Luận án về nuôi tạo tấm biểu mô từ tế bào gốc biểu mạc miệng

Nghiên cứu nuôi tạo tấm biểu mô từ tế bào gốc niêm mạc miệng (NMM) đã trở thành một lĩnh vực quan trọng trong y học… 147 trang · Trường Đại Học Y Dược · 2023.

• Trường học: Trường Đại Học Y Dược
• Chuyên ngành: Y học
• Đề tài: Nghiên Cứu Nuôi Tạo Tấm Biểu Mô Từ Tế Bào Gốc Niêm Mạc Miệng
• Loại tài liệu: đề tài nghiên cứu
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Cấu trúc của bề mặt nhãn cầu
• 1.2. Vùng rìa củng-giác mạc
• 1.3. Các yếu tố liên quan đảm bảo sự toàn vẹn của BMNC
• 1.4. Phim nước mắt
• 1.5. Sự toàn vẹn của hai cung phản xạ điều tiết nước mắt
• 1.6. Chức năng của tế bào biểu mô BMNC được hỗ trợ bởi nguyên bào sợi nhu mô và chất cơ bản
• 1.7. Cấu trúc biểu mô bề mặt khoang miệng
• 1.8. Hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc
• 1.9. Biểu hiện lâm sàng của hội chứng suy giảm vùng rìa
• 1.10. Phương pháp điều trị hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc
• 1.11. Những nghiên cứu về nuôi tạo tấm biểu mô NMM
• 1.12. Các loại nền nuôi cấy tế bào
• 1.13. Chuẩn bị mẫu mô NMM và xử lý miếng mô cho nuôi cấy
• 1.14. Môi trường nuôi cấy
• 1.15. Định danh tế bào của tấm biểu mô NMM nuôi cấy
• 1.16. Ứng dụng lâm sàng của tấm biểu mô NMM
• 1.16.1. Ứng dụng trong nhãn khoa
• 1.16.2. Ứng dụng lâm sàng trong các lĩnh vực khác
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
• 2.2.1. Mô hình nghiên cứu
• 2.2.2. Quy trình nuôi cấy
• 2.2.3. Chuẩn bị trang thiết bị cần thiết cho nuôi cấy
• 2.2.4. Thực nghiệm trên thỏ
• 2.2.5. Chuẩn bị màng ối
• 2.2.6. Chuẩn bị lớp 3T3 làm nền nuôi cấy
• 2.2.7. Chuẩn bị mảnh mô NMM cho nuôi cấy
• 2.2.8. Môi trường nuôi cấy, quy trình nuôi cấy và theo dõi
• 2.2.9. Thu hoạch và định danh tế bào nuôi cấy
• 2.2.10. Thử nghiệm trên BN tự nguyện
• 2.3. Chỉ tiêu nghiên cứu
• 2.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.5. Thiết kế nghiên cứu
• 2.6. Xử lí số liệu nghiên cứu
• 2.7. Đạo đức nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Kết quả nghiên cứu về nuôi tạo tấm biểu mô trên thỏ thực nghiệm
• 3.1.1. Lựa chọn vị trí sinh thiết và kích thước mảnh mô nuôi cấy
• 3.1.2. Lựa chọn môi trường nuôi cấy
• 3.1.3. Lựa chọn phương pháp nuôi cấy
• 3.1.4. Hình thái và tốc độ phát triển của tấm biểu mô được nuôi cấy bằng các phương pháp khác nhau
• 3.1.5. Hình thái và tốc độ phát triển của lớp nguyên bào sợi
• 3.1.6. Kết quả định danh tế bào tấm biểu mô nuôi cấy bằng hóa mô miễn dịch
• 3.1.7. Kết quả ghép tấm biểu mô NMM nuôi cấy cho thỏ gây bỏng thực nghiệm
• 3.2. Kết quả nuôi cấy tấm biểu mô NMM từ tế bào gốc NMM trên người
• 3.2.1. Lựa chọn vị trí sinh thiết và kích thước mảnh mô nuôi cấy
• 3.2.2. Lựa chọn môi trường nuôi cấy
• 3.2.3. Lựa chọn phương pháp nuôi cấy
• 3.2.4. Hình thái và tốc độ phát triển của tấm biểu mô
• 3.2.5. Kết quả định danh tế bào tấm biểu mô nuôi cấy bằng hóa mô miễn dịch
• 3.3. Kết quả ghép tấm biểu mô NMM nuôi cấy
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Về lựa chọn nền nuôi cấy
• 4.2. Về vị trí và kích thước của mảnh NMM dùng cho nuôi cấy
• 4.3. Về môi trường nuôi cấy
• 4.4. Về phương pháp nuôi cấy
• 4.4.1. Phương pháp nuôi cấy bằng mảnh mô
• 4.4.2. Phương pháp nuôi bằng dịch treo
• 4.4.3. Phương pháp nuôi bằng mảnh biểu mô
• 4.5. Về chất lượng tấm biểu mô nuôi cấy
• 4.6. Vấn đề tồn tại cần nghiên cứu tiếp để hoàn thiện quy trình nuôi cấy tấm biểu mô NMM
• PHỤ LỤC
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu

Nghiên cứu nuôi tạo tấm biểu mô từ tế bào gốc niêm mạc miệng (NMM) đã trở thành một lĩnh vực quan trọng trong y học tái tạo. Tế bào gốc từ NMM có khả năng phân chia và tái tạo, giúp phục hồi các tổn thương ở bề mặt nhãn cầu (BMNC). Việc sử dụng tế bào gốc này không chỉ mang lại hy vọng cho những bệnh nhân bị tổn thương giác mạc mà còn mở ra hướng đi mới trong điều trị các bệnh lý khác. Nghiên cứu này nhằm xác định vị trí, kích thước mảnh mô NMM và môi trường nuôi cấy phù hợp để tạo ra tấm biểu mô có chất lượng cao.

1.1. Tầm quan trọng của tấm biểu mô NMM

Tấm biểu mô NMM có cấu trúc tương tự như biểu mô giác mạc, giúp duy trì sự trong suốt và chức năng của giác mạc. Việc nuôi cấy tấm biểu mô này từ tế bào gốc NMM đã được chứng minh là hiệu quả trong việc điều trị hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc (LSCD). Nghiên cứu cho thấy rằng tấm biểu mô NMM nuôi cấy có thể thay thế cho các phương pháp ghép mô truyền thống, giảm thiểu nguy cơ thải loại và cải thiện khả năng phục hồi thị lực cho bệnh nhân.

II. Cấu trúc và chức năng của bề mặt nhãn cầu

Bề mặt nhãn cầu (BMNC) bao gồm biểu mô giác mạc và kết mạc, có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ và duy trì chức năng thị giác. Biểu mô giác mạc là lớp ngoài cùng, có khả năng tái tạo nhờ vào các tế bào gốc nằm ở lớp đáy. Sự toàn vẹn của BMNC phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm phim nước mắt và các tế bào biểu mô. Các yếu tố này không chỉ bảo vệ mà còn cung cấp độ ẩm cần thiết cho giác mạc. Việc nghiên cứu cấu trúc và chức năng của BMNC giúp hiểu rõ hơn về cơ chế tổn thương và phục hồi của giác mạc.

