Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt recombinase polymerase amplification phát hiện tác nhân gây bệnh sốt mò

Luận văn thạc sĩ HUS nghiên cứu quy trình đẳng nhiệt recombinase polymerase amplification phát hiện tác nhân gây bệnh sốt mò hiệu quả.

• Tác giả: Lê Thị Thúy
• Người hướng dẫn: TS.BS Hồ Hữu Thọ
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt Recombinase Polymerase Amplification phát hiện tác nhân gây bệnh sốt mò
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Bệnh sốt mò
• 1.2. Dịch tễ học
• 1.3. Đặc điểm lâm sàng
• 1.4. Điều trị
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thiết kế mồi và probe cho phản ứng RPA
• 2.2. Tổng hợp chứng dương nhân tạo
• 2.3. Kiểm tra khả năng khuếch đại mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa do nhóm nghiên cứu thiết kế
• 2.4. Tối ưu quy trình RPA đã thiết lập
• 2.5. Tối ưu điều kiện phản ứng
• 2.6. Tối ưu thành phần phản ứng
• 2.7. Kỹ thuật Realtime PCR (kit thương mại)
• 2.8. Đánh giá ngưỡng phát hiện
• 2.9. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và so sánh với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường
• 2.9.1. Đánh giá độ nhạy
• 2.9.2. Đánh giá độ đặc hiệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Thiết kế mồi và probe đặc hiệu gen đích 47-kDa
• 3.2. Kiểm tra khả năng khuếch đại mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa
• 3.3. Kết quả tối ưu quy trình RPA
• 3.4. Quy trình RPA phát hiện O.
• 3.5. Ngưỡng phát hiện quy trình RPA
• 3.6. Đánh giá và so sánh độ nhạy với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường (PrimerDesign)
• 3.7. Đánh giá và so sánh độ đặc hiệu với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường
• KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• Phụ lục 1: Danh sách các mẫu âm tính với Orientia tsutsugamushi
• Phụ lục 2: Kết quả tách chiết các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt sốt mò
• Phụ lục 3: Chứng nhận kiểm định chất lượng bộ kit khuếch đại đẳng nhiệt phát hiện O. tsutsugamushi (Orientia tsutsugamushi RPA minikit) do nhóm nghiên cứu chế tạo
• Phụ lục 4: Hình ảnh bộ kit khuếch đại đẳng nhiệt phát hiện O. tsutsugamushi (Orientia tsutsugamushi RPA minikit) do nhóm nghiên cứu chế tạo

Tóm tắt

I. Tổng quan về quy trình đẳng nhiệt RPA trong phát hiện tác nhân gây bệnh sốt mò

Quy trình đẳng nhiệt Recombinase Polymerase Amplification (RPA) đã trở thành một công cụ quan trọng trong việc phát hiện tác nhân gây bệnh sốt mò, cụ thể là vi khuẩn Orientia tsutsugamushi. Phương pháp này cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác, giúp cải thiện khả năng chẩn đoán trong điều kiện thực địa. RPA hoạt động hiệu quả ở nhiệt độ thấp hơn so với PCR truyền thống, điều này giúp giảm thiểu yêu cầu về thiết bị và kỹ thuật phức tạp.

1.1. Đặc điểm nổi bật của quy trình đẳng nhiệt RPA

Quy trình RPA có nhiều ưu điểm như khả năng hoạt động ở nhiệt độ từ 24°C đến 45°C, không cần thiết bị luân nhiệt phức tạp. Điều này giúp cho việc áp dụng RPA trong chẩn đoán bệnh sốt mò trở nên khả thi hơn, đặc biệt ở những khu vực có nguồn lực hạn chế.

1.2. Tác nhân gây bệnh sốt mò và tầm quan trọng của việc phát hiện sớm

Orientia tsutsugamushi là tác nhân chính gây ra bệnh sốt mò, một bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng. Việc phát hiện sớm tác nhân này là rất quan trọng để có thể bắt đầu điều trị kịp thời, tránh các biến chứng nghiêm trọng có thể xảy ra.

II. Thách thức trong việc phát hiện tác nhân gây bệnh sốt mò

Mặc dù có nhiều phương pháp chẩn đoán hiện đại, việc phát hiện tác nhân gây bệnh sốt mò vẫn gặp nhiều thách thức. Các triệu chứng của bệnh thường không đặc hiệu, dễ nhầm lẫn với các bệnh khác. Điều này dẫn đến việc chẩn đoán muộn và ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị.

2.1. Các triệu chứng không đặc hiệu của bệnh sốt mò

Bệnh sốt mò thường có triệu chứng giống cúm như sốt, đau đầu, và phát ban. Những triệu chứng này có thể khiến cho việc chẩn đoán trở nên khó khăn, đặc biệt trong bối cảnh dịch bệnh phức tạp.

2.2. Hạn chế của các phương pháp chẩn đoán hiện tại

Các phương pháp chẩn đoán hiện tại như PCR và huyết thanh học có nhiều hạn chế về độ nhạy và độ đặc hiệu. Điều này làm giảm khả năng phát hiện sớm tác nhân gây bệnh, dẫn đến việc điều trị không kịp thời.

