Nguyễn thị nga tổng hợp và đánh giá tác dụng kháng ung thư của một số dẫn chất n hydroxybenzamid mới mang khung 4 oxoquinazolin

N-Hydroxybenzamid là một dẫn chất mới đang được nghiên cứu với tiềm năng kháng ung thư. 102 trang · Trường Đại Học Dược Hà Nội · 2024.

• Tác giả: Nguyễn Thị Nga
• Người hướng dẫn: TS. Dương Tiến Anh
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Nghiên Cứu Tác Dụng Kháng Ung Thư Của Dẫn Chất N-Hydroxybenzamid Mới
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. GIỚI THIỆU VỀ ENZYM HISTON DEACETYLASE
• 2.1. Cấu trúc trung tâm hoạt động
• 2.2. HDAC và bệnh lý ung thư
• 3. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE
• 3.1. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC trong sinh lý ung thư
• 3.2. Phân loại các HDACi
• 3.3. Cấu trúc chung của các HDACi
• 4. KHUNG QUINAZOLIN VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ
• 4.1. Khung quinazolin và các dẫn chất
• 4.2. Một số phương pháp tổng hợp khung quinazolin-4(3H)-on
• 4.3. Hoạt tính kháng ung thư của khung quinazolin-4(3H)-on
• 5. PHẢN ỨNG CLICK CỘNG ĐÓNG VÒNG ALKYN – AZID XÚC TÁC ĐỒNG (I) (CUAAC) VÀ ỨNG DỤNG
• 5.1. Giới thiệu về phản ứng CuAAC
• 5.2. Cơ chế phản ứng
• 5.3. Ứng dụng phản ứng Click trong tổng hợp các hợp chất mang cấu trúc 1,2,3-triazol có hoạt tính sinh học
• 6. ĐỊNH HƯỚNG THIẾT KẾ CẤU TRÚC
• 7. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 7.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ
• 7.1.1. Thiết bị, dụng cụ
• 7.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 7.2.1. Tổng hợp hóa học
• 7.2.2. Đánh giá hoạt tính sinh học
• 7.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 7.3.1. Tổng hợp hóa học
• 7.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
• 8. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN
• 8.1. Tổng hợp hóa học
• 8.2. Kiểm tra độ tinh khiết
• 8.3. Khẳng định cấu trúc
• 9. HOẠT TÍNH SINH HỌC
• 9.1. Hoạt tính ức chế enzym histon deacetylase
• 9.2. Tác dụng gây độc tế bào in vitro
• 9.3. Đánh giá ảnh hưởng lên chu kỳ tế bào
• 9.4. Đánh giá ảnh hưởng lên quá trình apoptosis của tế bào
• 9.5. Tổng hợp hóa học
• 9.6. Khẳng định cấu trúc. Hoạt tính sinh học
• 10. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về N Hydroxybenzamid Và Tác Dụng Kháng Ung Thư

N-Hydroxybenzamid là một dẫn chất mới đang được nghiên cứu với tiềm năng kháng ung thư. Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng dẫn chất này có khả năng ức chế enzym histon deacetylase (HDAC), một yếu tố quan trọng trong sự phát triển của tế bào ung thư. Việc tìm hiểu về cấu trúc và cơ chế tác dụng của N-Hydroxybenzamid có thể mở ra hướng đi mới trong điều trị ung thư.

1.1. N Hydroxybenzamid Là Gì

N-Hydroxybenzamid là một hợp chất hữu cơ có cấu trúc đặc biệt, được biết đến với khả năng ức chế HDAC. Hợp chất này có thể tác động lên quá trình phiên mã của gen, từ đó ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào ung thư.

1.2. Tác Dụng Kháng Ung Thư Của N Hydroxybenzamid

N-Hydroxybenzamid đã được chứng minh có tác dụng kháng ung thư thông qua việc ức chế hoạt động của HDAC. Điều này giúp làm giảm sự phát triển và di căn của các tế bào ung thư, mở ra hy vọng cho các liệu pháp điều trị mới.

II. Vấn Đề Trong Nghiên Cứu Tác Dụng Kháng Ung Thư

Mặc dù N-Hydroxybenzamid cho thấy tiềm năng lớn trong việc điều trị ung thư, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong nghiên cứu và phát triển. Các vấn đề như độ an toàn, hiệu quả và khả năng tương tác với các liệu pháp khác cần được xem xét kỹ lưỡng.

2.1. Thách Thức Về Độ An Toàn

Một trong những thách thức lớn nhất là đảm bảo độ an toàn của N-Hydroxybenzamid trong điều trị. Các nghiên cứu cần phải xác định rõ các tác dụng phụ có thể xảy ra khi sử dụng hợp chất này.

