Phân Lập Và Đánh Giá Tác Dụng Chống Viêm In Vitro Của Hợp Chất Flavonoid C-Glucosid Từ Cây Xấu Hổ

Nghiên cứu phân lập và đánh giá tác dụng chống viêm in vitro của flavonoid c glycosid từ cây xấu hổ, mở ra hướng đi mới trong y học.

• Tác giả: Nguyễn Thị Diệu Thúy
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Quỳnh Chi
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Nghiên Cứu Tác Dụng Chống Viêm Của Hợp Chất Flavonoid Từ Cây Xấu Hổ
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về cây Xấu hổ (Mimosa pudica L.
• 1.2. Vị trí phân loại của Mimosa pudica L.
• 1.3. Đặc điểm thực vật, phân bố và sinh thái
• 1.4. Bộ phận dùng, thu hái, chế biến
• 1.5. Thành phần hóa học của cây Xấu hổ Mimosa pudica L.
• 1.6. Tác dụng dược lý của loài Mimosa pudica L.
• 1.7. Tổng quan về loài Mimosa diplotricha C. Wright ex Sa
• 1.8. Lựa chọn chất đánh dấu hóa học trong kiểm soát chất lượng dược liệu
• 1.8.1. Một số khái niệm
• 1.8.2. Marker tiêu chuẩn hóa
• 1.8.3. Lựa chọn chất đánh dấu (marker) định tính, định lượng
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu, thiết bị
• 2.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Các trang thiết bị nghiên cứu
• 2.4. Nội dung nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5. Phân lập hợp chất flavonoid glycosid từ cây Xấu hổ
• 2.6. Xác định cấu trúc của chất phân lập được
• 2.7. Đánh giá tác dụng chống viêm in vitro của hợp chất flavonoid glycosid phân lập từ cây Xấu hổ
• 3. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Phân lập hợp chất flavonoid glycosid từ cao toàn phần
• 3.2. Giai đoạn 1: Chiết xuất cao toàn phần từ dược liệu Xấu hổ
• 3.3. Giai đoạn 2: Phân đoạn bằng sắc ký cột rây phân tử Sephadex LH-20
• 3.4. Giai đoạn 3: Phân lập flavonoid glycosid bằng sắc ký cột silicagel pha đảo và tinh chế hợp chất phân lập được bằng sắc ký cột Sephadex LH-20
• 3.5. Xác định cấu trúc chất phân lập được. Đánh giá tác dụng chống viêm in vitro của hợp chất flavonoid glycosid phân lập từ cây Xấu hổ
• 3.6. Độc tính của hợp chất flavonoid glycosid trên đại thực bào phúc mạc
• 3.7. Tác dụng ức chế giải phóng NO của isoorientin
• 3.8. Phân lập hợp chất flavonoid từ cây Xấu hổ
• 3.9. Về tác dụng chống viêm in vitro của hợp chất flavonoid phân lập được
• KẾT LUẬN, ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về tác dụng chống viêm của flavonoid từ cây Xấu hổ

Cây Xấu hổ (Mimosa pudica L.) nổi bật với các hợp chất flavonoid có tác dụng chống viêm mạnh mẽ. Nghiên cứu cho thấy rằng các flavonoid như luteolin và isoorientin có khả năng ức chế sản xuất các cytokine gây viêm, từ đó giảm thiểu tình trạng viêm nhiễm trong cơ thể. Việc tìm hiểu về tác dụng của các hợp chất này không chỉ giúp nâng cao hiểu biết về dược liệu mà còn mở ra hướng đi mới trong điều trị các bệnh lý viêm nhiễm.

1.1. Tác dụng sinh học của flavonoid trong cây Xấu hổ

Flavonoid trong cây Xấu hổ đã được chứng minh có tác dụng sinh học đa dạng, bao gồm khả năng chống viêm, kháng khuẩn và bảo vệ gan. Các nghiên cứu cho thấy rằng luteolin có thể ức chế sản xuất NO và các cytokine gây viêm, từ đó giảm thiểu tình trạng viêm nhiễm trong cơ thể.