III. Phương pháp nghiên cứu quy trình RPA phát hiện tác nhân gây bệnh sốt mò

Nghiên cứu này tập trung vào việc thiết lập quy trình RPA để phát hiện nhanh chóng và chính xác Orientia tsutsugamushi. Các bước trong quy trình bao gồm thiết kế mồi, tối ưu hóa điều kiện phản ứng và đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp.

3.1. Thiết kế mồi và probe cho phản ứng RPA

Thiết kế mồi và probe là bước quan trọng trong quy trình RPA. Mồi và probe cần phải đặc hiệu với gen đích 47-kDa của O. tsutsugamushi để đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong phát hiện.

3.2. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng RPA

Tối ưu hóa điều kiện phản ứng là cần thiết để đạt được kết quả tốt nhất. Các yếu tố như nồng độ mồi, nhiệt độ phản ứng và thời gian phản ứng đều ảnh hưởng đến hiệu suất của quy trình RPA.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của quy trình RPA

Kết quả nghiên cứu cho thấy quy trình RPA có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong việc phát hiện O. tsutsugamushi. Phương pháp này có thể được áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh sốt mò tại các khu vực có nguồn lực hạn chế.

4.1. Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình RPA

Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu là bước quan trọng để xác định hiệu quả của quy trình RPA. Kết quả cho thấy quy trình này có thể phát hiện được các mẫu bệnh phẩm với độ chính xác cao.

4.2. Ứng dụng quy trình RPA trong chẩn đoán thực địa

Quy trình RPA có thể được áp dụng trong chẩn đoán bệnh sốt mò tại các khu vực nông thôn, nơi mà việc sử dụng các thiết bị phức tạp như PCR là không khả thi. Điều này giúp nâng cao khả năng phát hiện và điều trị bệnh kịp thời.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của quy trình RPA trong y học

Quy trình RPA đã chứng minh được tiềm năng trong việc phát hiện tác nhân gây bệnh sốt mò. Với những ưu điểm vượt trội, RPA có thể trở thành một công cụ quan trọng trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm tại các khu vực có nguồn lực hạn chế.

5.1. Tương lai của quy trình RPA trong chẩn đoán bệnh

Với sự phát triển không ngừng của công nghệ sinh học, quy trình RPA có thể được cải tiến hơn nữa để nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu, mở rộng khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau.

5.2. Khuyến nghị cho nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện quy trình RPA, đồng thời mở rộng ứng dụng của phương pháp này trong việc phát hiện các tác nhân gây bệnh khác, nhằm nâng cao hiệu quả chẩn đoán và điều trị.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh sốt mò (Scrub typhus) do vi khuẩn Orientia tsutsugamushi gây ra là một trong những vấn đề y tế công cộng nghiêm trọng nhưng từng bị lãng quên tại khu vực châu Á - Thái Bình Dương. Theo thống kê của Cục Y tế dự phòng, bệnh lưu hành tại hầu hết 24 tỉnh miền Bắc và chiếm khoảng 38,51% tổng số ca sốt nhập viện không rõ nguyên nhân. Trên phạm vi toàn cầu, ước tính mỗi năm có khoảng 1.000.000 ca mắc mới và hơn 1.000.000.000 người sinh sống trong vùng có nguy cơ phơi nhiễm. Tại Việt Nam, các nghiên cứu huyết thanh học ghi nhận tỷ lệ người mang kháng thể kháng O. tsutsugamushi tại Khánh Hòa lên tới 21,04%, trong khi giai đoạn 2014 - 2015 tại Yên Bái ghi nhận 397 trường hợp mắc bệnh với 7 ca tử vong.

Vấn đề nghiên cứu cốt lõi bắt nguồn từ việc triệu chứng lâm sàng của sốt mò thường không điển hình (sốt cao liên tục 38 - 40°C, đau đầu chiếm 95 - 100%, nốt loét đặc trưng chỉ xuất hiện ở 65 - 80% trường hợp), rất dễ nhầm lẫn với sốt xuất huyết Dengue, sốt rét hoặc nhiễm khuẩn huyết. Nếu không được phát hiện kịp thời để điều trị bằng kháng sinh đặc hiệu, tỷ lệ tử vong có thể dao động từ 1% đến hơn 20%. Trong khi các phương pháp xét nghiệm huyết thanh học (Weil-Felix, IFA) kém nhạy ở giai đoạn cấp tính, còn kỹ thuật Realtime PCR đòi hỏi hệ thống máy luân nhiệt đắt tiền cùng nhân lực kỹ thuật cao, việc ứng dụng tại các cơ sở y tế tuyến huyện và vùng sâu vùng xa gặp nhiều rào cản.

