MỞ ĐẦU Human papillomavirus (HPV) là một trong những nguyên nhân gây bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục phổ biến nhất ở cả nam và phụ nữ trên thế giới và đƣợc cho là nguyên nhân gây bệnh do virus lây truyền phổ biến nhất ở Hoa Kỳ [20]. Hơn 200 kiểu gen HPV đã đƣợc xác định trên cơ sở dữ liệu trình tự ADN cho thấy sự khác biệt về gen. Dựa trên sự liên quan của chúng với ung thƣ và các tổn thƣơng tiền thân, HPV có thể đƣợc xếp vào các nhóm HPV nguy cơ gây ung thƣ cao (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 , 66, 68, 70) và HPV nguy cơ gây ung thƣ thấp (HPV 6, 11, 42, 43, 44) [20]. Một số bằng chứng về lâm sàng, dịch tễ học, phân tử và thực nghiệm đã thiết lập mối quan hệ bệnh học giữa một số kiểu gen HPV và ung thƣ trên thế giới.
Nhiễm HPV nguy cơ cao là kết quả gây nên các tổn thƣơng tiền ung thƣ làm tăng nguy cơ ung thƣ cổ tử cung, âm hộ, âm đạo, dƣơng vật, hậu môn, miệng hoặc cổ họng [9, 17, 18, 37, 44, 47]. Đồng thời, HPV còn là nguyên nhân của nhiều bệnh lý lâm sàng trên da và niêm mạc nhƣ hạt cơm, sùi mào gà sinh dục - hậu môn, u nhú thanh quản ở trẻ sơ sinh. Tỷ lệ nhiễm HPV toàn cầu ƣớc tính là 11,7%. Châu Phi (24%), Đông Âu (21,4%) và Mỹ Latin (16,1%) là những vùng tỷ lệ nhiễm cao nhất.
Đặc biệt, nhiễm HPV có một đỉnh đầu tiên ở độ tuổi trẻ hơn 25 tuổi [12]. Tại Việt Nam nghiên cứu của Cao Minh Nga và cộng sự (2011) trên phụ nữ đến khám có bệnh lý sinh dục nhƣng tế bào học bình thƣờng tại bệnh viện Đại học Y dƣợc thành phố Hồ Chí Minh trong độ tuổi từ 18 - 69 cho thấy tỷ lệ nhiễm HPV là 19,79%, tỷ lệ đồng nhiễm từ 2 type HPV trở lên 40,31%, tỷ lệ nhiễm các type HPV nguy cơ cao là 63,57%, 2 nhóm vừa nguy cơ cao và nguy cơ thấp là 20,54%, type nguy cơ thấp là 15,89% [1]. HPV đang tiếp tục là một chủ đề quan trọng vì tỷ lệ nhiễm virus tiếp tục tăng nhanh, tỷ lệ đồng nhiễm cao (20 - 30%) và nhiều ảnh hƣởng của virus đến sức khỏe con ngƣời mới đƣợc công bố. Tầm soát dự phòng HPV bằng vắc xin đã đƣợc triển khai tại nhiều quốc gia trên thế giới từ năm 2006.
Tháng 12/2014, vắc xin Gardasil 9 đã đƣợc FDA (Hoa Kỳ) phê chuẩn và cho phép lƣu hành để phòng ngừa các type HPV 6, 11, 16, 18, 31, 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Một số quốc gia (Mỹ, Hà Lan.) đã đƣa xét nghiệm HPV ADN là xét nghiệm tầm soát ung thƣ cổ tử cung định kỳ cho phụ nữ. Do đó, việc chẩn đoán phân biệt các type HPV có nguy cơ gây ung thƣ cao và nguy cơ gây ung thƣ thấp ngày càng trở nên cần thiết, giúp phân loại, điều trị, theo dõi ở những bệnh nhân bị nhiễm HPV, xác định vai trò của các type HPV trong các trƣờng hợp đồng nhiễm và đánh giá hiệu quả của vắc xin. Hiện nay, kỹ thuật sinh học phân tử là phƣơng pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao để phát hiện các kiểu gen của HPV trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng.
