ĐẶT VẤN ĐỀ Bề mặt nhãn cầu (BMNC) bị tổn thương do nhiều nguyên nhân khác nhau như: bỏng mắt do hoá chất hoặc nhiệt, hội chứng Stevens-Johnson, nhiễm khuẩn mắt nặng, nhiều phẫu thuật thực hiện trên cùng một mắt, đeo kính tiếp xúc. Một trong những di chứng thường gặp khi tổn thương BMNC là hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc (Limbal stem cell deficiency-LSCD). Hậu quả của hội chứng này là làm mất độ trong của giác mạc do màng xơ mạch từ phía kết mạc xâm lấn qua vùng rìa lên bề mặt giác mạc. Hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc cũng có thể gây ra hiện tượng loét biểu mô giác mạc khó hàn gắn, tróc biểu mô giác mạc tái phát, thậm chí có thể gây thủng giác mạc.
Vì vậy, thị lực mắt bị bệnh bị suy giảm ở nhiều mức độ khác nhau [1],[2]. Để điều trị ngoại khoa hội chứng LSCD, các nhà nhãn khoa đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như: ghép màng ối đơn thuần, ghép kết mạc rìa tự thân hoặc dị thân, ghép giác-củng mạc vùng rìa. Với phương pháp ghép kết mạc rìa, ghép giác-củng mạc rìa tự thân, mảnh mô dùng để ghép được lấy từ mắt lành phải khá lớn. Phương pháp ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy được cho là có nhiều ưu điểm vượt trội so với các phương pháp sử dụng trước đây.
Quá trình nuôi cấy đã giảm thiểu số lượng tế bào không có chức năng bình thường, việc sinh thiết vùng rìa có thể nhắc lại nếu cần thiết, giảm nguy cơ thải loại mảnh ghép vì trong tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy không có mặt của tế bào Langerhans-tế bào đóng vai trò trình diện kháng nguyên. Phương pháp này đã được thực hiện tương đối phổ biến trên thế giới [3],[4],[5],[6]. Tuy nhiên, phương pháp này lại không thực hiện được ở các trường hợp bệnh nhân (BN) tổn thương cả hai mắt. 2 Đối với các trường hợp BN bị tổn thương BMNC cả hai mắt, trước đây, các bác sỹ nhãn khoa đã sử dụng phẫu thuật ghép tế bào gốc dị thân từ mắt người thân trong gia đình hoặc từ vùng rìa giác mạc của người hiến.
Tuy nhiên, những BN này phải dùng thuốc chống thải loại mảnh ghép và nguy cơ thải mảnh ghép khá cao [7],[8]. Trong cơ thể, biểu mô giác mạc và biểu mô lợp niêm mạc miệng (NMM) là loại biểu mô lát tầng không sừng hoá. Những tế bào lớp đáy của cả hai loại biểu mô này có khả năng phân chia để duy trì quá trình tái tạo sinh lý. Cả hai loại biểu mô này đều có nguồn gốc phôi thai là ngoại bì da.
và cộng sự (CS.) đã nuôi cấy thành công tấm biểu mô NMM và ghép tự thân cho thỏ bị bỏng giác mạc [2],[9]. Cũng tác giả này là người đầu tiên mô tả thành công việc ghép tấm biểu mô NMM nuôi cấy trên người bị LSCD [10]. Sau đó rất nhiều tác giả thông báo thực hiện thành công kỹ thuật này [11],[12],[13],[14],[15],[16],[17],[18],[19],[20],[21],[22],[23],[24],[25]. Các nghiên cứu cho thấy hình dạng, kích thước và cấu trúc siêu vi của tế bào tấm biểu mô NMM nuôi cấy khá tương đồng với biểu mô giác mạc bình thường [26].
Như vậy, việc sử dụng tấm biểu mô NMM nuôi cấy để điều trị tổn thương giác mạc là một lựa chọn tốt cho các BN bị tổn thương cả hai mắt và không còn vùng rìa. Với mong muốn áp dụng vào Việt Nam một phương pháp điều trị mới cho các BN bị hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa cả hai mắt, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu nuôi tạo tấm biểu mô từ tế bào gốc biểu mô niêm mạc miệng” nhằm mục tiêu sau đây: 1. Xác định vị trí, kích thước mảnh mô niêm mạc miệng và môi trường nuôi cấy phù hợp cho nuôi tạo tấm biểu mô. Xác định phương pháp phù hợp để nuôi tạo tấm biểu mô niêm mạc miệng.