2.2. Hiệu Quả Trong Điều Trị

Đánh giá hiệu quả của N-Hydroxybenzamid trong điều trị ung thư là một vấn đề quan trọng. Cần có các thử nghiệm lâm sàng để xác định mức độ hiệu quả của hợp chất này trên các dòng tế bào ung thư khác nhau.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Tác Dụng Kháng Ung Thư Của N Hydroxybenzamid

Để đánh giá tác dụng kháng ung thư của N-Hydroxybenzamid, các phương pháp nghiên cứu hiện đại đã được áp dụng. Các thí nghiệm in vitro và in vivo giúp xác định cơ chế tác dụng và hiệu quả của hợp chất này.

3.1. Thí Nghiệm In Vitro

Các thí nghiệm in vitro được thực hiện trên các dòng tế bào ung thư để đánh giá tác dụng ức chế của N-Hydroxybenzamid đối với enzym HDAC và sự phát triển của tế bào.

3.2. Thí Nghiệm In Vivo

Thí nghiệm in vivo giúp đánh giá tác dụng kháng ung thư của N-Hydroxybenzamid trong môi trường sinh lý thực tế. Kết quả từ các thí nghiệm này sẽ cung cấp thông tin quan trọng về khả năng điều trị của hợp chất.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Tác Dụng Kháng Ung Thư

Kết quả nghiên cứu cho thấy N-Hydroxybenzamid có khả năng ức chế hoạt động của HDAC và làm giảm sự phát triển của tế bào ung thư. Các dữ liệu thu được từ các thí nghiệm cho thấy hợp chất này có tiềm năng lớn trong điều trị ung thư.

4.1. Đánh Giá Hoạt Tính Sinh Học

Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy N-Hydroxybenzamid có khả năng ức chế enzym HDAC, từ đó làm giảm sự phát triển của tế bào ung thư trong các thí nghiệm in vitro.

4.2. Tác Dụng Gây Độc Tế Bào

N-Hydroxybenzamid đã cho thấy tác dụng gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư, điều này cho thấy khả năng điều trị tiềm năng của hợp chất này trong lâm sàng.

V. Kết Luận Về N Hydroxybenzamid Trong Điều Trị Ung Thư

N-Hydroxybenzamid là một dẫn chất hứa hẹn trong nghiên cứu kháng ung thư. Các kết quả nghiên cứu cho thấy hợp chất này có khả năng ức chế HDAC và tác động tích cực đến sự phát triển của tế bào ung thư. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để xác định rõ hơn về hiệu quả và độ an toàn của nó.

5.1. Tiềm Năng Trong Nghiên Cứu Kháng Ung Thư

N-Hydroxybenzamid có tiềm năng lớn trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư mới. Các nghiên cứu tiếp theo sẽ giúp làm rõ hơn về cơ chế tác dụng và hiệu quả của hợp chất này.

5.2. Hướng Đi Tương Lai

Hướng đi tương lai trong nghiên cứu N-Hydroxybenzamid là phát triển các dẫn chất mới với cấu trúc cải tiến nhằm tăng cường hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 2022, toàn cầu ghi nhận khoảng 20 triệu ca mắc ung thư mới và 9,7 triệu ca tử vong; dự báo đến năm 2050, số ca tử vong sẽ tăng 90%, vượt mức 18,5 triệu ca. Thực trạng này đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc phát triển các liệu pháp điều trị mới. Trong cơ chế bệnh sinh của khối u, bên cạnh các đột biến gen có tính không thể đảo ngược, các biến đổi biểu sinh (epigenetic modifications) có đặc tính thuận nghịch đang trở thành mục tiêu phân tử đầy tiềm năng. Trong số các cơ chế biến đổi biểu sinh, quá trình acetyl hóa và deacetyl hóa histon do hai hệ enzym đối kháng là histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) điều hòa giữ vai trò then chốt trong cấu trúc chất nhiễm sắc và kiểm soát biểu hiện gen.

Sự biểu hiện quá mức của các enzym HDAC được ghi nhận ở nhiều dòng tế bào ung thư ác tính. Tính đến thời điểm thực hiện đề tài, Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã phê duyệt một số chất ức chế HDAC (HDACi) trong lâm sàng như vorinostat (SAHA, 2006), romidepsin (2009), belinostat (2014), panobinostat (2015) và gần đây nhất là givinostat (đầu năm 2024). Đa số các thuốc này thuộc nhóm acid hydroxamic hoặc mang khung benzamid. Nhằm tối ưu hóa hoạt tính sinh học, xu hướng thiết kế phân tử lai (hybrid molecules) kết hợp các hợp phần có hoạt tính dược lý đã được ứng dụng rộng rãi. Khung dị vòng quinazolin-4(3H)-on và vòng 1,2,3-triazol đều là những cấu trúc có hoạt tính kháng ung thư đã được chứng minh qua nhiều nghiên cứu thực nghiệm.

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ của tác giả Nguyễn Thị Nga (Trường Đại học Dược Hà Nội, năm 2024) tập trung vào việc thiết kế cấu trúc mới kết hợp nhóm ức chế HDAC với dị vòng hoạt tính nhằm tìm kiếm các hợp chất kháng ung thư tiềm năng.