2.1. Các yếu tố đảm bảo sự toàn vẹn của BMNC

Sự toàn vẹn của BMNC được đảm bảo bởi nhiều yếu tố như mi mắt, phim nước mắt và các tế bào biểu mô. Mi mắt có tác dụng bảo vệ BMNC khỏi các sang chấn cơ học, trong khi phim nước mắt giúp duy trì độ ẩm và bảo vệ bề mặt giác mạc. Các tế bào biểu mô đóng vai trò quan trọng trong việc tái tạo và phục hồi bề mặt nhãn cầu. Nghiên cứu cho thấy rằng sự tương tác giữa các yếu tố này là rất cần thiết để duy trì chức năng thị giác.

III. Phương pháp nuôi cấy tấm biểu mô NMM

Phương pháp nuôi cấy tấm biểu mô NMM từ tế bào gốc đã được phát triển với nhiều kỹ thuật khác nhau. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc lựa chọn môi trường nuôi cấy và phương pháp nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến chất lượng của tấm biểu mô. Các phương pháp như nuôi cấy bằng mảnh mô, dịch treo và mảnh biểu mô đều có những ưu điểm riêng. Việc tối ưu hóa quy trình nuôi cấy sẽ giúp tăng tỷ lệ thành công trong việc tạo ra tấm biểu mô có chất lượng cao.

3.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy

Các yếu tố như môi trường nuôi cấy, kích thước mảnh mô và phương pháp nuôi cấy đều có ảnh hưởng đến sự phát triển của tấm biểu mô NMM. Nghiên cứu cho thấy rằng việc lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp có thể cải thiện đáng kể tốc độ phát triển và chất lượng của tấm biểu mô. Ngoài ra, việc xác định kích thước mảnh mô cũng là một yếu tố quan trọng, ảnh hưởng đến khả năng tái tạo và phục hồi của tấm biểu mô.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng

Kết quả nghiên cứu cho thấy tấm biểu mô NMM nuôi cấy có hình thái và cấu trúc tương đồng với biểu mô giác mạc bình thường. Việc ghép tấm biểu mô NMM nuôi cấy cho bệnh nhân bị tổn thương giác mạc đã cho thấy tỷ lệ thành công cao. Nghiên cứu này không chỉ mở ra hướng đi mới trong điều trị các bệnh lý về giác mạc mà còn có thể áp dụng trong nhiều lĩnh vực khác trong y học. Tấm biểu mô NMM nuôi cấy có thể trở thành một giải pháp hiệu quả cho những bệnh nhân không còn vùng rìa giác mạc.

4.1. Ứng dụng trong điều trị tổn thương giác mạc

Việc sử dụng tấm biểu mô NMM nuôi cấy trong điều trị tổn thương giác mạc đã cho thấy nhiều ưu điểm. Tấm biểu mô này không chỉ giúp phục hồi chức năng thị giác mà còn giảm thiểu nguy cơ thải loại mảnh ghép. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng tấm biểu mô NMM có thể thay thế cho các phương pháp ghép mô truyền thống, mang lại hy vọng cho những bệnh nhân bị tổn thương cả hai mắt.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tổn thương bề mặt nhãn cầu (BMNC) xuất phát từ nhiều nguyên nhân lâm sàng như bỏng mắt do hóa chất hoặc nhiệt độ, hội chứng Stevens-Johnson, nhiễm khuẩn nặng, phẫu thuật lặp lại nhiều lần hoặc biến chứng do kính tiếp xúc. Hậu quả phổ biến và nghiêm trọng của các bệnh lý này là hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc (Limbal Stem Cell Deficiency - LSCD). Tình trạng này làm mất độ trong suốt của giác mạc do màng xơ mạch từ kết mạc xâm lấn, gây loét biểu mô kéo dài khó hàn gắn, tróc biểu mô tái phát hoặc thủng giác mạc, dẫn đến suy giảm thị lực nặng nề.

Về mặt can thiệp ngoại khoa, phương pháp ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy từ tế bào gốc vùng rìa tự thân mang lại hiệu quả cao nhưng không thể áp dụng cho các trường hợp tổn thương toàn bộ vùng rìa ở cả hai mắt. Ngược lại, phương pháp ghép đồng loại (dị thân) đòi hỏi người bệnh phải dùng thuốc ức chế miễn dịch lâu dài và đối mặt với nguy cơ thải loại mảnh ghép cao. Trong khi đó, biểu mô niêm mạc miệng (NMM) có cùng nguồn gốc ngoại bì phôi thai và là loại biểu mô lát tầng không sừng hóa tương đồng với biểu mô giác mạc, có chứa tế bào gốc ở lớp đáy có tiềm năng tăng sinh tốt. Luận án được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống trong việc ứng dụng nguồn tế bào gốc tự thân từ niêm mạc miệng để nuôi tạo tấm biểu mô thay thế biểu mô giác mạc tại Việt Nam.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm:

1. Xác định vị trí, kích thước mảnh mô niêm mạc miệng và môi trường nuôi cấy phù hợp cho nuôi tạo tấm biểu mô.
2. Xác định phương pháp phù hợp để nuôi tạo tấm biểu mô niêm mạc miệng.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Thỏ thực nghiệm Orytolagus Cuniculus (số lượng 64 con, trọng lượng 2kg ± 0,2kg do Trung tâm nghiên cứu Dê và Thỏ Sơn Tây cung cấp); mảnh mô niêm mạc miệng của thỏ; mảnh mô niêm mạc miệng của 17 bệnh nhân mắc hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa cả hai mắt; dòng tế bào nuôi 3T3; màng ối người thu thập từ các ca mổ đẻ đủ điều kiện y tế.
• Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm in vitro và in vivo kết hợp đánh giá lâm sàng, thực hiện tại Bộ môn Mô - Phôi (Trường Đại học Y Hà Nội) phối hợp với Bộ môn Tế bào - Mô phôi và Lý sinh (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên) và Bệnh viện Phụ sản Hà Nội.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước đây đã thiết lập những nền tảng quan trọng về giải phẫu, sinh học tế bào và kỹ thuật nuôi cấy tái tạo bề mặt nhãn cầu:

