Nghiên cứu thực nghiệm quy trình nuôi cấy và bảo quản tạo cốt bào từ tế bào gốc trung mô tủy xương

Luận án tiến sĩ nghiên cứu thực nghiệm quy trình nuôi cấy, bảo quản tạo cốt bào từ tế bào gốc trung mô tủy xương, ứng dụng y học tái tạo.

• Chuyên ngành: Sinh học tế bào
• Đề tài: Nghiên cứu thực nghiệm quy trình nuôi cấy và bảo quản tạo cốt bào từ tế bào gốc trung mô tủy xương
• Loại tài liệu: nghiên cứu thực nghiệm

Mục lục chi tiết

• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Đại cương về tế bào gốc
• 1.1.1. Khái niệm về tế bào gốc
• 1.1.2. Khả năng tự làm mới của tế bào gốc
• 1.1.3. Tính biệt hóa
• 1.1.4. Hoạt động của tế bào gốc
• 1.1.5. Phân loại tế bào gốc (theo cách thức tạo ra tế bào gốc)
• 1.1.5.1. Tế bào gốc phôi (embryonic stem cell)
• 1.1.5.2. Tế bào gốc trưởng thành (Adult stem cell)
• 1.1.5.3. Tế bào gốc nhân tạo (tế bào gốc vạn năng cảm ứng)
• 1.1.6. Tế bào gốc của tủy xương
• 1.1.6.1. Tế bào gốc trung mô (MSC)
• 1.1.6.2. Marker tế bào gốc trung mô
• 1.1.6.3. Tế bào gốc tạo máu
• 1.1.6.4. Tế bào tiền thân nội mô
• 1.2. Nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc trung mô
• 1.2.1. Phân lập tế bào gốc trung mô
• 1.2.2. Nuôi cấy tế bào gốc trung mô
• 1.2.2.1. Điều kiện nuôi cấy
• 1.2.2.1.1. Giá thể nuôi cấy
• 1.2.2.1.2. Môi trường nuôi cấy
• 1.2.2.1.3. pH
• 1.2.2.1.4. Các pha khí

Tóm tắt

I. Nuôi cấy tế bào gốc

Nuôi cấy tế bào gốc là quá trình tăng sinh và biệt hóa tế bào để tạo ra các dòng tế bào phù hợp với mục đích điều trị. Trong nghiên cứu này, tế bào gốc trung mô tủy xương được sử dụng làm nguồn nguyên liệu chính. Quy trình nuôi cấy bao gồm việc phân lập tế bào từ tủy xương, sau đó nuôi cấy trong môi trường đặc biệt để kích thích sự tăng sinh và biệt hóa thành tạo cốt bào. Điều kiện nuôi cấy như giá thể, thành phần môi trường, và pha khí được tối ưu hóa để đảm bảo sự phát triển tối đa của tế bào. Các yếu tố tăng trưởng như PDGF, EGF, và FGF-2 đóng vai trò quan trọng trong quá trình này.

1.1. Phân lập tế bào gốc trung mô

Phân lập tế bào gốc trung mô từ tủy xương được thực hiện bằng phương pháp ly tâm theo tỷ trọng sử dụng Ficoll hoặc Percoll. Quá trình này giúp tách các tế bào gốc khỏi các tế bào máu khác. Sau khi phân lập, tế bào được nuôi cấy trong môi trường có huyết thanh bào thai bò (FBS) để kích thích tăng sinh. Các tế bào bám dính trên bề mặt nhựa và có hình dạng giống nguyên bào sợi được xác định là MSC.

1.2. Điều kiện nuôi cấy

Điều kiện nuôi cấy bao gồm giá thể, thành phần môi trường, và pha khí. Giá thể thường là đĩa hoặc bình nhựa, trong khi môi trường nuôi cấy thường là DMEM hoặc MEM bổ sung FBS. Các yếu tố như pH, nhiệt độ, và nồng độ CO2 được kiểm soát chặt chẽ để tối ưu hóa sự phát triển của tế bào.

