CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1. VI KHUẨN Helicobacter pylori 1. Nguồn gốc và phân loại Vào năm 1981, Robin Warren, nhà Giải phẫu bệnh người Úc, đã phát hiện được một loại vi khuẩn ở niêm mạc dạ dày của bệnh nhân bị viêm hoặc loét dạ dày và hình dạng của chúng giống vi khuẩn thuộc giống Campylobacter cho nên tên gọi đầu tiên của chúng là Campylobacter pylori. Đến năm 1983, Barry Marshall, người Úc, đã thành công trong việc nuôi cấy, phân lập vi khuẩn này từ mảnh sinh thiết dạ dày của bệnh nhân bị viêm dạ dày mạn, loét dạ dày, loét tá tràng và ghi nhận đặc tính tăng trưởng khác nhau giữa chúng với Campylobacter pylori.
Cho đến năm 1989, dưới kính hiển vi điện tử, vi khuẩn này không giống Campylobacter vì có cấu trúc lông khác hẳn, bên cạnh đó, còn có những khác biệt lớn trong tính chất sinh hoá và cấu trúc chuỗi 16S rRNA cho nên cuối cùng loài vi khuẩn này được xếp vào một giống mới, giống Helicobacter, thuộc họ Helicobacteraceae và được đổi tên là Helicobacter pylori [24], [25]. Dịch tễ học Một trong những nhiễm khuẩn mạn tính thường gặp nhất ở người mà các tác giả trong và ngoài nước thường hay nhắc đến đó chính là nhiễm H. Qua nhiều nghiên cứu nhận thấy tuổi, tình trạng kinh tế, xã hội và chủng tộc đã ảnh hưởng rất lớn đến tần suất nhiễm H. Đã có khoảng hơn nửa dân số thế giới bị nhiễm H.
pylori và tần suất nhiễm có sự khác biệt rất lớn giữa các nước phát triển và các nước đang phát triển. Ở các nước đang phát triển như Ấn Độ, Saudi Arabia, Việt Nam và châu Phi có tỉ lệ nhiễm H. pylori khá cao chiếm khoảng 80% ở lứa tuổi trên 20 tuổi. Trong khi đó, ở các 4 nước phát triển như Anh, Úc và Pháp, tỉ lệ nhiễm thấp hơn 10 – 20% và tăng khoảng 1% mỗi năm [11], [26], [27].
Nguyên nhân của sự khác biệt này chủ yếu là do vệ sinh môi trường, cụ thể như sự phát triển của hệ thống hiện đại trong việc xử lý nước và chất thảy ở các nước phát triển [28], [29], [30]. Riêng về tuổi, trẻ em phần lớn bị nhiễm ở độ tuổi từ 2 – 8, trong đó các nước phát triển tỉ lệ nhiễm cũng thấp hơn như tần suất nhiễm ở trẻ em Nhật Bản dưới 10 tuổi rất thấp chỉ có 5% và cũng tăng dần theo tuổi [27]. Thêm vào đó, ở các nước phát triển, người lớn có độ tuổi bị nhiễm thường trên 50 tuổi và tần suất này tăng thêm 10% mỗi năm, trong khi các nước đang phát triển có độ tuổi nhiễm sớm hơn thường trên 20 tuổi. Ở Việt Nam, Nguyễn Sào Trung (2005) đã ghi nhận tần suất nhiễm H.
pylori cao ở độ tuổi từ 31 - 50 tuổi [31]. Đường lây nhiễm chủ yếu là đường ăn uống (phân - miệng) hoặc lây trực tiếp (miệng - miệng) qua nước bọt. Ở những nơi có điều kiện vệ sinh kém, nước và thức ăn bị nhiễm là nguồn lây quan trọng ban đầu. Đó cũng chính là lý do giải thích tại sao ở các nước đang phát triển tần suất nhiễm H.
pylori cao hơn rất nhiều [11], [28], [32], [33]. Đặc điểm sinh học của H. Hình thể và dinh dưỡng Hình 1. Vi khuẩn Helicobacter pylori * Nguồn: McColl K.
(2010) [34] Helicobacter pylori là vi khuẩn Gram âm, hình cong, xoắn nhẹ, dài 1,5 - 5µm, đường kính 0,3 - 1µm. Bề mặt vi khuẩn nhẵn, vỏ mỏng, có 4 - 6 lông, 5 đầu mút hình củ hành, nhờ đó H. pylori di chuyển được trong lớp nhầy của niêm mạc dạ dày bởi chuyển động xoắn (Hình 1. Helicobacter pylori thuộc loại vi khuẩn vi hiếu khí, mọc chậm nên phải nuôi cấy từ 4 - 7 ngày.
