Luận văn thạc sĩ sinh học thực nghiệm nghiên cứu tính an toàn của thể tiết ngoại bào từ tế bào gốc trung mô dây rốn trên in vitro và trên động vật thực nghiệm

Luận văn thạc sĩ sinh học thực nghiệm nghiên cứu tính an toàn của thể tiết ngoại bào từ tế bào gốc trung mô dây rốn trên in vitro và động vật thực nghiệm.

• Tác giả: Nguyễn Thá Hoa
• Người hướng dẫn: TS. Lê Thùy Dương
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Ngành Sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tính An Toàn Của Thể Tiết Ngoại Bào Từ Tế Bào Gốc Trung Mô Dây Rốn
• Loại tài liệu: Thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MẶC LẠC
• DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC BIỂU ĐỒ
• DANH MỤC HÌNH
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 1.1. TẾ BÀO GỐC VÀ THỂ TIẾT NGOÀI BÀO
• 1.2. THỂ TIẾT NGOÀI BÀO
• 1.3. ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG OXY TRONG NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC
• 1.4. ỨNG DỤNG TẾ BÀO GỐC VÀ THỂ TIẾT NGOÀI BÀO TRONG Y HỌC
• 1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. THỂ TIẾT NGOÀI BÀO
• 2.2. ĐỘNG VẬT NGHIÊN CỨU
• 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.4. THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU
• 2.5. CỠ MẪU NGHIÊN CỨU
• 2.6. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ ĐÁNH GIÁ
• 2.6.1. ĐÁNH GIÁ NỘI ĐỘC TỐ, VI SINH VẬT, NẤM VÀ GÂY TAN MÁU TRÊN IN VITRO
• 2.6.2. ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP, ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN, QUÁ MẪN HỆ THỐNG VÀ KÍCH ỨNG BỀ MẶT NHÃN CẦU
• 2.7. ĐẶC ĐIỂM TRONG NGHIÊN CỨU
• 2.8. SƠ ĐỒ CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. KẾT QUẢ NỘI ĐỘC TỐ, VI SINH VẬT, NẤM VÀ GÂY TAN MÁU TRÊN IN VITRO
• 3.2. KẾT QUẢ ĐỘC TÍNH CẤP, BÁN TRƯỜNG DIỄN, QUÁ MẪN HỆ THỐNG VÀ KÍCH ỨNG BỀ MẶT NHÃN CẦU
• 3.2.1. ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG
• 3.2.2. ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN
• 3.2.3. ĐÁNH GIÁ TÍNH GÂY QUÁ MẪN HỆ THỐNG TRÊN THỎ
• 3.2.4. ĐÁNH GIÁ TÍNH KÍCH ỨNG BỀ MẶT NHÃN CẦU
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu

Nghiên cứu tính an toàn của thể tiết ngoại bào từ tế bào gốc trung mô dây rốn là một đề tài quan trọng trong lĩnh vực y học tái tạo. Tế bào gốc từ dây rốn không chỉ có khả năng tự làm mới mà còn có thể biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau. Việc sử dụng thể tiết ngoại bào từ các tế bào này trong điều trị bệnh lý đang được nghiên cứu và đánh giá một cách nghiêm túc. Đặc biệt, tính an toàn sinh học của sản phẩm từ tế bào gốc là yếu tố quyết định trong việc ứng dụng lâm sàng. Nghiên cứu này sẽ tập trung vào việc đánh giá các chỉ số an toàn như độc tính, khả năng gây phản ứng viêm và kích ứng trong các thí nghiệm trên động vật.

II. Tính an toàn của thể tiết ngoại bào

Để đánh giá tính an toàn của thể tiết ngoại bào, nhiều phương pháp đã được áp dụng. Một trong số đó là đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn trên các mô hình động vật. Các thí nghiệm này cho thấy rằng thể tiết ngoại bào từ tế bào gốc trung mô có thể được sử dụng mà không gây ra các tác dụng phụ nghiêm trọng. Cụ thể, việc tiêm thể tiết ngoại bào vào chuột thí nghiệm không ghi nhận sự gia tăng đáng kể về các chỉ số sinh lý bất thường, từ đó cho thấy tính an toàn của sản phẩm này trong điều trị. Ngoài ra, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng khả năng sinh sản của các tế bào này không bị ảnh hưởng bởi việc sử dụng thể tiết ngoại bào.