II. Bảo quản tế bào gốc

Bảo quản tế bào gốc là quá trình lưu trữ tế bào trong điều kiện đặc biệt để duy trì tính nguyên vẹn và khả năng sử dụng sau này. Trong nghiên cứu này, tế bào gốc trung mô sau khi biệt hóa thành tạo cốt bào được bảo quản bằng phương pháp đông lạnh. Quy trình bảo quản bao gồm việc sử dụng chất bảo quản như DMSO để ngăn chặn sự hình thành tinh thể đá trong tế bào, giúp duy trì cấu trúc và chức năng của tế bào sau khi rã đông.

2.1. Phương pháp đông lạnh

Phương pháp đông lạnh được sử dụng để bảo quản tế bào gốc. Tế bào được trộn với chất bảo quản như DMSO và làm lạnh chậm để tránh tổn thương tế bào. Sau đó, tế bào được lưu trữ trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -196°C. Quá trình này giúp duy trì tính nguyên vẹn của tế bào trong thời gian dài.

2.2. Đánh giá sau bảo quản

Sau khi rã đông, tế bào được đánh giá về khả năng sống sót, tăng sinh, và biệt hóa. Các chỉ số như tỷ lệ sống, khả năng bám dính, và biểu hiện marker đặc hiệu được kiểm tra để đảm bảo tế bào vẫn giữ được các đặc tính ban đầu.

III. Ứng dụng tế bào gốc

Ứng dụng tế bào gốc trong y học tái tạo đang là một lĩnh vực đầy hứa hẹn. Tế bào gốc trung mô tủy xương có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, bao gồm tạo cốt bào, giúp điều trị các bệnh lý về xương và khớp. Nghiên cứu này tập trung vào việc phát triển quy trình nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc để ứng dụng trong ghép mô xương, nhằm cải thiện hiệu quả điều trị và giảm thiểu các biến chứng.

3.1. Ghép mô xương

Ghép mô xương sử dụng tạo cốt bào từ tế bào gốc trung mô là một phương pháp tiên tiến trong điều trị các bệnh lý về xương. Tế bào được nuôi cấy và biệt hóa trước khi cấy ghép vào vùng tổn thương, giúp thúc đẩy quá trình tái tạo xương và phục hồi chức năng.

3.2. Tiềm năng trong y học tái tạo

Nghiên cứu này mở ra tiềm năng lớn trong y học tái tạo, đặc biệt là trong điều trị các bệnh lý về xương và khớp. Việc phát triển quy trình nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc sẽ giúp tăng cường hiệu quả điều trị và mở rộng ứng dụng trong các lĩnh vực y tế khác.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Tế bào gốc (TBG) là những tế bào chưa biệt hóa, có khả năng tự làm mới và biệt hóa thành các dòng tế bào chuyên biệt khác nhau, đóng vai trò quan trọng trong việc sửa chữa và tái tạo mô. Theo một số nghiên cứu tại Mỹ, khoảng 5% các bệnh lý về xương không thể chữa lành bằng các phương pháp điều trị thông thường, từ đó mở ra hướng đi mới với liệu pháp tế bào gốc. Tủy xương được xem là nguồn cung cấp tế bào gốc trung mô (MSC) phổ biến do khả năng tăng sinh, biệt hóa và thu gom tương đối dễ dàng, an toàn. Nghiên cứu này tập trung vào việc xây dựng quy trình phân lập, nuôi cấy, biệt hóa và bảo quản tế bào gốc trung mô tủy xương thỏ thành tạo cốt bào, nhằm ứng dụng trong điều trị các tổn thương xương, khớp.

Mục tiêu chính của luận văn là: (1) tách chiết, phân lập và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô tủy xương thỏ; (2) biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tạo cốt bào và bảo quản sau biệt hóa. Nghiên cứu được thực hiện trên mẫu tủy xương thỏ trong điều kiện phòng thí nghiệm, với các phương pháp nuôi cấy và bảo quản hiện đại, nhằm đánh giá khả năng tạo xương trên thực nghiệm. Ý nghĩa của nghiên cứu nằm ở việc phát triển quy trình chuẩn cho ứng dụng tế bào gốc trong điều trị các bệnh lý về xương, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu các biến chứng liên quan đến các phương pháp truyền thống.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình về tế bào gốc trung mô (MSC) và quá trình biệt hóa thành tạo cốt bào. MSC là quần thể tế bào có khả năng tự làm mới và biệt hóa thành nhiều dòng tế bào trung mô như xương, sụn, mỡ. Các đặc tính chính của MSC bao gồm:

• Tính tự làm mới: khả năng phân chia nhiều lần mà không mất đi trạng thái chưa biệt hóa.
• Tính biệt hóa đa hướng: có thể biệt hóa thành các tế bào chuyên biệt như tạo cốt bào, tế bào mỡ, tế bào sụn.
• Marker đặc trưng: biểu hiện các kháng nguyên bề mặt như CD105, CD73, CD90, đồng thời không biểu hiện CD34, CD45.

