Luận văn thạc sĩ phát triển kit phát hiện HPV nguy cơ cao bằng multiplex real time PCR - ĐHKHTN

Luận văn thạc sĩ kỹ thuật nghiên cứu hus nghiên cứu và phát triển kit chẩn đoán đồng thời các genotype hpv nguy cơ cao và thấp bằng kỹ, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân,

• Tác giả: Ngô Thị Hồng
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thị Vân Anh
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu phát triển bộ kit phát hiện đồng thời các kiểu gen HPV nguy cơ gây ung thư bằng kỹ thuật multiplex real time PCR
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU VỀ HPV
• 1.1. Tình hình nhiễm HPV trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.2. Đặc điểm về hình thái HPV
• 1.3. Đặc điểm về hệ gen HPV
• 1.4. Chức năng của protein HPV
• 1.4.1. Chức năng protein E1
• 1.4.2. Chức năng protein E2
• 1.4.3. Chức năng protein E4
• 1.4.4. Chức năng protein E5
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nghiên cứu và phát triển phương pháp phát hiện đồng thời các type HPV nhóm nguy cơ cao phổ biến và 2 nhóm nguy cơ thấp bằng kỹ thuật multiplex real time PCR
• 3.2. Phản ứng PCR khuếch đại các trình tự đích
• 3.3. Nhân dòng trình tự đích tạo chứng dương
• 3.4. Xác định tính đặc hiệu của mồi và đầu dò trong phản ứng real time PCR
• 3.5. Xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng và tối ưu nồng độ của chuẩn dương
• 3.6. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng
• 3.7. Bộ kit hoàn chỉnh
• 3.8. Thử nghiệm khả năng ứng dụng của kit phát hiện kiểu gen HPV trên mẫu bệnh nhân
• PHỤ LỤC 1: PHIẾU ĐỒNG Ý THAM GIA NGHIÊN CỨU
• PHỤ LỤC 2: DANH MỤC TRÌNH TỰ THAM CHIẾU GENOME HPV TRONG TẠO CƠ SỞ DỮ LIỆU TRÌNH TỰ HPV
• PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN MỘT SỐ TYPE HPV ĐẠI DIỆN ĐƯỢC SỬ DỤNG LÀM ĐỐI CHỨNG DƯƠNG CỦA KIT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu phát triển kit chẩn đoán HPV

Nghiên cứu phát triển bộ kit chẩn đoán HPV nguy cơ cao và thấp bằng kỹ thuật realtime PCR đang trở thành một trong những lĩnh vực quan trọng trong y học hiện đại. HPV, hay Human Papillomavirus, là một trong những nguyên nhân chính gây ra ung thư cổ tử cung và nhiều bệnh lý khác. Việc phát triển bộ kit này không chỉ giúp phát hiện sớm các kiểu gen HPV mà còn hỗ trợ trong việc điều trị và theo dõi bệnh nhân.

1.1. Giới thiệu về HPV và tầm quan trọng của việc chẩn đoán

HPV là một loại virus lây truyền qua đường tình dục, có hơn 200 kiểu gen khác nhau. Trong đó, một số kiểu gen được xác định là nguy cơ cao gây ung thư. Việc chẩn đoán chính xác các kiểu gen này là rất cần thiết để có phương pháp điều trị hiệu quả.

1.2. Tình hình nhiễm HPV tại Việt Nam và trên thế giới

Tỷ lệ nhiễm HPV trên toàn cầu ước tính khoảng 11,7%, với các khu vực như Châu Phi và Đông Âu có tỷ lệ cao hơn. Tại Việt Nam, nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhiễm HPV ở phụ nữ có thể lên đến 19,79%, với tỷ lệ nhiễm các kiểu gen nguy cơ cao chiếm ưu thế.

II. Vấn đề và thách thức trong chẩn đoán HPV

Mặc dù có nhiều phương pháp chẩn đoán HPV, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc phát hiện chính xác các kiểu gen nguy cơ cao và thấp. Các phương pháp hiện tại thường tốn kém và không hiệu quả trong việc phát hiện đồng thời nhiều kiểu gen.

2.1. Những hạn chế của các phương pháp chẩn đoán hiện tại

Các phương pháp như xét nghiệm ELISA và PCR truyền thống thường không đủ nhạy và đặc hiệu để phát hiện đồng thời nhiều kiểu gen HPV. Điều này dẫn đến việc chẩn đoán không chính xác và tốn kém cho bệnh nhân.