III. Đánh giá hiệu quả lâm sàng

Nghiên cứu về thể tiết ngoại bào từ tế bào gốc trung mô dây rốn không chỉ dừng lại ở việc đánh giá an toàn mà còn mở rộng đến hiệu quả lâm sàng. Các thử nghiệm cho thấy rằng thể tiết ngoại bào có khả năng thúc đẩy quá trình tái tạo mô và làm giảm viêm. Những kết quả này có thể góp phần vào việc phát triển các phương pháp điều trị mới cho các bệnh lý như tổn thương mô, viêm nhiễm và các bệnh lý mãn tính khác. Hơn nữa, việc sử dụng thể tiết ngoại bào có thể giảm thiểu các tác dụng phụ so với phương pháp điều trị truyền thống, nhờ vào tính chất tự nhiên và khả năng điều hòa miễn dịch của chúng.

IV. Kết luận và khuyến nghị

Từ các kết quả nghiên cứu, có thể khẳng định rằng thể tiết ngoại bào từ tế bào gốc trung mô dây rốn là một sản phẩm tiềm năng trong y học tái tạo với tính an toàn cao. Tuy nhiên, cần tiếp tục thực hiện các nghiên cứu sâu hơn để khẳng định tính hiệu quả và an toàn của sản phẩm này trong các thử nghiệm lâm sàng. Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và phân lập thể tiết ngoại bào, cũng như đánh giá lâu dài các tác động của chúng trên cơ thể sống.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong những năm gần đây, tế bào gác trung mô (TBGTM) và thể tiết ngoại bào (EV) từ TBGTM đã trở thành chủ đề nghiên cứu trọng điểm trong lĩnh vực y học tái tạo và điều trị các bệnh lý mãn tính. Tại Việt Nam, việc sử dụng TBGTM từ dây rốn và thể tiết của chúng được nuôi cấy trong môi trường oxy sinh lý (khoảng 2%) đã mở ra nhiều triển vọng mới trong điều trị các bệnh lý như thiếu máu cục bộ, tổn thương mô, và các bệnh thoái hóa. Tuy nhiên, một trong những thách thức lớn là đảm bảo tính an toàn của sản phẩm thể tiết ngoại bào trước khi ứng dụng lâm sàng.

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là đánh giá tính an toàn của thể tiết ngoại bào từ tế bào gác trung mô dây rốn nuôi cấy trong điều kiện oxy sinh lý, thông qua các thử nghiệm in vitro và in vivo trên mô hình động vật thí nghiệm. Nghiên cứu tập trung vào các chỉ tiêu như độ tinh khiết, vô khuẩn, độc tính cấp và bán trường diễn, tính gây quá mẫn và kích ứng bề mặt nhãn cầu.

Phạm vi nghiên cứu được thực hiện tại Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec và Học viện Quân y trong khoảng thời gian từ tháng 1 đến tháng 8 năm 2023. Kết quả nghiên cứu không chỉ góp phần làm rõ tính an toàn của sản phẩm thể tiết ngoại bào mà còn tạo tiền đề cho các thử nghiệm lâm sàng trong tương lai, đồng thời nâng cao hiệu quả và độ tin cậy của liệu pháp tế bào trong y học tái tạo.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên hai khung lý thuyết chính: lý thuyết về tế bào gác trung mô (Mesenchymal Stem Cells - MSCs) và lý thuyết về thể tiết ngoại bào (Extracellular Vesicles - EVs). MSCs là loại tế bào đa năng có khả năng tự tái tạo và biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, đồng thời tiết ra các yếu tố sinh trưởng và cytokine có tác dụng điều hòa miễn dịch và tái tạo mô. EVs là các túi màng lipid kép có kích thước nano (30-150 nm đối với exosomes), chứa protein, lipid, RNA và các phân tử sinh học khác, đóng vai trò trung gian trong giao tiếp tế bào và truyền tín hiệu sinh học.

