Xác định mức độ thuần chủng của cá sấu xiêm (Crocodylus siamensis) bằng sinh học phân tử

Luận văn thạc sĩ phân tích hus xác định mức độ thuần chủng của cá thể loài cá sấu xiêm crocodylus siamensis bằng sinh học phân, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải

• Tác giả: Nguyễn Thị Thắm
• Người hướng dẫn: PGS. Lê Đức Minh
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Sinh Thái Môi Trường
• Đề tài: Xác Định Mức Độ Thuần Chủng Của Cá Thể Loài Cá Sấu Xiêm (Crocodylus Siamensis) Bằng Sinh Học Phân Tử Nhằm Hỗ Trợ Công Tác Bảo Tồn
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
• 1.1. Cá sấu Xiêm và hiện trạng loài
• 1.2. Các mối đe doạ và vấn đề lai tạo cá sấu trong các cơ sở nuôi nhốt
• 2. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, địa điểm và vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Thu mẫu, khảo sát ngoài thực địa
• 2.2.2. Tách chiết ADN tổng số, PCR, tinh sạch, giải trình tự và xác định kiểu gen
• 2.2.3. Xây dựng cây quan hệ di truyền
• 2.2.4. Xác định mức độ thuần chủng
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tạo dữ liệu di truyền cho quần thể mới tại Lào
• 3.2. Sự khác biệt về mặt di truyền
• 3.3. Mối quan hệ di truyền
• 3.4. Xác định mức độ thuần chủng
• 3.5. Xác định dòng mẹ
• 3.6. Khuếch đại các locus microsatellite
• 3.7. Phân tích xác suất thuộc về nhóm thuần chủng
• 3.8. Phân tích tỷ lệ loài trong từng cá thể
• 3.9. Đánh giá hiện trạng bảo tồn tại VQG Cát Tiên
• 3.10. Khảo sát hiện trạng bảo tồn tại Bàu Sấu
• 3.11. Kết quả phỏng vấn người dân
• 3.12. Kết quả phỏng vấn cán bộ VQG Cát Tiên
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu mức độ thuần chủng cá sấu xiêm

Nghiên cứu mức độ thuần chủng của cá sấu xiêm (Crocodylus siamensis) bằng sinh học phân tử là một chủ đề quan trọng trong công tác bảo tồn loài này. Cá sấu xiêm là một trong những loài cá sấu nước ngọt có nguy cơ tuyệt chủng cao, đặc biệt tại Việt Nam. Việc xác định mức độ thuần chủng không chỉ giúp bảo tồn loài mà còn hỗ trợ trong việc tái thả cá sấu vào môi trường tự nhiên. Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để phân tích di truyền, từ đó đưa ra những kết luận về tình trạng hiện tại của quần thể cá sấu xiêm.

1.1. Cá sấu xiêm và hiện trạng loài tại Việt Nam

Cá sấu xiêm đã từng được coi là tuyệt chủng ngoài tự nhiên tại Việt Nam. Tuy nhiên, nhờ vào các chương trình bảo tồn và tái thả, số lượng cá thể đã tăng lên. Các nghiên cứu gần đây cho thấy cá sấu xiêm vẫn tồn tại tại Vườn Quốc gia Cát Tiên, nơi có môi trường sống phù hợp cho loài này. Việc bảo tồn cá sấu xiêm không chỉ là trách nhiệm của các nhà khoa học mà còn là của toàn xã hội.

1.2. Các mối đe dọa đến loài cá sấu xiêm

Cá sấu xiêm đang phải đối mặt với nhiều mối đe dọa, bao gồm sự mất môi trường sống, săn bắt trái phép và tình trạng lai tạo không kiểm soát giữa các loài cá sấu khác. Những yếu tố này không chỉ làm giảm số lượng cá thể mà còn ảnh hưởng đến tính thuần chủng của loài. Việc hiểu rõ các mối đe dọa này là cần thiết để có những biện pháp bảo tồn hiệu quả.

