huy động bởi G-CSF:

• Khi tế bào gốc di cư vào nhu mô gan bị ứ mật, chúng trực tiếp tiết ra các yếu tố điều hòa miễn dịch, làm giảm sự thâm nhiễm của các bạch cầu hạt gây viêm và ức chế tế bào Kupffer phóng thích cytokine TGF-β1.
• Sự sụt giảm tín hiệu TGF-β1 dẫn đến việc bất hoạt tế bào hình sao gan (thể hiện qua sự suy giảm protein α-SMA), ngăn chặn quá trình chuyển dạng nguyên bào sợi và giảm tổng hợp chuỗi collagen type 1 alpha 1 (col1α1).
• Tế bào gốc còn tăng cường sản xuất enzyme phân giải chất nền MMP, giúp tiêu biến các dải xơ cầu nối quanh khoảng cửa.

Kết quả này hoàn toàn nhất quán với các công bố y học quốc tế trước đây: Nghiên cứu của Virendra Singh và cộng sự (2014) trên bệnh nhân viêm gan do rượu ghi nhận G-CSF giúp tăng tỷ lệ sống sót sau 90 ngày lên 78,3% (so với 30,4% ở nhóm chứng); nghiên cứu của Laurent Spahr và cộng sự (2008) chứng minh G-CSF làm tăng lượng tế bào gốc CD34+ trong máu ngoại vi lên 747% và cải thiện yếu tố tăng trưởng tế bào gan HGF lên 212%. Nghiên cứu của Lê Thị Ngọc Mỹ đã mở rộng thành công phạm vi ứng dụng của liệu pháp G-CSF sang nhóm bệnh lý tổn thương gan do ứ mật cơ học, đồng thời khẳng định liều 60 µg/kg/ngày mang lại hiệu quả tái tạo mô học và kiểm soát xơ hóa tối ưu hơn so với liều 30 µg/kg/ngày.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các phát hiện thực nghiệm và cơ chế sinh học phân tử đã chứng minh, luận văn đưa ra 4 nhóm giải pháp và khuyến nghị hành động cụ thể:

1. Chuẩn hóa phác đồ sử dụng G-CSF cho các nghiên cứu chuyển giao lâm sàng: Thiết lập quy trình tiêm G-CSF (Filgrastim) với liều tương đương trên người khoảng 5 đến 10 µg/kg/ngày, duy trì liên tục trong 5 ngày ở giai đoạn sớm sau phẫu thuật dẫn lưu mật Kasai. Mục tiêu hướng tới là giảm hoạt độ men gan AST/ALT trên 35% và duy trì nồng độ Albumin huyết tương ổn định trên 35 g/L trong vòng 30 ngày điều trị. Đơn vị chủ trì thực hiện: Các nhóm nghiên cứu y học dịch chuyển tại các bệnh viện Nhi đồng và trung tâm ghép tạng.
2. Triển khai thử nghiệm tiền lâm sàng trên động vật bậc cao: Mở rộng khảo sát đánh giá độc tính bán trường diễn và khả năng dung nạp của G-CSF trên mô hình linh trưởng hoặc lợn trong khung thời gian 12 đến 18 tháng tới. Mục tiêu target metric là xác lập đường cong dược động học chi tiết và kiểm soát hoàn toàn nguy cơ lách to hay tăng áp lực tĩnh mạch cửa ngoài ý muốn. Chủ thể thực hiện: Viện Tế Bào Gốc phối hợp cùng các viện nghiên cứu y dược học quân sự.
3. Phát triển liệu pháp phối hợp đa mô thức (Combination Therapy): Nghiên cứu kết hợp G-CSF với các phân tử chống xơ hóa hướng đích (như chất ức chế TGF-β1 hoặc chất chống oxy hóa chuyên biệt) nhằm đạt chỉ tiêu hạ thấp mật độ xơ hóa nhu mô gan Sirius Red xuống dưới 0,10% trong vòng 60 ngày theo dõi dài hạn. Thời gian triển khai dự kiến trong 2 năm tiếp theo do các phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thực hiện.
4. Xây dựng hệ thống bảng chỉ thị sinh học (Biomarker Panel) theo dõi đáp ứng tế bào: Ứng dụng kỹ thuật Flow Cytometry và RT-PCR đa mồi định lượng các dấu ấn CD34+, c-Kit+, Sca-1+, tgf-β1 và col1α1 tại các mốc ngày 7, 14 và 28 nhằm cá nhân hóa liều lượng điều trị cho từng cá thể bệnh nhân. Cơ quan phụ trách: Các phòng xét nghiệm sinh học phân tử và chẩn đoán miễn dịch chuyên sâu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang giá trị học thuật và thực tiễn sâu rộng, là tài liệu tham khảo giá trị cao cho 4 nhóm đối tượng chính:

• Bác sĩ chuyên khoa Ngoại Nhi, Tiêu hóa - Gan mật và Ghép tạng: Cung cấp bằng chứng thực nghiệm vững chắc về liệu pháp dùng thuốc hỗ trợ phục hồi tế bào gan sau phẫu thuật Kasai. Bác sĩ có thể ứng dụng khung dữ liệu này để xây dựng các thử nghiệm lâm sàng liệu pháp bắc cầu, giúp bảo tồn chức năng gan tự nhiên và kéo dài thời gian sống cho bệnh nhi trong thời gian chờ nguồn tạng hiến.
• Nhà nghiên cứu Y sinh học và Công nghệ Tế bào gốc: Cung cấp quy trình vi phẫu BDL chuẩn xác trên động vật nhỏ, phương pháp định lượng huy động tế bào gốc bằng Flow Cytometry đa màu và các kỹ thuật nhuộm mô học chuyên sâu (Sirius Red, hóa mô miễn dịch CK7/α-SMA).
• Học viên cao học, nghiên cứu sinh ngành Khoa học Sự sống và Dược lý học: Tài liệu là hình mẫu phương pháp luận nghiên cứu kết hợp giữa đánh giá hình thái đại thể, chỉ số hóa sinh huyết tương, mô bệnh học định lượng và sinh học phân tử biểu hiện gen (qRT-PCR Livak 2^-ΔΔCt).
• Các doanh nghiệp dược phẩm sinh học và đơn vị phát triển trị liệu tiên tiến: Khai thác dữ liệu nghiên cứu về Filgrastim để mở rộng nghiên cứu phát triển chỉ định mới (drug repurposing) cho các bệnh lý xơ gan do ứ mật hiếm gặp ở trẻ em và người lớn.

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao phẫu thuật thắt ống mật chủ (BDL) được xem là mô hình tiêu chuẩn vàng cho nghiên cứu xơ gan ứ mật?

Mô hình BDL tái tạo chính xác cơ chế bệnh sinh của chứng hẹp đường mật ở người thông qua việc ngăn chặn cơ học dòng chảy của mật. Sau 7 ngày phẫu thuật, ứ đọng dịch mật làm men gan ALT và AST tăng vọt từ 13 đến 18 lần, diện tích xơ hóa tăng 7,5 lần, mô phỏng hoàn hảo các tổn thương hoại tử nhu mô gan và xơ hóa tiến triển tương tự giai đoạn cấp và bán cấp trên lâm sàng.

2. G-CSF huy động tế bào gốc nội sinh hỗ trợ điều trị tổn thương gan theo cơ chế nào?

G-CSF kích thích tủy xương tăng sinh dòng bạch cầu hạt trung tính và giải phóng enzyme protease, giúp cắt các cầu nối giữ tế bào gốc tạo máu để phóng thích chúng vào máu ngoại vi (bạch cầu tổng tăng hơn 3 lần, đạt trên 5.800 tế bào/ml). Tế bào gốc di chuyển đến gan giải phóng yếu tố tăng trưởng, tiết MMP phân giải collagen xơ và ức chế phản ứng viêm.

3. Vì sao liều G-CSF 60 µg/kg/ngày lại cho hiệu quả tốt hơn liều 30 µg/kg/ngày?

Liều 60 µg/kg/ngày giúp tối ưu hóa số lượng tế bào gốc CD3- c-Kit+ Sca-1+ huy động đến gan, duy trì tỷ lệ sống sót tuyệt đối 100% tại ngày 26 (so với 93,75% ở liều 30 µg/kg/ngày và 77,78% ở nhóm chứng). Mức độ giảm men gan AST, tăng Albumin và ức chế biểu hiện các gen tiền xơ (tgf-β1, α-sma, col1α1) ở liều 60 µg/kg/ngày đều đạt ý nghĩa thống kê vượt trội.