1.2. Các loại flavonoid chính trong cây Xấu hổ

Trong cây Xấu hổ, nhiều loại flavonoid đã được phân lập, bao gồm luteolin, isoorientin và orientin. Những hợp chất này không chỉ có tác dụng chống viêm mà còn có khả năng điều chỉnh các phản ứng miễn dịch, giúp cải thiện sức khỏe tổng thể.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu tác dụng của flavonoid

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về tác dụng của flavonoid từ cây Xấu hổ, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc xác định chính xác cơ chế hoạt động và hiệu quả lâm sàng của chúng. Việc thiếu các nghiên cứu lâm sàng quy mô lớn và tiêu chuẩn hóa quy trình chiết xuất là những vấn đề cần được giải quyết.

2.1. Thiếu hụt nghiên cứu lâm sàng

Nhiều nghiên cứu hiện tại chủ yếu tập trung vào các thí nghiệm in vitro mà chưa có đủ dữ liệu lâm sàng để khẳng định hiệu quả của flavonoid trong điều trị bệnh. Điều này tạo ra một khoảng trống lớn trong việc áp dụng thực tiễn.

2.2. Khó khăn trong việc tiêu chuẩn hóa quy trình chiết xuất

Quy trình chiết xuất flavonoid từ cây Xấu hổ hiện tại chưa được tiêu chuẩn hóa, dẫn đến sự biến đổi về chất lượng và hiệu quả của sản phẩm cuối cùng. Việc thiết lập các tiêu chuẩn rõ ràng là cần thiết để đảm bảo tính nhất quán trong nghiên cứu.

III. Phương pháp nghiên cứu tác dụng chống viêm của flavonoid

Nghiên cứu tác dụng chống viêm của flavonoid từ cây Xấu hổ thường sử dụng các phương pháp in vitro để đánh giá hiệu quả của các hợp chất này. Các thí nghiệm này giúp xác định khả năng ức chế sản xuất các cytokine gây viêm và các chỉ số sinh học khác.

3.1. Phương pháp chiết xuất flavonoid

Phương pháp chiết xuất flavonoid từ cây Xấu hổ thường sử dụng dung môi như ethanol hoặc methanol. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc lựa chọn dung môi phù hợp có thể ảnh hưởng đến hiệu quả chiết xuất và hàm lượng flavonoid thu được.

3.2. Đánh giá tác dụng chống viêm in vitro

Các thí nghiệm in vitro thường sử dụng tế bào RAW 264.7 để đánh giá tác dụng chống viêm của flavonoid. Kết quả cho thấy rằng các hợp chất này có khả năng ức chế sản xuất NO và các cytokine gây viêm, từ đó chứng minh hiệu quả chống viêm của chúng.

IV. Ứng dụng thực tiễn của flavonoid trong điều trị viêm

Flavonoid từ cây Xấu hổ không chỉ có tiềm năng trong nghiên cứu mà còn có thể được ứng dụng trong điều trị các bệnh lý viêm nhiễm. Việc phát triển các sản phẩm từ flavonoid có thể mang lại lợi ích cho sức khỏe cộng đồng.

4.1. Sản phẩm từ flavonoid trong y học cổ truyền

Trong y học cổ truyền, cây Xấu hổ đã được sử dụng để điều trị nhiều bệnh lý viêm nhiễm. Việc chiết xuất và phát triển các sản phẩm từ flavonoid có thể nâng cao hiệu quả điều trị và mở rộng ứng dụng của dược liệu này.