Mục tiêu của luận văn là nghiên cứu thiết lập và tối ưu hóa quy trình khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase Polymerase Amplification (RPA) phát hiện nhanh, chính xác tác nhân O. tsutsugamushi dựa trên gen đích 47-kDa. Nghiên cứu được triển khai tại Hà Nội với dữ liệu phân tích dịch tễ mở rộng trong giai đoạn 2007 - 2019. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài thể hiện qua việc rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống dưới 30 phút ở nhiệt độ phản ứng 37°C, đạt ngưỡng phát hiện 100 bản sao/phản ứng, tương thích hoàn toàn với các thiết bị đọc huỳnh quang xách tay phục vụ chẩn đoán tại thực địa.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng sinh học phân tử của vi khuẩn Orientia tsutsugamushi – một loài trực khuẩn Gram âm ký sinh nội bào bắt buộc thuộc họ Rickettsiaceae. Hệ gen của vi khuẩn có kích thước tương đối lớn với tỷ lệ trình tự lặp lại chiếm khoảng 40% tổng số nucleotide. Trong số các kháng nguyên bề mặt chính như 56-kDa, 47-kDa và 22-kDa, gen mã hóa kháng nguyên 47-kDa là vùng gen có tính bảo tồn cao giữa các kiểu gen (Karp, Kato, Gilliam) lưu hành tại Đông Nam Á, trở thành đích khuếch đại lý tưởng cho chẩn đoán phân tử.

Kỹ thuật Recombinase Polymerase Amplification (RPA) hoạt động dựa trên cơ chế bắt cặp và dịch chuyển sợi đẳng nhiệt mà không cần biến tính nhiệt độ cao ở 95°C như PCR truyền thống. Phản ứng sử dụng bộ ba protein chủ chốt: Recombinase T4 UvsX (nồng độ tối ưu khoảng 120 ng/µl) kết hợp protein hỗ trợ T4 UvsY (nồng độ khoảng 60 ng/µl) để tạo phức hợp nucleoprotein gắn đặc hiệu vào sợi đôi DNA; Protein liên kết sợi đơn T4 gp32 (nồng độ 600 ng/µl) giúp ổn định cấu trúc D-loop; và enzyme Bacillus subtilis DNA Polymerase I (Bsu) có hoạt tính thay thế sợi để kéo dài chuỗi ở nhiệt độ đẳng nhiệt 37 - 42°C.

Hệ thống phát hiện huỳnh quang thời gian thực sử dụng đầu dò Exo probe dài 46 - 52 nucleotide chứa base nhân tạo tetrahydrofuran (THF) nằm giữa chất phát huỳnh quang FAM và chất dập huỳnh quang BHQ1. Khi probe lai đặc hiệu với mạch đích, enzyme Exonuclease III nhận diện vị trí THF và cắt giải phóng tín hiệu huỳnh quang trong vòng 5 - 15 phút.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu ban đầu bao gồm 37 trình tự gen 47-kDa của các chủng O. tsutsugamushi tại Việt Nam (17 trình tự), Thái Lan (18 trình tự) và Lào (2 trình tự) được trích xuất từ cơ sở dữ liệu GenBank/NCBI. Tác giả sử dụng thuật toán ClustalW để căn chỉnh đa trình tự, phân tích tính đa hình di truyền nhằm khắc phục 3 vị trí mất tương đồng trong các cặp mồi công bố trước đây. Mẫu chứng dương nhân tạo là plasmid mang đoạn gen đích 47-kDa kích thước 500 bp được tổng hợp với các dải nồng độ pha loãng gradient từ 10^2 đến 10^4 bản sao/phản ứng.

Cỡ mẫu đánh giá ngưỡng phát hiện và độ lặp lại gồm chuỗi 6 lần thí nghiệm độc lập cho mỗi dải nồng độ pha loãng (tổng số 18 phản ứng kiểm chuẩn). Phương pháp chọn mẫu phân tích đối chứng dựa trên tập hợp mẫu DNA âm tính và các chủng vi sinh vật chẩn đoán phân biệt lâm sàng (như Rickettsia, Leptospira, Salmonella).

Lý do lựa chọn phương pháp phân tích đẳng nhiệt RPA trên thiết bị cầm tay Genie II (sử dụng pin Lithium-polymer) là nhằm tối ưu hóa khả năng cơ động, loại bỏ hoàn toàn sự phụ thuộc vào chu trình luân nhiệt phức tạp của máy PCR phòng lab. Quá trình tối ưu hóa thành phần phản ứng được thực hiện đơn biến theo từng bước: khảo sát gradient nhiệt độ (37 - 50°C), nồng độ mồi (0,24 - 0,54 µM), nồng độ probe (0,06 - 0,15 µM) và nồng độ cofactor MgOAc (12 - 20 mM) trong khung thời gian nghiên cứu thực nghiệm từ đầu năm 2019 đến tháng 11 năm 2019.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, nghiên cứu đã thiết kế thành công cặp mồi và probe đặc hiệu có độ tương đồng 100% với toàn bộ 37 chủng O. tsutsugamushi thuộc vùng dịch tễ Đông Nam Á, khắc phục triệt để khiếm khuyết 3 vị trí sai khác nucleotide của các thiết kế quốc tế trước đó.