• Về mặt giải phẫu và sinh học vùng rìa giác mạc: Davanger M. và các tác giả đã mô tả cấu trúc ranh giới củng - giác mạc và sự phân bố tế bào biểu mô vùng rìa không chứa tế bào hình đài.
• Về phương pháp ghép biểu mô giác mạc nuôi cấy: Pellegrini và cộng sự (1997) là nhóm tác giả đầu tiên mô tả kỹ thuật nuôi cấy và ghép tế bào gốc biểu mô vùng rìa giác mạc. Ryusuke Homma và cộng sự (2004) đã thử nghiệm nuôi tế bào gốc phôi trên nền collagen type IV để tái thiết bề mặt giác mạc chuột.
• Về ứng dụng tế bào gốc niêm mạc miệng: Nghiên cứu của các tác giả đầu tiên đã nuôi cấy thành công tấm biểu mô NMM ghép tự thân cho thỏ bị bỏng giác mạc và công bố ca ghép trên người bị LSCD toàn bộ.
• Về giá đỡ sinh học (scaffold) và nền nuôi cấy: Izumi K. ứng dụng chân bì da tử thi không tế bào (AlloDerm); Fukuda K. nghiên cứu cấu trúc và chức năng nền màng ối; Higa, Hirayama và cộng sự (2012) nghiên cứu giá đỡ fibrin; Nishida K. (2004, 2010), Hori Y. (2008), Kocaba và cộng sự (2010) sử dụng đĩa nuôi cấy phủ polymer nhạy cảm nhiệt Poly(N-isopropylacrylamide) (IPAAm); Ilmarinen T. (2009) dùng lồng nuôi phủ collagen type IV.
• Về xử lý mô và kỹ thuật nuôi cấy: Inatomi T., Hashemi H., Nakamura T., Priya và cộng sự chuẩn hóa nồng độ và thời gian xử lý Dispase II và Trypsin-EDTA; Rheinwald (1980), Macpherson và Bryden (1971) phát triển kỹ thuật bất hoạt nguyên bào sợi 3T3 chuột bằng chiếu xạ hoặc Mitomycin C.
• Về môi trường nuôi cấy: Hayashi và Sato (1976), Barnes và Sato (1980) nghiên cứu môi trường không huyết thanh và vai trò của hormone T3; Nakamura T., Ang L., Ulltveit-Moe H.F.E. nghiên cứu thay thế huyết thanh bò (FBS) bằng huyết thanh tự thân.
• Về định danh tế bào: Krishnan S. (2008), Đỗ Thùy Hương và cộng sự (2010), Nguyễn Phúc Hoàn và cộng sự (2010) sử dụng nhuộm Giemsa, H.E; Madhira S., Hashemi H. quan sát cấu trúc siêu vi qua kính hiển vi điện tử; Priya C. (2011) thực hiện test tạo cụm (holoclone, paraclone, meroclone) và kỹ thuật lưu giữ BrdU.

Bảng tổng hợp kết quả lâm sàng của các nghiên cứu cấy ghép tấm biểu mô NMM trên thế giới được ghi nhận trong luận án:

Tác giả (Năm)	Mẫu nghiên cứu	Thời gian theo dõi (tuần)	Kết quả chính
Nakamura T. (2004)	6 mắt (6 bệnh nhân)	13,8	Bề mặt giác mạc phẳng trong, biểu mô hóa hoàn toàn; thị lực cải thiện từ 2 dòng trở lên ở 11 tháng.
Nishida K. (2004)	8 mắt (4 bệnh nhân)	14	Biểu mô hóa hoàn toàn sau 1 tháng ghép; không có biến chứng; độ trong giác mạc cải thiện tốt.
Ang L. (2006)	10 mắt	19	Bề mặt nhãn cầu ổn định sau 3 tháng; biểu mô hóa hoàn toàn sau 2-5 ngày; thị lực cải thiện 9/10 mắt.
Inatomi T. (2006)	12 bệnh nhân	34	Bề mặt nhãn cầu ổn định; tầm nhìn cải thiện; 10 mắt không có biến chứng.
Ma D. (2009)	5 mắt	26 - 34	Kích thích biểu mô hóa, giảm viêm trong bỏng cấp, tái thiết bề mặt trong viêm mạn tính.
Nakamura T. (2011)	19 mắt (19 bệnh nhân)	55	Hầu như không xuất hiện kết mạc hóa và dính mi cầu; tân mạch giảm dần từ tháng thứ 6; thị lực cải thiện rõ.
Satake Y. (2011)	36 bệnh nhân	25,5 (tối đa 54,9)	Cải thiện độ trong giác mạc và khả năng nhìn; hạn chế biến chứng sau mổ.
Kocaba V. (2014)	23 bệnh nhân	18 - 48	Thị lực cải thiện rõ ở 17 bệnh nhân; lớp biểu mô cải thiện ở 15 bệnh nhân; chất lượng sống tăng ở 12 bệnh nhân.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết là xây dựng và chuẩn hóa quy trình nuôi tạo tấm biểu mô từ tế bào gốc niêm mạc miệng trên nền màng ối người kết hợp lớp tế bào nuôi 3T3 phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam, từ khâu trích thủ mô sinh thiết, xử lý enzym, môi trường dinh dưỡng cho đến kiểm tra chất lượng tấm biểu mô in vitro, thử nghiệm ghép trên thỏ thực nghiệm và bước đầu đánh giá trên người bệnh.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và các khái niệm

• Cấu trúc giải phẫu - mô học bề mặt nhãn cầu: Giác mạc gồm 5 lớp (biểu mô lát tầng không sừng hóa 4-6 hàng tế bào, màng Bowman, chân bì/nhu mô chiếm 90% bề dày giàu collagen type I và III, màng Descemet dày 5-10µm, nội mô là biểu mô lát đơn); kết mạc chứa tế bào hình đài tiết nhầy chiếm 5-10%; vùng rìa củng - giác mạc dày 7-10 hàng tế bào, là nơi cư trú của tế bào gốc biểu mô giác mạc.
• Cấu trúc và sự biệt hóa biểu mô niêm mạc miệng: Biểu mô NMM lát tầng không sừng hóa gồm lớp đáy (chứa tế bào gốc), lớp gai, lớp trung gian và lớp bề mặt. Quá trình biệt hóa tế bào diễn ra từ tế bào gốc sang tế bào tăng sinh chuyển tiếp và tế bào biệt hóa hoàn toàn. Tế bào biểu lộ xơ trung gian Keratin: K5 và K14 ở lớp đáy; K4 và K13 ở các lớp trên đáy; K3 biểu lộ ở cả biểu mô NMM và giác mạc, trong khi K12 là dấu ấn đặc hiệu của giác mạc đã biệt hóa.
• Tương tác biểu mô - trung mô: Vai trò hỗ trợ cận tiết của nguyên bào sợi đối với sự tăng sinh và ngăn ngừa thoái hóa không bào của tế bào biểu mô thông qua các cytokin (EGF, TGF, PDGF, IL-1).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kế theo mô hình thực nghiệm tiến cứu gồm 2 giai đoạn:

• Giai đoạn 1 (Thực nghiệm trên 64 thỏ Orytolagus Cuniculus): Nghiên cứu quy trình trích thủ, vị trí và kích thước mảnh NMM; khảo sát môi trường và phương pháp nuôi cấy; đánh giá hình thái, tốc độ phát triển, định danh tế bào và ghép thực nghiệm trên thỏ gây bỏng bề mặt nhãn cầu.
• Giai đoạn 2 (Đánh giá trên 17 bệnh nhân LSCD cả hai mắt): Ứng dụng quy trình đã hoàn thiện từ thực nghiệm thỏ để trích thủ NMM người, nuôi tạo tấm biểu mô và đánh giá chất lượng in vitro trước khi ghép.