II. Phương pháp nghiên cứu mức độ thuần chủng cá sấu xiêm

Nghiên cứu mức độ thuần chủng của cá sấu xiêm được thực hiện thông qua các phương pháp sinh học phân tử hiện đại. Các chỉ thị di truyền như microsatellite và ADN ty thể được sử dụng để phân tích và xác định mức độ thuần chủng của các cá thể. Phương pháp này cho phép xác định mối quan hệ di truyền giữa các cá thể và đánh giá tình trạng bảo tồn của quần thể.

2.1. Tách chiết ADN và phân tích di truyền

Quá trình tách chiết ADN từ mẫu cá sấu xiêm được thực hiện bằng các phương pháp chuẩn hóa. Sau đó, ADN được phân tích bằng kỹ thuật PCR để khuếch đại các đoạn gen cần thiết. Kết quả thu được sẽ được sử dụng để xác định kiểu gen và mức độ thuần chủng của các cá thể.

2.2. Xây dựng cây quan hệ di truyền

Dữ liệu di truyền thu được sẽ được sử dụng để xây dựng cây quan hệ di truyền. Cây quan hệ này giúp xác định mối quan hệ giữa các cá thể cá sấu xiêm và các loài cá sấu khác. Phân tích này không chỉ cung cấp thông tin về mức độ thuần chủng mà còn giúp hiểu rõ hơn về sự phát triển và tiến hóa của loài.

III. Kết quả nghiên cứu mức độ thuần chủng cá sấu xiêm

Kết quả nghiên cứu cho thấy mức độ thuần chủng của cá sấu xiêm tại các khu vực nuôi nhốt và tự nhiên có sự khác biệt rõ rệt. Các cá thể thuần chủng được xác định có tỷ lệ cao hơn tại Vườn Quốc gia Cát Tiên so với các cơ sở nuôi nhốt khác. Điều này cho thấy sự cần thiết phải bảo tồn và phát triển quần thể cá sấu xiêm tại môi trường tự nhiên.

3.1. Phân tích di truyền và xác định dòng mẹ

Phân tích di truyền cho thấy các cá thể cá sấu xiêm tại Vườn Quốc gia Cát Tiên có sự đồng nhất cao về mặt di truyền. Việc xác định dòng mẹ thông qua phân tích ADN giúp hiểu rõ hơn về nguồn gốc và sự phát triển của quần thể cá sấu xiêm tại đây.

3.2. Đánh giá hiện trạng bảo tồn tại VQG Cát Tiên

Kết quả khảo sát cho thấy quần thể cá sấu xiêm tại VQG Cát Tiên đang trong tình trạng ổn định. Số lượng cá thể đã tăng lên đáng kể nhờ vào các chương trình bảo tồn và tái thả. Tuy nhiên, vẫn cần có các biện pháp bảo vệ nghiêm ngặt để đảm bảo sự phát triển bền vững của loài này.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu mức độ thuần chủng cá sấu xiêm

Nghiên cứu mức độ thuần chủng cá sấu xiêm không chỉ có giá trị trong việc bảo tồn loài mà còn có thể áp dụng trong các chương trình tái thả và quản lý quần thể. Các kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho các chính sách bảo tồn và phát triển bền vững loài cá sấu xiêm tại Việt Nam.

4.1. Chính sách bảo tồn cá sấu xiêm

Các kết quả nghiên cứu sẽ được sử dụng để xây dựng các chính sách bảo tồn cá sấu xiêm hiệu quả hơn. Việc xác định mức độ thuần chủng sẽ giúp các nhà quản lý đưa ra các quyết định đúng đắn trong việc bảo vệ loài này.