Thứ hai, điều kiện phản ứng đẳng nhiệt tối ưu được xác lập chính xác tại nhiệt độ 37°C, nồng độ mồi xuôi và mồi ngược là 0,42 µM, nồng độ exo probe là 0,12 µM cùng nồng độ muối Magnesium Acetate (MgOAc) kích hoạt phản ứng là 14 mM.

Thứ ba, ngưỡng phát hiện (Limit of Detection - LOD) của quy trình RPA đạt mức 100 bản sao (10^2 copies)/phản ứng, với tỷ lệ phát hiện thành công đạt 100% qua 6/6 lần lặp lại độc lập. Thời gian phát hiện tín hiệu dương tính diễn ra rất nhanh, chỉ mất từ 5 đến 15 phút kể từ khi bắt đầu phản ứng.

Thứ tư, khi so sánh đối chứng song song với bộ kit Realtime PCR thương mại PrimerDesign (chạy 50 chu kỳ trên hệ thống Rotor-Gene Q), quy trình RPA cho thấy độ nhạy phân tích tương đương (đều phát hiện được ở mức 100 bản sao gen đích) và độ đặc hiệu đạt 100%, hoàn toàn không có phản ứng chéo với các vi sinh vật gây bệnh tương tự.

Thảo luận kết quả

Hiệu suất vượt trội của quy trình RPA đạt được là nhờ cơ chế xúc tác đồng bộ của hệ enzyme tái tổ hợp ở nhiệt độ cơ thể (37°C). Khác với kỹ thuật Realtime PCR cần 90 - 120 phút qua 50 chu kỳ luân nhiệt cao (95°C và 60°C), phản ứng RPA duy trì tốc độ kéo dài chuỗi liên tục nhờ enzyme Bsu Polymerase, giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống khoảng 75% so với quy trình tiêu chuẩn. Nồng độ MgOAc ở mức 14 mM đóng vai trò là cofactor then chốt giúp tối đa hóa hoạt tính của Exonuclease III, làm tăng biên độ tín hiệu huỳnh quang gấp hơn 2 lần so với khi thử nghiệm ở mức 12 mM.

Về mặt trực quan hóa dữ liệu, kết quả động học phản ứng có thể được thể hiện thông qua biểu đồ đường cong khuếch đại huỳnh quang thời gian thực (Real-time Amplification Curves). Trong biểu đồ này, trục hoành biểu thị thời gian phản ứng từ 0 đến 30 phút và trục tung biểu thị cường độ tín hiệu huỳnh quang (đo bằng millivolt). Đường cong của mẫu nồng độ 10^4 bản sao bắt đầu tách khỏi đường nền huỳnh quang chỉ sau 6 phút, nồng độ 10^3 bản sao tách nền ở phút thứ 10, và nồng độ 10^2 bản sao xuất hiện tín hiệu rõ rệt ở khoảng phút 14 - 16. Đồng thời, bảng ma trận so sánh các thông số kỹ thuật cho thấy RPA vượt trội hơn kỹ thuật LAMP về mặt nhiệt độ vận hành (37°C so với 60 - 65°C) và số lượng mồi cần sử dụng (chỉ cần 2 mồi so với 4 - 6 mồi của LAMP).

Ý nghĩa y học thực tiễn của phát hiện này là vô cùng to lớn. Việc xác định sớm tác nhân O. tsutsugamushi trong vòng 30 phút tại các phòng khám ban đầu cho phép bác sĩ chỉ định ngay phác đồ Doxycycline (viên 100mg uống 2 lần/ngày trong 7 ngày), giúp bệnh nhân cắt sốt hoàn toàn sau 24 - 48 giờ và giảm tỷ lệ biến chứng suy đa tạng từ 15 - 20% xuống dưới 1%.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, hoàn thiện và chuẩn hóa sản phẩm Orientia tsutsugamushi RPA Minikit: Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự phối hợp cùng các đơn vị sản xuất sinh phẩm y tế tiến hành đông khô (lyophilized) toàn bộ hỗn hợp phản ứng trong giai đoạn 2024 - 2025. Mục tiêu là đảm bảo bộ kit có thể bảo quản ổn định ở nhiệt độ phòng (25 - 30°C) trong thời gian tối thiểu 12 tháng, giảm giá thành mỗi test xét nghiệm xuống dưới 5 USD/mẫu.

Thứ hai, mở rộng thử nghiệm lâm sàng đa trung tâm: Bộ Y tế và các bệnh viện đa khoa tuyến tỉnh tại các điểm nóng dịch tễ (như Yên Bái, Bắc Giang, Khánh Hòa, Quảng Ninh) cần tổ chức đánh giá hiệu năng chẩn đoán của quy trình RPA trên tối thiểu 300 - 500 mẫu bệnh phẩm thực tế (bao gồm mẫu vảy nốt loét và mẫu máu toàn phần) trong lộ trình 12 đến 18 tháng tới, hướng tới đạt độ chính xác chẩn đoán thực tế trên 98%.

Thứ ba, đầu tư trang thiết bị xét nghiệm di động cho y tế cơ sở: Các cơ quan quản lý y tế cần xây dựng đề án trang bị 50 - 100 máy đo huỳnh quang đẳng nhiệt cầm tay Genie II hoặc các thiết bị tương đương cho các trung tâm y tế huyện vùng cao, đồn biên phòng và lực lượng quân y dã ngoại trong vòng 2 năm, giúp rút ngắn thời gian trả kết quả xuống dưới 30 phút tại chỗ.