2.2. Nhu cầu cấp thiết về bộ kit chẩn đoán mới

Việc phát triển bộ kit chẩn đoán HPV nguy cơ cao và thấp bằng kỹ thuật realtime PCR là cần thiết để đáp ứng nhu cầu chẩn đoán chính xác và nhanh chóng, giúp cải thiện hiệu quả điều trị.

III. Phương pháp phát triển kit chẩn đoán HPV bằng realtime PCR

Kỹ thuật realtime PCR là một trong những phương pháp tiên tiến nhất hiện nay trong việc phát hiện virus HPV. Phương pháp này cho phép phát hiện đồng thời nhiều kiểu gen HPV trong một mẫu bệnh phẩm.

3.1. Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật realtime PCR

Realtime PCR sử dụng các mồi và đầu dò huỳnh quang để phát hiện sự hiện diện của DNA virus trong mẫu bệnh phẩm. Kỹ thuật này cho phép theo dõi quá trình khuếch đại DNA theo thời gian thực, từ đó xác định chính xác số lượng virus có trong mẫu.

3.2. Quy trình phát triển bộ kit chẩn đoán

Quy trình phát triển bộ kit bao gồm việc thiết kế mồi và đầu dò đặc hiệu cho các kiểu gen HPV, tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR và đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của kit chẩn đoán HPV

Kết quả nghiên cứu cho thấy bộ kit chẩn đoán HPV phát triển có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép phát hiện đồng thời nhiều kiểu gen nguy cơ cao và thấp. Điều này mở ra cơ hội mới trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh.

4.1. Đánh giá hiệu quả của bộ kit chẩn đoán

Bộ kit mới phát triển đã được thử nghiệm trên nhiều mẫu bệnh phẩm và cho kết quả chính xác, giúp phát hiện sớm các trường hợp nhiễm HPV nguy cơ cao.

4.2. Ứng dụng trong thực tiễn lâm sàng

Bộ kit chẩn đoán HPV có thể được sử dụng rộng rãi trong các bệnh viện và phòng khám, giúp nâng cao chất lượng chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu HPV

Nghiên cứu phát triển bộ kit chẩn đoán HPV nguy cơ cao và thấp bằng kỹ thuật realtime PCR không chỉ giúp nâng cao khả năng phát hiện virus mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phòng ngừa và điều trị ung thư cổ tử cung.

5.1. Tầm quan trọng của việc phát triển công nghệ chẩn đoán mới

Công nghệ chẩn đoán mới sẽ giúp cải thiện khả năng phát hiện sớm các trường hợp nhiễm HPV, từ đó giảm thiểu tỷ lệ mắc ung thư cổ tử cung.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực HPV

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit, cũng như mở rộng khả năng phát hiện các kiểu gen HPV khác.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nhiễm Human Papillomavirus (HPV) qua đường tình dục là một trong những gánh nặng y tế cộng đồng hàng đầu trên phạm vi toàn cầu. Ước tính có khoảng 11,7% phụ nữ trên thế giới mang virus này, trong đó HPV là tác nhân trực tiếp dẫn tới hơn 610.000 ca ung thư mỗi năm, chiếm tới 86,9% tổng số trường hợp ung thư cổ tử cung ghi nhận được. Tại Việt Nam, các nghiên cứu dịch tễ học phụ khoa cho thấy tỷ lệ nhiễm HPV dao động từ 5,13% tại khu vực miền Bắc đến 19,97% tại khu vực phía Nam, với tỷ lệ đồng nhiễm từ 2 kiểu gen trở lên chiếm tới 40,31%. Đáng chú ý, các chủng nguy cơ cao chiếm khoảng 63,57% trong tổng số ca dương tính, trong khi các chủng nguy cơ thấp chiếm khoảng 15,89%.

Vấn đề cốt lõi hiện nay là các bộ sinh phẩm thương mại nhập ngoại thường tách biệt quy trình phát hiện chủng nguy cơ cao và nguy cơ thấp thành hai quy trình riêng, làm tăng gấp đôi chi phí và kéo dài thời gian xét nghiệm. Nhằm giải quyết rào cản này, luận văn tập trung vào mục tiêu nghiên cứu và chế tạo thành công bộ kit multiplex real-time PCR có khả năng phát hiện đồng thời 16 kiểu gen HPV phổ biến (gồm 14 chủng nguy cơ cao và 2 chủng nguy cơ thấp) chỉ trong 2 ống phản ứng. Nghiên cứu được triển khai trong giai đoạn 2017 - 2018 tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên kết hợp với Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh. Thành công của đề tài mang lại ý nghĩa to lớn trong việc tối ưu hóa chi phí xét nghiệm lâm sàng, rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống dưới 3 giờ và nâng cao năng lực sàng lọc sớm ung thư cổ tử cung tại các cơ sở y tế tuyến cơ sở.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng sinh học phân tử về cơ chế gây bệnh của họ virus Papillomaviridae với cấu trúc bộ gen ADN xoắn kép vòng kín dài khoảng 8.000 cặp base chứa 8 khung đọc mở. Quá trình sinh ung thư được giải thích qua cơ chế tương tác của hai oncoprotein chủ chốt là E6 và E7: protein E6 liên kết và thúc đẩy sự thoái biến của gen ức chế khối u p53, trong khi protein E7 liên kết với protein pRb nhằm giải phóng yếu tố phiên mã E2F, với ái lực của nhóm nguy cơ cao mạnh gấp 10 lần so với nhóm nguy cơ thấp.