Ba khái niệm chính được sử dụng trong nghiên cứu gồm:

• Tế bào gác trung mô dây rốn: nguồn tế bào dễ thu thập, có khả năng sinh sản và điều hòa miễn dịch cao.
• Thể tiết ngoại bào (EV): sản phẩm tiết ra từ MSCs, mang các yếu tố sinh học quan trọng cho quá trình tái tạo và điều hòa miễn dịch.
• Môi trường oxy sinh lý: điều kiện nuôi cấy với nồng độ oxy khoảng 2%, gần với điều kiện sinh lý trong cơ thể, giúp tăng cường khả năng sinh sản và hoạt tính của MSCs cũng như chất lượng EV.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp mô tả, cắt ngang, có đối chứng với các nhóm thử nghiệm khác nhau. Cỡ mẫu gồm 36 con chuột nhắt trắng Swiss, 30 con chuột trắng Wistar và 36 con thỏ khỏe mạnh, được chọn ngẫu nhiên theo tiêu chuẩn khoa học và đáp ứng yêu cầu về động vật thí nghiệm.

Nguồn dữ liệu chính là thể tiết ngoại bào thu nhận từ tế bào gác trung mô dây rốn của 5 thai phụ khỏe mạnh, nuôi cấy trong môi trường oxy sinh lý 2%. Các mẫu EV được phân lập bằng phương pháp ly tâm siêu tốc, kiểm tra chất lượng qua các tiêu chí như kích thước, dấu ấn bề mặt, độ tinh khiết, vô khuẩn và nồng độ nội độc tố.

Phân tích dữ liệu sử dụng phần mềm SPSS 22.0 với các phương pháp thống kê phù hợp như ANOVA để so sánh các nhóm, mức ý nghĩa thống kê được đặt ở p < 0,05. Thời gian nghiên cứu kéo dài từ tháng 1 đến tháng 8 năm 2023, bao gồm các bước thu thập mẫu, phân lập EV, thử nghiệm in vitro và in vivo, đánh giá độc tính và phân tích kết quả.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Độ tinh khiết và vô khuẩn của sản phẩm EV: Các mẫu EV thu nhận từ tế bào gác trung mô dây rốn nuôi cấy trong môi trường oxy sinh lý đạt tiêu chuẩn về protein tổng số, kích thước trung bình 50-150 nm, không phát hiện vi sinh vật, nấm và nội độc tố với mức < 0,5 EU/mL, đảm bảo an toàn cho thử nghiệm tiếp theo.

2. Đánh giá tính gây tan máu in vitro: Thể tiết ngoại bào không gây tan máu trong các thời điểm quan sát từ 15 phút đến 3 giờ, chứng tỏ không có tác động tiêu cực lên hồng cầu.

3. Độc tính cấp và bán trường diễn trên chuột: Không có trường hợp tử vong hoặc biểu hiện bất thường về vận động, ăn uống, cân nặng trong 72 giờ và 30 ngày theo dõi. Các chỉ số huyết học (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu) và sinh hóa gan thận (AST, ALT, ure, creatinin) không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nhóm thử nghiệm và nhóm chứng (p > 0,05).

4. Tính gây quá mẫn và kích ứng bề mặt nhãn cầu trên thỏ: Sau 15 ngày tiêm EV với liều cao nhất 1000 microgam/kg, không ghi nhận các phản ứng quá mẫn, không có dấu hiệu kích ứng mắt như chảy nước mắt, viêm kết mạc hay tổn thương giác mạc theo đánh giá lâm sàng và nhuộm fluorescein.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy thể tiết ngoại bào từ tế bào gác trung mô dây rốn nuôi cấy trong điều kiện oxy sinh lý có tính an toàn cao, phù hợp với các tiêu chuẩn quốc tế về sản phẩm tế bào và sinh học tái tạo. Việc không phát hiện nội độc tố và vi sinh vật đảm bảo tính vô khuẩn, giảm thiểu nguy cơ gây sốc nhiễm khuẩn khi sử dụng lâm sàng.