4.2. Tiềm năng trong phát triển dược phẩm mới

Nghiên cứu về flavonoid từ cây Xấu hổ có thể dẫn đến việc phát triển các dược phẩm mới với tác dụng chống viêm mạnh mẽ. Điều này không chỉ giúp cải thiện sức khỏe mà còn tạo ra cơ hội kinh doanh cho ngành dược phẩm.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu flavonoid

Nghiên cứu về tác dụng chống viêm của flavonoid từ cây Xấu hổ đang mở ra nhiều triển vọng mới trong lĩnh vực y học. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các sản phẩm từ flavonoid sẽ góp phần nâng cao hiệu quả điều trị và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

5.1. Tương lai của nghiên cứu flavonoid

Tương lai của nghiên cứu flavonoid từ cây Xấu hổ hứa hẹn sẽ mang lại nhiều phát hiện mới. Việc đầu tư vào nghiên cứu lâm sàng và phát triển sản phẩm sẽ giúp khẳng định giá trị của dược liệu này.

5.2. Khuyến nghị cho nghiên cứu tiếp theo

Cần có các nghiên cứu lâm sàng quy mô lớn để xác định hiệu quả và độ an toàn của flavonoid trong điều trị bệnh. Đồng thời, việc tiêu chuẩn hóa quy trình chiết xuất cũng cần được chú trọng để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về cây Xấu hổ (Mimosa pudica L. Vị trí phân loại của Mimosa pudica L. Cây Xấu hổ còn có tên gọi khác là cây Mắc cỡ, cây Thẹn, cây Trinh nữ, Hàm tu thảo [7].

Vị trí phân loại của loài Mimosa pudica L. trong hệ thống phân loại thực vật của Takhatajan 1987 [10] như sau: Giới Thực vật (Plantae) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa Hồng (Rosidae) Bộ Đậu (Fabales) Họ Đậu (Fabaceae) Phân họ Trinh nữ (Mimosoideae) Chi Mimosa Loài Mimosa pudica L. Đặc điểm thực vật, phân bố và sinh thái 1. Đặc điểm thực vật Cây nhỏ, mọc hoang ở ven đường, thân có gai hình móc.

Lá 2 lần kép lông chim, nhưng cuống phụ xếp như hình chân vịt; khẽ động vào lá cụp xuống. Cuống chung gầy, mang nhiều lông, dài 4cm, cuống phụ 2 đôi, có lông trắng cứng. Lá chét 15-20 đôi nhỏ, gần như không có cuống [7]. Hoa màu tím đỏ, tụ thành hình đầu trái xoan.

Cụm hoa mọc ở kẽ lá gồm rất nhiều hoa nhỏ xếp thành đấu tròn, màu tím hồng; dài nhỏ hình đấu; tràng 4 cánh dính nhau ở nửa dưới; nhị 4, rất mảnh, bầu 4 noãn [9]. Quả giáp dài 2cm, rộng 3mm, tụ thành hình ngôi sao, ở phần giữa các hạt quả hẹp lại, có lông cứng ở mép. Hạt gần như hình trái xoan, dài 2mm, rộng 1,5mm [7]. Mùa hoa quả: tháng 6-8 [7].

Phân bố, sinh thái Chi Mimosa có khoảng 400 loài trên thế giới, phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới châu Mỹ, châu Phi và châu Á. Ở Việt Nam có 4 loài gồm: Mimosa pudica L. Wright, Mimosa pigra L. có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ, sau đó du nhập sang các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như Ấn Độ, Nam Châu Phi, khu vực Đông Nam Á, Hàn Quốc, Nhật Bản,….

Ở Việt Nam, loài này phân bố rải rác khắp nơi, từ đồng bằng đến miền núi với độ cao dưới 1000 m [9]. Bản đồ phân bố toàn cầu của Mimosa pudica L. Bộ phận dùng, thu hái, chế biến Dùng toàn cây hoặc lá và rễ cây Xấu hổ, thu hái quanh năm, rửa sạch đất cát, thái mỏng, phơi hay sấy khô [7]. Thành phần hóa học của cây Xấu hổ Mimosa pudica L.

