CHƯƠNG 1 TONG QUAN 1.1 Nguồn gốc, cau tạo, tính chat và ứng dung của collagen 1.1 Nguồn nguyên liệu tach chiết collagen Trước đây, collagen được trích ly từ da và xương của một số loài động vật có xương sống như lợn và trâu bò. Collagen nguyên thể trích ly từ các nguồn này được ứng dụng nhiều trong công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm [14]. Tuy nhiên, collagen từ lợn và trâu bò có một số hạn chế nhất định nên trong những năm gan đây, các nha khoa học đã tập trung nghiên cứu tách chiết collagen từ những nguồn nguyên liệu thay thé có nguồn gốc từ phế liệu thủy sản như: da, xương, vây, vay của các loài cá nước ngọt và cá biển, da mực, da ếch.1 Collagen tách chiết từ da bò Collagen trích ly từ da bò đã được sử dụng từ rất lâu trong lĩnh vực y khoa, nó cũng đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực sản xuất mỹ phẩm và các sản phẩm chăm sóc sức khỏe [15]. Tuy nhiên, mãi đến năm 1970 nghiên cứu về trích ly collagen từ da bò mới được hiểu biết rõ, khi các nhà nghiên cứu phát triển hệ thống tách chiết collagen từ da bò và điều chế nó thành dạng lỏng [16].2 Collagen tách chiết từ da lợn Từ nhiều năm nay, da lợn là nguồn collagen dùng trong sản xuất các sản phẩm như vỏ bao xúc xích và các loại màng.
Trong lĩnh vực y khoa, màng collagen từ da lợn cho thấy rất hữu ích trong phẫu thuật chỉnh hình. Gần đây, các nhà nghiên cứu cho răng collagen dạng bột nhão tách chiết từ da lợn phủ lên vết thương rộng không có dấu hiệu đào thải và không gây ra triệu chứng viêm sưng quá mức, chính vì vậy có thể xem collagen tách chiết từ da lợn là một lựa chọn hiệu quả thay thế cho da trong điều trị vết thương rộng [17Ị.3 Collagen tách chiết từ cá Tương tự như collagen loại I tách chiết từ động vật hữu nhũ, collagen cá gồm ba chuỗi polypeptid, mỗi chuỗi có khoảng 1000 amino acid với trọng lượng khoảng 100 kDa. Collagen cá có hàm lượng hydroxyproline thấp hơn collagen động vật hữu nhũ, do đó chúng có ít liên kết ngang và kém bên hơn so với collagen của động vật có xương song trên cạn [18]. Nguồn collagen từ động vật hữu nhũ rat phù hợp dé ứng dụng trong sinh học dược, tuy nhiên do sự tôn tại của các mối nguy sinh học và tín ngưỡng tôn giáo nên collagen tach chiết từ phế phụ phâm của ngành chế biến thủy hải sản sẽ là nguồn collagen thay thé có hiệu quả và day triển vọng [14], [19], [20].2 Cau tạo phân tử collagen Những hình anh đặc trưng về thành phan cau tạo và cấu trúc của collagen đã được công bố vào thập niên 1940 và 1950.
Thành phần amino acid của collagen khác với các protein đã biết, điểm đặc trưng nhất của collagen là có hàm lượng glycine và proline rất cao [21]. Những thử nghiệm ban đầu để xác định cấu trúc cơ sở của collagen bằng phương pháp thủy phân từng phan cho thay: trong chuỗi collagen thông thường, glycine có thé chiếm 1/3 tong chiều dài chuỗi [22]. Nghiên cứu về collagen ở động vật có xương sống trưởng thành cho thấy có một lượng carbohydrate thấp (khoảng dưới 1 %) trong collagen. Năm 1966, người ta xác định được carbohydrate đó là galactose hoặc glucosylgalactose liên kết với nhóm hydroxyl của hydroxylysine [23].