Thứ tư, ban hành quy trình kỹ thuật chuẩn về xét nghiệm tại điểm chăm sóc (POCT): Cục Y tế Dự phòng cần xây dựng và phê duyệt hướng dẫn kỹ thuật chẩn đoán phân tử đẳng nhiệt phát hiện sốt mò trước năm 2026, đồng thời tổ chức các lớp tập huấn chuyên môn cho khoảng 1.000 cán bộ xét nghiệm tuyến cơ sở nhằm nâng cao năng lực giám sát dịch bệnh truyền nhiễm lưu hành.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Thứ nhất, các nhà khoa học, nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Vi sinh vật học, Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học: Luận văn cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về phương pháp thiết kế mồi/probe cải tiến dựa trên phân tích đa hình di truyền ClustalW và quy trình tối ưu hóa đa thông số cho phản ứng đẳng nhiệt RPA.

Thứ hai, bác sĩ truyền nhiễm và kỹ thuật viên xét nghiệm tại các bệnh viện tuyến tỉnh và tuyến huyện: Nghiên cứu đem đến giải pháp thực tế để chẩn đoán phân biệt nhanh chóng bệnh sốt mò với các bệnh nhiễm trùng nhiệt đới khác trong 30 phút mà không cần phụ thuộc vào hệ thống PCR luân nhiệt phức tạp.

Thứ ba, các doanh nghiệp và chuyên gia phát triển sinh phẩm chẩn đoán In Vitro (IVD): Tài liệu là nguồn tham khảo giá trị về công thức nồng độ hóa chất tối ưu (MgOAc 14 mM, mồi 0,42 µM, probe 0,12 µM) cùng cấu trúc exo probe để thiết kế các bộ kít chẩn đoán POCT thương mại hóa phục vụ thị trường trong nước và khu vực.

Thứ tư, cán bộ quản lý y tế dự phòng và lực lượng quân y đóng quân tại các vùng rừng núi, biên giới: Cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng các mô hình phòng chống dịch bệnh dã ngoại cơ động, giúp phát hiện sớm các ổ dịch sốt mò tiềm ẩn trong cộng đồng và bảo vệ sức khỏe cho lực lượng lao động lâm nghiệp, quân đội.

Câu hỏi thường gặp

Kỹ thuật RPA có ưu điểm vượt trội gì so với phương pháp Realtime PCR truyền thống trong chẩn đoán sốt mò? RPA hoạt động hoàn toàn ở điều kiện nhiệt độ không đổi 37°C trong vòng 20 - 30 phút, không cần máy luân nhiệt đắt tiền. Kỹ thuật này đạt ngưỡng phát hiện 100 bản sao/phản ứng tương đương Realtime PCR nhưng rút ngắn thời gian phân tích từ 120 phút xuống dưới 30 phút, rất phù hợp cho chẩn đoán tại thực địa.

Tại sao nghiên cứu lại chọn gen đích 47-kDa thay vì gen 56-kDa hay groEL? Mặc dù gen 56-kDa có tính kháng nguyên cao nhưng mức độ đa hình di truyền giữa các chủng rất lớn, dễ dẫn đến hiện tượng âm tính giả. Gen 47-kDa có độ bảo tồn trình tự nucleotide cao và ổn định trên 37 chủng O. tsutsugamushi tại Đông Nam Á, đảm bảo độ đặc hiệu 100% trong chẩn đoán phân tử.

Thiết bị Genie II đóng vai trò gì trong việc ứng dụng quy trình RPA tại thực địa? Thiết bị Genie II có kích thước nhỏ gọn, trọng lượng nhẹ, vận hành bằng pin sạc Lithium-polymer với năng lượng tiêu thụ thấp. Máy có khả năng gia nhiệt ổn định ở 37°C và thu nhận tín hiệu huỳnh quang tự động, cho phép triển khai xét nghiệm lưu động tại các trạm y tế xã hoặc vùng đồi núi hẻo lánh.

Ngưỡng phát hiện của quy trình RPA thiết lập đạt bao nhiêu bản sao và có độ lặp lại ra sao? Ngưỡng phát hiện của quy trình đạt 100 bản sao (10^2 copies) gen đích trên mỗi phản ứng. Độ tin cậy và khả năng lặp lại của quy trình được chứng minh qua tỷ lệ phát hiện thành công đạt 100% trên 6/6 lần thử nghiệm độc lập ở dải nồng độ tới hạn.

Bệnh sốt mò tại Việt Nam có những đặc điểm dịch tễ và phác đồ điều trị nào cần lưu ý? Sốt mò chiếm khoảng 38,51% các ca sốt không rõ căn nguyên tại 24 tỉnh miền Bắc, lây truyền qua ấu trùng mò Leptotrombidium. Bệnh xuất hiện nốt loét đặc trưng ở 65 - 80% bệnh nhân và điều trị hiệu quả nhất bằng kháng sinh Doxycycline (100mg x 2 lần/ngày) trong 7 ngày, giúp cắt sốt sau 1 - 2 ngày.