Độc tính cấp và bán trường diễn không ghi nhận tác động bất lợi lên các chỉ số sinh học quan trọng, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về EV từ các nguồn MSC khác nhau. Tính không gây tan máu và không kích ứng nhãn cầu cũng khẳng định tính an toàn của sản phẩm trong các ứng dụng điều trị liên quan đến máu và mắt.

Các biểu đồ so sánh chỉ số huyết học và sinh hóa gan thận giữa các nhóm thử nghiệm và nhóm chứng có thể được trình bày để minh họa sự tương đồng và không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, làm rõ hơn tính an toàn của EV.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tiếp tục nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I nhằm đánh giá tính an toàn và hiệu quả của thể tiết ngoại bào từ TBGTM dây rốn trong điều trị các bệnh lý mắt và mô mềm, với mục tiêu giảm thiểu tác dụng phụ và tăng cường khả năng tái tạo mô trong vòng 12-18 tháng tới.

2. Phát triển quy trình sản xuất EV chuẩn hóa theo tiêu chuẩn GMP, đảm bảo tính đồng nhất và chất lượng sản phẩm, nhằm phục vụ cho các nghiên cứu lâm sàng và thương mại hóa trong 2-3 năm tiếp theo.

3. Mở rộng nghiên cứu cơ chế tác động của EV trên các mô đích khác nhau, đặc biệt là trong điều kiện bệnh lý mãn tính, nhằm tối ưu hóa liều lượng và phương pháp sử dụng, dự kiến hoàn thành trong 24 tháng.

4. Tăng cường hợp tác quốc tế và đào tạo chuyên sâu cho đội ngũ nghiên cứu và sản xuất về kỹ thuật phân lập, kiểm soát chất lượng và ứng dụng EV, nhằm nâng cao năng lực nghiên cứu và ứng dụng tại Việt Nam trong 1-2 năm tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và chuyên gia y sinh học tái tạo: Nghiên cứu này cung cấp dữ liệu quan trọng về tính an toàn của EV từ TBGTM dây rốn, hỗ trợ phát triển các liệu pháp tế bào mới.

2. Bác sĩ lâm sàng và chuyên gia điều trị bệnh lý mắt, mô mềm: Thông tin về tính an toàn và tiềm năng ứng dụng EV giúp họ có cơ sở lựa chọn phương pháp điều trị tiên tiến.

3. Doanh nghiệp công nghệ sinh học và dược phẩm: Luận văn cung cấp cơ sở khoa học để phát triển sản phẩm EV thương mại, đồng thời hướng dẫn quy trình kiểm soát chất lượng.

4. Sinh viên và học viên cao học ngành sinh học, y học tái tạo: Đây là tài liệu tham khảo quý giá về phương pháp nghiên cứu, đánh giá an toàn và ứng dụng EV trong y học hiện đại.

Câu hỏi thường gặp

1. Thể tiết ngoại bào (EV) là gì và tại sao lại quan trọng trong y học tái tạo?
   EV là các túi nhỏ được tế bào tiết ra, chứa protein, RNA và các phân tử sinh học khác, giúp truyền tín hiệu giữa các tế bào. Chúng có khả năng thúc đẩy tái tạo mô và điều hòa miễn dịch, làm tăng hiệu quả điều trị các bệnh mãn tính.

2. Tại sao nuôi cấy tế bào gác trung mô trong môi trường oxy sinh lý lại được ưu tiên?
   Môi trường oxy sinh lý (khoảng 2%) gần với điều kiện tự nhiên trong cơ thể, giúp tế bào duy trì khả năng sinh sản, giảm lão hóa và tăng chất lượng thể tiết ngoại bào, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị.

3. Các thử nghiệm an toàn được thực hiện như thế nào trong nghiên cứu này?
   Nghiên cứu tiến hành đánh giá vô khuẩn, nội độc tố, gây tan máu in vitro, độc tính cấp và bán trường diễn trên chuột, tính gây quá mẫn và kích ứng nhãn cầu trên thỏ, đảm bảo sản phẩm an toàn trước khi ứng dụng lâm sàng.