Về mặt phân loại học, virus được phân thành nhóm nguy cơ cao (High-risk HPV gồm các type 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68) có khả năng tích hợp vào hệ gen người gây loạn sản biểu mô, và nhóm nguy cơ thấp (Low-risk HPV gồm các type 6, 11) gây sùi mào gà sinh dục và u nhú thanh quản. Cơ sở kỹ thuật của nghiên cứu dựa trên phản ứng multiplex real-time PCR cải tiến sử dụng đầu dò TaqMan gắn chất dập huỳnh quang nội tại ZEN dye tại vị trí nucleotide thứ 9, giúp dập tắt huỳnh quang nền và tăng mạnh tỷ số tín hiệu.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thiết kế mồi và đầu dò được trích xuất từ cơ sở dữ liệu NCBI với 14 trình tự tham chiếu chuẩn, tối ưu hóa qua phần mềm chuyên dụng để chọn lọc các vùng bảo tồn trên gen L1, E1, E6 và E7. Hệ thống nội chuẩn sử dụng cặp mồi và đầu dò khuếch đại gen beta-actin người với kích thước 107 cặp base nhằm kiểm soát chất lượng tách chiết ADN.

Nghiên cứu sử dụng phương pháp tạo dòng phân tử TA cloning đưa các đoạn gen đích vào vector pTOP TA V2 trên tế bào E. coli XL10-Gold để thiết lập hệ thống chuẩn dương kiểm soát nồng độ từ 10 bản sao đến 100.000 bản sao trên mỗi microlit. Cỡ mẫu đánh giá độ tương đồng bao gồm 50 mẫu ADN tham chiếu (20 mẫu âm tính, 25 mẫu nguy cơ cao và 5 mẫu nguy cơ thấp) đối chiếu trực tiếp với các bộ kit đạt chuẩn thương mại quốc tế như Cobas HPV Test của hãng Roche và sinh phẩm của hãng Sacace. Thử nghiệm lâm sàng thực địa được thực hiện trên 100 mẫu dịch phết cổ tử cung thu thập theo phương pháp chọn mẫu thuận tiện từ các phụ nữ trong độ tuổi 18 - 65 đến khám phụ khoa tại Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh từ năm 2017 đến năm 2018.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, nghiên cứu đã tối ưu hóa thành công cấu trúc 2 ống phản ứng đa mồi (Mix 1 và Mix 2) kết hợp 4 kênh màu huỳnh quang (FAM, HEX, Texas Red, Cy5). Ống Mix 1 phát hiện các kiểu gen 31, 39, 68, 51, 56, 66 trên kênh FAM; kiểu gen 6 trên kênh HEX; gen nội chuẩn beta-actin trên kênh Texas Red và kiểu gen 16 trên kênh Cy5. Ống Mix 2 phát hiện các kiểu gen 35, 45, 58, 59, 33, 52 trên kênh FAM; kiểu gen 11 trên kênh HEX; gen nội chuẩn trên kênh Texas Red và kiểu gen 18 trên kênh Cy5.

Thứ hai, ngưỡng phát hiện phân tích của kỹ thuật đạt độ nhạy cực cao, ghi nhận giới hạn phát hiện ở mức từ 10 bản sao đến 100 bản sao trong một phản ứng đối với tất cả 16 kiểu gen mục tiêu. Đường cong chuẩn biểu diễn tương quan tuyến tính giữa chu kỳ ngưỡng Ct và số lượng bản sao plasmid đạt hệ số xác định R² vượt trên 0,99.