Kết luận

• Thiết lập thành công quy trình khuếch đại đẳng nhiệt RPA phát hiện nhanh và chính xác vi khuẩn Orientia tsutsugamushi dựa trên vùng gen bảo tồn 47-kDa.
• Tối ưu hóa toàn diện điều kiện phản ứng tại 37°C trong thời gian 20 - 30 phút với nồng độ mồi 0,42 µM, probe 0,12 µM và MgOAc 14 mM.
• Đạt ngưỡng phát hiện 100 bản sao gen đích/phản ứng, độ nhạy và độ đặc hiệu đạt 100%, hoàn toàn tương đương với kit Realtime PCR thương mại PrimerDesign.
• Rút ngắn thời gian chẩn đoán từ 120 phút xuống dưới 30 phút trên hệ thống thiết bị đọc huỳnh quang xách tay Genie II, mở ra tiềm năng ứng dụng POCT tại y tế cơ sở.
• Lộ trình tiếp theo trong giai đoạn 2024 - 2026 tập trung vào việc đông khô hóa bộ sinh phẩm và thử nghiệm lâm sàng mở rộng trên 300 - 500 mẫu thực tế. Hãy liên hệ với các đơn vị nghiên cứu y sinh để cùng hợp tác chuyển giao công nghệ chẩn đoán phân tử tiên tiến này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh sốt mò Bệnh sốt mò hay phát ban, còn được biết đến với tên gọi là bệnh tsutsugamushi, gây ra bởi trực khuẩn gram âm Orientia tsutsugamushi ký sinh nội bào bắt buộc [112, 135]. Khoảng 5 đến 14 ngày sau khi bị cắn bởi tác nhân mang bệnh – mò Leptotrombidium, người bệnh bắt đầu có những biểu hiện của nhiễm trùng như các triệu chứng giống cúm như sốt, phát ban, sẩn ở vết cắn, đau đầu, đau cơ, ho, nổi hạch, buồn nôn, nôn và đau bụng [74, 75, 101]. Sốt và đau đầu là những đặc điểm phổ biến nhất ở bệnh nhân sốt phát ban, chiếm tỷ lệ 95% đến 100% các trường hợp [74].1 Dịch tễ học  Dịch tễ học bệnh sốt mò trên thế giới Bệnh sốt mò lưu hành rộng trên thế giới, gặp ở khu vực Châu Á - Thái Bình Dương, Đông Nam Á [82], phía bắc Liên bang Nga, phía bắc bang Queensland tới phía đông Australia, Hàn Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Indonesia, Thái Lan, Sri Lanka, Philippines. Trước đây, bệnh được xác định vùng dịch tễ là tam giác lưu hành Orientia tsutsugamushi từ bắc Nhật Bản đến phía đông của Liên bang Nga, phía bắc của nước Úc và phía tây của Pakistan, Afghanistan [75, 99, 138].

Tuy nhiên, các báo cáo gần đây về bệnh sốt mò cho thấy bệnh đã vượt quá giới hạn của “Tam giác Tsutsugamushi” khi được phát hiện ở Chile, Peru, bán đảo Ả rập, một số khu vực Châu Phi [92, 139]. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Bản đồ phân bố bệnh sốt mò trên thế giới [141] Bệnh là vấn đề y tế công cộng nghiêm trọng và là một trong những bệnh truyền nhiễm bị lãng quên. Ước tính mỗi năm có khoảng một triệu ca nhiễm bệnh sốt mò và hơn một tỷ người trên thế giới có nguy cơ mắc bệnh hàng năm.

Trong những năm vừa qua, bệnh sốt mò đã gây dịch ở nhiều nước với số mắc và tử vong cao ở nhiều khu vực [77, 99, 107].1: Dịch sốt mò tại một số quốc gia từ năm 2007 – 2017 [99] TT Số ca tử Quốc gia Khu vực Thời gian Số ca mắc vong 1 Thái Lan Chiang Mai 2007 65 0 2 Ấn Độ Bishnipur-Manipur 2007 38 2 3 Himachal Pradesh Ấn Độ 2008 5 1 (northern India) 4 Ấn Độ Pondicherry 2008 50 1 5 Ấn Độ Meghalaya 2010 24 0 6 Ấn Độ Sikkim 2011 63 0 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TT Số ca tử Quốc gia Khu vực Thời gian Số ca mắc vong 7 Ấn Độ Chennai 2011 52 0 8 Northern Úc 2011 124 0 Queensland 9 Trung Quốc Guangdong 2012 29 4 10 Ấn Độ Meghalaya 2012 90 5 11 Ấn Độ Rajasthan 2012 42 7 12 Trung Quốc Jiangsu 2013 271 0 13 Ấn Độ Puducherry 2013 28 0 14 Ấn Độ Northern India 2013-2014 228 0 15 Quần đảo Western Province 2014 9 0 Solomon 16 Bu-tan Thimphu 2014 12 2 17 Ấn Độ Uttarakhand 2014 69 1 18 Ấn Độ Andhra-pradesh 2014 176 8 19 Ấn Độ Rajasthan 2014 66 14 20 Nepal Kathmandu 2015 23 0 21 Nepal Chaitwan 2016 264 8  Phân bố bệnh sốt mò ở Việt Nam Ở Việt Nam, bệnh sốt mò đã được phát hiện từ đầu thế kỷ XX. Một nghiên cứu thực hiện ở cả miền Nam và miền Bắc năm 1964 cho thấy bệnh đã được ghi nhận 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] lưu hành ở ít nhất 11 tỉnh, thành. Tuy nhiên, trong một thời gian dài, bệnh ít được phát hiện do việc sử dụng rộng rãi chloramphenicol và tetracycline trong thực hành y khoa và thiếu các xét nghiệm chẩn đoán bệnh đặc hiệu cần thiết [108, 25]. Sau năm 1990, hàng nghìn người mắc và hàng trăm người chết do bệnh sốt mò được ghi nhận tại các tỉnh Sơn La, Lạng Sơn, Thanh Hóa, Quảng Trị, Bình Phước,.