Vi khuẩn mọc trên các môi trường chuyên biệt như Pylori agar, Skirrow cải tiến hoặc trên các môi trường Columbia, Brucella, BHI agar có thêm 7 – 10% máu ngựa hoặc máu cừu tươi, để ở 37 oC trong điều kiện có 5% O2, 10% CO2, 85% N2 và độ ẩm cao. Môi trường chọn lọc thường có thêm các thuốc kháng sinh như vancomycin, trimethoprim và amphotericin B để ức chế tạp nhiễm. Helicobacter pylori có thể tăng trưởng được ở nhiệt độ từ 30 – 40oC, chịu được môi trường pH từ 5,5 - 8,5 và sống nhiều tháng ở âm 70oC trong môi trường thích hợp [24]. Kết quả có thể đọc sau 3 - 5 ngày nuôi cấy (hoặc có thể để đến 14 ngày) với các khuẩn lạc tròn, bóng, màu xám trong, đường kính từ 0,5 – 1mm, không tan máu hoặc tan máu alpha.
Đặc biệt, tiêu chuẩn xác định H. pylori sau nuôi cấy là khuẩn lạc phải cho kết quả dương tính với các thử nghiệm oxidase, catalase và urease, trong đó thử nghiệm urease cho dương tính nhanh và mạnh. * Thử nghiệm oxydase Lấy 1mm khuẩn lạc trong suốt đặt lên giấy thấm. Nhỏ thuốc thử TMPD 0,1% (TMPD: N,N,N’,N’-Tetramethyl-p-phenylenediamine).
Cytochrom C khử + H+ + O2 Cytochrom oxy hóa + H2O Cytochrom oxy hóa + TMPD khử TMPD oxy hóa (màu xanh) Đọc kết quả ngay sau 30 giây: phản ứng (+) tính thì sinh khối chuyển màu xanh và phản ứng (-) tính sinh khối vẫn còn màu trắng (Hình 1. Thử nghiệm oxydase của Helicobacter pylori * Nguồn: Lê Văn Phủng (2009) [35] * Thử nghiệm catalase Lấy 1mm khuẩn lạc trong suốt đặt lên lame kính sạch. H2O2 H2O + O2 (bọt khí) Catalase Đọc kết quả ngay sau 1 - 2 giây: phản ứng (+) tính thì có bọt khí xuất hiện và phản ứng (-) tính không có bọt khí (Hình 1. Thử nghiệm catalase của Helicobacter pylori * Nguồn: Lê Văn Phủng (2009) [35] * Thử nghiệm urease Thử nghiệm urease nhằm phát hiện gián tiếp sự có mặt của H.
pylori thông qua urease của chúng. pylori sản xuất urease có hoạt tính rất cao, vì vậy, chỉ cần đưa mảnh sinh thiết có chứa H. pylori hoặc khuẩn lạc của H. pylori vào một lượng nhỏ dung dịch urea có chỉ thị màu.
Lúc này hoạt tính urease của vi khuẩn sẽ nhanh chóng phân hủy urea thành ammonia, làm môi trường trở thành kiềm hóa và chỉ thị màu sẽ thay đổi từ màu vàng thành màu hồng cánh sen. Kết quả đọc trong vòng 20 phút với độ đặc hiệu gần như 100% (Hình 1. Thử nghiệm urease của Helicobacter pylori * Nguồn: Lê Văn Phủng (2009) [35] Đồng thời trên tiêu bản nhuộm Gram, hình thể vi khuẩn H. pylori đa số là hình cong, mức độ xoắn không điển hình như trên tiêu bản trực tiếp từ mảnh sinh thiết, có thể có cả hình trực khuẩn (Hình 1.5) và nếu để sau 10 ngày nuôi cấy, có thể xuất hiện các thể hình cầu [24], [36], [37].
Hình ảnh nhuộm Gram của Helicobacter pylori * Nguồn: O'Rourke J. Tính chất hóa sinh và kháng nguyên urease của H. pylori Urease là một trong những enzyme chủ yếu trong sinh bệnh học của H. Trọng lượng phân tử của urease khoảng 550 kDa.