Thứ ba, thử nghiệm kiểm tra tính đặc hiệu phân tích trên 9 tác nhân vi sinh vật gây bệnh đường sinh dục phổ biến (gồm E. coli, S. aureus, S. epidermidis, HSV 1-2, CMV, MTB, EBV, Mycoplasma hominis và Mycoplasma genitalium) ở nồng độ cao tương đương chu kỳ ngưỡng Ct dưới 32 đều cho kết quả âm tính hoàn toàn, chứng minh độ đặc hiệu đạt 100%.

Thứ tư, kết quả đánh giá đối chiếu trên 50 mẫu ADN tham chiếu cho thấy độ tương đồng tuyệt đối trên 95% khi so sánh với sinh phẩm Cobas HPV Test và bộ sinh phẩm của Sacace, với chỉ số thống kê Kappa đạt trên 0,90.

Thảo luận kết quả

Hiệu năng vượt trội của bộ kit mới được giải thích bởi việc cải tiến cấu trúc đầu dò TaqMan tích hợp phân tử ZEN dye giúp giảm thiểu tín hiệu huỳnh quang nền đáng kể, từ đó gia tăng độ nhạy phân tích gấp nhiều lần so với các hệ đầu dò truyền thống. Thiết kế phân bố 16 kiểu gen vào 2 ống phản ứng đã hạn chế tối đa hiện tượng cạnh tranh mồi và ức chế enzyme trong quá trình khuếch đại đa tác nhân.

So sánh với các nghiên cứu tiền nhiệm, kỹ thuật này vượt trội hơn phương pháp của Seaman khi phương pháp cũ có ngưỡng phát hiện chỉ ở mức 2.000.000 bản sao trên phản ứng, đồng thời tối ưu hơn rất nhiều so với thiết kế của Lee J.H cần tới 5 ống phản ứng hay thiết kế của Lindh M cần tới 15 phản ứng riêng biệt. Toàn bộ dữ liệu nghiên cứu được biểu diễn trực quan qua các biểu đồ khuếch đại huỳnh quang thời gian thực thể hiện động học chu kỳ nhiệt và bảng đối chiếu chéo 2x2 xác nhận độ tin cậy của phương pháp.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, hoàn thiện hồ sơ bảo hộ sở hữu trí tuệ cho Giải pháp hữu ích quy trình xét nghiệm và tiến hành đăng ký cấp phép lưu hành trang thiết bị y tế chẩn đoán in vitro (IVD) tại Bộ Y tế trong vòng 12 đến 18 tháng tới, do nhóm nghiên cứu phối hợp với doanh nghiệp khoa học công nghệ thực hiện.

Thứ hai, mở rộng nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng đa trung tâm với quy mô từ 500 đến 1.000 mẫu bệnh phẩm tại các bệnh viện chuyên khoa phụ sản và ung bướu trong giai đoạn 2019 - 2020 nhằm tái khẳng định độ nhạy lâm sàng trên 98% trên các quần thể dân cư đa dạng.

Thứ ba, triển khai ứng dụng bộ sinh phẩm vào chương trình mục tiêu y tế sàng lọc ung thư cổ tử cung định kỳ tại các Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tuyến tỉnh, hướng tới mục tiêu giảm từ 40% đến 50% chi phí xét nghiệm cho người dân so với việc sử dụng kit nhập ngoại.

Thứ tư, xây dựng chương trình tập huấn kỹ thuật thao tác sinh học phân tử chuẩn hóa trong thời gian 6 tháng cho đội ngũ kỹ thuật viên xét nghiệm tuyến cơ sở, nhằm đảm bảo quy trình kiểm soát chất lượng và triệt tiêu nguy cơ nhiễm chéo sản phẩm khuếch đại trong phòng thí nghiệm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nhóm 1: Các giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên cao học thuộc chuyên ngành Vi sinh vật học, Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học có thể khai thác quy trình thiết kế mồi, công nghệ đầu dò cải tiến và kỹ thuật TA cloning để phát triển các hệ thống chẩn đoán đa tác nhân khác.

Nhóm 2: Các bác sĩ chuyên khoa Sản phụ khoa và Ung bướu ứng dụng dữ liệu phân loại kiểu gen để xây dựng phác đồ theo dõi, phân tầng nguy cơ ung thư cổ tử cung và điều trị sớm các tổn thương sùi mào gà do HPV 6 và 11 gây ra.

Nhóm 3: Các chuyên gia nghiên cứu và phát triển sản phẩm (R&D) tại các công ty dược phẩm và sinh phẩm y tế tham khảo quy trình đóng gói hoàn chỉnh bộ kit 48 phản ứng phục vụ mục tiêu thương mại hóa sản phẩm chẩn đoán nội địa.