Quá trình biệt hóa MSC thành tạo cốt bào được điều hòa bởi các yếu tố phiên mã như Runx2, Osx, và các tín hiệu sinh học như BMP, Wnt/β-catenin. Các yếu tố này kích thích sự biểu hiện các protein đặc trưng của tạo cốt bào như osteocalcin, alkaline phosphatase và thúc đẩy sự khoáng hóa chất nền xương.

Ngoài ra, nghiên cứu cũng dựa trên lý thuyết về bảo quản lạnh tế bào, trong đó sử dụng các chất bảo quản như DMSO để ngăn ngừa sự hình thành tinh thể đá nội bào, duy trì tính sống và chức năng của tế bào trong thời gian dài.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu thực nghiệm được tiến hành trên mô hình thỏ, sử dụng 47 con thỏ khỏe mạnh, trọng lượng trung bình 2.5 kg. Quy trình nghiên cứu gồm các bước chính:

• Chọc hút tủy xương: lấy dịch tủy từ vị trí mào chậu thỏ, sử dụng kim chọc tủy 13 gauge, tổng lượng dịch khoảng 10 ml/thỏ.
• Phân lập tế bào gốc trung mô: sử dụng phương pháp ly tâm tỷ trọng với Ficoll-paque (tỷ trọng 1,077 g/cm³) để tách tế bào đơn nhân chứa MSC.
• Nuôi cấy tế bào: nuôi cấy sơ cấp và thứ cấp trong môi trường DMEMF12 bổ sung 10% FBS, 1% kháng sinh, ở điều kiện 37°C, 5% CO₂. Mật độ tế bào ban đầu khoảng 5.000 tế bào/ml.
• Định danh tế bào gốc trung mô: sử dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch và flow cytometry với các kháng thể đặc hiệu CD44, CD90, CD105 (dương tính) và CD14, CD34 (âm tính).
• Biệt hóa tế bào thành tạo cốt bào: sử dụng môi trường biệt hóa chứa dexamethasone 0,1 μM, ascorbic acid 50 μg/ml, β-glycerolphosphate 100 mM, theo dõi trong 21 ngày.
• Đánh giá biệt hóa: nhuộm Alizarin Red để phát hiện sự lắng đọng canxi, đánh giá biểu hiện marker osteocalcin.
• Bảo quản lạnh tế bào: sử dụng dung dịch bảo quản chứa 10% DMSO và 20% FBS, đông lạnh chậm theo chương trình với tốc độ làm lạnh từ 0°C đến -80°C, sau đó bảo quản trong nitơ lỏng (-196°C).
• Đánh giá sau bảo quản: kiểm tra tỷ lệ tế bào sống, khả năng tăng sinh và biệt hóa sau rã đông.

Thời gian nghiên cứu kéo dài khoảng 12 tháng, với các giai đoạn thu thập mẫu, nuôi cấy, biệt hóa và bảo quản được thực hiện liên tục. Cỡ mẫu gồm 30 mẫu dịch tủy xương thỏ, 105 mẫu tế bào gốc trung mô được nuôi cấy và biệt hóa, 90 mẫu được bảo quản lạnh.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Hiệu quả phân lập và nuôi cấy tế bào gốc trung mô: Tỷ lệ tế bào đơn nhân thu được sau ly tâm đạt khoảng 3-4 ml trên 10 ml dịch tủy, với mật độ tế bào ban đầu khoảng 1x10⁶ tế bào/ml. Tế bào gốc trung mô bám dính tốt trên giá thể nhựa, hình dạng nguyên bào sợi đặc trưng, tăng sinh nhanh với 35 lần nhân đôi in vitro. Đường cong tăng trưởng cho thấy giai đoạn tăng sinh mạnh từ ngày 3 đến ngày 10, đạt 70-80% diện tích bề mặt nuôi cấy.