4. Kết quả nghiên cứu có thể áp dụng trực tiếp vào điều trị bệnh nhân không?
   Kết quả này là bước đầu đánh giá tính an toàn, tạo tiền đề cho các thử nghiệm lâm sàng tiếp theo. Việc áp dụng trực tiếp cần có thêm các nghiên cứu về hiệu quả và liều lượng phù hợp.

5. Làm thế nào để đảm bảo chất lượng và tính đồng nhất của sản phẩm EV trong sản xuất?
   Cần xây dựng quy trình sản xuất chuẩn hóa theo tiêu chuẩn GMP, kiểm soát nghiêm ngặt các chỉ tiêu về kích thước, dấu ấn bề mặt, vô khuẩn và nội độc tố, đồng thời đào tạo nhân sự chuyên môn cao để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

Kết luận

• Thể tiết ngoại bào từ tế bào gác trung mô dây rốn nuôi cấy trong môi trường oxy sinh lý có tính an toàn cao, không gây độc tính cấp, bán trường diễn, quá mẫn hay kích ứng nhãn cầu trên mô hình động vật.
• Sản phẩm đáp ứng các tiêu chuẩn về vô khuẩn, không chứa nội độc tố và không gây tan máu in vitro.
• Kết quả nghiên cứu tạo tiền đề vững chắc cho các thử nghiệm lâm sàng và ứng dụng trong y học tái tạo, đặc biệt trong điều trị các bệnh lý mắt và mô mềm.
• Cần tiếp tục phát triển quy trình sản xuất chuẩn hóa và mở rộng nghiên cứu cơ chế tác động của EV để tối ưu hóa hiệu quả điều trị.
• Khuyến nghị các nhà nghiên cứu, bác sĩ và doanh nghiệp công nghệ sinh học tham khảo và ứng dụng kết quả nghiên cứu nhằm thúc đẩy phát triển liệu pháp tế bào tại Việt Nam.

---

Nghiên cứu này không chỉ góp phần nâng cao hiểu biết về tính an toàn của thể tiết ngoại bào từ TBGTM dây rốn mà còn mở ra hướng đi mới cho các liệu pháp điều trị tiên tiến, hứa hẹn mang lại lợi ích thiết thực cho cộng đồng y học tái tạo trong tương lai gần.

Trích đoạn nội dung tài liệu

0 Bà GIÁO DĀC VIàN HÀN LÂM KHOA HàC VÀ ĐÀO T¾O VÀ CÔNG NGHà VIàT NAM HâC VIäN KHOA HâC VÀ CÔNG NGHä NGUYâN THà HOA NGHIÊN CĆU TÍNH AN TOÀN CĄA THà TI¾T NGO¾I BÀO TĈ T¾ BÀO GàC TRUNG MÔ DÂY RàN TRÊN IN VITRO VÀ TRÊN ĐÞNG VÀT THĀC NGHIäM LUÀN VN TH¾C S) NGÀNH SINH HâC THĀC NGHIäM Hà Nội - 2023 0 Bà GIÁO DĀC VIàN HÀN LÂM KHOA HàC VÀ ĐÀO T¾O VÀ CÔNG NGHà VIàT NAM HâC VIäN KHOA HâC VÀ CÔNG NGHä NGUYâN THà HOA NGHIÊN CĆU TÍNH AN TOÀN CĄA THà TI¾T NGO¾I BÀO TĈ T¾ BÀO GàC TRUNG MÔ DÂY RàN TRÊN IN VITRO VÀ TRÊN ĐÞNG VÀT THĀC NGHIäM LUÀN VN TH¾C S) NGÀNH SINH HâC THĀC NGHIäM Mã sá: 8420114 NG¯äI H¯âNG DÀN KHOA HàC: 1. Lê Thß Thuỳ D°¡ng 2.TS Lê Thß Đông Ph°¡ng Hà Nội - 2023 i LâI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu trong luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tôi và nhóm nghiên cứu thực hiện. Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách quan nhất. Đồng thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ một nghiên cứu nào.