Mục tiêu nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể gồm hai nội dung:

1. Tổng hợp được 6 dẫn chất N-hydroxybenzamid mới mang khung 4-oxoquinazolin và dị vòng triazol hướng ức chế enzym histon deacetylase.
2. Đánh giá tác dụng ức chế HDAC và tác dụng kháng một số tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: 6 dẫn chất N-hydroxybenzamid mới mang khung 4-oxoquinazolin và dị vòng 1,2,3-triazol (ký hiệu từ 7a đến 7f).
• Phạm vi nghiên cứu:
  • Về hóa học: Tổng hợp, tinh chế, kiểm tra độ tinh khiết (nhiệt độ nóng chảy, sắc ký lớp mỏng) và xác định cấu trúc hóa học bằng các phương pháp phổ học (IR, HRMS, 1H-NMR, 13C-NMR).
  • Về sinh học: Đánh giá khả năng ức chế enzym HDAC tổng chiết từ tế bào HeLa; thử nghiệm độc tính tế bào in vitro trên 1 dòng tế bào thường (MRC-5: nguyên bào sợi phổi thai nhi người) và 2 dòng tế bào ung thư người (SW620: ung thư đại tràng; MDA-MB-231: ung thư vú); khảo sát tác động lên chu kỳ tế bào và quá trình chết theo chương trình (apoptosis) trên dòng tế bào SW620 của dẫn chất đại diện 7d.
• Thời gian và địa điểm thực hiện: Nghiên cứu được hoàn thành vào tháng 2 năm 2024; thực hiện thực nghiệm tại Bộ môn Hóa Dược – Khoa Công nghệ Hóa dược (Trường Đại học Dược Hà Nội), phối hợp đo phổ tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQGHN), Viện Hóa sinh biển (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và thử nghiệm sinh học tại Khoa Dược (Đại học Quốc gia Chungbuk, Hàn Quốc).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận được xây dựng trên nền tảng lý thuyết hóa dược hiện đại về thiết kế thuốc hướng đích biểu sinh và hóa học tổng hợp hữu cơ:

• Khung lý thuyết về enzym HDAC và mô hình pharmacophore: Hệ enzym HDAC ở người gồm 18 loại, chia thành 2 họ và 4 nhóm. Trong đó, các HDAC nhóm I (HDAC1-3, 8), nhóm II (IIa: HDAC4-5, 7, 9; IIb: HDAC6, 10) và nhóm IV (HDAC11) là các enzym phụ thuộc ion Zn2+. Trung tâm hoạt động của các HDAC phụ thuộc kẽm có cấu trúc dạng lòng túi dài hẹp chứa ion Zn2+ ở đáy. Mô hình pharmacophore kinh điển và mở rộng của các chất ức chế HDAC bao gồm 4 hợp phần chính:
  1. Nhóm gắn kẽm (ZBG - Zinc Binding Group): Tác giả chọn acid hydroxamic (-CONHOH) do khả năng tạo phức chelat mạnh với ion Zn2+ tại trung tâm xúc tác.
  2. Vùng cầu nối (Linker): Sử dụng hợp phần benzamid nhằm mô phỏng cấu trúc của các dẫn chất HDACi tiềm năng đang thử nghiệm lâm sàng (như givinostat, tubastatin A).
  3. Nhóm liên kết (CU - Connecting Unit): Vòng 1,2,3-triazol được đưa vào đóng vai trò là nhóm cấu đẳng sinh học (bioisostere) thay thế nhóm amid cổ điển, có độ phân cực cao và khả năng tương tác liên kết hydro.
  4. Vùng nhận diện bề mặt (Cap group): Sử dụng khung 4-oxoquinazolin thế tại vị trí 6 hoặc 7 bằng các nhóm methyl, cloro, bromo để tương tác với các acid amin ở miệng túi enzym.
• Phản ứng cộng đóng vòng Alkyn – Azid xúc tác đồng (I) (CuAAC): Phản ứng hóa học Click giữa dẫn chất propargyl quinazolinon và methyl 4-(azidomethyl)benzoat, dựa trên cơ chế hai nguyên tử đồng do Fokin và cộng sự đề xuất (năm 2013), giúp tạo chọn lọc sản phẩm 1,4-disubstituted 1,2,3-triazol với hiệu suất cao.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được triển khai đồng bộ qua các kỹ thuật:

• Phương pháp tổng hợp hóa học: Áp dụng quy trình tổng hợp hữu cơ 5 giai đoạn: phản ứng thế nucleophin SN2 tạo dẫn chất azid; phản ứng ngưng tụ đóng vòng Niementowski tạo khung quinazolin-4(3H)-on; phản ứng N-alkyl hóa tạo dẫn chất propargyl; phản ứng CuAAC; phản ứng hydroxamic hóa chuyển nhóm ester thành acid hydroxamic trong môi trường kiềm (NH2OH.HCl/NaOH ở nhiệt độ 0°C).
• Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết: Sử dụng sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản mỏng pha tĩnh silicagel 60 F254 và xác định nhiệt độ nóng chảy trên máy đo nhiệt điện tử.
• Phương pháp khẳng định cấu trúc: Ghi và phân tích phổ hồng ngoại (FTIR Shimadzu viên nén KBr), phổ khối lượng phân giải cao (HRMS Agilent 6530 QTOF ESI), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) trên máy Bruker AV-500 với dung môi DMSO-d6.
• Phương pháp thử nghiệm sinh học in vitro:
  • Đánh giá ức chế HDAC tổng: Sử dụng bộ Fluorogenic HDAC Assay Kit (Enzo Life Sciences Inc.), ủ cơ chất peptid gắn lysin acetyl hóa với dịch chiết HDAC từ tế bào HeLa, đo huỳnh quang trên máy VICTOR (PerkinElmer) ở bước sóng kích thích 360 nm và phát xạ 460 nm; tính toán IC50 bằng phần mềm GraphPad Prism 5.0.
  • Đánh giá độc tính tế bào (SRB assay): Nhuộm protein tế bào sống bằng Sulforhodamin B sau 48 giờ tiếp xúc chất thử; đo mật độ quang học (OD) tại bước sóng 510 nm trên máy đọc ELISA; xác định IC50 bằng phần mềm Probits với hai chất đối chứng dương là vorinostat (SAHA) và adriamycin (ADR).
  • Đánh giá chu kỳ tế bào và Apoptosis: Tế bào ung thư đại tràng SW620 được xử lý với dẫn chất 7d và SAHA ở nồng độ 5 µM trong 24 giờ. Nhuộm propidium iodid (PI) kết hợp RNase để phân tích chu kỳ tế bào; nhuộm kép Annexin V-FITC và PI để định lượng tỷ lệ apoptosis qua hệ thống đo tế bào dòng chảy FACScalibur (BD Biosciences) và xử lý dữ liệu bằng phần mềm Cell Quest Pro.

Nội dung chính theo từng chương

Đặt vấn đề và Tổng quan tài liệu

Tác giả hệ thống hóa cơ sở phân tử của các biến đổi biểu sinh trong ung thư, tập trung vào cấu trúc không gian và cơ chế xúc tác của các HDAC phụ thuộc kẽm (đặc biệt là HDAC8 theo mô hình của Gantt và cộng sự, 2016). Phân tích chi tiết các con đường sinh học mà HDACi tác động lên tế bào khối u: cảm ứng bắt giữ chu kỳ tế bào (thông qua hoạt hóa gen CDKN1A mã hóa p21), kích hoạt apoptosis (qua con đường ty thể nội sinh làm giảm Bcl-2/Bcl-xL, tăng Bax/Bak và con đường thụ thể gây chết ngoại sinh TRAILR/TNFR), ức chế tân tạo mạch (giảm HIF1-α, VEGF, bFGF) và cản trở cơ chế sửa chữa tổn thương ADN. Chương này cũng phân loại các nhóm HDACi, điểm lại lịch sử các chất đã được FDA cấp phép, tổng kết các phương pháp tổng hợp khung quinazolin-4(3H)-on từ acid anthranilic, isotoic anhydrid, o-nitrobenzamid, anthranilamid và 2-halobenzamid, cùng cơ chế phản ứng Click CuAAC và ứng dụng của dị vòng triazol trong cấu trúc thuốc kháng ung thư.

Chương 2. Nguyên vật liệu, thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết thông số các hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích (AR) từ Sigma-Aldrich, Merck, Fluka; hệ thống trang thiết bị thí nghiệm bao gồm máy cất quay Buchi R-210, tủ nuôi cấy Vision Scientific, máy đo phổ cộng hưởng từ Bruker và máy đo phổ khối Agilent. Mô tả cụ thể quy trình thao tác chuẩn của 5 phản ứng tổng hợp hóa học, các hệ dung môi khai triển sắc ký lớp mỏng (hệ DCM:MeOH với tỷ lệ 90:1, 15:1 và 9:1), kỹ thuật đo nhiệt độ nóng chảy và các thông số cài đặt máy đo quang phổ. Tác giả chuẩn hóa quy trình thực nghiệm sinh học từ khâu chuẩn bị nồng độ mẫu thử trong DMSO (đảm bảo nồng độ DMSO cuối cùng < 0,1%), các bước nuôi cấy tế bào ung thư người và tế bào thường trong môi trường DMEM bổ sung 5% FBS, kỹ thuật cố định tế bào bằng acid tricloroacetic (TCA), đến thao tác phân tích tế bào dòng chảy với chất huỳnh quang.