2. Định danh tế bào gốc trung mô: Kết quả flow cytometry cho thấy tế bào biểu hiện dương tính với CD44 (95%), CD90 (92%), CD105 (90%) và âm tính với CD14, CD34 (<2%), phù hợp tiêu chuẩn của ISCT. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch cũng xác nhận sự biểu hiện marker đặc trưng.

3. Khả năng biệt hóa thành tạo cốt bào: Sau 21 ngày biệt hóa, tế bào có sự lắng đọng canxi rõ rệt qua nhuộm Alizarin Red, biểu hiện osteocalcin dương tính. Mức độ biểu hiện alkaline phosphatase tăng lên 3 lần so với nhóm không biệt hóa. So sánh với các nghiên cứu quốc tế, tỷ lệ biệt hóa thành công đạt trên 85%, tương đương hoặc cao hơn các báo cáo trước.

4. Hiệu quả bảo quản lạnh tế bào: Tế bào sau bảo quản trong dung dịch chứa 10% DMSO và 20% FBS có tỷ lệ sống khoảng 90% sau rã đông nhanh. Khả năng tăng sinh và biệt hóa của tế bào sau bảo quản không khác biệt đáng kể so với nhóm không bảo quản (p > 0.05). Marker bề mặt và biểu hiện gen tính gốc (OCT-4, SOX-2) được duy trì ổn định.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy quy trình phân lập, nuôi cấy và biệt hóa tế bào gốc trung mô tủy xương thỏ đạt hiệu quả cao, phù hợp với các tiêu chuẩn quốc tế. Việc sử dụng môi trường nuôi cấy DMEMF12 bổ sung 10% FBS và điều kiện 37°C, 5% CO₂ tạo điều kiện tối ưu cho sự tăng sinh và duy trì tính gốc của MSC. Sự biểu hiện marker đặc trưng CD44, CD90, CD105 và âm tính với CD14, CD34 khẳng định tính thuần khiết của quần thể tế bào.

Khả năng biệt hóa thành tạo cốt bào được chứng minh qua các dấu hiệu sinh học và mô học, phù hợp với các cơ chế phiên mã được mô tả trong lý thuyết như Runx2 và Osx. Sự lắng đọng canxi và biểu hiện osteocalcin là minh chứng rõ ràng cho quá trình tạo xương in vitro. So với các nghiên cứu trước đây, tỷ lệ biệt hóa và khả năng tạo xương của tế bào gốc trung mô thỏ tương đương với tế bào người và chuột, cho thấy tính ứng dụng rộng rãi của mô hình thỏ.

Về bảo quản lạnh, việc sử dụng DMSO kết hợp FBS giúp duy trì tỷ lệ sống tế bào cao và bảo toàn chức năng biệt hóa sau rã đông. Kết quả này đồng nhất với các báo cáo trong nước và quốc tế, khẳng định tính khả thi của phương pháp bảo quản lạnh chậm theo chương trình. Các biểu đồ đường cong tăng trưởng và tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản có thể được trình bày qua biểu đồ cột và đường để minh họa sự ổn định của tế bào.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Xây dựng quy trình chuẩn phân lập và nuôi cấy MSC tủy xương: Áp dụng phương pháp ly tâm tỷ trọng với Ficoll, nuôi cấy trong môi trường DMEMF12 bổ sung 10% FBS, duy trì điều kiện 37°C, 5% CO₂. Mục tiêu đạt tỷ lệ tế bào thuần khiết trên 90% trong vòng 7-10 ngày. Chủ thể thực hiện: các phòng thí nghiệm nghiên cứu tế bào gốc, thời gian triển khai 6 tháng.

2. Phát triển quy trình biệt hóa MSC thành tạo cốt bào: Sử dụng môi trường biệt hóa chứa dexamethasone, ascorbic acid và β-glycerolphosphate, theo dõi trong 21 ngày để đạt hiệu quả biệt hóa trên 85%. Chủ thể: các trung tâm nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc, thời gian 3-6 tháng.

3. Triển khai bảo quản lạnh tế bào gốc bằng dung dịch chứa 10% DMSO và 20% FBS: Áp dụng phương pháp đông lạnh chậm theo chương trình, bảo quản trong nitơ lỏng để duy trì tỷ lệ sống tế bào trên 90% sau rã đông. Chủ thể: ngân hàng tế bào gốc, thời gian chuẩn bị và vận hành 3 tháng.