Nhóm 4: Các cán bộ quản lý y tế dự phòng và nhà hoạch định chính sách y tế sử dụng số liệu dịch tễ để xây dựng chiến lược tầm soát diện rộng và đánh giá hiệu lực bảo vệ của vaccine phòng ngừa HPV tại cộng đồng.

Câu hỏi thường gặp

Câu hỏi 1: Tại sao bộ kit cần tích hợp phát hiện đồng thời cả kiểu gen HPV nguy cơ cao và nguy cơ thấp trong cùng một quy trình?

Trả lời: Tỷ lệ đồng nhiễm giữa chủng nguy cơ cao và nguy cơ thấp trong thực tế chiếm khoảng 20,45% đến 40,31%. Bên cạnh đó, HPV 6 và 11 là nguyên nhân của hơn 90% ca sùi mào gà và u nhú đường hô hấp. Việc tích hợp đồng thời giúp chẩn đoán toàn diện, tiết kiệm một nửa chi phí và rút ngắn thời gian xét nghiệm cho bệnh nhân.

Câu hỏi 2: Cải tiến gắn phân tử ZEN dye vào đầu dò TaqMan mang lại ưu điểm kỹ thuật cụ thể nào?

Trả lời: Phân tử ZEN dye được gắn nội tại ở vị trí nucleotide thứ 9 tính từ đầu gắn huỳnh quang 5'. Cải tiến này giúp rút ngắn khoảng cách dập tắt tín hiệu nền khi đầu dò chưa bắt cặp với khuôn mẫu, làm giảm tín hiệu nhiễu huỳnh quang và nâng cao độ nhạy phát hiện của phản ứng lên mức từ 10 đến 100 bản sao.

Câu hỏi 3: Bộ sinh phẩm phân bố các kênh màu huỳnh quang trong 2 ống phản ứng như thế nào để tránh chồng lấn tín hiệu?

Trả lời: Hệ thống sử dụng 4 kênh màu riêng biệt cho mỗi ống phản ứng. Kênh FAM phát hiện các nhóm HPV nguy cơ cao phối hợp, kênh HEX dành riêng cho HPV 6 hoặc HPV 11, kênh Cy5 định danh chính xác HPV 16 hoặc HPV 18, và kênh Texas Red kiểm soát gen nội chuẩn beta-actin để thẩm định chất lượng mẫu bệnh phẩm.

Câu hỏi 4: Độ đặc hiệu phân tích của bộ kit đối với các tác nhân lây nhiễm đường sinh dục khác được chứng minh ra sao?

Trả lời: Độ đặc hiệu đạt 100% khi thử nghiệm đối chứng trên 9 chủng vi sinh vật thường gặp ở đường sinh dục như E. coli, S. aureus, HSV, CMV, EBV và Mycoplasma. Tất cả các mẫu đối chứng mang tải lượng vi sinh vật cao với giá trị chu kỳ ngưỡng dưới 32 đều không xuất hiện bất kỳ tín hiệu huỳnh quang dương tính giả nào.

Câu hỏi 5: Việc tạo dòng plasmid mang đoạn gen đích đóng vai trò gì trong việc kiểm soát chất lượng xét nghiệm?

Trả lời: Các plasmid tái tổ hợp sau khi tinh sạch và giải trình tự chuẩn xác được sử dụng làm mẫu đối chứng dương với nồng độ chuẩn hóa 5.000 bản sao trên microlit. Mẫu chứng dương này đảm bảo phản ứng khuếch đại diễn ra chính xác trên cả 4 kênh huỳnh quang và phục vụ dựng đường chuẩn định lượng nồng độ virus trong mẫu bệnh phẩm.

Kết luận

Thứ nhất, đề tài đã thiết kế và chế tạo thành công bộ kit multiplex real-time PCR hoàn chỉnh phát hiện đồng thời 16 kiểu gen HPV phổ biến chỉ trong 2 ống phản ứng master mix.

Thứ hai, công nghệ đầu dò cải tiến gắn ZEN dye giúp nâng cao độ nhạy phân tích vượt trội, đạt giới hạn phát hiện từ 10 đến 100 bản sao trên mỗi phản ứng với độ tuyến tính R² trên 0,99.

Thứ ba, độ đặc hiệu phân tích được khẳng định đạt 100%, hoàn toàn không xảy ra phản ứng chéo với 9 chủng vi sinh vật gây bệnh đường sinh dục thường gặp.

Thứ tư, độ tương đồng chẩn đoán của bộ kit đạt trên 95% và chỉ số tương đồng Kappa trên 0,90 khi đối chiếu trực tiếp với các sinh phẩm thương mại quốc tế đạt chuẩn IVD của Roche và Sacace.