3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Cấu trúc của bề mặt nhãn cầu BMNC là vùng được giới hạn bởi hai đường xám của mi trên và mi dưới, bao gồm biểu mô giác mạc, biểu mô kết mạc và ranh giới là biểu mô vùng rìa giác mạc (Hình 1. Giác mạc Giác mạc chiếm 1/6 vỏ ngoài của nhãn cầu, hình hơi bầu dục, dày 0,8– 0,9mm ở vùng trung tâm và 1,1 mm ở chu biên. Giác mạc là cấu trúc vô mạch, gồm 5 lớp: Biểu mô giác mạc, màng Bowman, nhu mô giác mạc, màng Descemet và nội mô giác mạc.
(1) Biểu mô giác mạc: là biểu mô lát tầng không sừng hoá, gồm 4-6 hàng tế bào, chiếm khoảng 10% bề dày của giác mạc. Biểu mô được chia thành 3 lớp: lớp đáy, lớp tế bào hình cánh, lớp bề mặt. Các tế bào lớp đáy hình trụ, các tế bào liên kết với nhau bằng thể liên kết và liên kết với màng đáy bằng thể bán liên kết, các tế bào được sinh ra sẽ phát triển lên các lớp phía trên. Các tế bào lớp giữa (tế bào hình cánh) có nhân tròn hoặc dài, các tế bào liên kết với nhau bằng thể liên kết và các mộng liên kết.
Các tế bào bề mặt có hình đa diện dẹt, liên kết với nhau bằng vòng dính, dải bịt và thể liên kết, bề mặt tế bào có những vi nhung mao ngắn và được phủ bởi một lớp glycocalyx. Lớp glycocalyx này liên kết với mucin của phim nước mắt, bảo vệ sự toàn vẹn của BMNC. Trong bào tương của các tế bào biểu mô giác mạc đã biệt hóa thể hiện dấu ấn của xơ trung gian K3 (keratin 3) và K12. Đặc biệt, K12 là dấu ấn tốt nhất và chỉ có ở những lớp trên đáy của biểu mô giác mạc.
(2) Màng Bowman: Gồm màng đáy của biểu mô và màng Bowman chính thức. Màng Bowman là lớp ngoài của chân bì giác mạc (nhu mô giác mạc), 4 gồm các sợi collagen xếp theo các hướng khác nhau. Màng Bowman rất dai và là lớp bảo vệ quan trọng của nhãn cầu. (3) Chân bì giác mạc: Chiếm 90% bề dày giác mạc, gồm các sợi collagen chủ yếu là type I, III, ít collagen type IV và V.
Xen giữa các sợi và lá collagen là những tế bào sợi dẹt gọi là giác mạc bào (keratocyte), khoảng gian sợi và gian bào chứa chất căn bản giàu glycosaminoglycan. (4) Màng Descemet: Dày 5-10µm, được tạo ra từ chất tiết của nội mô giác mạc. Nó được coi như là màng đáy của biểu mô sau giác mạc. (5) Nội mô giác mạc: Là biểu mô lát đơn gồm 1 hàng tế bào đa diện dẹt xếp đều đặn phủ mặt sau giác mạc.
Các tế bào nội mô giác mạc không có khả năng phân chia. Giác mạc thỏ bình thƣờng (H. Biểu mô trước giác mạc 2. Nội mô giác mạc 5 1.
Kết mạc Kết mạc trải từ vùng rìa củng giác mạc đến đường xám của bờ mi, được chia thành 3 phần. Kết mạc mi lợp mặt trong của mi mắt, thuộc loại biểu mô trụ tầng. Kết mạc nhãn cầu lợp mặt trước nhãn cầu (trừ diện giác mạc), thuộc loại biểu mô lát tầng không sừng hoá. Kết mạc cùng đồ tiếp nối kết mạc nhãn cầu với kết mạc mi.