4. Việc phân tích đồng thời ba gen tgf-β1, α-sma và col1α1 có ý nghĩa khoa học gì?

Ba gen này phản ánh toàn diện chuỗi thác tín hiệu xơ hóa sinh học phân tử: tgf-β1 là cytokine chỉ huy phản ứng xơ, α-sma phản ánh mức độ hoạt hóa tế bào hình sao thành nguyên bào sợi, và col1α1 quy định sự tổng hợp sợi collagen type I. Kết quả qRT-PCR tại ngày 19 ghi nhận sự suy giảm đồng bộ của cả 3 gen này (p < 0,05) chứng minh G-CSF đã can thiệp tận gốc chuỗi bệnh sinh xơ gan.

5. Liệu pháp huy động tế bào gốc bằng G-CSF có thể thay thế hoàn toàn phẫu thuật ghép gan không?

G-CSF không thể thay thế hoàn toàn việc tái lập thông thương cơ học đường mật hoặc thay thế lá gan đã xơ hóa giai đoạn cuối. Tuy nhiên, liệu pháp đóng vai trò như một giải pháp trị liệu bổ trợ đắc lực giúp tái tạo nhu mô, giảm viêm hoại tử, bảo tồn chức năng gan còn lại và kéo dài thời gian sống quý báu cho bệnh nhân trong giai đoạn chờ ghép tạng.

Kết luận

• Tạo dựng thành công mô hình thực nghiệm chuẩn xác: Thiết lập hoàn chỉnh quy trình phẫu thuật thắt ống mật chủ (BDL) trên chuột nhắt trắng Swiss, tái hiện đầy đủ các đặc trưng bệnh lý ứ mật với hoạt độ men gan tăng 13-18 lần và tỷ lệ sống sau 7 ngày đạt 85,45%.
• Xác thực hiệu lực huy động tế bào gốc của G-CSF: Chứng minh phác đồ tiêm G-CSF 5 ngày liên tiếp giúp nâng số lượng bạch cầu tổng tăng gấp 3 lần và gia tăng tỷ lệ tế bào gốc CD3- c-Kit+ Sca-1+ di cư đến mô gan tổn thương.
• Chứng minh hiệu quả giảm xơ hóa và phục hồi chức năng gan: Liệu pháp G-CSF 60 µg/kg/ngày giúp nâng tỷ lệ sống sót lên 100% ở ngày 26, cải thiện chỉ số AST và Albumin, đồng thời ức chế có ý nghĩa biểu hiện các gen tiền xơ (tgf-β1, α-sma, col1α1).
• Khẳng định ưu thế của liều tối ưu: Liều điều trị G-CSF 60 µg/kg/ngày thể hiện năng lực bảo vệ tế bào và chống xơ hóa vượt trội so với liều 30 µg/kg/ngày trên cả phương diện mô bệnh học và sinh học phân tử.
• Định hướng lộ trình nghiên cứu tiếp theo: Đề xuất kế hoạch 2 năm mở rộng thử nghiệm tiền lâm sàng trên động vật bậc cao và thiết lập phác đồ phối hợp trị liệu nhằm nhanh chóng đưa liệu pháp tế bào gốc nội sinh vào ứng dụng điều trị hỗ trợ bệnh nhi hẹp đường mật tại Việt Nam. Quý độc giả, nhà khoa học và các chuyên gia y tế quan tâm có thể khai thác chi tiết số liệu toàn văn của luận văn để phục vụ công tác nghiên cứu và triển khai ứng dụng thực tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Bệnh hẹp đường mật ở trẻ sơ sinh 1. Sơ lược về gan và đường mật Gan là cơ quan nội tạng lớn nhất của cơ thể, ở người trưởng thành gan nặng khoảng 1500g, chiếm 2,5% tổng trọng lượng cơ thể (Si-Tayeb và cộng sự, 2010). Gan nằm ở bên phải khoang bụng bên dưới cơ hoành, được chia thành 2 thùy trái và phải.