4.2. Tái thả cá sấu xiêm vào môi trường tự nhiên

Nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng cho các chương trình tái thả cá sấu xiêm. Việc xác định các cá thể thuần chủng sẽ giúp tăng khả năng sống sót của chúng khi được thả vào môi trường tự nhiên.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu cá sấu xiêm

Nghiên cứu mức độ thuần chủng cá sấu xiêm bằng sinh học phân tử đã cung cấp những thông tin quý giá về tình trạng hiện tại của loài. Tuy nhiên, vẫn cần tiếp tục nghiên cứu và theo dõi để đảm bảo sự phát triển bền vững của quần thể cá sấu xiêm tại Việt Nam. Tương lai của loài này phụ thuộc vào các nỗ lực bảo tồn và quản lý hiệu quả.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc theo dõi sự phát triển của quần thể cá sấu xiêm và đánh giá hiệu quả của các chương trình bảo tồn. Việc áp dụng các công nghệ sinh học mới sẽ giúp nâng cao hiệu quả nghiên cứu.

5.2. Tầm quan trọng của bảo tồn cá sấu xiêm

Bảo tồn cá sấu xiêm không chỉ là trách nhiệm của các nhà khoa học mà còn là của toàn xã hội. Việc nâng cao nhận thức về tầm quan trọng của loài này sẽ góp phần vào các nỗ lực bảo tồn và phát triển bền vững.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Cá sấu Xiêm (Crocodylus siamensis) là loài bò sát nước ngọt đặc hữu của khu vực Đông Nam Á, hiện được Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) xếp ở bậc Cực kỳ nguy cấp (CR A2cd v3.1) và nằm trong Phụ lục I của Công ước CITES. Các dự báo sinh thái cảnh báo quần thể loài có nguy cơ suy giảm tới 80% trong vòng 3 thế hệ do mất sinh cảnh và nạn săn bắt trái phép. Tại Việt Nam, loài này từng bị tuyên bố tuyệt chủng ngoài tự nhiên vào năm 2000. Dù chương trình tái thả từ năm 2001 đã giúp khôi phục quần thể tại khu vực Bàu Sấu thuộc Vườn quốc gia Cát Tiên, nguy cơ ô nhiễm di truyền đang đe dọa trực tiếp sự tồn vong của loài.

Tình trạng lai tạp không kiểm soát giữa cá sấu Xiêm với cá sấu nước mặn (Crocodylus porosus) và cá sấu Cuba (Crocodylus rhombifer) tại các cơ sở nuôi nhốt thương mại diễn ra phổ biến nhằm tạo con lai tăng trưởng nhanh và lấy da. Con lai mang hình thái tương tự cá sấu Xiêm nhưng mang nguồn gen xáo trộn, gây hiểm họa khôn lường nếu tái thả vào tự nhiên. Luận văn thạc sĩ khoa học chuyên ngành Sinh thái môi trường của tác giả Nguyễn Thị Thắm (2018) được thực hiện nhằm giải quyết nút thắt then chốt: ứng dụng sinh học phân tử để xác định mức độ thuần chủng của 85 mẫu cá thể thu thập tại Việt Nam, Lào và các vườn thú châu Âu trong giai đoạn 2016 - 2018. Nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu di truyền chuẩn xác, tạo tiền đề khoa học vững chắc phục vụ chương trình nhân giống bảo tồn và quản lý bền vững hơn 150 ha sinh cảnh đất ngập nước Bàu Sấu.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng di truyền học bảo tồn và sinh học phân tử hiện đại, kết hợp đồng thời hai hệ thống chỉ thị di truyền:

• Hệ thống chỉ thị vi vệ tinh (Microsatellite/SSR): Dựa trên mô hình alen vô hạn (IAM) và mô hình đột biến từng bước (SMM). Tốc độ đột biến của các locus vi vệ tinh dao động từ 10^-2 đến 10^-6 trên mỗi locus trong một thế hệ. Do tính đa hình cao và di truyền theo phân ly Mendel, chỉ thị microsatellite nhân cho phép định lượng mức độ pha tạp alen giữa các loài lai cận duyên.
• Hệ thống gen ty thể (mtDNA): Vận dụng nguyên lý di truyền theo dòng mẹ. Đoạn gen ty thể kích thước 790 bp bao gồm các vùng mã hóa tRNA-Thr, tRNA-Pro, tRNA-Phe và một phần vùng kiểm soát D-loop. Vùng D-loop có tốc độ đột biến thay thế nucleotide cao gấp 5 đến 10 lần so với hệ gen nhân, đóng vai trò then chốt trong xác định nguồn gốc tổ tiên dòng mẹ và phân tích phát sinh chủng loại.
• Khái niệm cốt lõi: Đề tài chuẩn hóa các khái niệm về độ thuần chủng di truyền (ngưỡng đóng góp hệ gen trên 99%), cấu trúc quần thể phân nhóm (K-clusters), khoảng cách di truyền HKY và xác suất hậu nghiệm Bayesian (Posterior Probability - PP).

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu và cỡ mẫu: Tổng cộng 85 mẫu sinh học được phân tích, bao gồm 64 mẫu mô cơ đuôi cá sấu Xiêm thu tại Vườn thú Sài Gòn (28 mẫu), Vườn thú Lào tại Viêng Chăn (21 mẫu), Vườn thú Thủ Lệ (12 mẫu), Trạm cứu hộ Hòn Me - Kiên Giang (1 mẫu) và vườn thú Tây Ban Nha (2 mẫu); 3 mẫu phân thu tại quần thể hoang dã Bản Sóc (tỉnh Khammouane, Lào); 4 mẫu mô cơ đối chứng chuẩn tại Vườn quốc gia Cát Tiên; 4 mẫu máu chuẩn từ các vườn thú châu Âu (Cộng hòa Séc, Tây Ban Nha); 5 mẫu mô cá sấu Cuba và 5 mẫu máu cá sấu nước mặn làm nhóm ngoại suy so sánh.
• Phương pháp chọn mẫu: Kết hợp chọn mẫu có chủ đích tại các trung tâm cứu hộ, vườn thú và phương pháp điều tra thực địa không xâm lấn (thu mẫu phân tươi và bắt cá non ban đêm để cắt mẫu mô vảy đuôi rồi thả lại) tại Bàu Sấu trong chuyến khảo sát từ ngày 13/5/2018 đến 20/5/2018.
• Quy trình thí nghiệm: Tách chiết ADN tổng số bằng kit chuyên dụng GeneJET Genomic DNA Purification Kit cho mẫu mô và QIAamp DNA Stool Mini Kit cho mẫu phân. Khuếch đại PCR đoạn gen ty thể 790 bp và 8 locus microsatellite đặc hiệu (Cj16, Cj18, Cj101, Cj104, Cj119, Cj131, Cp10, Cr391). Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel Agarose 1%, tinh sạch và giải trình tự gen Sanger hai chiều.
• Lý do lựa chọn phương pháp phân tích: Dữ liệu giải trình tự ty thể được phân tích quan hệ phát sinh chủng loại bằng phương pháp Bayesian qua phần mềm MrBayes v3.0 với 10 triệu thế hệ MCMC nhằm đảm bảo xác suất hậu nghiệm tiệm cận độ tin cậy tuyệt đối. Dữ liệu microsatellite được phân tích cấu trúc di truyền đa loài bằng phần mềm STRUCTURE v2.4 (chạy 1 triệu bước MCMC, loại bỏ 100.000 bước burn-in, thiết lập K=3 tương ứng 3 loài có nguy cơ lai chéo) kết hợp phần mềm GeneClass v2.0 nhằm định lượng chính xác tỷ lệ hệ gen của từng loài trong từng cá thể.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