Ở trong nƣớc, chƣa có thông tin về nghiên cứu phát triển phƣơng pháp hay bộ kít phát hiện HPV nguy cơ thấp mà chỉ có thông tin về bộ kit phát hiện nguy cơ cao (Khoa Thƣơng). Một số hãng sinh phẩm của nƣớc ngoài (Sacace - Italy) có thể phát hiện các type HPV nguy cơ cao và thấp nhƣng thiết kế tách riêng thành hai bộ sinh phẩm dẫn tới việc chẩn đoán nhiễm các type HPV cho cùng một bệnh nhân sẽ tốn kinh phí, thời gian. Do đó, phát triển phƣơng pháp phát hiện đồng thời các kiểu gen nguy cơ cao và thấp là cần thiết. Xuất phát từ thực tiễn trên, luận văn “Nghiên cứu phát triển bộ kit phát hiện đồng thời các kiểu gen HPV nguy cơ gây ung thƣ bằng kỹ thuật multiplex real time PCR” đƣợc thực hiện với những mục tiêu sau: 1.
Nghiên cứu chế tạo bộ kit multiplex real time PCR phát hiện đồng thời 16 kiểu gen HPV có nguy cơ gây ung thƣ phổ biến (HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 và 68). Đánh giá sự tƣơng đồng của bộ kit mới chế tạo với bộ kit thƣơng mại. Thử nghiệm khả năng ứng dụng của kit phát hiện kiểu gen HPV trên mẫu bệnh nhân. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1.
Giới thiệu về HPV Papillomavirus là các thành viên trong họ Papillomaviridae, đƣợc tìm thấy trong rất nhiều loài động vật có vú trong đó có con ngƣời. Các loài vật chủ khác nhau sẽ nhiễm các loại Papillomavirus đặc thù cho loài đó. Các Papillomavirus gây bệnh cho ngƣời gọi là Human papillomavirus (HPV). Từ thời Hy Lạp cổ đại, tổn thƣơng u sùi (sùi mào gà) ở bộ phận sinh dục đã đƣợc mô tả giống nhƣ một quả dâu.
Cuối thế kỷ 19, một số tác giả đã mô tả biểu hiện tế bào học của tổn thƣơng hạt cơm ở da và các sùi mào gà là giống nhau. Sau đó ngƣời ta đã gây bệnh thực nghiệm ở trên da bằng cách cấy bệnh phẩm tổn thƣơng sùi mào gà ở qui đầu. Tình hình nhiễm HPV trên thế giới và ở Việt Nam 1. Tình hình nhiễm HPV trên thế giới Trên thế giới (2012), tỷ lệ nhiễm HPV ở phụ nữ có cổ tử cung bình thƣờng là 11 - 12%.
Tỷ lệ cao hơn ở vùng cận Sahara - Châu Phi (24%), Đông Âu (21%) và châu Mỹ Latinh (16%) [22]. Hai loại phổ biến nhất là HPV 16 (3,2%) và HPV 18 (1,4%). Sự gia tăng tỷ lệ bệnh ở phụ nữ có cổ tử cung bất thƣờng tƣơng ứng với mức độ nghiêm trọng của tổn thƣơng (90% ở phụ nữ ung thƣ cổ tử cung CIN3). Nhiễm HPV đã đƣợc xác định là nguyên nhân gây nên ung thƣ cổ tử cung, dƣơng vật, âm đạo, hậu môn và hầu họng.
Năm 2008, ƣớc tính trên thế giới có 12,7 triệu ung thƣ và khoảng 610.000 trong số đó do HPV gây nên [22]. Tỷ lệ này thay đổi đáng kể theo khu vực địa lý và mức độ phát triển kinh tế: 14,2% ở châu Phi cận Sahara và 15,5% ở Ấn Độ, so với 1,6% ở Bắc Mỹ và 1,2% ở Úc/New Zealand. Ung thƣ cổ tử cung đƣợc cho là 100% liên quan đến HPV, chiếm 530.000 trƣờng hợp (86,9%). Ung thƣ cổ tử cung là ung thƣ phổ biến thứ ba ở phụ nữ và có mối liên hệ chặt chẽ với mức độ phát triển kinh tế, tỷ lệ chênh lệch giữa các nƣớc phát triển và kém phát triển là 4 lần.
Ƣớc tính tỷ lệ dự đoán ung thƣ cổ tử cung vào năm 2030 cho thấy sự gia tăng 2%. Hàng năm, tỷ lệ mụn cóc sinh dục (do HPV 6,11) ở các 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com nƣớc phát triển dao động từ 0,1 - 0,2% dân số. Tỷ lệ cao nhất xảy ra ở tuổi vị thành viên và thanh thiếu niên.1: Tỷ lệ mắc ung thư cổ cung (theo độ tuổi/100.000 dân) trên thế giới [10] 1. Tình hình nhiễm HPV tại Việt Nam Tại Việt Nam, nghiên cứu của Phạm Thị Hoàng Anh và cộng sự (2003), trên 1246 phụ nữ ở Hà Nội và 1122 phụ nữ ở thành phố Hồ Chí Minh độ tuổi từ 15-69, bằng cách sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi GP5+/6+ cho thấy HPV ADN đã đƣợc phát hiện trong 10,9% phụ nữ ở thành phố Hồ Chí Minh và 2,0% ở Hà Nội.