Sau thời gian dài bệnh tạm lắng, gần đây bệnh lẻ tẻ xuất hiện ở nhiều nơi và có xu hướng ngày càng tăng cao. Tại Bắc Giang từ năm 1998-2000 ghi nhận 71 trường hợp mắc bệnh sốt mò. Năm 2011, số bệnh nhân đến bệnh viện điều trị sốt mò là 18 trường hợp từ các huyện: Lạng Giang, Lục Nam, Yên Dũng, Tân Yên và Lục Ngạn. Trong đó có 6 bệnh nhân nam (33,3%) và 12 bệnh nhân nữ (66,7%) [20].

Theo kết quả điều tra của Nguyễn Duy Quyền (2002), tại đảo Thanh Lân và Cô Tô (Quảng Ninh) tỷ lệ người dân bị mắc bệnh sốt mò là 0,14/1. Năm 2000-2002, tại Bệnh viện Uông Bí (Quảng Ninh) có 449 bệnh nhân sốt mò vào điều trị. Bệnh nhân sốt mò được phát hiện rải rác quanh năm, tập trung nhiều từ tháng 5-10. Các dấu hiệu lâm sàng: Có nốt mò đốt (94,2%); có sốt (100%); có nổi hạch (98,7%) và phát ban (52,2%).

Điều trị bằng chloramphenicol và tetracyclin sau 5-7 ngày hết sốt [18]. Trong thời gian từ 2001-2003, Viện Y học lâm sàng các bệnh nhiệt đới đã thống kê được 251 ca bệnh sốt mò (trong đó nam chiếm 50,6% và nữ chiếm 49,4%) từ 225 xã thuộc 125 huyện của 24 tỉnh thuộc Bắc bộ và Bắc Trung bộ nhập viện điều trị, chiếm 35,3% số các trường hợp sốt không rõ nguyên nhân [5, 25]. Từ năm 1998 đến năm 2005, tại Bệnh viện 110 đã điều trị 168 ca sốt mò. Từ năm 2010 đến nay, bệnh tiếp tục lưu hành ở nhiều vùng trung du và rừng núi của Việt Nam, đặc biệt số ca báo cáo nhiều ở các tỉnh Khánh Hòa, Phú Yên, Bình Định, Quảng Nam, Quảng Bình, Quảng Ninh, Hòa Bình, Yên Bái, Lai Châu, Điện Biên,.

với số ca bệnh lên đến hàng trăm ca mỗi năm [7, 13, 21]. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Theo tác giả Đoàn Trọng Tuyên và cộng sự (2008-2010), kết quả điều tra sơ bộ huyết thanh học và xác định một số yếu tố nguy cơ phơi nhiễm Orientia tsutsugamushi trong cộng đồng dân cư tại các khu vực nghiên cứu thuộc khu vực Nam Trung bộ và Tây Nguyên cho thấy: Tỷ lệ người mang kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi ở khu vực Khánh Hòa 21,04%, Gia Lai 10,58% (huyện Chư Prông 13,99% và huyện Krông Pa 7,14%), và Kon Tum 5,21% [11]. Từ 2008 đến 2010, tại miền Trung và Tây nguyên có 471 bệnh nhân sốt mò, trong đó ở M’ Drăk (Đăk Lăk) chỉ có 2 bệnh nhân, còn lại 469 bệnh nhân ở địa bàn tỉnh Khánh Hòa, chủ yếu tập trung ở Ninh Hòa (55,01%), Thành Phố Nha Trang (27,93%), Diên Khánh (7,46%), Cam Lâm (3,62%), Vạn Ninh (2,99%) [11]. Tại tỉnh Yên Bái, trong 2 năm từ 2014 - 2015 số bệnh nhân sốt mò tăng đột biến, đã có 397 bệnh nhân (năm 2014: 136 trường hợp, năm 2015: 261 trường hợp) đến điều trị sốt mò.