Chương 3. Thực nghiệm, kết quả và bàn luận

Trình bày toàn bộ tiến trình tổng hợp hóa học và phân tích kết quả của 6 dẫn chất N-hydroxybenzamid (7a-f) qua sơ đồ 5 bước:

1. Tổng hợp nguyên liệu methyl 4-(azidomethyl)benzoat (2): Phản ứng giữa methyl 4-(bromomethyl)benzoat (1) với natri azid (NaN3) trong methanol hồi lưu 8 giờ đạt hiệu suất 91,3%, sản phẩm lỏng màu vàng nhạt, Rf = 0,55 (DCM).
2. Tổng hợp các dẫn chất quinazolin-4(3H)-on (4a-f): Ngưng tụ acid 2-aminobenzoic hoặc các dẫn chất thế tương ứng (3a-f) với formamid ở 120°C trong 6 giờ; thu nhận sản phẩm rắn màu nâu nhạt với hiệu suất cao: 4a (94,5%), 4b (89,6%), 4c (91,3%), 4d (88,2%), 4e (90,5%), 4f (92,7%).
3. Tổng hợp các dẫn chất 3-(prop-2-yn-1-yl)quinazolin-4(3H)-on (5a-f): Cho 4a-f phản ứng với propargyl bromid có mặt K2CO3 và KI trong aceton ở 60°C trong 3 giờ; hiệu suất phản ứng đạt gần như định lượng: 5a (99,0%), 5b (97,4%), 5c (98,4%), 5d (96,7%), 5e (99,3%), 5f (97,9%).
4. Tổng hợp các dẫn chất ester mang dị vòng 1,2,3-triazol (6a-f): Ghép nối 5a-f với dẫn chất azid 2 qua phản ứng CuAAC xúc tác CuI trong acetonitril ở 50°C trong 3-4 giờ; xử lý loại đồng qua phễu lọc Celite; hiệu suất thu được: 6a (87,4%), 6b (88,0%), 6c (89,6%), 6d (86,9%), 6e (86,2%), 6f (84,7%).
5. Tổng hợp các dẫn chất đích N-hydroxybenzamid (7a-f): Hydroxamic hóa các ester 6a-f bằng hydroxylamin hydroclorid (10 đương lượng) trong hỗn hợp dung môi MeOH:DMF (tỷ lệ 10:3) dưới tác dụng của dung dịch NaOH bão hòa ở 0°C (duy trì pH = 11-12 trong 2 giờ); kết tủa sản phẩm bằng cách chỉnh về pH = 7 bằng dung dịch HCl 5%; kết tinh lại bằng methanol - nước thu được các chất rắn màu trắng với hiệu suất bước cuối từ 59,7% đến 64,0%.

Kiểm tra lý hóa xác nhận cả 6 dẫn chất đều tinh khiết, thể hiện qua khoảng nóng chảy hẹp (1-2°C) và sắc ký lớp mỏng chỉ xuất hiện một vết duy nhất. Phân tích phổ hồng ngoại (IR) ghi nhận đầy đủ các dải hấp thụ dao động hóa trị đặc trưng: liên kết νOH của nhóm acid hydroxamic xuất hiện ở vùng 3295 - 3473 cm⁻¹; dao động νNH amid ở vùng 3003 - 3308 cm⁻¹; dao động νC=O của nhóm carbonyl quinazolinon và nhóm hydroxamid tách thành các pic riêng biệt trong khoảng 1628 - 1678 cm⁻¹; dao động νC=C nhân thơm và vòng triazol xuất hiện trong vùng 1528 - 1610 cm⁻¹. Cấu trúc hóa học của các hợp chất tiếp tục được minh chứng đầy đủ qua các tín hiệu phổ khối lượng phân giải cao (HRMS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR).

Về hoạt tính sinh học, chương này thảo luận số liệu đánh giá khả năng ức chế enzym HDAC và tác dụng gây độc tế bào in vitro trên các dòng tế bào nghiên cứu. Dẫn chất đại diện 7d (chứa nhóm thế 6-cloro trên khung quinazolinon) được phân tích chuyên sâu về tác động làm ngừng chu kỳ tế bào và cảm ứng apoptosis trên dòng ung thư đại tràng SW620, đối chiếu trực tiếp với chất chuẩn vorinostat (SAHA).

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã hoàn thành toàn diện hai mục tiêu đề ra với các kết quả cụ thể:

• Về mặt tổng hợp hóa học: Đã tổng hợp thành công 6 dẫn chất N-hydroxybenzamid mới mang khung 4-oxoquinazolin và dị vòng 1,2,3-triazol (7a-f) chưa từng được công bố trước đó. Quy trình 5 bước phản ứng đạt hiệu suất tương đối cao và ổn định.

Dữ liệu lý hóa và hiệu suất tổng hợp toàn phần của các dẫn chất được tổng hợp trong bảng sau:

Dẫn chất	Nhóm thế R	Hiệu suất toàn phần (%)	Giá trị Rf (DCM:MeOH = 9:1)	Điểm nóng chảy (°C)	Dao động νC=O (IR, cm⁻¹)
7a	H	51,7	0,38	191,3 – 192,4	1675, 1648
7b	6-CH3	46,7	0,40	203,6 – 205,0	1678, 1632
7c	7-CH3	49,5	0,40	199,1 – 200,4	1670, 1628
7d	6-Cl	44,2	0,41	211,1 – 212,3	1675, 1629
7e	6-Br	51,2	0,42	227,9 – 229,4	1673, 1628
7f	7-Br	49,2	0,42	224,3 – 225,9	1664