Các hợp chất vô cơ Theo một số nghiên cứu, cây Xấu hổ có hàm lượng selen rất cao, mỗi mùa và vùng thu hái khác nhau, dược liệu có hàm lượng selen ở mỗi bộ phận lại khác nhau. Trong lá, hàm lượng Selen là 3000 γ/g vào tháng 8 và đến tháng 12 còn 300 γ/g. Trong quả, tháng 8, hàm lượng Selen là 290 γ/g, tháng 12 tăng là 1560 γ/g. Xấu hổ thu hái ở Đà Nẵng có hàm lượng selen là lớn nhất, những mẫu thu hái ở Vĩnh Phúc, Hải Phòng có hàm lượng selen ít hơn những nơi khác.

Đặc biệt, kết quả nghiên cứu mẫu Xấu hổ được thu hái ở Đồng Nai không cho thấy sự có mặt của hợp chất selen. Như vậy lá cây Xấu hổ có hàm lượng selen rất cao vào mùa hè rồi giảm nhanh, trong khi hàm lượng selen ở quả lại tăng [2]. Cả lá, thân và rễ của Xấu hổ đều đã được xác định có chứa một số nguyên tố vô cơ khác: Al, Si, Mg, Ca, Fe, Mn, Ti, Cu, Pb, Na [3]. Các hợp chất hữu cơ Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của Xấu hổ cho thấy sự có mặt của một số nhóm chất hữu cơ như: flavonoid, alcaloid, saponin, tanin, sterol, các acid amin và acid hữu cơ [1] [3] [2].

Flavonoid Flavonoid được nhiều nghiên cứu cho thấy là thành phần chính trong Xấu hổ, nhiều hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc trong đó các hợp chất C-glycosid flavonoid chiếm số lượng lớn. Một số hợp chất flavonoid đã được phân lập từ loài M. STT Tên hợp chất Công thức cấu tạo TLTK [5] 1 Luteolin [23] 2 Apigenin [5] Aglycon 3 3-Methylquercetin [5] 2’-O- 4 Methylisoliquiriti [5] genin 4 5,7,3’,4’-tetra hydroxyl-6-C-[α- L-rhamno 5 [52] pyranosyl-(1→2) β-D-gluco pyranosyl flavon 7,8,3’,4’- tetra hydroxyl-6-C-[α- L-rhamno 6 pyranosyl- [52] (1→2)β-D- gluco pyranosyl flavon 5,7,3’,4’-tetra hydroxyl-6-C-[β- D-apiose-(1→4)]- 7 β-D- [53] glucopyranosyl C- flavon flavonoid glycosid 5,7,4’-trihydroxy- 8-C-β-D 8 [52] glucopyranosyl flavon Cassiaoccidentalin 9 [39] B 5 5,7,4’-trihydroxy- 8-C-[α-L- rhamnopyranosyl - 10 (1→ 2) β-D- [57] glucopy ranosyl flavon 6,7,3’,4’-tetra hydroxyl-8-C-[α- L-rhamno 11 [53] pyranosyl-(1→2)]- β-D-gluco pyranosyl flavon 5,7,3’,4’-tetra C- hydroxyl-8-C-[β- flavonoid D-apiose-(1→4)]- 12 [57] glycosid β-D- glycopyranosyl flavon 13 Orientin [39] 14 Isoorientin [39] 6 15 Vitexin [57] 16 Isovitexin [57] 17 Isoquercitrin [44] O- flavonoid 18 Avicularin [44] glycosid Apigenin - 7 - O - 19 β - D - glucosid [44] 7 b.Các hợp chất phenol khác Bảng 1. Công thức cấu tạo một số hợp chất phenol khác STT Tên hợp chất Công thức cấu tạo TLTK 1 Acid p-coumarin [40] [23] 2 Acid gallic [40] 3 Acid chlorogenic [40] 4 Ethyl gallate [40] 4-(24’-methoxy-2,4’- methyl-1’-oxo-5’-n- 5 [40] propyl-tetracosanyl)- phenol 6 Acid caffeic [40] 8 Bảng 1.