• Xác định 100% dòng mẹ cá sấu Xiêm: Kết quả đối chiếu trình tự đoạn gen ty thể 790 bp trên ngân hàng gen NCBI cho thấy toàn bộ 65 cá thể khảo sát tại các vườn thú và tự nhiên đều có độ tương đồng di truyền từ 99% đến 100% với loài Crocodylus siamensis. Điều này chứng minh các phép lai thương mại trước đây đều sử dụng cá sấu Xiêm cái làm cá thể mẹ.
• Phân tách rõ ràng khoảng cách di truyền: Khoảng cách di truyền giữa cá sấu Xiêm với cá sấu Cuba dao động từ 6,29% đến 9,91%, và với cá sấu nước mặn từ 6,56% đến 11,75%. Mức độ sai khác nội bộ giữa các cá thể cá sấu Xiêm đạt 0%. Cây phát sinh chủng loại Bayesian củng cố sự tách biệt này với giá trị xác suất hậu nghiệm đạt mức tuyệt đối (PP = 100). Quần thể hoang dã mới tại Bản Sóc (Lào) được xác nhận thuộc nhánh cá sấu Xiêm bản địa.
• Tỷ lệ cá thể thuần chủng đạt 80%: Phân tích STRUCTURE v2.4 tại K=3 chỉ ra 52 trên tổng số 65 cá thể khảo sát (chiếm 80%) đạt tỷ lệ gen cá sấu Xiêm trên 99%, đủ tiêu chuẩn công nhận là cá thể thuần chủng phục vụ nhân giống tái thả.
• Phát hiện 20% cá thể bị lai tạp: Nghiên cứu phát hiện 13 trên 65 cá thể (chiếm 20%) mang nguồn gen lai chéo với tỷ lệ gen Xiêm dao động từ 88,5% đến 98,9%. Điển hình là cá thể Cr60 tại Vườn thú Lào có tỷ lệ gen Xiêm thấp nhất (88,5%), dù cơ sở nuôi nhốt trước đó khẳng định cá thể này thuần chủng. Mẫu Cr1 thu tại Hòn Me (Kiên Giang) đạt độ thuần chủng 99,2%, khẳng định sự tồn tại hiếm hoi của cá thể hoang dã thuần chủng ngoài tự nhiên.

Thảo luận kết quả

Dữ liệu phân tích cấu trúc di truyền được trực quan hóa sinh động qua biểu đồ cột màu đa sắc STRUCTURE (với K=3). Biểu đồ phân định rõ ba dải màu đặc trưng cho ba loài: dải màu đại diện cho cá sấu Xiêm chiếm trọn vẹn ở các cá thể thuần chủng, trong khi xuất hiện các vệt màu pha tạp từ cá sấu Cuba và cá sấu nước mặn ở 13 mẫu lai. Sự không đồng nhất giữa kết quả GeneClass v2.0 (nhiều mẫu thuần chủng chỉ đạt xác suất dưới 10%) và STRUCTURE v2.4 phản ánh hạn chế của GeneClass khi kích thước mẫu chuẩn tham chiếu còn nhỏ. Do đó, mô hình cấu trúc quần thể Bayesian của STRUCTURE với ngưỡng đánh giá 99% mang lại độ tin cậy khoa học cao nhất.

Khảo sát thực địa tại Bàu Sấu ghi nhận sinh cảnh đầm lầy rộng khoảng 150 ha vào đầu mùa mưa cung cấp nguồn thức ăn dồi dàu cho quần thể cá sấu phục hồi sau tái thả. Tuy nhiên, hai áp lực sinh thái lớn đang đe dọa sinh cảnh: sự phát triển quá mức của các trảng cỏ nổi gây tích tụ trầm tích làm nông lòng bàu, và sự xâm lấn nghiêm trọng của cây mai dương gai góc. Mai dương làm thu hẹp hơn 30% diện tích bãi cát bằng phẳng ven bờ, cản trở trực tiếp tập tính phơi nắng và làm tổ đẻ trứng (trung bình 11 đến 26 trứng mỗi tổ) của cá sấu cái.