• Về kiểm tra cấu trúc: Cấu trúc phân tử của 6 dẫn chất được làm sáng tỏ và chứng minh nhất quán bằng hệ thống dữ liệu phổ thực nghiệm bao gồm phổ IR, HRMS, 1H-NMR và 13C-NMR.
• Về hoạt tính sinh học:
  • Khẳng định khả năng ức chế enzym HDAC tổng tách chiết từ tế bào HeLa của các dẫn chất tổng hợp.
  • Xác định tác dụng gây độc tế bào in vitro của dãy chất trên hai dòng tế bào ung thư người (SW620, MDA-MB-231) và đánh giá tính an toàn/độ chọn lọc đối với dòng tế bào bình thường MRC-5, so sánh với các đối chứng dương SAHA và adriamycin.
  • Khảo sát cơ chế cho thấy dẫn chất đại diện 7d có khả năng tác động làm thay đổi phân bố các pha trong chu kỳ tế bào và kích thích quá trình chết tự nhiên (apoptosis) trên dòng tế bào ung thư đại tràng SW620 ở nồng độ 5 µM sau 24 giờ.
• Đóng góp khoa học: Đề tài đã đóng góp vào ngân hàng dữ liệu hóa dược một dãy dẫn chất lai hóa mới (hybrid molecules) mang khung 4-oxoquinazolin gắn với nhóm ZBG N-hydroxybenzamid qua cầu nối 1,2,3-triazol; cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết cho phản ứng CuAAC tạo liên kết dị vòng và phương pháp hydroxamic hóa chọn lọc từ tiền chất ester benzoic; đồng thời cung cấp những bằng chứng thực nghiệm về mối liên quan giữa cấu trúc và tác dụng sinh học (SAR) đối với đích ức chế enzym HDAC.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận còn một số hạn chế nhất định dựa trên phạm vi thực tế được thực hiện:

• Về mặt hóa học: Số lượng dẫn chất được tổng hợp còn giới hạn (6 chất), tập trung chủ yếu vào các nhóm thế methyl hoặc halogen (Cl, Br) tại hai vị trí C-6 và C-7 trên khung quinazolin-4(3H)-on; chưa khảo sát thêm các nhóm thế hút/đẩy điện tử khác hoặc các vị trí thế khác trên vòng benzen của quinazolin.
• Về đánh giá sinh học:
  • Thử nghiệm ức chế enzym mới dừng lại ở hỗn hợp HDAC tổng chiết từ tế bào HeLa, chưa thực hiện sàng lọc tính chọn lọc trên từng isoform enzym HDAC tái tổ hợp chuyên biệt (như HDAC1, HDAC2, HDAC6, HDAC8).
  • Các thử nghiệm sâu về cơ chế phân tử (chu kỳ tế bào và apoptosis) mới chỉ tiến hành trên một dẫn chất đại diện duy nhất (7d) trên một dòng tế bào đích (SW620).
  • Nghiên cứu hoàn toàn dừng lại ở quy mô in vitro, chưa đánh giá các thông số dược động học (độ tan, độ bền chuyển hóa) và hiệu lực kháng ung thư in vivo trên mô hình động vật.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Mở rộng thư viện hóa học bằng cách tổng hợp thêm các dẫn chất mang các nhóm thế chức hóa đa dạng hơn trên khung quinazolin hoặc thay đổi chiều dài/cấu trúc của cầu nối linker.
• Đánh giá hoạt tính ức chế chọn lọc của các dẫn chất tiềm năng trên từng phân nhóm enzym HDAC tinh khiết.
• Làm rõ cơ chế phân tử thông qua các kỹ thuật sinh học phân tử chuyên sâu (Western blot đánh giá sự biến đổi mức độ acetyl hóa histon H3, H4, biểu hiện của protein p21, p53, caspase, PARP).
• Triển khai thử nghiệm độc tính cấp và hoạt tính kháng u trên mô hình khối u ghép dị loài (xenograft) trên chuột.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh ngành Hóa dược và Dược học: Cung cấp khung tài liệu bài bản về phương pháp thiết kế phân tử thuốc hướng đích ức chế enzym (HDACi) dựa trên mô hình pharmacophore cải tiến; quy trình chuẩn bị và thực hiện các phản ứng hữu cơ nhiều giai đoạn.
• Các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực Hóa học hữu cơ và Hóa học các hợp chất thiên nhiên/dị vòng: Tài liệu cung cấp quy trình chi tiết về phản ứng cộng đóng vòng alkyn – azid xúc tác đồng (I) (CuAAC) để xây dựng cầu nối 1,2,3-triazol, phương pháp xử lý loại muối đồng bằng Celite, và kỹ thuật chuyển hóa nhóm ester thành acid hydroxamic với hiệu suất cao mà không làm phá vỡ các liên kết nhạy cảm trong phân tử.
• Các phòng thí nghiệm sinh học phân tử và dược lý ung thư: Phần phương pháp cung cấp quy trình chuẩn hóa các phép thử sinh học in vitro bao gồm kỹ thuật đo huỳnh quang xác định hoạt tính HDAC, phương pháp nhuộm Sulforhodamin B (SRB) trên đĩa 96 giếng, cũng như kỹ thuật cố định và nhuộm tế bào để phân tích chu kỳ tế bào (PI/RNase) và apoptosis (Annexin V-FITC/PI) bằng hệ thống đo tế bào dòng chảy (Flow cytometry).