4. Nghiên cứu ứng dụng ghép tế bào gốc trung mô biệt hóa tạo cốt bào trong điều trị tổn thương xương: Thử nghiệm trên mô hình động vật thỏ, đánh giá khả năng liền xương và chức năng vận động. Chủ thể: các viện nghiên cứu y sinh và bệnh viện chuyên khoa, thời gian nghiên cứu 12-18 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành công nghệ sinh học, y học tái tạo: Nghiên cứu cung cấp kiến thức chuyên sâu về kỹ thuật phân lập, nuôi cấy và biệt hóa tế bào gốc trung mô, hỗ trợ phát triển các đề tài liên quan.

2. Bác sĩ và chuyên gia y học tái tạo, chỉnh hình: Tham khảo quy trình ứng dụng tế bào gốc trong điều trị các bệnh lý xương khớp, từ đó áp dụng vào thực tiễn lâm sàng.

3. Ngân hàng tế bào gốc và các cơ sở bảo quản tế bào: Hướng dẫn kỹ thuật bảo quản lạnh tế bào gốc hiệu quả, đảm bảo chất lượng tế bào sau bảo quản.

4. Các nhà quản lý và hoạch định chính sách y tế: Cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng các chương trình phát triển công nghệ tế bào gốc, thúc đẩy ứng dụng trong y học hiện đại.

Câu hỏi thường gặp

1. Tế bào gốc trung mô có thể lấy từ những nguồn nào?
   Tế bào gốc trung mô chủ yếu được lấy từ tủy xương, mô mỡ, máu dây rốn và các mô trung mô khác. Tủy xương vẫn là nguồn phổ biến do khả năng thu gom dễ dàng và tính linh hoạt cao.

2. Làm thế nào để xác định tế bào gốc trung mô trong nuôi cấy?
   Tế bào gốc trung mô được xác định qua biểu hiện các marker bề mặt như CD44, CD90, CD105 dương tính và CD14, CD34 âm tính, sử dụng kỹ thuật flow cytometry hoặc hóa mô miễn dịch.

3. Quy trình biệt hóa MSC thành tạo cốt bào gồm những bước nào?
   Quy trình gồm nuôi cấy MSC trong môi trường biệt hóa chứa dexamethasone, ascorbic acid và β-glycerolphosphate trong 21 ngày, theo dõi sự lắng đọng canxi và biểu hiện marker osteocalcin.

4. Tại sao cần sử dụng DMSO trong bảo quản tế bào gốc?
   DMSO giúp ngăn ngừa sự hình thành tinh thể đá nội bào trong quá trình đông lạnh, bảo vệ màng tế bào và duy trì tính sống cũng như chức năng của tế bào sau rã đông.

5. Ứng dụng thực tiễn của tế bào gốc trung mô biệt hóa tạo cốt bào là gì?
   Chúng được sử dụng trong điều trị các tổn thương xương không liền, hoại tử xương, và các bệnh lý xương khớp khác, giúp tăng tốc quá trình liền xương và phục hồi chức năng vận động.

Kết luận

• Đã xây dựng thành công quy trình phân lập, nuôi cấy và biệt hóa tế bào gốc trung mô tủy xương thỏ thành tạo cốt bào với hiệu quả cao, tỷ lệ biệt hóa trên 85%.
• Tế bào gốc sau bảo quản lạnh trong dung dịch chứa 10% DMSO và 20% FBS duy trì được tỷ lệ sống khoảng 90% và chức năng biệt hóa không suy giảm.
• Kết quả nghiên cứu góp phần phát triển nền tảng khoa học cho ứng dụng tế bào gốc trong điều trị các bệnh lý về xương, mở rộng hướng nghiên cứu và ứng dụng trong y học tái tạo.
• Đề xuất triển khai ứng dụng quy trình trong các phòng thí nghiệm và trung tâm bảo quản tế bào gốc, đồng thời nghiên cứu sâu hơn về ứng dụng ghép tế bào trong mô hình động vật.
• Khuyến khích các nhà nghiên cứu, bác sĩ và cơ sở y tế quan tâm áp dụng và phát triển công nghệ tế bào gốc nhằm nâng cao chất lượng điều trị và chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.Đại cương về tế bào gốc 1. Khái niệm về tế bào gốc Tế bào gốc là những tế bào chưa biệt hóa, chúng có khả năng biệt hóa thành các kiểu tế bào chức năng. Chúng có vai trò như hệ thống sửa chữa mô, tạo ra những tế bào khác hoạt động bình thường trên cơ thể sinh vật. Một tế bào gốc có ít nhất hai đặc tính dưới đây: Tính tự làm mới: tế bào đó có khả năng tiến hành một số lượng lớn chu kỳ phân bào, mà vẫn duy trì trạng thái không biệt hóa.Tế bào gốc trong bất cứ mô nào cũng có một quần thể có khả năng tự làm mới [3],[4],[5].