Đề xuất và khuyến nghị

• Sàng lọc và gắn vi chip định danh điện tử: Tiến hành lấy mẫu mô và xét nghiệm ADN cho 100% cá thể cá sấu nuôi nhốt tại các vườn thú và trạm cứu hộ trong vòng 12 đến 24 tháng tới. Thực hiện cách ly triệt để 13 cá thể lai tạp khỏi đàn giống sinh sản và gắn chip vi mạch theo dõi cho 52 cá thể thuần chủng (tỷ lệ gen trên 99%) để xây dựng nguồn giống tái thả quốc gia do Chi cục Kiểm lâm các tỉnh chủ trì.
• Thiết lập ngân hàng dữ liệu di truyền chuẩn hóa: Ứng dụng bộ 8 locus microsatellite và đoạn gen ty thể 790 bp để xây dựng cơ sở dữ liệu số hóa quản lý nguồn gen bò sát nguy cấp giai đoạn 2019 - 2022, do Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật phối hợp cùng các trường đại học triển khai.
• Kiểm soát sinh cảnh và xử lý thực vật xâm lấn: Xây dựng kế hoạch hàng năm nạo vét khơi thông 150 ha mặt nước Bàu Sấu, đồng thời triệt phá hoàn toàn diện tích cây mai dương xâm lấn trong giai đoạn 2020 - 2023 nhằm khôi phục các bãi cát tự nhiên phục vụ sinh sản cho cá sấu, do Ban Quản lý Vườn quốc gia Cát Tiên chịu trách nhiệm.
• Hoàn thiện hành lang pháp lý kiểm định tái thả: Ban hành quy chuẩn kỹ thuật bắt buộc kiểm định di truyền đạt độ thuần chủng tối thiểu 99% trước khi cấp phép tái thả bất kỳ cá thể cá sấu nào về tự nhiên hoặc cấp chứng chỉ CITES xuất nhập khẩu thương mại từ năm 2021, dưới sự quản lý của Cơ quan Quản lý CITES Việt Nam.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Ban quản lý các vườn quốc gia và khu bảo tồn đất ngập nước: Đặc biệt là Vườn quốc gia Cát Tiên, Vườn quốc gia Pang Sida và Kaengkrachan; ứng dụng quy trình phân tích di truyền để thẩm định nguồn giống trước khi tái thả và triển khai kế hoạch bảo vệ 150 ha sinh cảnh hồ Bàu Sấu.
• Cơ quan quản lý nhà nước về kiểm lâm và CITES: Cục Kiểm lâm và Cơ quan thẩm quyền quản lý CITES Việt Nam; sử dụng bộ chỉ thị sinh học để kiểm soát hơn 50.000 cá thể cá sấu nuôi nhốt thương mại, ngăn chặn hành vi trà trộn con lai vào chuỗi cung ứng xuất khẩu.
• Các nhà khoa học, giảng viên và học viên chuyên ngành: Các chuyên gia thuộc ngành Sinh thái học, Di truyền học, Động vật học và Quản lý tài nguyên môi trường; khai thác quy trình phối hợp giữa gen ty thể 790 bp và 8 locus microsatellite cùng mô hình thống kê 10 triệu chuỗi MCMC làm tài liệu tham khảo học thuật.
• Các tổ chức phi chính phủ và cơ sở cứu hộ động vật: Các tổ chức bảo tồn như Quỹ Nagao, Quỹ Quốc tế Bảo vệ Thiên nhiên (WWF), Vườn thú Cologne và Trạm cứu hộ Hòn Me; tham khảo dữ liệu thực chứng để hoạch định ngân sách và chiến lược bảo tồn đa dạng sinh học giai đoạn 2020 - 2030.

Câu hỏi thường gặp

• Vì sao không thể phân biệt cá sấu Xiêm thuần chủng và cá thể lai bằng mắt thường? Cá thể lai giữa cá sấu Xiêm với cá sấu nước mặn hoặc cá sấu Cuba thường mang kiểu hình trung gian hoặc trội hoàn toàn về kích thước và hoa văn da lưng rất giống cá sấu Xiêm thuần chủng. Trong thực tế, 13 cá thể lai phát hiện tại các vườn thú đều bị nhầm lẫn là thuần chủng nếu chỉ dựa vào quan sát hình thái bên ngoài.