Câu hỏi thường gặp

1. Dãy phân tử đích trong khóa luận được thiết kế dựa trên mô hình pharmacophore nào của các chất ức chế HDAC?

Dãy chất được thiết kế dựa trên mô hình pharmacophore của các chất ức chế HDAC gồm 4 hợp phần:

• Nhóm gắn kẽm (ZBG): nhóm acid hydroxamic (-CONHOH) có khả năng chelat hóa với ion Zn2+ tại đáy khoang xúc tác.
• Vùng cầu nối (Linker): hợp phần benzamid liên kết ZBG với dị vòng.
• Nhóm liên kết (CU): dị vòng 1,2,3-triazol đóng vai trò nhóm cấu đẳng sinh học (bioisostere) thay thế liên kết amid truyền thống.
• Nhóm nhận diện bề mặt (Cap group): khung 4-oxoquinazolin (với các nhóm thế H, 6-CH3, 7-CH3, 6-Cl, 6-Br, 7-Br) tương tác với miệng túi enzym.

2. Phản ứng hóa học Click CuAAC trong khóa luận sử dụng điều kiện xúc tác và dung môi cụ thể nào?

Phản ứng CuAAC ghép nối dẫn chất propargyl quinazolinon (5a-f) với methyl 4-(azidomethyl)benzoat (2) sử dụng xúc tác muối đồng(I) iodid (CuI, tỷ lệ 1,0 đương lượng mol) trong dung môi acetonitril (MeCN), khuấy ở nhiệt độ 50°C trong thời gian từ 3 đến 4 giờ. Hỗn hợp phản ứng sau đó được kiềm hóa bằng dung dịch Na2CO3 để kết tủa muối đồng dưới dạng hydroxyd và lọc loại qua phễu Buchner có lớp trợ lọc Celite.

3. Hiệu suất toàn phần của quá trình tổng hợp 6 dẫn chất (7a-f) đạt bao nhiêu và chất nào có hiệu suất cao nhất?

Hiệu suất toàn phần qua quy trình 5 bước dao động từ 44,2% đến 51,7%. Trong đó, dẫn chất 7a (nhóm thế R = H) đạt hiệu suất toàn phần cao nhất là 51,7%, tiếp theo sát là dẫn chất 7e (R = 6-Br) với hiệu suất 51,2%. Dẫn chất có hiệu suất toàn phần thấp nhất trong dãy là 7d (R = 6-Cl) đạt 44,2%.

4. Hoạt tính ức chế enzym và độc tính tế bào của các hợp chất được đánh giá trên những hệ thống mô hình nào?

• Hoạt tính ức chế enzym được thử nghiệm trên hỗn hợp enzym HDAC tổng tách chiết từ dòng tế bào HeLa người, sử dụng bộ kit đo huỳnh quang Fluorogenic HDAC Assay Kit.
• Tác dụng gây độc tế bào in vitro được đánh giá qua phương pháp đo độ hấp thụ màu sulforhodamin B (SRB) trên 3 dòng tế bào: dòng tế bào thường MRC-5 (nguyên bào sợi phổi thai nhi người) và 2 dòng tế bào ung thư người gồm SW620 (ung thư đại tràng) và MDA-MB-231 (ung thư vú), đối chiếu với hai hoạt chất chuẩn là vorinostat (SAHA) và adriamycin (ADR).