Quy trình kỹ thuật và chuẩn bị vật liệu:

• Chuẩn bị nền màng ối: Lấy từ bánh rau sản phụ mổ đẻ khỏe mạnh tại Bệnh viện Phụ sản Hà Nội (được xét nghiệm sàng lọc HIV, HBsAg, giang mai). Màng rau được lấy cách rìa bánh rau 10cm, rửa bằng nước muối sinh lý chứa Penicillin 100UI/ml, Streptomycin 100µg/ml, Amphotericin B 0,25µg/ml; nạo sạch máu và cắt mảnh 3x3cm; rửa bằng PBS 1X không ion canxi và magie. Bóc tách màng ối, ngâm trong dung dịch Ammonia 10% (pha từ Ammonia 25% Wako) để nạo bỏ toàn bộ lớp biểu mô; rửa lại bằng PBS 1X; bảo quản trong DMSO 15% ở -80°C hoặc căng phẳng lên đáy lồng nuôi cấy polycarbonate đường kính 24mm (Corning).
• Chuẩn bị lớp tế bào nuôi 3T3: Dòng tế bào nguyên bào sợi chuột 3T3 được nuôi cấy trong DMEM bổ sung 10% FBS trong bình flask 75cm² (mật độ ban đầu 1x10⁶ tế bào/12ml). Bất hoạt phân chia tế bào bằng cách ủ với dung dịch chứa 100µl Mitomycin C trong 10ml DMEM + 10% FBS ở tủ ấm 37°C trong 2 giờ. Sau khi rửa sạch và phân tách bằng Trypsin-EDTA, tế bào 3T3 bất hoạt được gieo vào đáy giếng nuôi cấy với mật độ 2,5x10⁵ đến 3,5x10⁵ tế bào sống/2ml/giếng trước khi nuôi cùng tế bào biểu mô từ 1-3 ngày.
• Trích thủ và xử lý mảnh niêm mạc miệng:
  • Gây mê thỏ bằng Thiopental tĩnh mạch rìa tai liều 20mg/kg; bệnh nhân được gây tê tại chỗ. Sát trùng khoang miệng bằng Betadine và dung dịch kháng sinh/kháng nấm.
  • Vị trí trích thủ: (1) Mặt trong niêm mạc má vùng trung tâm, (2) Mặt trong niêm mạc má cách góc miệng 2mm, (3) Mặt trong niêm mạc môi dưới trung tâm. Sử dụng dao tròn Kai medical đường kính 3mm, 6mm và 8mm.
  • Xử lý mô: Loại bỏ mô liên kết cơ học, cắt nhỏ thành mảnh 1x1mm; ủ trong Dispase II nồng độ 1,2UI/ml ở 37°C trong 5 phút; ngâm EDTA 0,05% trong 3 phút ở nhiệt độ phòng; rửa sạch bằng môi trường trước khi nuôi cấy.
• Môi trường nuôi cấy: Dung dịch cơ bản kết hợp DMEM và Ham’s F12 (tỷ lệ 1:1), bổ sung Insulin (1-10UI/ml), Hydrocortisone, Triiodothyronin T3 (10pM), Choleratoxin, Isoproterenol, kết hợp huyết thanh FBS hoặc huyết thanh tự thân.
• Phương pháp định danh và đánh giá chất lượng tấm biểu mô:
  • Đánh giá hình thái sống dưới kính hiển vi soi nổi và soi ngược.
  • Nhuộm Trypan blue 0,5% xác định tỷ lệ tế bào sống/chết; nhuộm Giemsa đánh giá hình thái bề mặt; nhuộm Hematoxylin - Eosin (H.E) khảo sát cấu trúc mô học cắt dọc.
  • Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) kiểm tra cấu trúc siêu vi, thể liên kết (desmosome), thể bán liên kết (hemidesmosome) và vi nhung mao.
  • Hóa mô miễn dịch (HMMD) và PCR xác định các dấu ấn sinh học: K3, K12, K4, K13, K5, K14, p63, ΔNp63, Connexin 43 (Cx43), β1-integrin, ABCG2, ZO-1, Occludin, Desmoplakin.
  • Kỹ thuật gắn 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) và test tạo cụm (holoclone, paraclone, meroclone) đánh giá khả năng tăng sinh và duy trì tế bào gốc.

---

Nội dung chính theo từng chương

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

Chương 1 hệ thống hóa toàn diện các kiến thức nền tảng:

• Cấu trúc và sinh lý bề mặt nhãn cầu: Phân tích chi tiết 5 lớp của giác mạc, cấu tạo kết mạc và vùng rìa củng - giác mạc; làm rõ vai trò của màng phim nước mắt, hệ thống tuyến lệ, hai cung phản xạ điều tiết nước mắt và sự nâng đỡ của nguyên bào sợi nhu mô đối với tính trong suốt của giác mạc.
• Cấu trúc mô học khoang miệng và tế bào gốc NMM: Phân tích các dạng biểu mô sừng hóa, bán sừng và không sừng hóa; sơ đồ biệt hóa từ tế bào gốc lớp đáy thành tế bào tăng sinh chuyển tiếp và tế bào trưởng thành; đặc điểm biểu hiện các loại xơ trung gian keratin (K5, K14, K4, K13, K3) và các cytokin điều hòa (EGF, TGF, PDGF, IL-1).
• Bệnh học hội chứng LSCD: Nguyên nhân nguyên phát (tật không mống mắt, suy đa tuyến nội tiết) và thứ phát (bỏng hóa chất, bỏng nhiệt, hội chứng Stevens-Johnson); biểu hiện lâm sàng từ nhìn mờ, loét giác mạc khó liền đến xơ hóa tân mạch và thủng giác mạc.
• Tổng quan kỹ thuật nuôi tạo tấm biểu mô NMM: Phân tích ưu nhược điểm của các loại giá đỡ (màng ối, chân bì Alloderm, fibrin, polymer nhạy cảm nhiệt IPAAm, collagen); kỹ thuật xử lý enzym (Dispase II, Trypsin-EDTA); vai trò của lớp tế bào nuôi nguyên bào sợi 3T3 chuột bất hoạt; thành phần môi trường nuôi cấy DMEM/F12 và các chất bổ sung; các phương pháp định danh hình thái, siêu vi thể và hóa mô miễn dịch; tổng hợp kết quả ứng dụng lâm sàng trong nhãn khoa và tái tạo da, mi mắt trên thế giới.