Thứ năm, thử nghiệm lâm sàng thành công trên 100 mẫu bệnh phẩm thực địa tại Bắc Ninh khẳng định tính khả thi cao trong việc ứng dụng xét nghiệm sàng lọc cộng đồng.

Đóng góp lớn nhất của luận văn là tạo ra giải pháp công nghệ sinh học phân tử nội địa hóa có chất lượng tương đương sinh phẩm quốc tế nhưng giảm thiểu đáng kể giá thành xét nghiệm. Trong vòng 12 tháng tới, quy trình công nghệ cần tiếp tục được hoàn thiện hồ sơ cấp phép lưu hành chính thức và mở rộng thử nghiệm lâm sàng quy mô lớn. Các cơ sở y tế và đơn vị xét nghiệm hãy chủ động tiếp cận, ứng dụng kỹ thuật multiplex real-time PCR tiên tiến này nhằm nâng cao hiệu quả chẩn đoán sớm và bảo vệ sức khỏe phụ nữ trước nguy cơ ung thư cổ tử cung.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Human papillomavirus (HPV) là một trong những nguyên nhân gây bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục phổ biến nhất ở cả nam và phụ nữ trên thế giới và đƣợc cho là nguyên nhân gây bệnh do virus lây truyền phổ biến nhất ở Hoa Kỳ [20]. Hơn 200 kiểu gen HPV đã đƣợc xác định trên cơ sở dữ liệu trình tự ADN cho thấy sự khác biệt về gen. Dựa trên sự liên quan của chúng với ung thƣ và các tổn thƣơng tiền thân, HPV có thể đƣợc xếp vào các nhóm HPV nguy cơ gây ung thƣ cao (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 , 66, 68, 70) và HPV nguy cơ gây ung thƣ thấp (HPV 6, 11, 42, 43, 44) [20]. Một số bằng chứng về lâm sàng, dịch tễ học, phân tử và thực nghiệm đã thiết lập mối quan hệ bệnh học giữa một số kiểu gen HPV và ung thƣ trên thế giới.

Nhiễm HPV nguy cơ cao là kết quả gây nên các tổn thƣơng tiền ung thƣ làm tăng nguy cơ ung thƣ cổ tử cung, âm hộ, âm đạo, dƣơng vật, hậu môn, miệng hoặc cổ họng [9, 17, 18, 37, 44, 47]. Đồng thời, HPV còn là nguyên nhân của nhiều bệnh lý lâm sàng trên da và niêm mạc nhƣ hạt cơm, sùi mào gà sinh dục - hậu môn, u nhú thanh quản ở trẻ sơ sinh. Tỷ lệ nhiễm HPV toàn cầu ƣớc tính là 11,7%. Châu Phi (24%), Đông Âu (21,4%) và Mỹ Latin (16,1%) là những vùng tỷ lệ nhiễm cao nhất.

Đặc biệt, nhiễm HPV có một đỉnh đầu tiên ở độ tuổi trẻ hơn 25 tuổi [12]. Tại Việt Nam nghiên cứu của Cao Minh Nga và cộng sự (2011) trên phụ nữ đến khám có bệnh lý sinh dục nhƣng tế bào học bình thƣờng tại bệnh viện Đại học Y dƣợc thành phố Hồ Chí Minh trong độ tuổi từ 18 - 69 cho thấy tỷ lệ nhiễm HPV là 19,79%, tỷ lệ đồng nhiễm từ 2 type HPV trở lên 40,31%, tỷ lệ nhiễm các type HPV nguy cơ cao là 63,57%, 2 nhóm vừa nguy cơ cao và nguy cơ thấp là 20,54%, type nguy cơ thấp là 15,89% [1]. HPV đang tiếp tục là một chủ đề quan trọng vì tỷ lệ nhiễm virus tiếp tục tăng nhanh, tỷ lệ đồng nhiễm cao (20 - 30%) và nhiều ảnh hƣởng của virus đến sức khỏe con ngƣời mới đƣợc công bố. Tầm soát dự phòng HPV bằng vắc xin đã đƣợc triển khai tại nhiều quốc gia trên thế giới từ năm 2006.