5. Dẫn chất nào được chọn để nghiên cứu sâu về chu kỳ tế bào và apoptosis, và phép thử được thực hiện bằng kỹ thuật gì?

Dẫn chất 7d (mang nhóm thế 6-cloro trên khung 4-oxoquinazolin) được lựa chọn làm đại diện để đánh giá tác động lên chu kỳ tế bào và quá trình apoptosis trên dòng tế bào ung thư đại tràng người SW620 (xử lý ở nồng độ 5 µM trong 24 giờ). Phép thử được thực hiện bằng kỹ thuật đo tế bào dòng chảy (Flow cytometry) trên hệ thống thiết bị FACScalibur với thuốc nhuộm huỳnh quang Propidium iodid (kết hợp RNase) cho chu kỳ tế bào và bộ nhuộm kép Annexin V-FITC / Propidium iodid cho quá trình apoptosis.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của dược sĩ Nguyễn Thị Nga đã hoàn thành việc thiết kế, tổng hợp và khẳng định cấu trúc của 6 dẫn chất N-hydroxybenzamid mới mang khung 4-oxoquinazolin kết hợp dị vòng 1,2,3-triazol với hiệu suất toàn phần đạt từ 44,2% đến 51,7%. Các dẫn chất đều đạt độ tinh khiết cao và được xác nhận cấu trúc đầy đủ bằng các phương pháp phổ học IR, HRMS, 1H-NMR và 13C-NMR. Kết quả thử nghiệm sinh học in vitro đã chứng minh hoạt tính ức chế enzym HDAC và tác dụng gây độc trên các dòng tế bào ung thư đại tràng SW620 và ung thư vú MDA-MB-231, đồng thời bước đầu làm sáng tỏ cơ chế tác động lên chu kỳ tế bào và cảm ứng apoptosis của dẫn chất đại diện 7d. Nghiên cứu cung cấp dữ liệu thực nghiệm có giá trị khoa học, tạo tiền đề cho các định hướng tối ưu hóa cấu trúc thuốc kháng ung thư hướng đích biểu sinh tiếp theo.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Theo dữ liệu thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), vào năm 2022 ước tính có khoảng 20 triệu ca ung thư mới và 9,7 triệu ca tử vong, dự đoán đến năm 2050 số ca tử vong sẽ tăng 90%, đạt hơn 18,5 triệu ca [23]. Từ đó có thể thấy gánh nặng ung thư toàn cầu đang ngày càng gia tăng nhanh chóng và việc tìm kiếm các phương pháp điều trị ung thư mới trở thành vấn đề cấp bách. Hai yếu tố quan trọng thúc đẩy sự hình thành, phát triển và di căn của các khối u là những đột biến gen làm gián đoạn trình tự ADN và các biến đổi biểu sinh gây thay đổi biểu hiện gen, đặc biệt là các gen gây ung thư và ức chế khối u. Trong khi các đột biến gen có đặc tính không thể đảo ngược, khả năng có thể đảo ngược của các biến đổi biểu sinh giúp chúng trở thành mục tiêu tiềm năng trong phát triển các liệu pháp điều trị ung thư mới [58].

Một trong những nhân tố chính tham gia vào các biến đổi biểu sinh là protein histon. Hiện nay, các enzym chịu trách nhiệm cho các quá trình biến đổi sau dịch mã trên histon đang trở thành các đích phân tử được nghiên cứu rộng rãi trong điều trị các khối u như EZH2, DOT1L, LSD1 và đặc biệt là HDAC với nhiều thuốc được FDA phê duyệt sử dụng trong lâm sàng nhất [20]. Đến nay, trong 4 thuốc ức chế HDAC được FDA phê duyệt cho điều trị nhiều loại ung thư khác nhau bao gồm vorinostat (2006), romidepsin (2009), belinostat (2014) và panobinostat (2015), có 3 chất thuộc nhóm các acid hydroxamic. Ngoài ra, một số HDACi khác thuộc nhóm các acid hydroxamic mang hợp phần benzamid cũng đang được nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng ở các pha khác nhau như givinostat [15], tubastatin A [11], nexturastat A [75].

Điều này cho thấy tiềm năng của các khung cấu trúc này trong nghiên cứu phát triển các HDACi mới. Bên cạnh đó, một hướng đi mới hiện nay trong thiết kế tổng hợp các HDACi là thêm vào cấu trúc các hợp phần có hoạt tính sinh học để tăng hiệu quả. Cấu trúc quinazolin-4(3H)-on và vòng 1,2,3-triazol đã được chứng minh có các tác dụng như kháng khuẩn, chống viêm, kháng HIV và đặc biệt là hoạt tính kháng ung thư [2], [29]. Từ cơ sở của các nghiên cứu trên, đề tài “Tổng hợp và đánh giá tác dụng kháng ung thư của một số dẫn chất N-hydroxybenzamid mới mang khung 4- oxoquinazolin” được thực hiện với hai mục tiêu: 1.

Tổng hợp được 6 dẫn chất N-hydroxybenzamid mới mang khung 4- oxoquinazolin và dị vòng triazol hướng ức chế enzym histon deacetylase. Đánh giá tác dụng ức chế HDAC và tác dụng kháng một số tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được. Giới thiệu về enzym histon deacetylase Trong nhân tế bào người, các nucleosome cấu tạo lên nhiễm sắc thể được hình thành từ sợi ADN có độ dài khoảng 145 – 147 nucleotid quấn quanh lõi octamer histon bao gồm hai bản sao của mỗi loại protein histon: H2A, H2B, H3 và H4 [49]. Các nghiên cứu chỉ ra rằng các biến đổi sau dịch mã (PTM – Post-translational modification) trên histon làm thay đổi điện tích và cấu trúc các đầu tận cùng của protein, từ đó gây ra sự thay đổi mức độ tháo xoắn của chất nhiễm sắc và cuối cùng gây kích hoạt hoặc ức chế quá trình phiên mã trong tế bào [39], [90].

Các biến đổi này bao gồm acetyl hóa, methyl hóa, phosphoryl hóa, ubiquityl hóa, sumoyl hóa… trong đó quá trình acetyl hóa histon là một trong những biến đổi phổ biến nhất và đóng vai trò vô cùng quan trọng trong điều hòa biểu hiện gen [42].