Công thức cấu tạo một số hợp chất sterol STT Tên hợp chất Công thức cấu tạo TLTK 1 Stigmastanol [8] 2 Stigmasterol [3] 3 α-spinasterol [41] 4 β-sitosterol [8] c. Các hợp chất hữu cơ khác - Alcaloid: Phần lớn các nghiên cứu từ loài Mimosa pudica L. đã phân lập được một alcaloid có tên là mimosin [9]. - Chất béo, chất nhầy: có mặt trong lá và hạt [9].

- Crocetin, crocetin dimethylester [9], α-tocoferol, lutein, betulaprenol-9 [3], 1- triacontanol, phytol, diisooctyl phtalat [8]. Tác dụng dược lý của loài Mimosa pudica L. Nhiều nghiên cứu về tác dụng sinh học đã được thử nghiệm trên Mimosa pudica L. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng M.

có một số tác dụng như: tác dụng bảo vệ gan [29], [43], chống viêm [25], [42], [51], kháng khuẩn [13], [15], [32], giảm đau [16], [24], trị đái tháo đường [38], [45], [56], giải lo âu, chống oxy hóa, hạ lipid, chống sốt rét và bảo vệ thần kinh….[11] 9 Ở Ấn Độ, nghiên cứu đánh giá tác dụng chống viêm trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan: dịch chiết nước và dịch chiết cồn cây Xấu hổ (với liều tương đương lần lượt là 50, 100, 200 mg/kg tính theo dược liệu khô) đều có tác dụng giảm phù chân do carrageenan. Tác dụng này tương đương indomethacin (liều 10 mg/kg) [21]. Trên mô hình gây viêm tại phổi bằng Sephacryl S-200, dịch chiết nước Xấu hổ (liều 2,8g/kg thể trọng chuột) có tác dụng chống viêm rõ rệt: làm giảm có ý nghĩa trọng lượng phổi, giảm số lượng bạch cầu ưa acid trong dịch rửa phế quản so với lô chứng bệnh. Tác dụng làm giảm trọng lượng phổi và làm giảm số lượng bạch cầu ưa acid trong dịch rửa phế quản của dịch chiết nước Xấu hổ tương đương tác dụng của dexamethason (0,5mg/kg) [1].

Luteolin, một hợp chất nhóm flavonoid được phân lập từ cây Xấu hổ có nhiều tác dụng dược lý đã được ghi nhận, trong đó tác dụng chống viêm là một tác dụng điển hình. Luteolin có thể ức chế sản xuất NO do LPS gây ra ở các dòng tế bào khác nhau. Trong các tế bào RAW 264,7 được kích hoạt bằng LPS, luteolin thể hiện hoạt động chống viêm mạnh bằng cách giảm sản xuất NO và prostaglandin E2 [46]. Ngoài ra, luteolin còn làm giảm nồng độ IL-1β, IL-6 và TNF-α trong huyết thanh và điều chỉnh tăng FOXP3, điều này có thể liên quan đến sự gia tăng tế bào T điều hòa trong phổi của mô hình chuột.

T điều hòa sản xuất IL-10, một cytokine chống viêm có khả năng ngăn chặn phản ứng viêm thông qua việc thúc đẩy sự phân cực của đại thực bào M2 [48], [50]. Trên hệ thân kinh, luteolin làm giảm tình trạng viêm vùng đồi thị bằng cách ức chế stress của lưới nội chất trong tế bào hình sao giúp bảo tồn chức năng của hệ thần kinh. Cơ chế này kích hoạt sự cải thiện khả năng học tập không gian và cải thiện tình trạng thiếu hụt trí nhớ ở chuột [28], [31]. Ngoài luteolin, một số flavonoid khác được tìm thấy ở Xấu hổ cũng thể hiện tác dụng chống viêm mạnh như agigenin, isoorientin, orientin, ….