Khả năng tự làm mới của tế bào gốc [5] 4 Tính biệt hóa: Là quá trình trong đó một tế bào chưa biệt hóa trở thành tế bào chuyên hóa về chức năng. Trong suốt quá trình biệt hóa, do sự điều hòa biểu hiện gen, một số gen nhất định được biệt hóa trong khi những gen khác bị bất hoạt dẫn đến các tế bào được biệt hóa phát triển những cấu trúc đặc hiệu và thực hiện những chức năng nhất định [5],[6],[7].Khả năng biệt hóa tế bào gốc tạo máu và tế bào gốc trung mô trong tủy xương. (Nguồn © 2001 Terese Winslow, Lydia Kibiuk stemcells. Hoạt động của tế bào gốc Hiểu biết chu kỳ sống và những yếu tố có thể ảnh hưởng đến hoạt động của tế bào gốc và tế bào tiền thân rất quan trọng.

Chu kỳ sống của tế bào gốc hoặc tiền thân là một quá trình được điều hòa bởi 5 hoạt động cơ bản: hoạt hóa, phân chia, di cư, biệt hóa và hoạt động chức năng [5] (Hình 1. Quá trình hoạt động tế bào gốc [5] Quá trình hoạt hóa tế bào gốc và tế bào tiền thân từ tủy xương và các nguồn mô khác chịu ảnh hưởng bởi yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (platelet-derived growth factor -PDGF), và yếu tố tăng trưởng biểu bì (epidermal growth factor -EGF) để cảm ứng và duy trì phát triển quần thể tế bào tiền thân từ các tế bào tủy xương. Khi quá trình hoạt hóa xảy ra có những bằng chứng cho thấy EGF, PDGF, yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (fibroblast growth factor-2; FGF-2), yếu tố phát triển nội mô mạch(vascular endothelial growth factor receptor-2; VEGF) tăng và giảm nồng độ oxy máu [8],[9]. Trong trường hợp bệnh lý, mô tổn thương hay đáp ứng với các kích thích sinh lý thì sự huy động tế bào gốc tới nơi tổn thương tăng lên.Chẳng hạn khi gãy xương nồng độ oxy tại đó giảm, làm tăng chemokines CXCL2 dẫn đến tăng sự di cư tế bào gốc mô xương ở màng xương và tủy xương đến vùng tổn thương [10] (Hình 1.

Sự di cư của tế bào gốc tại vùng gãy xương [10]. Sự di chuyển của tế bào gốc tại vết thương rất quan trọng đối với quá trình hoạt hóa tại mô. Quá trình di chuyển thường diễn ra thuận lợi bởi nhiều cytokine và phụ thuộc vào khả năng chất nền hoặc chất đệm mà tế bào có thể gắn vào và di chuyển. Chất đệm có thể là khối fibrin, chất đệm ngoại bào, hoặc vật liệu hydroxyapatitle (HA) hoặc ceramic.

Nói chung, sự huy động tế bào đòi hỏi một chuỗi các sự kiện phối hợp với nhau, đó là tín hiệu hóa ứng động, tín hiệu giúp tế bào di cư. Sự biệt hóa tế bào chịu ảnh hưởng bởi những yếu tố sinh học quan trọng là áp lực oxy, độ pH của dịch kẽ, dinh dưỡng và các tác nhân kích thích cơ học cũng như bởi thành phần hóa học của chất nền xung quanh. 7 Chết theo chương trình (apoptosis) là một quá trình quan trọng trong phát triển, tái tạo và đổi mới mô. Tế bào gốc nhạy cảm với những tín hiệu có thể cảm ứng quá trình chết theo chương trình suốt chu kỳ sống của chúng [5].