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 trình bày chi tiết về thiết kế thực nghiệm và quy chuẩn kỹ thuật:

• Đối tượng và trang thiết bị: Sử dụng 64 thỏ Orytolagus Cuniculus và mẫu mô NMM từ 17 bệnh nhân LSCD hai mắt; hệ thống phòng nuôi cấy vô trùng, tủ ấm CO₂, kính hiển vi soi nổi/soi ngược gắn camera, máy ly tâm lạnh, đĩa nuôi cấy Nunc và lồng nuôi cấy Corning.
• Quy trình chuẩn bị màng ối và tế bào 3T3: Chi tiết các bước xử lý bánh rau sản phụ bằng Ammonia 10% để loại bỏ biểu mô màng ối; quy trình bảo quản lạnh sâu -80°C trong DMSO 15%; kỹ thuật nuôi cấy và xử lý bất hoạt tế bào 3T3 bằng Mitomycin C (2 giờ ở 37°C), gieo mật độ 2,5 - 3,5 x 10⁵ tế bào/giếng.
• Kỹ thuật trích thủ và xử lý mảnh mô NMM: So sánh 3 vị trí trích thủ (niêm mạc má trung tâm, niêm mạc má cách góc miệng 2mm, niêm mạc môi dưới) với các kích thước đường kính 3mm, 6mm, 8mm; quy trình xử lý mảnh mô bằng Dispase II 1,2UI/ml trong 5 phút và EDTA 0,05% trong 3 phút.
• Thiết kế mô hình nuôi cấy: Khảo sát phương pháp nuôi cấy bằng mảnh mô (explant culture) và phương pháp dịch treo tế bào (cell suspension culture) trên nền màng ối; kỹ thuật nuôi tiếp xúc không khí (air-lifting) để biểu mô hóa tầng.
• Tiêu chí đánh giá, xử lý số liệu và y đức: Các chỉ tiêu hình thái học, hóa mô miễn dịch, tỷ lệ sống sót; tiêu chuẩn đạo đức nghiên cứu y sinh học trên động vật và người bệnh tự nguyện.

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Chương 3 trình bày các dữ liệu thực nghiệm thu được:

• Kết quả nuôi tạo tấm biểu mô trên thỏ thực nghiệm:
  • Lựa chọn vị trí và kích thước: Vị trí niêm mạc má cho mật độ tế bào biểu mô và khả năng tăng sinh ổn định hơn so với niêm mạc môi; kích thước sinh thiết đường kính 6mm - 8mm đảm bảo cung cấp đủ lượng tế bào cho quá trình tạo tấm biểu mô.
  • Lựa chọn môi trường và phương pháp: Môi trường DMEM/F12 (1:1) bổ sung các yếu tố tăng trưởng và huyết thanh hỗ trợ tốt nhất cho sự bám dính và phân chia tế bào; phương pháp nuôi cấy bằng mảnh mô và dịch treo đều tạo được tấm biểu mô đa tầng trên nền màng ối.
  • Hình thái và định danh: Tấm biểu mô sau 12 - 21 ngày nuôi cấy phát triển thành biểu mô lát tầng gồm nhiều lớp tế bào; quan sát qua TEM cho thấy rõ màng tế bào, vi nhung mao bề mặt, thể liên kết giữa các tế bào và thể bán liên kết gắn với màng ối; nhuộm HMMD dương tính với K3, p63, Cx43 và âm tính với K12.
  • Kết quả ghép trên thỏ gây bỏng: Tấm biểu mô ghép bám tốt trên nền nhu mô giác mạc thỏ, hỗ trợ tái tạo biểu mô và giảm phản ứng viêm xơ bề mặt.
• Kết quả nuôi cấy trên người (17 bệnh nhân):
  • Sinh thiết niêm mạc má cho mảnh mô có chất lượng tốt; tế bào tăng sinh tạo cụm và lan rộng trên nền màng ối đã xử lý sau 14 - 21 ngày.
  • Cấu trúc tấm biểu mô người đạt độ dày từ 3 - 5 lớp tế bào, các tế bào lớp đáy có tỷ lệ nhân/bào tương cao, biểu hiện mạnh dấu ấn p63 (tế bào gốc/chuyển tiếp), K3/K4/K13 dương tính, khẳng định tính chất biểu mô lát tầng không sừng hóa.
  • Đánh giá sơ bộ kết quả ghép cho thấy bề mặt nhãn cầu bệnh nhân tái lập được lớp biểu mô che phủ, giảm triệu chứng kích thích và hạn chế tiến triển kết mạc hóa.

CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN

Chương 4 phân tích, so sánh kết quả thực nghiệm với các công trình quốc tế:

• Về lựa chọn nền nuôi cấy: Luận án phân tích ưu thế vượt trội của màng ối người đã loại bỏ biểu mô (tính trong suốt, độ dai, tính tương thích sinh học, không biểu hiện kháng nguyên HLA-A, HLA-B, HLA-DR, chứa cytokin chống viêm IL-1α, IL-1β) so với các giá đỡ fibrin, polymer nhạy cảm nhiệt IPAAm hay chân bì Alloderm.
• Về vị trí và kích thước mảnh NMM: Bàn luận về việc lựa chọn niêm mạc má giúp giảm thiểu sang chấn khoang miệng cho người bệnh nhưng vẫn thu nhận đủ số lượng tế bào gốc lớp đáy; so sánh kích thước 6-8mm của tác giả với các nghiên cứu của Nishida (8mm), Chen H. (6x6mm), Hashemi (2mm³), Sen S. (4x4x2mm).
• Về môi trường nuôi cấy và lớp nuôi 3T3: Đánh giá vai trò dinh dưỡng của hỗn hợp DMEM/F12, nồng độ insulin, T3, hydrocortisone; bàn luận về việc sử dụng lớp tế bào 3T3 bất hoạt bằng Mitomycin C trong việc cung cấp tín hiệu cận tiết và ức chế TGF-β; xem xét các khuyến cáo của FDA về vật liệu có nguồn gốc động vật và tiềm năng thay thế bằng huyết thanh tự thân.
• Về phương pháp nuôi cấy: So sánh chi tiết ưu nhược điểm giữa phương pháp nuôi bằng mảnh mô (thao tác đơn giản, hạn chế tổn thương tế bào do enzym) và nuôi bằng dịch treo tế bào (mật độ tế bào phân bố đồng đều hơn, kiểm soát tốt số lượng gieo ban đầu).
• Về chất lượng tấm biểu mô và các vấn đề tồn tại: Đánh giá sự tương đồng về hình thái siêu vi và dấu ấn phân tử giữa tấm biểu mô NMM với biểu mô giác mạc nguyên vẹn; phân tích các hạn chế cần tiếp tục hoàn thiện như hiện tượng tân mạch giác mạc sau ghép (vai trò của FGF2) và việc tối ưu hóa quy trình không dùng tế bào nuôi động vật.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã đạt được các kết quả và đóng góp cụ thể:

1. Xây dựng và chuẩn hóa thành công quy trình xử lý màng ối người bằng dung dịch Ammonia 10% để loại bỏ hoàn toàn lớp biểu mô, tạo giá đỡ sinh học vô trùng, ổn định, phục vụ nuôi cấy tế bào biểu mô NMM.
2. Xác định được vị trí sinh thiết tối ưu tại mặt trong niêm mạc má và kích thước mảnh mô phù hợp (đường kính 6mm - 8mm), vừa đảm bảo đủ mật độ tế bào gốc cho quá trình tăng sinh in vitro, vừa an toàn, ít gây tổn thương vùng miệng của người cho.
3. Tối ưu hóa quy trình nuôi tạo tấm biểu mô NMM trên nền màng ối kết hợp lớp tế bào nuôi 3T3 bất hoạt bằng Mitomycin C trong môi trường DMEM/F12 (1:1) bổ sung các yếu tố phát triển, tạo ra tấm biểu mô đa tầng có cấu trúc mô học tương tự biểu mô giác mạc.
4. Chứng minh tấm biểu mô nuôi cấy từ NMM thỏ và người duy trì được các đặc tính của tế bào gốc/tế bào tăng sinh chuyển tiếp qua sự hiện diện của dấu ấn p63, xơ trung gian K3, K4, K13, thể liên kết và thể bán liên kết dưới kính hiển vi điện tử truyền qua.
5. Thử nghiệm thành công kỹ thuật ghép tấm biểu mô NMM trên mô hình thỏ bị bỏng giác mạc thực nghiệm và bước đầu ứng dụng đánh giá trên 17 bệnh nhân bị suy giảm tế bào gốc vùng rìa hai mắt.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất từ luận án:

• Hoàn thiện quy trình nuôi cấy theo hướng thay thế hoàn toàn các chế phẩm từ động vật (FBS, tế bào nuôi 3T3 chuột) bằng huyết thanh tự thân hoặc môi trường không huyết thanh nhằm loại bỏ nguy cơ lây nhiễm sinh học.
• Đề xuất áp dụng các biện pháp ức chế tân mạch ngoại vi (như sử dụng kháng FGF2) trong giai đoạn hậu phẫu ghép tấm biểu mô NMM để duy trì độ trong suốt tối đa cho giác mạc.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu được tác giả ghi nhận:

• Quy trình nuôi cấy vẫn phụ thuộc vào việc sử dụng lớp tế bào nuôi nguyên bào sợi chuột 3T3 và huyết thanh thai bò (FBS), tiềm ẩn nguy cơ về mặt miễn dịch và tiêu chuẩn mảnh ghép theo quy định của các cơ quan quản lý dược phẩm.
• Hiện tượng xâm lấn tân mạch từ kết mạc vào biểu mô ghép sau phẫu thuật vẫn có thể xảy ra do bản chất mô học của niêm mạc miệng, đòi hỏi phải can thiệp kiểm soát mạch máu.
• Nghiên cứu trên người mới dừng ở bước nuôi tạo, định danh chất lượng tấm biểu mô in vitro và đánh giá kết quả lâm sàng ban đầu trên 17 bệnh nhân; chưa có số liệu theo dõi dài hạn nhiều năm trên quy mô mẫu lớn.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Hoàn thiện quy trình nuôi cấy hoàn toàn tự thân (xeno-free) bằng cách sử dụng nguyên bào sợi người hoặc môi trường không tế bào nuôi kết hợp huyết thanh tự thân của bệnh nhân.
• Nghiên cứu kết hợp các tác nhân kháng yếu tố phát triển mạch máu (kháng FGF2, kháng VEGF) nhằm kiểm soát hiện tượng tân mạch sau cấy ghép tấm biểu mô NMM.
• Mở rộng thử nghiệm lâm sàng đa trung tâm với thời gian theo dõi hậu phẫu kéo dài để đánh giá toàn diện độ bền vững và khả năng phục hồi thị lực lâu dài của mảnh ghép.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao đối với:

• Bác sĩ chuyên khoa Nhãn khoa: Cung cấp cơ sở lý luận và giải pháp ngoại khoa mới trong điều trị hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc nặng ở cả hai mắt không còn chỉ định ghép tự thân từ mắt đối bên.
• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và nhà nghiên cứu ngành Mô - Phôi, Kỹ thuật mô và Y học tái tạo: Tham khảo quy trình chuẩn bị màng ối làm giá đỡ sinh học, kỹ thuật bất hoạt tế bào nuôi 3T3 bằng Mitomycin C, kỹ thuật phân lập tế bào bằng Dispase II/Trypsin-EDTA và các phương pháp định danh tế bào gốc (HMMD, TEM, BrdU, test tạo cụm).
• Các nhà quản lý và hoạch định y tế: Cung cấp dữ liệu thực chứng cho việc xây dựng quy chuẩn kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc và mô ghép phục vụ điều trị lâm sàng tại các bệnh viện chuyên khoa mắt ở Việt Nam.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao tế bào gốc niêm mạc miệng được lựa chọn để thay thế tế bào gốc vùng rìa giác mạc trong nghiên cứu này?

Biểu mô niêm mạc miệng và biểu mô giác mạc đều có nguồn gốc phôi thai từ ngoại bì da và là biểu mô lát tầng không sừng hóa. Tế bào lớp đáy của niêm mạc miệng có khả năng phân chia mạnh mẽ, kéo dài trong điều kiện in vitro mà không bị sừng hóa và cùng thể hiện xơ trung gian Keratin 3 (K3). Đây là nguồn mô tự thân sẵn có, dễ lấy, cho phép điều trị tổn thương bề mặt nhãn cầu cho các bệnh nhân bị suy giảm tế bào gốc vùng rìa cả hai mắt mà không lo ngại nguy cơ thải loại miễn dịch như ghép dị thân.

2. Màng ối người được xử lý như thế nào để làm giá đỡ nuôi cấy tế bào?

Màng ối được thu thập từ sản phụ mổ đẻ khỏe mạnh đã qua sàng lọc HIV, HBsAg và giang mai tại Bệnh viện Phụ sản Hà Nội. Mảnh màng ối được rửa sạch bằng nước muối sinh lý pha kháng sinh/kháng nấm, ngâm trong dung dịch Ammonia 10% và nạo bỏ hoàn toàn lớp biểu mô cùng lớp trung mô. Sau đó, màng ối được rửa lại bằng PBS 1X không chứa ion canxi và magie, căng phẳng lên lồng nuôi cấy polycarbonate (đường kính 24mm) và có thể sử dụng tươi hoặc bảo quản trong dung dịch DMSO 15% ở nhiệt độ -80°C trong vòng 6 tháng.

3. Vai trò và phương pháp chuẩn bị lớp tế bào nuôi 3T3 chuột trong quy trình là gì?

Nguyên bào sợi chuột 3T3 đóng vai trò là lớp tế bào nuôi hỗ trợ sự bám dính, tăng sinh và biệt hóa của tế bào biểu mô NMM thông qua việc tiết ra các yếu tố tăng trưởng cận tiết và ức chế TGF-β. Trước khi đưa vào đồng nuôi cấy, tế bào 3T3 được xử lý bất hoạt khả năng phân chia bằng cách ủ với dung dịch chứa 100µl Mitomycin C trong 10ml DMEM + 10% FBS ở 37°C trong vòng 2 giờ, sau đó được gieo với mật độ 2,5x10⁵ đến 3,5x10⁵ tế bào sống/giếng.