Nghiên cứu nhiễu xa tia X trên sợi collagen cho thấy, collagen có cấu trúc xoắn bộ ba (triple-helices) [24]. Quan sát nhiễu xạ trên sợi co collagen từ gân đuôi chuột cho thay một sự phản xạ mạnh mẽ có tính đối xứng ở 2,9 A° và phan xạ cầu năm trong khoảng II-16A° tùy thuộc vào mức độ hydrate hóa [25]. Sự cải tiến hình ảnh nhiễu xạ bang cách kéo căng [26] cho thay sự biến đổi cấu trúc dạng hình que và cấu trúc dang xoăn ốc. Theo Ramachandran và Kartha [24], collagen bao gồm ba sợi bện thành dang dây thừng xoăn theo chiều từ trái qua phải, trong khi đó từng sợi collagen xoăn từ phải qua trái.
Cầu trúc xoắn của collagen giải thích tính đặc trưng của ảnh nhiễu xạ tia X và các amino acid đặc trưng của chúng.1 Thanh phan amino acid của phân tử collagen Phân tử collagen được cau tạo từ 20 loại amino acid. Trong đó glycine có hàm lượng cao nhất, chiếm 33 % tong số amino acid, khoảng 12 % proline, alanine va hydroxyproline mỗi loại chiếm 11 %, tong lượng amino acid còn lại khoảng 23 %. Hàm lượng hydroxylysine, histidine, phenylalanine, isoleucine, tyrosine va amino acid chứa lưu huỳnh vào khoảng 1 % hoặc thấp hon. Các amino acid có cực chiếm khoảng 40 % phân tử collagen, trong đó 11 % là amino acid có tính bazơ, 9 % là amino acid có tính acid và khoảng 17 % là amino acid ở dạng hydroxy, khoảng 5 % acid aspartic và glutamic còn lại tồn tại ở dang amid.
Cac amino acid không phân cực chiếm khoảng 40 % phân tử collagen.1 Thanh phần amino acid của collagen tách chiết từ da một số loài cá © [9], [11], [27], [28], [29] “en Ca Ca cá cá Cá cá Ca ca Ca rô Amino acid °®Í bơn | đuối bác ac nóc ho | gig | POPE) biên quái | đuổi đỏ | nhị Hydroxyproline | 59 72 77 | 68,1 | 50.6 | 74,2 | 80,2 | 102 84 Aspartic acid 55 37 27 | 49,7 | 61,6 | 50,9 | 42,7 | 43,1 | 59,7 Threonine 22 36 20 | 26,2 | 35,9 | 26,7 | 30,6 | 27,4 | 25,8 Serine 39 46 28 | 44.8 | 43,4 | 42 | 40,2 | 33 31,1 Glutamic acid 80 75 95 | 77,6 | 103 78 86 | 80,1 | 96,1 Proline 104 | 81 93 109 | 83,9 | 110 | 113 | 115 | 110 Glycine 322 | 348 | 363 | 333 252 | 326 | 326 | 335 | 251,5 Alanine 114 | 114 | 96 123 123 | 127 | 110 | 106 | 104,4 Valine 28 27 24 | 27,9 | 36,5 | 20,6 | 28 | 26,9 | 18,9 Methionine 20 16 21 | 8,42 | 7,39 | 8,49 | 7,56 | 8,71 | 13,8 Isoleucine 14 17 12 | 7,11 | 21,1 | 9,93 | 15,3 | 12,3 | 13,4 Leucine 30 23 20 | 15,8 | 41,6 | 23 | 26,8 | 23,5 | 27,3 Tyrosine 5 2 6 2,40 | 8,38 | 3,13 | 2,8 | 2,24 | 5,3 Phenylalanine 13 12 28 11,5 18,8 | 13,7 | 13,6 | 9,52 | 17.5 Hydroxylysine 5 7 8 - - - - - 16,2 Lysine 31 28 25 | 30,1 | 44,5 | 29,4 | 19,2 | 24,1 | 34,9 Histidine 8 9 5 5,95 | 10,4 | 6,32 | 10,8 | 4,48 | 7,8 Arginine 51 49 52 | 59,0 | 58,4 | 50,6 | 47,1 | 47,0 | 82,3 Tryptophane - - - - - - - - - Cystein - - - - - - - - - (*) Kết quả tinh theo số amino acid/ 1000 amino acid tổng số.2 Cau trúc của collagen Collagen là một protein có câu trúc chặt chẽ với nhiêu mức câu trúc có trật tự từ đơn giản đến phức tạp: phân tử collagen, vi sợi, sợi và bó sợi collagen.1 mô tả mỗi liên hệ giữa phan tử collagen, vi sợi, sợi và bó sợi collagen ở dây chẳng [30]. Vi sợi collagen Soi collagen Bó sợi _=— \{ Sợi dây collagen chăng Nguyên bào sợi Jitrf Mạch máu ‘aw Oe lạ. Ạ es 4 ss Ar củ -~x* t ea. Pi ỦWŠ Be So ste ` V_.