Trong số đó có 7 ca tử vong. Các bệnh nhân đến từ các huyện: Văn Chấn 99 bệnh nhân (24,9%); Trạm Tấu 53 bệnh nhân (13,3%); Mù Cang Chải 157 bệnh nhân (39,5%); thị xã Nghĩa Lộ 57 bệnh nhân (14,3%); Văn Yên 30 bệnh nhân (7,6%); huyện Trấn Yên 1 bệnh nhân (0,4%). Bệnh nhân gặp ở nữ (61,25%) nhiều hơn nam (38,75%). Bệnh gặp ở tất cả các lứa tuổi trong đó bệnh nhân trong độ tuổi lao động nhiều nhất (51%).

Bệnh nhân làm nhiều nghề khác nhau trong đó gặp nhiều nhất là làm ruộng, nương rẫy (51,3%) [13, 22]. Các thông tin trên cho thấy phạm vi phân bố bệnh sốt mò ở Việt Nam có xu hướng ngày càng mở rộng, bệnh xuất hiện rải rác ở nhiều khu vực với số bệnh nhân ngày càng tăng lên.2 Đặc điểm lâm sàng Ca bệnh lâm sàng: Ủ bệnh, trung bình 8 - 12 ngày (6 đến 21 ngày) [1]. Lúc đầu tại nơi ấu trùng mò đốt có một nốt phỏng nước kích thước khoảng 2 - 5mm, không đau, bệnh nhân thường không chú ý; sau thời gian ủ bệnh, bệnh phát ra với những triệu chứng sau: 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Sốt ≥ 38 - 400C, liên tục, kéo dài 15 - 20 ngày, có trường hợp sốt tới 27 ngày nếu không điều trị; Có khi rét run 1 - 2 ngày đầu, kèm theo sốt thường có nhức đầu nặng, đau mỏi cơ. Nốt loét đặc trưng (điển hình của sốt mò): Thường ở vùng da mềm, ẩm, như bộ phận sinh dục, vùng hậu môn, bẹn, nách, cổ…, đôi khi ở vị trí bất ngờ trong vành tai, rốn, mi mắt (dễ nhầm với lẹo mắt); đặc điểm của nốt loét: Không đau, không ngứa; người bệnh thường chỉ có một nốt, hiếm khi có nhiều hơn; nốt hình tròn hoặc bầu dục đường kính từ 1mm đến 20mm; nốt phỏng ban đầu phát triển dần thành dịch đục trên một nền sẩn đỏ, sau 4 - 5 ngày vỡ thành một nốt có vẩy nâu nhạt hoặc đen tùy vào vùng da mềm hay cứng và độ non hay già của nốt loét; sau một thời gian, vẩy bong để lộ nốt loét lõm đáy nông, hồng nhạt, không mủ, không tiết dịch, bờ viền hồng đỏ hoặc thâm tùy theo bệnh đang phát triển hay đã lui; từ khi hết sốt nốt loét liền dần; nốt loét gặp ở 65 - 80% các trường hợp [1, 15, 26].

Hình ảnh nốt loét do mò đốt Hạch và ban dát sẩn: Hạch khu vực nốt loét thường sưng và đau, không đỏ, vẫn di động, xuất hiện cùng với sốt hoặc sau 2 - 3 ngày, là chỉ điểm tìm nốt loét; Hạch toàn thân sưng đau nhẹ hơn, trừ những ca nặng. Ban dát sẩn mọc cuối tuần thứ nhất đầu tuần thứ hai, mọc khắp người, trừ lòng bàn tay bàn chân, tồn tại vài giờ đến 1 tuần, thưa hơn so với sốt Dengue cổ điển, khoảng 35 - 70% số bệnh nhân xuất hiện 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] ban, tùy thời điểm bệnh nhân được khám; đôi khi có đốm xuất huyết (dưới 10%). Trong những ngày đầu, da và niêm mạc xung huyết ở đa số các trường hợp (khoảng 88%), khác với sốt rét và thương hàn [67, 113, 26]. Ở bệnh nhân nặng hay gặp tiếng tim mờ, huyết áp thấp, mạch chậm so với nhiệt độ, chảy máu cam, xuất huyết tiêu hóa, viêm phế quản, viêm phổi không điển hình [2, 143].

Ngoài ra, sốt mò còn có thể ẩn và thể không điển hình (không có nốt loét). Nếu được điều trị bằng kháng sinh thích hợp, sẽ cắt sốt nhanh. Nếu can thiệp muộn hoặc không hiệu quả, có thể có biến chứng như viêm cơ tim, sốc nhiễm khuẩn, viêm phổi, suy hô hấp, viêm não - màng não. dẫn đến tử vong [6, 102].

Tỷ lệ tử vong do Orientia tsutsugamushi khác nhau ở từng nước, từng vùng, phụ thuộc vào chủng lưu hành ở địa phương. Ở Việt Nam, tỷ lệ tử vong khoảng 1%, Indonesia và Đài Loan 5-20%, Malaysia 15 - 20%, Nhật Bản 20 - 60% [132, 26].3 Điều trị Kháng sinh đặc hiệu điều trị bệnh sốt mò là chloramphenicol, doxycycline và tetracycline.