Biểu mô của kết mạc nhãn cầu gồm 6-8 hàng tế bào, các tế bào biểu mô kết mạc không đều đặn và có kích thước nhỏ hơn so với các tế bào biểu mô giác mạc. Xen kẽ với các tế bào nằm trên cùng của kết mạc có tế bào hình đài tiết nhày, chiếm khoảng 5-10% số lượng tế bào biểu mô bề mặt nhãn cầu, chúng tiết dịch nhày tạo thành phần của phim nước mắt. Các tế bào hình đài chỉ có trong kết mạc, không có ở giác mạc. Vùng rìa củng-giác mạc Vùng rìa là vùng tiếp nối giữa củng mạc với giác mạc, ở đây có sự chuyển tiếp từ biểu mô giác mạc thành biểu mô kết mạc nhãn cầu, vùng này không có màng Bowman và màng Descemet.
Việc phân định ranh giới giữa vùng rìa và kết mạc là tương đối khó, vị trí tương ứng là nơi gặp nhau giữa mống mắt và mô nền giác mạc; hơn nữa, khác với kết mạc, biểu mô vùng rìa không có tế bào hình đài tiết nhày [27]. Quan sát trên lâm sàng, Davanger M. Về mặt cấu tạo, vùng rìa củng-giác mạc là một vùng hình nhẫn nằm giữa củng mạc và giác mạc. Vòng nhẫn này rộng hơn ở phía trên (1,5mm) và phía dưới (1mm), còn ở hai bên thì hẹp (khoảng 0,8mm) [1].
Biểu mô vùng rìa củng giác mạc gồm 7-10 hàng tế bào, các tế bào liên kết chặt chẽ với nhau giống như các tế bào của biểu mô giác mạc. Bên dưới 6 màng đáy, mô liên kết của vùng rìa tập trung nhiều dây thần kinh và giàu mạch máu, ngoài ra còn thấy sự có mặt của một số tế bào trung mô. Các yếu tố liên quan đảm bảo sự toàn vẹn của BMNC [29]. Để có thể thực hiện được chức năng nhìn của mắt, ngoài hệ thống thần kinh toàn vẹn, sự toàn vẹn của BMNC là cần thiết giúp cho hình ảnh nhìn thấy có thể tới điểm hội tụ trên võng mạc.
Có rất nhiều yếu tố tham gia để đảm bảo sự toàn vẹn của BMNC đó là: 1. Mi mắt Mi mắt có tác dụng bảo vệ BMNC khỏi các sang chấn về mặt cơ học từ môi trường bên ngoài, cấu trúc mềm mại của bờ tự do mi mắt giúp dàn trải đều của phim nước mắt trên BMNC làm BMNC luôn nhẵn bóng và đủ độ ẩm cần thiết. Ở BN bỏng mắt, bờ tự do của mi bị tổn thương ở nhiều mức độ khác nhau ảnh hưởng đến sự bền vững của màng nước mắt và gây ảnh hưởng đến sự toàn vẹn của BMNC. Phim nước mắt.
Sự toàn vẹn của bề mặt nhãn cầu cũng được đảm bảo bởi mối quan hệ mật thiết giữa biểu mô bề mặt nhãn cầu và phim nước mắt. Các rối loạn bề mặt nhãn cầu làm phim nước mắt kém bền vững và ngược lại. Hai đặc tính cơ bản của biểu mô bề mặt nhãn cầu là biểu mô không sừng hoá và tiết mucin (là thành phần quan trọng của màng phim nước mắt do tế bào hình đài tiết ra) đóng vai trò quan trọng để đảm bảo sự bền vững của màng phim nước mắt. Các tuyến lệ Thành phần không kém quan trọng của phim nước mắt là nước mắt cùng các chất điện phân và các loại protein do tuyến lệ chính và tuyến lệ phụ tiết ra.
Trong các trường hợp bỏng mắt toàn bộ, hệ thống tuyến lệ phụ đều bị 7 tổn hại cùng với biểu mô bề mặt nhãn cầu, do đó phim nước mắt bị phá huỷ hoàn toàn, gây tình trạng khô mắt nặng nề.