Ngoài ra, dựa vào sự cung cấp máu người ta chia gan thành 8 tiểu phần, mỗi tiểu phần có hệ thống động mạch và đường ống mật riêng (hình 1. Gan nhận 25% đến 30% lượng máu từ tim thông qua các động mạch gan và nhận 70% đến 75% lượng máu từ ruột thông qua tĩnh mạch cửa [20].1: Hình ảnh bề mặt trước và sau minh họa sự phân chia thùy gan [20] Gan được chia thành 2 thùy lớn trái/phải và 8 thùy nhỏ theo thứ tự I , II, III, IV, V, VI, VII, VIII. Gan đảm nhiệm nhiều chức năng trong cơ thể: Chuyển hóa chất dinh dưỡng (Carbonhydrate, lipid, protein), chức năng tổng hợp (protein huyết tương, albumin, hormone steroid (duy trì áp lực máu), hormone angiotensinogen (điều hòa huyết áp), chức năng dự trữ (glycogen, vitamin A, E, K, B, C, đồng, sắt,…), hỗ trợ hệ thống miễn dịch, phân hủy các chất độc và thuốc, phân hủy hemoglobin tạo sắc tố mật, nội tiết kiểm soát các con đường tín hiệu tăng trưởng, cân bằng nội môi lipid và cholesterol, sản xuất dịch mật cần thiết cho quá trình tiêu hóa. Trong 3 tháng đầu tiên của thai kỳ, gan là nơi tạo hồng cầu chính cho thai nhi [21, 22].

3 Các tế bào của gan được tổ chức xung quanh đơn vị cấu trúc và chức năng của gan - tiểu thùy. Tiểu thùy gan hình trụ ở giữa có tĩnh mạch trung tâm, mặt cắt của hình trụ là các chuỗi tế bào gan sắp xếp theo hình lục giác quanh tĩnh mạch trung tâm. Ở các đỉnh của hình lục giác này là bộ ba bao gồm các nhánh của động mạch cửa, tĩnh mạch cửa và đường mật (hình 1.2: Cấu trúc tiểu thùy gan [23] Tiểu thùy gan bao gồm các bộ ba cửa chảy về tĩnh mạch trung tâm Bộ ba cửa gồm động mạch gan (hepatic artery), tĩnh mạch cửa (portal vein), nhánh ống mật (bilde duct) Các tiểu thùy có các mao mạch thành mỏng dẫn lưu bộ ba cửa về phía tĩnh mạch trung tâm. Mỗi mao mạch được lót bằng các tế bào nội mô.

Xung quanh tĩnh mạch trung tâm là các bè tế bào gan xếp theo hình nan hoa, gồm hai dãy tế bào gan xếp hướng vào tâm tiểu thùy, giữa hai dãy tế bào có một ống tiểu quản mật. Tất cả các tế bào gan đều bài tiết vào các tiểu quản mật, rồi mật chảy vào các ống mật lớn hơn 4 và cuối cùng đổ vào ống mật chủ. Vùng kết nối giữa tiểu quản mật và ống mật được gọi là “ống Hering” (canals Hering). Phức hợp liên kết giữa các tế bào gan ngăn cản không cho bilirubin vào mao mạch [19, 21].

Máu giàu oxy từ động mạch gan trộn với máu giàu chất dinh dưỡng máu từ tĩnh mạch cửa trong mao mạch trước khi chảy qua một hệ thống các khoảng xoang gan (sinusoidal space) sau đó đổ về tĩnh mạch trung tâm [21]. Gan được cấu tạo bởi sáu loại tế bào khác nhau: Tế bào gan (Hepatocyte) là quần thể tế bào biểu mô của gan, chiếm phần lớn thể tích gan và chịu trách nhiệm về hầu hết các chức năng của gan (Alberts và cộng sự, 2008). Tế bào biểu mô ống mật (biliary epithelium) là quần thể nhiều thứ hai ở gan, giúp vận chuyển và duy trì độ pH của dịch mật (Tietz và Larusso, 2006) có chức năng biểu mô như các tế bào lót không lòng ống mật [19][24]. Các tế bào ống mật cũng đóng một vai trò trong việc truyền tín hiệu nội tiết trong xơ hóa và cũng có thể góp phần kích hoạt tế bào hình sao [25].