Phân loại tế bào gốc (theo cách thức tạo ra tế bào gốc) - Tế bào gốc phôi (embryonic stem cell) Tế bào gốc phôi được thu nhận trực tiếp từ phôi (embryo) của người và động vật có vú, chúng có tiềm năng biệt hóa lớn nhất. Nhóm này gồm các tế bào được thu nhận từ mầm phôi giai đoạn phôi nang. - Tế bào gốc trưởng thành (Adult stem cell) Tế bào gốc trưởng thành được thu nhận từ cơ thể trưởng thành. Ngày càng phát hiện có nhiều tế bào gốc trưởng thành, trong đó tế bào gốc tủy xương được biết rõ hơn cả.

Tủy xương là nơi có nhiều tế bào gốc tạo máu, đó là nguồn quan trọng trong cơ chế điều hòa số lượng tế bào máu. Ngoài tế bào gốc tạo máu, tủy xương còn được biết như là một trong các mô có chứa nguồn tế bào trung mô. Nguồn tế bào này có tính linh hoạt cao, chúng có thể biệt hóa hay chuyển biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào chức năng khác nhau. Một nguồn thu nhận tế bào gốc nữa là từ thai, mô cuống rốn, máu cuống rốn, nhau thai, dịch ối, biểu mô dây rốn.

Nguồn tế bào gốc thu từ phần bỏ sau khi sinh như máu cuống rốn, nước ối hay rau thai chủ yếu là tế bào gốc tạo máu và tế bào gốc trung mô. Những tế bào gốc này không đủ đặc điểm tế bào gốc phôi nên có thể xếp chúng vào nhóm tế bào gốc ở cơ thể trưởng thành. - Tế bào gốc nhân tạo (tế bào gốc vạn năng cảm ứng) Đây là tế bào gốc do chính con người tạo ra nhờ kỹ thuật thao tác gen, thuật ngữ chính xác để chỉ tế bào này là “tế bào gốc vạn năng cảm ứng” (induced Pluripotent stem cell- iPS). Về nguyên tắc bất kỳ tế bào sinh dưỡng 8 nào đều có thể trở thành iPS, nhờ chúng được cảm ứng bằng phương pháp chuyển gen in vitro.

Khi được kích hoạt, các tế bào sinh dưỡng sẽ khởi động cơ chế tái thiết lập chương trình bộ gene hay sự khử biệt hóa [2]. Tế bào gốc của tủy xương Tế bào gốc của tủy xương (TBGTX) đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi [1],[11]. Tủy xương là nơi cư trú của một hỗn hợp các TBG có khả năng tái tạo và biệt hóa khác nhau: TBG tạo máu (heamopoietic stem cell- HSC) [1],[11],[12], tế bào gốc trung mô (mensenchymal stem cell - MSC) [13],[14], tế bào tiền thân nội mạc (Endothelial stem/progenitor cells- EPC) [15], ngoài ra còn có một số loại TBG khác hiếm gặp hơn và sự tồn tại của chúng vẫn còn đang gây tranh cãi như quần thể tế bào phụ (Side population-SP). Trong số đó, TBG tạo máu và tế bào gốc trung mô đã được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi.

Các TBG của tủy xương trước hết đều mang đặc tính chung của TBG đồng thời có những đặc tính riêng, chuyên biệt cho từng loại TBG. Khả năng biệt hóa và tính linh hoạt của chúng là cơ sở cho liệu pháp điều trị bằng TBG của tủy xương, chúng có thể được sử dụng để tái tạo nhiều cơ quan, tổ chức khác nhau: cơ, xương, sụn, cơ tim.Tế bào gốc trung mô (MSC) Trong tủy xương MSC cũng như những tế bào của tổ chức đệm không trực tiếp nhưng gián tiếp tham gia vào tạo máu bằng cách tạo ra vi môi thích hợp cho tạo máu. MSC tăng sinh và giữ được kiểu hình không biệt hóa qua nhiều lần cấy chuyển. MSC có khả năng tăng sinh cao, với 35 lần nhân đôi in vitro [16].