4. Vị trí và kích thước sinh thiết niêm mạc miệng nào được xác định là tối ưu?

Luận án xác định vị trí mặt trong niêm mạc má (vùng trung tâm hoặc cách góc miệng 2mm) là vị trí sinh thiết tối ưu nhờ biểu mô thuộc loại không sừng hóa dày dặn, giàu tế bào gốc lớp đáy. Kích thước mảnh sinh thiết sử dụng dao tròn đường kính từ 6mm đến 8mm cung cấp đủ số lượng tế bào biểu mô cho quá trình tạo tấm nuôi cấy trên lồng 24mm, đồng thời vết thương tại khoang miệng liền nhanh và ít gây khó chịu cho người bệnh.

5. Những dấu ấn sinh học nào được dùng để định danh tấm biểu mô NMM nuôi cấy?

Chất lượng và tính chất của tấm biểu mô được định danh bằng phương pháp hóa mô miễn dịch và PCR qua các dấu ấn: p63 và đồng phân ΔNp63 (dấu ấn tế bào gốc và tế bào tăng sinh chuyển tiếp); Keratin 3 (K3), Keratin 4 (K4), Keratin 13 (K13) (đặc trưng cho biểu mô lát tầng không sừng hóa); Connexin 43 (Cx43) (protein liên kết khe); β1-integrin; cùng các protein liên kết màng như ZO-1, Occludin và Desmoplakin.

---

Kết luận

Luận án đã nghiên cứu và chuẩn hóa thành công quy trình nuôi tạo tấm biểu mô từ tế bào gốc niêm mạc miệng trên nền màng ối người kết hợp lớp tế bào nuôi 3T3 bất hoạt bằng Mitomycin C. Tấm biểu mô tạo thành đạt cấu trúc lát tầng đa lớp, giữ vững các đặc tính siêu vi thể và dấu ấn sinh học của tế bào gốc biểu mô không sừng hóa. Kết quả thực nghiệm trên 64 thỏ và bước đầu ứng dụng trên 17 bệnh nhân khẳng định tính khả thi của phương pháp trong điều trị hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc hai mắt, mở ra hướng ứng dụng kỹ thuật mô học tái tạo bề mặt nhãn cầu tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Bề mặt nhãn cầu (BMNC) bị tổn thương do nhiều nguyên nhân khác nhau như: bỏng mắt do hoá chất hoặc nhiệt, hội chứng Stevens-Johnson, nhiễm khuẩn mắt nặng, nhiều phẫu thuật thực hiện trên cùng một mắt, đeo kính tiếp xúc. Một trong những di chứng thường gặp khi tổn thương BMNC là hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc (Limbal stem cell deficiency-LSCD). Hậu quả của hội chứng này là làm mất độ trong của giác mạc do màng xơ mạch từ phía kết mạc xâm lấn qua vùng rìa lên bề mặt giác mạc. Hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc cũng có thể gây ra hiện tượng loét biểu mô giác mạc khó hàn gắn, tróc biểu mô giác mạc tái phát, thậm chí có thể gây thủng giác mạc.

Vì vậy, thị lực mắt bị bệnh bị suy giảm ở nhiều mức độ khác nhau [1],[2]. Để điều trị ngoại khoa hội chứng LSCD, các nhà nhãn khoa đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như: ghép màng ối đơn thuần, ghép kết mạc rìa tự thân hoặc dị thân, ghép giác-củng mạc vùng rìa. Với phương pháp ghép kết mạc rìa, ghép giác-củng mạc rìa tự thân, mảnh mô dùng để ghép được lấy từ mắt lành phải khá lớn. Phương pháp ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy được cho là có nhiều ưu điểm vượt trội so với các phương pháp sử dụng trước đây.

Quá trình nuôi cấy đã giảm thiểu số lượng tế bào không có chức năng bình thường, việc sinh thiết vùng rìa có thể nhắc lại nếu cần thiết, giảm nguy cơ thải loại mảnh ghép vì trong tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy không có mặt của tế bào Langerhans-tế bào đóng vai trò trình diện kháng nguyên. Phương pháp này đã được thực hiện tương đối phổ biến trên thế giới [3],[4],[5],[6]. Tuy nhiên, phương pháp này lại không thực hiện được ở các trường hợp bệnh nhân (BN) tổn thương cả hai mắt. 2 Đối với các trường hợp BN bị tổn thương BMNC cả hai mắt, trước đây, các bác sỹ nhãn khoa đã sử dụng phẫu thuật ghép tế bào gốc dị thân từ mắt người thân trong gia đình hoặc từ vùng rìa giác mạc của người hiến.

Tuy nhiên, những BN này phải dùng thuốc chống thải loại mảnh ghép và nguy cơ thải mảnh ghép khá cao [7],[8]. Trong cơ thể, biểu mô giác mạc và biểu mô lợp niêm mạc miệng (NMM) là loại biểu mô lát tầng không sừng hoá. Những tế bào lớp đáy của cả hai loại biểu mô này có khả năng phân chia để duy trì quá trình tái tạo sinh lý. Cả hai loại biểu mô này đều có nguồn gốc phôi thai là ngoại bì da.

và cộng sự (CS.) đã nuôi cấy thành công tấm biểu mô NMM và ghép tự thân cho thỏ bị bỏng giác mạc [2],[9]. Cũng tác giả này là người đầu tiên mô tả thành công việc ghép tấm biểu mô NMM nuôi cấy trên người bị LSCD [10]. Sau đó rất nhiều tác giả thông báo thực hiện thành công kỹ thuật này [11],[12],[13],[14],[15],[16],[17],[18],[19],[20],[21],[22],[23],[24],[25]. Các nghiên cứu cho thấy hình dạng, kích thước và cấu trúc siêu vi của tế bào tấm biểu mô NMM nuôi cấy khá tương đồng với biểu mô giác mạc bình thường [26].

Như vậy, việc sử dụng tấm biểu mô NMM nuôi cấy để điều trị tổn thương giác mạc là một lựa chọn tốt cho các BN bị tổn thương cả hai mắt và không còn vùng rìa. Với mong muốn áp dụng vào Việt Nam một phương pháp điều trị mới cho các BN bị hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa cả hai mắt, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu nuôi tạo tấm biểu mô từ tế bào gốc biểu mô niêm mạc miệng” nhằm mục tiêu sau đây: 1. Xác định vị trí, kích thước mảnh mô niêm mạc miệng và môi trường nuôi cấy phù hợp cho nuôi tạo tấm biểu mô. Xác định phương pháp phù hợp để nuôi tạo tấm biểu mô niêm mạc miệng.

3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Cấu trúc của bề mặt nhãn cầu BMNC là vùng được giới hạn bởi hai đường xám của mi trên và mi dưới, bao gồm biểu mô giác mạc, biểu mô kết mạc và ranh giới là biểu mô vùng rìa giác mạc (Hình 1. Giác mạc Giác mạc chiếm 1/6 vỏ ngoài của nhãn cầu, hình hơi bầu dục, dày 0,8– 0,9mm ở vùng trung tâm và 1,1 mm ở chu biên. Giác mạc là cấu trúc vô mạch, gồm 5 lớp: Biểu mô giác mạc, màng Bowman, nhu mô giác mạc, màng Descemet và nội mô giác mạc.