Tế bào hình sao (hepatic stellate cells) chiếm tỷ lệ 15% tổng số tế bào gan và nằm trong khoảng Dise, tồn tại ở hai trạng thái khác nhau về chức năng và hình thái (Ignat, S. R và cộng sự, 2020) [26]. Ở trạng thái tĩnh lặng, tế bào hình sao lưu trữ vitamin A trong giọt lipid nội bào, tập trung xung quanh xoang gan. Khi gan tổn thương (nhiễm mỡ, nhiễm virut, rượu, ứ mật, stress oxy hóa) các tế bào hình sao chuyển sang trạng thái hoạt hóa giống nguyên bào sợi cơ (myofibroblast), đặc trưng bởi những thay đổi về hình thái tế bào, biểu hiện gen và tiết chemokine.

Tế bào hình sao hoạt hóa không lưu trữ vitamin A, tạo ra collagen loại I, các protein ma trận ngoại bào và α-SMA, thúc đẩy quá trình xơ hóa gan do viêm. Quá trình này góp phần tạo sẹo ở gan, có thể tiến triển thành xơ gan [24-27]. Tế bào Kupffer chiếm khoảng 30% tế bào không nhu mô trong gan, có chức năng miễn dịch và thực bào (Naito et al. KC đóng một vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh phản ứng viêm khi gan bị tổn thương [28].

Tế bào nội mô (sinusoidal endothelium) tạo ra các lỗ có kích thước từ 50–180 nm ở người hoặc 50–280 nm ở chuột nhắt và chuột cống. Tổ chức này rất quan trọng để trao đổi protein và các hạt trong giới hạn kích thước này giữa huyết tương và các loại tế bào của gan trong khi duy trì các chức năng nhất định [21]. Tế bào gốc gan có nguồn gốc từ các nguyên bào gan 5 (hepatoblasts), tế bào gốc gan biệt hóa thành các tế bào oval (oval cells), còn được gọi là tế bào tiền thân gan (hepatic progenitor cells). Những quần thể tế bào này được tìm thấy ở đoạn nối giữa các tế bào gan và ống mật, còn gọi là “ống Hering” (canals Hering) [21].

Tế bào tiền thân gan có hai tiềm năng biệt hóa thành tế bào gan và biệt hóa thành tế bào ống mật, đóng vai trò sửa chữa và tái tạo gan. Tế bào tiền thân gan được chứng minh có nguồn gốc là tế bào gốc tạo máu (heamatopoeitic stem cells) [29]. Sơ lược bệnh hẹp đường mật ở trẻ sơ sinh Bệnh hẹp đường mật là hiện tượng từng phần hoặc toàn bộ đường ống dẫn mật trong và ngoài gan có đường kính hẹp hơn so với bình thường từ khi trẻ mới sinh ra [30, 31]. Bệnh gây nên tình trạng ứ mật, dẫn tới biến chứng viêm đường mật cấp, áp xe gan, suy gan và xơ gan mật thứ cấp.

Nếu không được điều trị, chức năng gan có thể bị hủy hoại hoàn toàn, dẫn đến tử vong trước 2 tuổi [5]. Khoảng 15%-25% trẻ sơ sinh có các dị tật bẩm sinh khác: đa xơ cứng/liệt nửa người, dị tật ruột, chứng nghịch đảo phủ tạng, dị tật tim hoặc thận. Bệnh hẹp đường mật đặc trưng bởi sự tăng sinh ống mật, kích hoạt tế bào gan, tích lũy protein ma trận ngoại bào gây xơ hóa gan. Nếu không được điều trị, xơ hóa gan tiến triển thành xơ gan dẫn đến tăng áp lực tính mạch cửa, chướng bụng do cổ chướng, giãn tĩnh mạch bụng và xuất huyết tiêu hóa.