Tháng 12/2014, vắc xin Gardasil 9 đã đƣợc FDA (Hoa Kỳ) phê chuẩn và cho phép lƣu hành để phòng ngừa các type HPV 6, 11, 16, 18, 31, 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Một số quốc gia (Mỹ, Hà Lan.) đã đƣa xét nghiệm HPV ADN là xét nghiệm tầm soát ung thƣ cổ tử cung định kỳ cho phụ nữ. Do đó, việc chẩn đoán phân biệt các type HPV có nguy cơ gây ung thƣ cao và nguy cơ gây ung thƣ thấp ngày càng trở nên cần thiết, giúp phân loại, điều trị, theo dõi ở những bệnh nhân bị nhiễm HPV, xác định vai trò của các type HPV trong các trƣờng hợp đồng nhiễm và đánh giá hiệu quả của vắc xin. Hiện nay, kỹ thuật sinh học phân tử là phƣơng pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao để phát hiện các kiểu gen của HPV trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng.

Ở trong nƣớc, chƣa có thông tin về nghiên cứu phát triển phƣơng pháp hay bộ kít phát hiện HPV nguy cơ thấp mà chỉ có thông tin về bộ kit phát hiện nguy cơ cao (Khoa Thƣơng). Một số hãng sinh phẩm của nƣớc ngoài (Sacace - Italy) có thể phát hiện các type HPV nguy cơ cao và thấp nhƣng thiết kế tách riêng thành hai bộ sinh phẩm dẫn tới việc chẩn đoán nhiễm các type HPV cho cùng một bệnh nhân sẽ tốn kinh phí, thời gian. Do đó, phát triển phƣơng pháp phát hiện đồng thời các kiểu gen nguy cơ cao và thấp là cần thiết. Xuất phát từ thực tiễn trên, luận văn “Nghiên cứu phát triển bộ kit phát hiện đồng thời các kiểu gen HPV nguy cơ gây ung thƣ bằng kỹ thuật multiplex real time PCR” đƣợc thực hiện với những mục tiêu sau: 1.

Nghiên cứu chế tạo bộ kit multiplex real time PCR phát hiện đồng thời 16 kiểu gen HPV có nguy cơ gây ung thƣ phổ biến (HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 và 68). Đánh giá sự tƣơng đồng của bộ kit mới chế tạo với bộ kit thƣơng mại. Thử nghiệm khả năng ứng dụng của kit phát hiện kiểu gen HPV trên mẫu bệnh nhân. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG 1.

Giới thiệu về HPV Papillomavirus là các thành viên trong họ Papillomaviridae, đƣợc tìm thấy trong rất nhiều loài động vật có vú trong đó có con ngƣời. Các loài vật chủ khác nhau sẽ nhiễm các loại Papillomavirus đặc thù cho loài đó. Các Papillomavirus gây bệnh cho ngƣời gọi là Human papillomavirus (HPV). Từ thời Hy Lạp cổ đại, tổn thƣơng u sùi (sùi mào gà) ở bộ phận sinh dục đã đƣợc mô tả giống nhƣ một quả dâu.

Cuối thế kỷ 19, một số tác giả đã mô tả biểu hiện tế bào học của tổn thƣơng hạt cơm ở da và các sùi mào gà là giống nhau. Sau đó ngƣời ta đã gây bệnh thực nghiệm ở trên da bằng cách cấy bệnh phẩm tổn thƣơng sùi mào gà ở qui đầu. Tình hình nhiễm HPV trên thế giới và ở Việt Nam 1. Tình hình nhiễm HPV trên thế giới Trên thế giới (2012), tỷ lệ nhiễm HPV ở phụ nữ có cổ tử cung bình thƣờng là 11 - 12%.

Tỷ lệ cao hơn ở vùng cận Sahara - Châu Phi (24%), Đông Âu (21%) và châu Mỹ Latinh (16%) [22]. Hai loại phổ biến nhất là HPV 16 (3,2%) và HPV 18 (1,4%). Sự gia tăng tỷ lệ bệnh ở phụ nữ có cổ tử cung bất thƣờng tƣơng ứng với mức độ nghiêm trọng của tổn thƣơng (90% ở phụ nữ ung thƣ cổ tử cung CIN3). Nhiễm HPV đã đƣợc xác định là nguyên nhân gây nên ung thƣ cổ tử cung, dƣơng vật, âm đạo, hậu môn và hầu họng.

Năm 2008, ƣớc tính trên thế giới có 12,7 triệu ung thƣ và khoảng 610.000 trong số đó do HPV gây nên [22]. Tỷ lệ này thay đổi đáng kể theo khu vực địa lý và mức độ phát triển kinh tế: 14,2% ở châu Phi cận Sahara và 15,5% ở Ấn Độ, so với 1,6% ở Bắc Mỹ và 1,2% ở Úc/New Zealand. Ung thƣ cổ tử cung đƣợc cho là 100% liên quan đến HPV, chiếm 530.000 trƣờng hợp (86,9%). Ung thƣ cổ tử cung là ung thƣ phổ biến thứ ba ở phụ nữ và có mối liên hệ chặt chẽ với mức độ phát triển kinh tế, tỷ lệ chênh lệch giữa các nƣớc phát triển và kém phát triển là 4 lần.