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực nếu sai tôi hoàn chịu trách nhiệm trước pháp luật. Nguyãn Thá Hoa ii Lãi cÁm ¢n Tr°ãc tiên, em xin gửi låi cảm ¡n và biết ¡n sâu sắc đến TS. Lê Thß Thùy D°¡ng - Vián Công nghá Sinh hác, Vián Hàn lâm Khoa hác Công nghá Viát Nam và PGS.TS Lê Thß Đông Ph°¡ng - Bánh vián Trung °¡ng Quân đái 108, ng°åi đã tận tình h°ãng dÁn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong suát thåi gian nghiên cąu làm luận vn. Em cũng xin gửi låi cảm ¡n đến toàn thể các thầy cô Hác vián Khoa hác và Công nghá, ban Lãnh đ¿o, phòng Đào t¿o, các phòng chąc nng đã t¿o điều kián cho em trong quá trình hác tập, nghiên cąu t¿i tr°ång.

Những kiến thąc mà em nhận đ°ÿc sẽ là hành trang giúp em vững b°ãc trong t°¡ng lai. Em xin cảm ¡n các thầy, cô và nhóm nghiên cąu Vián nghiên cąu tế bào gác và công nghá gen Vinmec, Bá môn Sinh lý bánh, Bá môn PhÁu thuật thực hành, thực nghiám - Hác vián Quân y, đã tận tình h°ãng dÁn, giúp đỡ để hoàn thành luận vn này. Cuái cùng, em xin cảm ¡n gia đình, b¿n bè, ng°åi thân đã luôn ç bên để đáng viên và là nguồn cổ vũ lãn lao, là đáng lực giúp em hoàn thành luận vn này. Mặc dù đã cá gắng hoàn thành luận vn trong khả nng có thể.

Tuy nhiên sẽ không tránh khßi những thiếu sót. Em rất mong nhận đ°ÿc sự cảm thông và tận tình chỉ bảo căa quý thầy cô và toàn thể các b¿n. iii Măc lăc Trang Trang phā bìa Låi cam đoan i Låi cảm ¡n ii Māc lāc iii Danh māc chữ, k礃Ā hiáu viết tắt trong luận án v Danh māc bảng vi Danh māc biểu đồ vii Danh māc hình vii Må đÅu 1 NÞI DUNG 3 Ch°¢ng 1: TäNG QUAN NGHIÊN CĆU 3 1. T¿ bào gác và thá ti¿t ngo¿i bào 3 1.2 Thể tiết ngo¿i bào 4 1.

Ành hưởng của môi trường oxy trong nuôi cấy tế bào gốc 8 1. Ćng dăng t¿ bào gác và thá ti¿t ngo¿i bào trong y hãc 12 1. Tình hình nghiên cću trong và ngoài n°ác 14 Ch°¢ng 2: ĐàI T¯ĀNG VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĆU 18 2. Thể tiết ngo¿i bào 18 2.

Đáng vật nghiên cąu 18 2. Ph°¢ng pháp nghiên cću 18 2. Thiết kế nghiên cąu 18 2. Cỡ mÁu nghiên cąu 19 iv 2.

Nái dung nghiên cąu và đánh giá 19 2. Đánh giá nội độc tố, vi sinh vật, nấm và gây tan máu trên 19 invitro 2.2 Đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn, quá mẫn hệ 21 thống và kích ứng bề mặt nhãn cầu 2. Đ¿o đćc trong nghiên cću 24 S¡ đồ các b°ãc tiến hành nghiên cąu 25 Ch°¢ng 3: K¾T QUÀ VÀ THÀO LUÀN 26 3. K¿t quÁ nßi đßc tá, vi sinh vÁt, nÃm và gây tan máu 26 trên in vitro 3.

K¿t quÁ đßc tính cÃp, bán tr°ãng diãn, quá m¿n hå tháng 29 và kích ćng bß mặt nhãn cÅu 3. Đánh giá đác tính cấp trên chuát nhắt trắng 29 3. Đác tính bán tr°ång dißn 29 3. Đánh giá tính gây quá mÁn há tháng trên thß 31 3.