Mặc dù phẫu thuật Kasai vào thời điểm chuẩn đoán đã giúp lưu thông dòng chảy mật, xơ hóa đường mật vẫn tiến triển ở 75% số bệnh nhi. Do đó, bệnh hẹp đường mật là chỉ định phổ biến nhất để ghép gan cho trẻ em trên toàn thế giới để kéo dài sự sống [5][32][33]. Tỷ lệ mắc bệnh từ 1: 5000 đến 1: 19.000 ca sinh, bệnh xảy ra thường xuyên hơn ở các nước Châu Á so với Bắc Mỹ và Châu Âu [9]. Tỷ lệ bệnh ở các nước Châu Á (1/2700-3500), Châu Âu và Bắc Mỹ (1/5000-18.

Anh và Pháp (1/17000- 19. Tỷ lệ hẹp đường mật tăng trung bình 7,9% mỗi năm từ năm 1997 đến năm 2012 (P <0,001) [10]. Theo tổ chức JAPS (Japanese Association of Pediatric Surgeons), dựa vào vị trí hẹp trong hệ thống đường dẫn mật ngoài gan chia ra làm ba loại (hình 1.3) [5] 6  Loại I: Hẹp ống mật chủ, chiếm khoảng 5% trường hợp  Loại II: Hẹp đến ống gan chung, chiếm khoảng 2% trường hợp.  Loại III: Hẹp đến rốn gan, chiếm 90% các trường hợp.3: Hình ảnh minh họa phân loại chứng hẹp đường mật ở người [5] Các yếu tố di truyền bẩm sinh, các yếu tố môi trường bên ngoài và do hoạt động bất thường của hệ miễn dịch là 3 nhóm nguyên nhân của bệnh hẹp đường mật [9].

 Các yếu tố di truyền bẩm sinh: Do sự đột biến hoặc sai hỏng các gen liên quan đến quá trình phát triển ống mật của cơ thể. Gây ra sự phát triển không bình thường của ống mật hoặc các cơ quan gần ống mật [33]. Gen ADD3 được thể hiện trong tế bào gan và biểu mô mật, ADD3 bị lỗi có thể dẫn đến lắng đọng quá nhiều actin và myosin, góp phần đến xơ hóa đường mật [9].  Các yếu tố bên ngoài: Nhiễm virus hepatotropic, reovirus, rotavirus, cytomegalovirus [1, 5, 7, 9-11, 13, 32-35].

Các virus này tấn công trực tiếp vào ống mật, gây chết tế bào ống mật và xơ ống mật, dẩn tới sự tắc nghẽn. Phơi nhiễm độc tố [1][11][9]. Một số trường hợp hẹp đường mật có thể xảy ra do tiếp xúc với aflatoxin B1 và ở mức độ thấp hơn aflatoxin B2 trong những tháng cuối của thai kỳ [33, 35]. Bệnh viện Nhi Philadelphia đã báo cáo về một loại độc tố mới biliatresone gây ra sự phá hủy hệ thống mật trên các loài động vật cừu và dê [9].

7  Hoạt động bất thường của hệ miễn dịch. Tổn thương qua trung gian miễn dịch đối với tế bào biểu mô ống mật. Hệ thống miễn dịch tấn công vào gan hoặc ống dẫn mật mà không rõ lý do, gây chết tế bào và phá hủy hệ thống ống mật [33]. Chuẩn đoán và điều trị bệnh bệnh hẹp đường mật Bệnh nhân hẹp đường mật bị ứ đọng dịch mật ở gan, bilirubin trong dịch mật tràn vào máu, thận phải tăng đào thải qua đường tiểu.

Triệu chứng của ứ mật thường rõ ràng vào giữa tuần thứ 2 và tuần thứ 4 sau sinh. Bệnh nhân biểu hiện vàng da, có thể có gan to, chắc và bụng căng lên, phân bạc màu, nước tiểu sậm màu, nổi ngứa ở da, hấp thụ các chất dinh dưỡng kém gây ra tăng trưởng chậm [1, 5, 9]. Các xét nghiệm chuẩn đoán bệnh: Xét nghiệm máu và gan, kiểm tra siêu âm, X- quang, sinh thiết gan, acid mật trong nước tiểu, bilirubin trong phân. Mức độ huyết thanh của alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), bilirubin toàn phần, bilirubin trực tiếp, gamma glutamyl transpeptidase (GGT) và số lượng tiểu cầu được xác định trong các phòng thí nghiệm lâm sàng như một phần của đánh giá cho tất cả các bệnh nhân tắt mật.