Đỉnh HPV phát hiện ADN ở phụ nữ dƣới 25 tuổi đƣợc tìm thấy ở thành phố Hồ Chí Minh (22,3%) nhƣng không tìm thấy ở Hà Nội. Phụ nữ ở Hà Nội cho thấy tỷ lệ nhiễm HPV thấp nhất từng đƣợc báo cáo và tỷ lệ nhiễm HPV trong dân số dƣờng nhƣ tƣơng quan chặt chẽ với tỷ lệ mắc Ung thƣ cổ tử cung xâm lấn [34]. Nghiên cứu của Cao Minh Nga, Lục Thị Vân Bích và cộng sự (2009) trên phụ nữ có bệnh lý sinh dục nhƣng tế bào học bình thƣờng đến khám tại bệnh viện Đại học Y dƣợc thành phố Hồ Chí Minh trong độ tuổi từ 18-69 cho thấy, tỷ lệ nhiễm HPV là 19,97%, trong đó các type HPV nguy cơ cao chiếm 63,57%, các type nguy 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com cơ thấp 15,89%, nhiễm cả hai nhóm nguy cơ 20,45%, đồng nhiễm 2 loại HPV trở lên chiếm tỷ lệ khá cao 40,31% [1, 3]. Lê Trung Thọ và cộng sự (2008) nghiên cứu trên 1500 phụ nữ tuổi từ 18-69, sống tại quận Hoàng Mai và Đông Anh - Hà Nội, bằng kỹ thuật sinh học phân tử cho thấy tỷ lệ nhiễm HPV ở cộng đồng phụ nữ Hà Nội là 5,13%.
Cao ở nhóm tuổi 20-29 (18,47%). Các type HPV nguy cơ cao có tỷ lệ 68,95%, các type nguy cơ thấp chiếm 27,27%. Số ngƣời nhiễm 1 type chiếm 72,72%, số nhiễm 2 type chiếm 14,28%, số nhiễm 3 type trở lên rất ít gặp [2]. Phạm Thọ Dƣợc và cộng sự (2013) nghiên cứu trên 1072 phụ nữ tuổi sinh đẻ tỉnh Đắk Lắk bằng kỹ thuật lai phân tử cho kết quả tỷ lệ nhiễm HPV là 11,8%, ba kiểu gen phổ biến là HPV 16 (28,6%), HPV 18 (22,1%) và HPV 58 (15,6%) [4].
Đặc điểm về hình thái HPV HPV là một loại virus tƣơng đối nhỏ, không có vỏ bọc. Hạt virus có đƣờng kính 52 - 55nm, bao gồm một phân tử ADN sợi đôi có khoảng 8000 cặp base (bp) gắn với protein histone và chứa trong một vỏ capsid gồm 72 capsomer. Capsid chứa hai protein cấu trúc muộn: L1 (kích thƣớc 55 kDa, 80% tổng protein virus) và L2 (70 kDa) - cả hai đều đƣợc mã hóa bằng virus (protein này là thành phần kháng nguyên đƣợc sử dụng trong phản ứng miễn dịch đặc hiệu). Các hạt virus hoàn chỉnh (VLPs) có thể đƣợc tạo ra bởi sự biểu hiện của L1, một mình hoặc kết hợp với L2 [7, 26].
Hạt virus của HPV [13] 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Đặc điểm về hệ gen HPV 1. Cấu trúc hệ gen Cấu trúc hệ gen của nhóm Pappilomavirus nói chung tƣơng tự nhau, tất cả các khung đọc mở ORF (Open Reading Frame) của virus đều trên một chuỗi ADN, điều này có nghĩa là quá trình phiên mã chỉ xảy ra trên một mạch duy nhất. Hệ gen của HPV có 8 khung đọc mở ORF, có thể chia thành 3 vùng chức năng [5, 15].
Sơ đồ bộ gen HPV [40] Vùng mã hóa sớm (Early region) gồm 6 gen mã hóa, ký hiệu là E1, E2, E4, E5, E6, E7 và các khung đọc mở ORF tƣơng ứng.