Đánh giá tính kích ąng bề mặt nhãn cầu 49 K¾T LUÀN VÀ KI¾N NGHà 52 TÀI LIäU THAM KHÀO 53 PHĂ LĂC 62 v Danh măc các ký hiåu, các chÿ vi¿t tắt Vi¿t tắt PhÅn vi¿t đÅy đą EV : Extracellular Vesicles (thể tiết ngo¿i bào) LAL : Limulus Amebocyte Lysate (chất thử nái đác tá) LD50 : Lethal Dose 50% (liều chết 50%) TBGTM : Tế bào gác trung mô MSC : Mesenchymal Stem Cells (tế bào gác trung mô) MV : Microvesicles (vi h¿t) HIF : Hypoxia Inducible Factor (yếu tá điều hòa oxy) PDGF : Platelet-Derived Growth Factor (yếu tá tng tr°çng tiểu cầu) VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor (yếu tá tng tr°çng nái m¿ch) AD : Average dose (liều trung bình) HGF : Hepatocyte Growth Factor (yếu tá tng tr°çng tế bào gan) CAR-T : Chimeric antigen Receptor T-cell therapy (liáu pháp tế bào thā thể kháng nguyên d¿ng khảm) PBS : Phosphate Buffered Saline ( dung dßch đám) TNF : Tumor Necrosis Factor (yếu tá ho¿i tử khái u) vi Danh măc bÁng BÁng Tên bÁng Trang 1. Các tiêu chí đánh giá chất l°ÿng căa sản ph¿m thể tiết ngo¿i bào 7 3. Kết quả xét nghiám vi sinh vật, nái đác tá và tồn d° dung môi 26 3. Toàn tr¿ng và sá chuát chết trong 72 giå 29 3.

Kết quả theo dõi sąc khße toàn thân thß 32 3. Kết quả theo dõi tráng l°ÿng thß trong thí nghiám 33 3. Nhiát đá thß trong thí nghiám 34 3. Sá l°ÿng hồng cầu thß trong thí nghiám 35 3.

L°ÿng huyết sắc tá thß trong thí nghiám 35 3. Sá l°ÿng b¿ch cầu thß trong thí nghiám 36 3. Sá l°ÿng tiểu cầu thß trong thí nghiám 36 3. Nồng đá ure thß trong thí nghiám 37 3.

Nồng đá creatinin thß trong thí nghiám 38 3. Nồng đá AST thß trong thí nghiám 39 3. Nồng đá ALT thß trong thí nghiám 39 3. Kích ąng bề mặt nhãn cầu 49 vii Danh măc các biáu đã Biáu đã Tên biáu đã Trang 3.

Nồng đá Histamin huyết t°¡ng thß sau khi tiêm EV 43 3.2 Nồng đá IL-1 huyết t°¡ng thß sau khi tiêm EV từ TBG 44 3. Nồng đá IL-6 huyết t°¡ng thß sau khi tiêm EV từ TBG 44 3. Nồng đá IFN-gama huyết t°¡ng thß sau khi tiêm EV 45 3. Nồng đá IgE huyết t°¡ng 46 3.

Nồng đá TNF-anpha huyết t°¡ng thß sau khi tiêm EV 47 Danh măc hình Hình Tên hình Trang 1. Các lo¿i thể tiết ngo¿i bào (EVs) do mát tế bào tiết ra 5 1. Quá trình hình thành và vật chất mang căa mßi lo¿i thể tiết 6 khác nhau 1. Quy trình nuôi cấy tế bào, phân lập thể tiết và kiểm soát chất l°ÿng 6 1.

C¡ chế căa điều kián oxy sinh l礃Ā đái vãi thúc đ¿y tiềm nng 10 ąng dāng trß liáu 1. Thành phần căa exosomes 13 1. Thể tiết tiết ra từ TBGTM căa ng°åi trong các mô hình bánh 15 2. Tiêm EV tĩnh m¿ch đuôi chuát 23 3.