(1) Biểu mô giác mạc: là biểu mô lát tầng không sừng hoá, gồm 4-6 hàng tế bào, chiếm khoảng 10% bề dày của giác mạc. Biểu mô được chia thành 3 lớp: lớp đáy, lớp tế bào hình cánh, lớp bề mặt. Các tế bào lớp đáy hình trụ, các tế bào liên kết với nhau bằng thể liên kết và liên kết với màng đáy bằng thể bán liên kết, các tế bào được sinh ra sẽ phát triển lên các lớp phía trên. Các tế bào lớp giữa (tế bào hình cánh) có nhân tròn hoặc dài, các tế bào liên kết với nhau bằng thể liên kết và các mộng liên kết.

Các tế bào bề mặt có hình đa diện dẹt, liên kết với nhau bằng vòng dính, dải bịt và thể liên kết, bề mặt tế bào có những vi nhung mao ngắn và được phủ bởi một lớp glycocalyx. Lớp glycocalyx này liên kết với mucin của phim nước mắt, bảo vệ sự toàn vẹn của BMNC. Trong bào tương của các tế bào biểu mô giác mạc đã biệt hóa thể hiện dấu ấn của xơ trung gian K3 (keratin 3) và K12. Đặc biệt, K12 là dấu ấn tốt nhất và chỉ có ở những lớp trên đáy của biểu mô giác mạc.

(2) Màng Bowman: Gồm màng đáy của biểu mô và màng Bowman chính thức. Màng Bowman là lớp ngoài của chân bì giác mạc (nhu mô giác mạc), 4 gồm các sợi collagen xếp theo các hướng khác nhau. Màng Bowman rất dai và là lớp bảo vệ quan trọng của nhãn cầu. (3) Chân bì giác mạc: Chiếm 90% bề dày giác mạc, gồm các sợi collagen chủ yếu là type I, III, ít collagen type IV và V.

Xen giữa các sợi và lá collagen là những tế bào sợi dẹt gọi là giác mạc bào (keratocyte), khoảng gian sợi và gian bào chứa chất căn bản giàu glycosaminoglycan. (4) Màng Descemet: Dày 5-10µm, được tạo ra từ chất tiết của nội mô giác mạc. Nó được coi như là màng đáy của biểu mô sau giác mạc. (5) Nội mô giác mạc: Là biểu mô lát đơn gồm 1 hàng tế bào đa diện dẹt xếp đều đặn phủ mặt sau giác mạc.

Các tế bào nội mô giác mạc không có khả năng phân chia. Giác mạc thỏ bình thƣờng (H. Biểu mô trước giác mạc 2. Nội mô giác mạc 5 1.

Kết mạc Kết mạc trải từ vùng rìa củng giác mạc đến đường xám của bờ mi, được chia thành 3 phần. Kết mạc mi lợp mặt trong của mi mắt, thuộc loại biểu mô trụ tầng. Kết mạc nhãn cầu lợp mặt trước nhãn cầu (trừ diện giác mạc), thuộc loại biểu mô lát tầng không sừng hoá. Kết mạc cùng đồ tiếp nối kết mạc nhãn cầu với kết mạc mi.

Biểu mô của kết mạc nhãn cầu gồm 6-8 hàng tế bào, các tế bào biểu mô kết mạc không đều đặn và có kích thước nhỏ hơn so với các tế bào biểu mô giác mạc. Xen kẽ với các tế bào nằm trên cùng của kết mạc có tế bào hình đài tiết nhày, chiếm khoảng 5-10% số lượng tế bào biểu mô bề mặt nhãn cầu, chúng tiết dịch nhày tạo thành phần của phim nước mắt. Các tế bào hình đài chỉ có trong kết mạc, không có ở giác mạc. Vùng rìa củng-giác mạc Vùng rìa là vùng tiếp nối giữa củng mạc với giác mạc, ở đây có sự chuyển tiếp từ biểu mô giác mạc thành biểu mô kết mạc nhãn cầu, vùng này không có màng Bowman và màng Descemet.

Việc phân định ranh giới giữa vùng rìa và kết mạc là tương đối khó, vị trí tương ứng là nơi gặp nhau giữa mống mắt và mô nền giác mạc; hơn nữa, khác với kết mạc, biểu mô vùng rìa không có tế bào hình đài tiết nhày [27]. Quan sát trên lâm sàng, Davanger M. Về mặt cấu tạo, vùng rìa củng-giác mạc là một vùng hình nhẫn nằm giữa củng mạc và giác mạc. Vòng nhẫn này rộng hơn ở phía trên (1,5mm) và phía dưới (1mm), còn ở hai bên thì hẹp (khoảng 0,8mm) [1].

Biểu mô vùng rìa củng giác mạc gồm 7-10 hàng tế bào, các tế bào liên kết chặt chẽ với nhau giống như các tế bào của biểu mô giác mạc. Bên dưới 6 màng đáy, mô liên kết của vùng rìa tập trung nhiều dây thần kinh và giàu mạch máu, ngoài ra còn thấy sự có mặt của một số tế bào trung mô. Các yếu tố liên quan đảm bảo sự toàn vẹn của BMNC [29]. Để có thể thực hiện được chức năng nhìn của mắt, ngoài hệ thống thần kinh toàn vẹn, sự toàn vẹn của BMNC là cần thiết giúp cho hình ảnh nhìn thấy có thể tới điểm hội tụ trên võng mạc.

Có rất nhiều yếu tố tham gia để đảm bảo sự toàn vẹn của BMNC đó là: 1. Mi mắt Mi mắt có tác dụng bảo vệ BMNC khỏi các sang chấn về mặt cơ học từ môi trường bên ngoài, cấu trúc mềm mại của bờ tự do mi mắt giúp dàn trải đều của phim nước mắt trên BMNC làm BMNC luôn nhẵn bóng và đủ độ ẩm cần thiết. Ở BN bỏng mắt, bờ tự do của mi bị tổn thương ở nhiều mức độ khác nhau ảnh hưởng đến sự bền vững của màng nước mắt và gây ảnh hưởng đến sự toàn vẹn của BMNC. Phim nước mắt.

Sự toàn vẹn của bề mặt nhãn cầu cũng được đảm bảo bởi mối quan hệ mật thiết giữa biểu mô bề mặt nhãn cầu và phim nước mắt. Các rối loạn bề mặt nhãn cầu làm phim nước mắt kém bền vững và ngược lại. Hai đặc tính cơ bản của biểu mô bề mặt nhãn cầu là biểu mô không sừng hoá và tiết mucin (là thành phần quan trọng của màng phim nước mắt do tế bào hình đài tiết ra) đóng vai trò quan trọng để đảm bảo sự bền vững của màng phim nước mắt. Các tuyến lệ Thành phần không kém quan trọng của phim nước mắt là nước mắt cùng các chất điện phân và các loại protein do tuyến lệ chính và tuyến lệ phụ tiết ra.

Trong các trường hợp bỏng mắt toàn bộ, hệ thống tuyến lệ phụ đều bị 7 tổn hại cùng với biểu mô bề mặt nhãn cầu, do đó phim nước mắt bị phá huỷ hoàn toàn, gây tình trạng khô mắt nặng nề.