Enzyme này mang tính quan trọng sống còn đối với H. pylori trong môi trường dạ dày. Urease có tên hệ thống là carbamine amidohydrolase, là enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân urea thành ammonia và acid carbonic: urease (NH2)2CO + H2O NH3 + NH2COOH NH2COOH + H2O NH3 + H2CO3 8 NH3 vừa được tạo ra nhanh chóng hợp nước để tạo thành NH4+ và OH-. H2CO3 H+ + HCO3- 2NH3 + 2H2O 2NH4+ + 2OH- Gốc OH- này kết hợp với gốc H+ của acid HCl trong dịch nhày ở niêm mạc dạ dày, từ đó làm tăng dần pH ở bề mặt niêm mạc dạ dày từ thấp đến trung tính và tạo nên một lớp đệm pH trung tính bao quanh H.
Cơ chế tác động này của urease đã giúp H. pylori không bị tác động của môi trường acid mạnh (pH < 4) ở dạ dày (Hình 1. Bên cạnh đó, urease còn là tác nhân kích thích mạnh mẽ hoạt động thực bào đơn nhân và sản sinh ra các cytokine gây viêm. Đồng thời, NH3 còn gây độc trực tiếp lên tế bào và phá vỡ liên kết giữa các tế bào làm tổn thương niêm mạc dạ dày.
Như vậy, urease biểu hiện cả hai chức năng: vừa là tác nhân xâm lấn và cũng vừa là tác nhân gây độc. Urease là một trong những mục tiêu quan trọng nhất trong việc phát triển thuốc để kiểm soát nhiễm H. pylori ở dạ dày [39], [40], [41], [42], [43]. Vai trò của H.
pylori urease trong nhiễm H. pylori * Nguồn: Follmer C. Cơ chế xâm lấn của H. pylori vào dịch nhày dạ dày * Nguồn: Bansil R.
(2013) [39] 9 Trong bảng phân loại enzyme theo quy ước quốc tế, urease mang mã số EC 3. Vào năm 1926, urease lần đầu tiên được Summer tách chiết từ đậu rựa (jack bean). Urease là các tinh thể có 8 cạnh, không màu, trong suốt, quan sát được dưới kính hiển vi và có đường kính d = 4 – 30µm tùy theo phương pháp tách chiết. Khối lượng phân tử của urease được Polacco và Havir xác định bằng phương pháp lọc gel trên cột agarose A-15m đối với urease đậu rựa và đậu nành Brazil.
Urease đậu nành có 2 phân tử lượng khác nhau 540 kDa và 420 kDa, còn urease đậu rựa chỉ có một phân tử lượng là 480 kDa. Như vậy, urease từ những nguồn khác nhau có phân tử lượng khác nhau và ngay cả trong cùng một nguồn đậu nành đã có tới 2 loại urease. Hai loại urease này khác nhau ở thành phần apoenzyme nhưng bản chất của coenzyme vẫn không thay đổi. Các apoenzyme là những chuỗi polypeptide được hình thành từ nhiều acid amine, mà thành phần của các acid amine này thì không giống nhau ở những nguồn khác nhau, điều này lý giải sự khác nhau về khối lượng phân tử giữa chúng [45], [46].
Urease dễ dàng hòa tan trong dung dịch ammonia loãng và dung dịch kiềm loãng, có thể hòa tan hoặc đông tụ trong dung dịch muối loãng và acid hữu cơ tùy thuộc nồng độ acid. Điểm đẳng điện của urease nằm trong khoảng pH = 5,0 – 5,1 và tại điểm đẳng điện độ hòa tan của urease cực nhỏ. Urease cũng mang những đặc tính của protein như tan trong nước và dung dịch muối loãng; không đi qua được màng thẩm tích vì có kích thước phân tử lớn; tan khi có lớp áo nước và tích điện; tủa khi mất lớp áo nước và trung tính; bị biến tính dưới tác dụng của acid, kiềm đặc, các ion kim loại nặng và nhiệt độ cao; dễ bị tủa thuận nghịch trong các dung môi hữu cơ 10 (ethanol, acetone.) hoặc muối ammonium sulfate, sodium chloride; tính chất hóa lý có thể thay đổi khi kết hợp với cơ chất, coenzyme, ion kim loại hoặc một số chất hữu cơ đặc hiệu khác; và phân tử enzyme có thể tồn tại ở các trạng thái ion như anion, cation hoặc trung hòa tùy theo pH của môi trường.