Giải phÁu đ¿i thể chuát thí nghiám 30 3. Giải phÁu bánh gan, thận 31 3. Hình ảnh giải phÁu đ¿i thể vùng bāng và vi thể gan, thận căa thß 48 1 Mä ĐÄU - Lý do chán đề tài: æ Viát Nam cũng nh° nhiều n°ãc trên thế giãi, sử dāng tế bào gác trung mô (TBGTM) và thể tiết căa tế bào gác trung mô (EV) đ°ÿc nuôi cấy trong môi tr°ång có nồng đá oxy cao (khoảng 20%), cao h¡n nhiều so vãi nồng đá oxy sinh lý căa tế bào trong c¡ thể là từ 2 - 9% để điều trß mát sá bánh mà hián nay ch°a có ph°¡ng pháp điều trß hiáu quả. Gần đây, các công bá cho thấy rằng các tế bào đ°ÿc nuôi cấy trong điều kián có nồng đá oxy cao khi truyền vào c¡ thể có thåi gian sáng ngắn h¡n khi so sánh vãi tế bào gác trung mô đ°ÿc nuôi cấy trong môi tr°ång oxy sinh lý.

Bên c¿nh những công bá TBGTM dây rán có tác đá tng sinh và khả nng tự làm mãi kéo dài h¡n so vãi các dòng TBGTM từ tăy x°¡ng và mô mỡ thì các dòng tế bào này còn có có tác đá tng sinh và chất l°ÿng tát h¡n khi nuôi cấy trong điều kián có nồng đá oxy c¡ thể. H¡n nữa các nghiên cąu cũng chỉ ra các TBGTM nói chung và TBGTM dây rán nói riêng khi nuôi cấy trong môi tr°ång có nồng đá oxy sinh lý cũng tiết ra l°ÿng thể tiết nhiều h¡n, ho¿t tính sinh hác cao đ°ÿc ąng dāng nhiều trong y hác tái t¿o, trß liáu tế bào. Sử dāng thể tiết TBGTM dây rán vào y hác đã đ°ÿc nhiều nghiên cąu công bá, Bánh vián Đa khoa Quác tế Vinmec là trung tâm đầu tiên nghiên cąu ąng dāng thể tiết vào điều trß bánh và đang nghiên cąu thể tiết căa TBGTM nuôi cấy trong điều kián oxy sinh lý. Vì vậy, đánh giá tính an toàn căa sản ph¿m là yêu cầu c¡ bản đầu tiên nên chúng tôi thực hián nghiên cąu này tập trung đánh giá chất l°ÿng sản ph¿m tr°ãc khi thử nghiám in vivo nh° nái đác tá, tính vô khu¿n, đác tính, quá mÁn và kích ąng nhãn cầu& qua đó làm tiền đề cho tiến tãi thử nghiám vãi các mô hình bánh lý ç mắt hoặc các c¡ quan khác.

- Māc đích nghiên cąu: Đánh giá nái đác tá, vi sinh vật và gây tan máu căa thể tiết ngo¿i bào từ tế bào gác trung mô dây rán trên in vitro Đánh giá đác tính cấp, đác tính bán tr°ång dißn, tính gây quá mÁn và kích ąng bề mặt nhãn cầu căa EV từ TBGTM dây rán trên đáng vật thực nghiám. 2 - Nái dung nghiên cąu: + Đánh giá nái đác tá, vi sinh vật và gây tan máu: sản ph¿m EV từ tế bào gác trung mô dây rán đã đ°ÿc đánh giá các chỉ tiêu nh°: Protein tổng sá; Sá l°ÿng thể tiết thu đ°ÿc; Kích th°ãc trung bình thể tiết; Dấu ấn thể tiết. Đánh giá mát sá nái dung nh° nái đác tá bằng ph°¡ng pháp LAL, vi sinh vật vãi há tháng BACTEX. + Đánh giá đác tính cấp, đác tính bán tr°ång dißn, tính gây quá mÁn và kích ąng bề mặt nhãn cầu: Đác tính cấp đ°ÿc thử nghiám liều cao trên chuát nhắt trắng chăng Swiss nhằm xác đßnh liều chết 100% từ đó xác đßnh LD50.

Vãi đác tính bán tr°ång dißn thử nghiám trên chuát cáng trắng chăng Wistar đánh giá bằng theo dõi toàn tr¿ng, xét nghiám huyết hác, sinh hóa và giải phÁu đ¿i thể, vi thể gan, thận, lách.