• Tại sao cần kết hợp đồng thời chỉ thị gen ty thể và chỉ thị microsatellite? Đoạn gen ty thể 790 bp chỉ di truyền theo dòng mẹ, giúp xác định nguồn gốc giống cái ban đầu. Chỉ thị microsatellite nhân phân tích trên 8 locus giúp phát hiện dòng gen phân ly từ cả bố và mẹ, từ đó định lượng chính xác tỷ lệ pha tạp alen nhân của các thế hệ lai F1, F2 mà gen ty thể không thể phát hiện.

• Tỷ lệ cá thể lai tạp trong các cơ sở nuôi nhốt được ghi nhận ở mức nào? Nghiên cứu chỉ ra có 20% cá thể (13 trên 65 mẫu khảo sát) tại các vườn thú bị lai tạp, trong đó cá thể Cr60 tại Vườn thú Lào có mức độ pha tạp cao nhất khi tỷ lệ gen cá sấu Xiêm chỉ còn 88,5%.

• Quần thể hoang dã phát hiện tại Bản Sóc (Lào) mang giá trị di truyền ra sao? Kết quả giải trình tự 2 trên 3 mẫu phân thu tại Bản Sóc cho thấy khoảng cách di truyền đạt mức sai khác 0% so với cá sấu Xiêm chuẩn. Cây phát sinh loài Bayesian khẳng định quần thể này hoàn toàn thuần chủng và thuộc về nhánh bản địa tự nhiên.

• Tiêu chuẩn di truyền nào được áp dụng để lựa chọn cá thể tái thả tự nhiên? Cá thể đạt tiêu chuẩn tái thả bắt buộc phải có nguồn gốc dòng mẹ thuần chủng xác nhận qua gen ty thể (độ tương đồng trên 99%) và tỷ lệ hệ gen cá sấu Xiêm đạt trên 99% khi phân tích cấu trúc quần thể qua phần mềm STRUCTURE v2.4 với K=3.

Kết luận

• Ứng dụng thành công tổ hợp chỉ thị phân tử gồm đoạn gen ty thể 790 bp và 8 locus microsatellite đặc hiệu nhằm xác định mức độ thuần chủng của cá sấu Xiêm với độ tin cậy khoa học cao.
• Khẳng định 80% cá thể (52/65 mẫu) khảo sát đạt tiêu chuẩn thuần chủng trên 99%, đồng thời bóc tách 20% cá thể lai tạp (tỷ lệ gen Xiêm từ 88,5% đến 98,9%) trong hệ thống nuôi nhốt.
• Thiết lập dữ liệu di truyền nguyên bản cho quần thể hoang dã mới tại Bản Sóc (Lào) và ghi nhận cá thể tự nhiên thuần chủng quý hiếm (đạt 99,2%) tại Kiên Giang.
• Đánh giá toàn diện hiện trạng sinh thái Bàu Sấu với hơn 150 ha mặt nước, chỉ rõ nguy cơ thu hẹp sinh cảnh do cây mai dương xâm lấn và quá trình bồi lắng của trảng cỏ nổi.
• Đề xuất lộ trình giai đoạn 2020 - 2025 gắn vi chip định danh 100% cá thể giống bố mẹ thuần chủng phục vụ chương trình nhân giống phục hồi loài bò sát cực kỳ nguy cấp này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Do có sự đa dạng về địa hình, tiểu vùng khí hậu và các hệ sinh thái nên khu hệ động vật hoang dã của Việt Nam rất đa dạng về thành phần loài, phân bố ở hầu hết các vùng địa lý và cảnh quan khác nhau. Tuy nhiên, những ảnh hƣởng của suy thoái môi trƣờng do tác động của con ngƣời, tình trạng khai thác quá mức và biến đổi khí hậu, đã khiến nhiều loài động vật đứng trƣớc nguy cơ bị tuyệt chủng vì mất sinh cảnh sống và suy giảm số lƣợng quần thể, đặc biệt là các loài sống ở hệ sinh thái rừng nhiệt đới, trong đó có các loài cá sấu. Loài này cũng đƣợc liệt vào phụ lục I theo công ƣớc CITES bởi sự phân mảnh quần thể và tình trạng săn bắt trái phép tăng mạnh. Tại Việt Nam, loài này đã từng đƣợc coi là tuyệt chủng ngoài tự nhiên.