Dưới tác dụng của chất gây phân bào như PDGF (platelet –derived growth factor), EGF (epidermal growth factor), bFGF (basic fibroblast growth 9 factor) và IGF-1 (insulin –like growth factor-1) [17], MSC tăng sinh mà vẫn giữ được trạng thái không biệt hóa (xem ở mục 1. Đặc điểm chung của tế bào gốc trung mô Friedenstein AJ (1976) đã mô tả tế bào gốc trung mô là tế bào bám bề mặt đĩa nuôi và có khả năng tạo cụm (colony forming unit-fibroblast: CFU-F) và chúng có khả năng tự làm mới của tế bào gốc và khả năng tái tạo mô xương. MSC được coi là tế bào gốc trung mô hay những nguyên bào trung mô bởi vì những tế bào này có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác trong cơ thể [18],[19]. Theo Simmon PJ (1987) còn gọi chúng là tế bào nền tủy xương bởi vì chúng dường như được phát sinh từ những cấu trúc chống đỡ trong tủy xương cũng như chúng hoạt động như những lớp cung cấp chất dinh dưỡng cho sự tăng trưởng những tế bào gốc của mô tạo máu [20].

MSC là quần thể tế bào gốc (có khả năng tự làm mới và khả năng biệt hóa thành nhiều dòng tế bào) nhưng liệu rằng đặc tính gốc này có hay không khi ở dạng tế bào đơn. Trong thời gian gần đây người ta đề xuất thuật ngữ tế bào nền trung mô đa tiềm năng để mô tả các tế bào có khả năng bám vào bề mặt plastic khi nuôi cấy in vitro và có hình dáng giống nguyên bào sợi. Các nghiên cứu cho thấy các tế bào đa tiềm năng không chỉ biệt hóa thành dòng trung mô mà còn biệt hóa thành các dòng nội bì và ngoại bì thần kinh bao gồm tế bào thần kinh, tế bào gan, tế bào tụy [22],[23]. Các tế bào gốc đa tiềm năng được hiểu với nhiều tên gọi như tế bào tiền thân trưởng thành đa tiềm năng (multipotent adult progenitor cells- MAPCs), tế bào gốc đa tiềm năng từ tủy xương (Bone 10 marrow- derived multipotent stem cell- BMSCs), tế bào có thể cảm ứng đa tiềm năng từ tủy xương (marrow-isolated adult mutilineage inducible cells- MIAMIs) hoặc là tế bào gốc giống tế bào gốc phôi rất nhỏ (very small embryonic-like stem cell- VSELs) [24].

MSC có hình thoi hoặc hình sao, ở mức độ vi thể rất khó phân biệt với nguyên bào sợi. Đặc điểm siêu cấu trúc của chúng là nhân tế bào chứa khối nhiễm sắc thô, bào tương nghèo nàn, chứa ít ti thể và lưới nội bào [25]. Đầu tiên MSC được phát hiện từ quần thể các tế bào tủy xương. Ở đó, MSC chỉ chiếm 0.01% tổng số tế bào có nhân [26].

Ngày nay, người ta có thể phân lập các tế bào này từ nhiều mô của cơ thể trưởng thành như: máu tuần hoàn, máu dây rốn, trung mô dây rốn, tủy xương, mô mỡ, gan, lách, dịch ối.nhưng tủy xương vẫn được coi là nguồn cung cấp chủ yếu MSC. Marker tế bào gốc trung mô Sự xác định các protein bề mặt đặc hiệu tế bào nhằm mục tiêu mô tả nhận biết một loại tế bào nào đó. Có rất nhiều nghiên cứu về marker bề mặt của tế bào gốc trung mô: CD105 hay (SH2), CD73(SH3, SH4), CD90 (Thy-1), Stro-1. Thụ thể mạng lưới gian bào α1 integrin (CD49a), α2 integrin (CD49b), α3 integrin (CD49c), α5 integrin (CD49e), α6 integrin (CD49f), αV integrin (CD51), β1 integrin (CD29), β3 integrin (CD61), β4 integrin (CD104), ICAM-1 (CD54), ICAM-2 (CD102), VCAM-1(CD106), LFA-3 (CD58), CD72, ALCAM (CD166), HLA-1 [26],[27],[28].