“^ ' Đầu sợi collagen Dang gap nép tom —= l100nn = Hình 1.1 Cau trúc của sợi dây chang a. Câu trúc của phân tử collagen Phân tử collagen được hình thành từ ba chuỗi polypeptide, mỗi chuỗi polypeptide được tạo nên bởi một dãy các a- amino acid được sắp xếp theo dạng bộ ba như sau: Gly-X- Y, với Gly = Glycine, X và Y là các amino acid khác, thông thường X là proline (Pro) và Y là hydroxy-proline (Hyp). Ba chuỗi polypeptide cuộn lại xung quanh một trục, hình thành cau trúc xoăn bộ ba. Phân tử collagen có cau trúc hình sợi dai với đường kính khoảng 1,5 nm và chiều dai 300 nm, trọng lượng phân tử khoảng 285 kDa [31].
Tùy thuộc vào từng loại collagen mà cau trúc xoắn bộ ba có thé được hình thành từ ba chuỗi polypeptide giống nhau hoặc khác nhau. Collagen loại I (type I) được hình thành từ hai chuôi ơi và một chuỗi a2, các chuỗi ơi, a2 có một sự khác biệt nhỏ vê thành phân amino acid [32|. Collagen dạng xoắn @ glycine X: proline Y: hydroxyproline Soi cơ collagen type I Hình 1.2 Cấu trúc phân tử collagen loại I [32] b. Sự sắp xếp các phân tử trong vỉ sợi collagen Vi sợi collagen được hình thành từ quá trình tự sắp xếp các phân tử collagen.
Vi sợi collagen có dạng hình trụ với đường kính 10 - 500 nm [33]. Dùng kính hién vi điện tử hoặc kính hién vi lực nguyên tử có thé quan sát được những dải sáng và tối cách đều nhau. Chu ky của các dai này khoảng 67 nm, được gọi là chu ky D. Sự hình thành các dải này, ban đầu được giải thích theo mô hình của Hodge và Petruska [34].
Theo mô hình này năm phân tử collagen được sắp xếp so le như hình 1. Mô hình giải thích sự xuất hiện của dai tối còn gọi là “khoảng trống” hay “vùng trống”, là vị trí chỉ có bốn phân tử collagen hiện diện, còn dải sáng được gọi là “vùng chồng lắp” là vị trí cả năm 8 phân tử collagen hiện diện. Sự chuyển mô hình Hodge và Petruska từ dạng 2D vốn có sang dạng 3D ở vi sợi collagen đã gây tranh luận trong nhiều năm. Dựa vào kết quả nhiễu xạ tia X và kỹ thuật phân tích cau trúc bậc cao như TEM, một số mô hình đã được đưa ra để mô tả sự sắp xếp phân tử trong vi sợi collagen.
Những mô hình này có thể dựa trên hai giả thuyết cơ bản. Giả thuyết thứ nhất: năm phân tử collagen tạo thành một cau trúc vi sợi do sự hình thành các liên kết ở vùng telopeptide. Giả thuyết thứ hai: các phân tử collagen tạo thành mang 3D kết tinh (hoặc giống dạng kết tinh) [31], [33]. ray TT~ ' Ving : ' chồng » Vung.
' lap § trông alk + Chu ki D =67nm Hình 1. (B) Biểu đồ thé hiện sự sắp xếp hai chiều của các phân tử collagen trong vi sợi. Chu kì D hình thành từ sự sắp xếp so le của các phân tử collagen trong vi sợi [30]. Theo mô hình vi sợi, các đoạn phân tử collagen gắn chặt với nhau ở vùng chong lắp và lỏng lẻo hơn ở vùng trống [35].
Chu kì D ở mô hình vi sợi hình thành do sự sắp xếp các phân tử collagen do Smith đưa ra đã được thừa nhận rộng rãi [36].