Cho tới đầu những năm 2000, nhóm các nhà khoa học tại Việt Nam và đại học Queensland đã thực hiện chƣơng trình tái thả cá sấu xiêm về vƣờn quốc gia Cát Tiên từ một số sơ sở nuôi động vật hoang dã. Nghiên cứu của Polet năm 2006 và kết quả điều tra, giám sát vào năm 2015, 2017 của VQG Cát Tiên cho thấy có sự xuất hiện con non và gia tăng số lƣợng cá thể phản ánh hiệu quả của chƣơng trình tái thả. Tại Lào và Việt Nam, lai không kiểm soát giữa các loài này thƣờng xuyên diễn ra tại các trại nuôi nhốt. Hai loài thƣờng đƣợc lai với cá sấu Xiêm là cá sấu nƣớc mặn (C.

porosus) và cá sấu Cuba (C. Con lai thƣờng có kích thƣớc lớn, có giá trị thẩm mỹ và khó phân biệt về mặt hình thái với cá sấu Xiêm thuần chủng. Sự tồn tại của cá thể lai ngoài tự nhiên sẽ gây tác động xấu đến sự tồn tại của cá thể thuần chủng bởi sự cạnh tranh về nơi ở, nguồn thức ăn và có thể làm ảnh hƣởng đến nguồn gen của loài. Bên cạnh đó, quần thể mới phát hiện tại bản Sóc, Khammouane, Lào chƣa đƣợc thực hiện nghiên cứu về sinh học phân tử.

8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Vì những lý do trên tôi thực hiện đề tài “Xác định mức độ thuần chủng của cá thể loài cá sấu Xiêm (Crocodylus siamensis) bằng sinh học phân tử nhằm hỗ trợ công tác bảo tồn”. Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng dữ liệu di truyền cho quần thể mới phát hiện tại Khammouane (Lào). - Xác định sự thuần chủng của các cá thể tại khu vực nuôi nhốt bao gồm một vƣờn thú tại Lào, vƣờn thú Thủ Lệ (Hà Nội), vƣờn thú Sài Gòn (Tp. Hồ Chí Minh).

- Đánh giá hiện trạng bảo tồn loài tại VQG Cát Tiên. Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Xây dựng cơ sở dữ liệu di truyền cho quần thể mới Khuếch đại, giải trình tự đoạn gen ty thể có kích thƣớc 790bp, đồng thời xác định kiểu gen 8 locus microsatellite Xây dựng cây quan hệ di truyền dựa trên các mẫu vật của quần thể mới với các dữ liệu đã công bố trên ngân hàng gen (NCBI). - Nội dung 2: Đánh giá mức độ thuần chủng của các cá thể trong một số khu nuôi nhốt tại Lào và Việt Nam Xác định dòng mẹ: khuếch đại, giải trình tự đoạn gen ty thể, đối chiếu với các trình tự trên ngân hàng gen (NCBI) bằng công cụ Blast và xây dựng cây quan hệ di truyền dựa trên các dữ liệu thu đƣợc. Xác định độ thuần chủng: khuếch đại, xác định kiểu gen 8 locus microsatellite.

Phân tích xác suất thuộc nhóm cá thể thuần chủng bằng phần mềm GeneClassv2 Phân tích tỷ lệ loài trong từng cá thể bằng phần mềm STRUCTUREv2.