Đánh giá tác dụng chống viêm của apigenin trên mô hình tổn thương cơ tim do LPS gây ra cho thấy apigenin làm giảm tổn thương bằng cách ức chế quá trình oxy hóa và các cytokine gây viêm như TNF-α, IL-1β, MIP-1α và MIP-2 thông qua điều hòa NF-κB [33]. Đối với hợp chất isoorientin, nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng isoorientin có thể làm giảm các phản ứng gây viêm do LPS gây ra bao gồm ức chế giải phóng NO, COX-2 và các cytokine gây viêm như TNF-α và IL-1β, thông qua việc điều chỉnh giảm đường truyền tín hiệu MAPK/NF-κB trong tế bào BV-2 [27]. Isoorientin ức chế con đường JAK2/STAT3, làm giảm tình trạng viêm trên mô hình tổn thương phổi cấp tính do nhiễm trùng huyết [22]. Tổng quan về loài Mimosa diplotricha C.

Wright ex Sa Bên cạnh loài Mimosa pudica L. (cây Xấu hổ, cây Trinh nữ) đã được biết đến với 10 các tác dụng như trên, ở nước ta hiện nay còn có một loài Mimosa khác là Mimosa diplotricha C. Wright ex Sa. (thường được gọi là Trinh nữ móc, Trinh nữ thân vuông) có đặc điểm thực vật, sinh thái gần giống loài Mimosa pudica L.

Đây là loài nằm trong danh mục các loài ngoại lai xâm hại, thường mọc gần loài Mimosa pudica L. và phát triển rất nhanh. Về thành phần hóa học, loài M.Wright cũng chứa các nhóm chất hữu cơ: flavonoid, alcaloid, sterol, đường khử, acid amin [4], saponin [26] như M. Các hợp chất flavonoid phân lập được ở loài M.Wright chủ yếu là methoxy flavonoid như: 2-hydroxy-3,7,4′,8,5′- pentamethoxyflavon, 7,3′,4′-trihydroxy-3,8-dimethoxyflavon, 2-hydroxy-3,7,8,4,5- pentamethoxyflavon [41], 2′,5′-dihydroxy-3,7,8,4′-tetramethoxyflavon, 3′-hydroxy- 3,7,8,4′- tetramethoxyflavon, 2′-hydroxy-3,7,8,4′-tetramethoxyflavon [36],….

2-hydroxy-3,7,4′,8,5′-pentamethoxyflavon 7,3′,4′-trihydroxy-3,8-dimethoxyflavone Quercetin-3-O-xylopyranoside 5,3′-di-O-methylluteolin Hình 1. Công thức cấu tạo một số hợp chất flavoid của M.Wright Và hiện nay, vẫn chưa có nhiều nghiên cứu chứng minh về tác dụng của loài này. Lựa chọn chất đánh dấu hóa học trong kiểm soát chất lượng dược liệu 1. Một số khái niệm Các khái niệm theo quan điểm của Tổ chức y tế thế giới WHO [49]: Thành phần có tác dụng điều trị đã biết (Constituents with known therapeutic activities): là chất hoặc nhóm chất được xác định về hóa học và đóng góp vào tác dụng của dược liệu/chế phẩm.

Thành phần có tác dụng dược lý (sinh học) được ghi nhận (Constituents with recognized pharmacological (biological) activities): là các chất hóa học đặc trưng (chất hoặc nhóm chất) được xác định về hóa học, sự liên quan giữa tác dụng dược lý của 11 chúng tới hiệu quả điều trị hoặc độc tính của dược liệu/chế phẩm chưa được thiết lập đầy đủ. Thành phần đặc trưng (Characteristic constituents): là các chất hoặc nhóm chất được xác định về hóa học và đặc trưng cho một dược liệu nào đó hoặc một loài/chi/họ thực vật. Thành phần có độc tính (Toxic constituents): là các chất hoặc nhóm chất được xác định về hóa học có độc tính, mặc dù chúng có thể góp phần vào tác dụng điều trị của dược liệu/chế phẩm.