Ƣớc tính tỷ lệ dự đoán ung thƣ cổ tử cung vào năm 2030 cho thấy sự gia tăng 2%. Hàng năm, tỷ lệ mụn cóc sinh dục (do HPV 6,11) ở các 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] nƣớc phát triển dao động từ 0,1 - 0,2% dân số. Tỷ lệ cao nhất xảy ra ở tuổi vị thành viên và thanh thiếu niên.1: Tỷ lệ mắc ung thư cổ cung (theo độ tuổi/100.000 dân) trên thế giới [10] 1. Tình hình nhiễm HPV tại Việt Nam Tại Việt Nam, nghiên cứu của Phạm Thị Hoàng Anh và cộng sự (2003), trên 1246 phụ nữ ở Hà Nội và 1122 phụ nữ ở thành phố Hồ Chí Minh độ tuổi từ 15-69, bằng cách sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi GP5+/6+ cho thấy HPV ADN đã đƣợc phát hiện trong 10,9% phụ nữ ở thành phố Hồ Chí Minh và 2,0% ở Hà Nội.

Đỉnh HPV phát hiện ADN ở phụ nữ dƣới 25 tuổi đƣợc tìm thấy ở thành phố Hồ Chí Minh (22,3%) nhƣng không tìm thấy ở Hà Nội. Phụ nữ ở Hà Nội cho thấy tỷ lệ nhiễm HPV thấp nhất từng đƣợc báo cáo và tỷ lệ nhiễm HPV trong dân số dƣờng nhƣ tƣơng quan chặt chẽ với tỷ lệ mắc Ung thƣ cổ tử cung xâm lấn [34]. Nghiên cứu của Cao Minh Nga, Lục Thị Vân Bích và cộng sự (2009) trên phụ nữ có bệnh lý sinh dục nhƣng tế bào học bình thƣờng đến khám tại bệnh viện Đại học Y dƣợc thành phố Hồ Chí Minh trong độ tuổi từ 18-69 cho thấy, tỷ lệ nhiễm HPV là 19,97%, trong đó các type HPV nguy cơ cao chiếm 63,57%, các type nguy 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] cơ thấp 15,89%, nhiễm cả hai nhóm nguy cơ 20,45%, đồng nhiễm 2 loại HPV trở lên chiếm tỷ lệ khá cao 40,31% [1, 3]. Lê Trung Thọ và cộng sự (2008) nghiên cứu trên 1500 phụ nữ tuổi từ 18-69, sống tại quận Hoàng Mai và Đông Anh - Hà Nội, bằng kỹ thuật sinh học phân tử cho thấy tỷ lệ nhiễm HPV ở cộng đồng phụ nữ Hà Nội là 5,13%.

Cao ở nhóm tuổi 20-29 (18,47%). Các type HPV nguy cơ cao có tỷ lệ 68,95%, các type nguy cơ thấp chiếm 27,27%. Số ngƣời nhiễm 1 type chiếm 72,72%, số nhiễm 2 type chiếm 14,28%, số nhiễm 3 type trở lên rất ít gặp [2]. Phạm Thọ Dƣợc và cộng sự (2013) nghiên cứu trên 1072 phụ nữ tuổi sinh đẻ tỉnh Đắk Lắk bằng kỹ thuật lai phân tử cho kết quả tỷ lệ nhiễm HPV là 11,8%, ba kiểu gen phổ biến là HPV 16 (28,6%), HPV 18 (22,1%) và HPV 58 (15,6%) [4].

Đặc điểm về hình thái HPV HPV là một loại virus tƣơng đối nhỏ, không có vỏ bọc. Hạt virus có đƣờng kính 52 - 55nm, bao gồm một phân tử ADN sợi đôi có khoảng 8000 cặp base (bp) gắn với protein histone và chứa trong một vỏ capsid gồm 72 capsomer. Capsid chứa hai protein cấu trúc muộn: L1 (kích thƣớc 55 kDa, 80% tổng protein virus) và L2 (70 kDa) - cả hai đều đƣợc mã hóa bằng virus (protein này là thành phần kháng nguyên đƣợc sử dụng trong phản ứng miễn dịch đặc hiệu). Các hạt virus hoàn chỉnh (VLPs) có thể đƣợc tạo ra bởi sự biểu hiện của L1, một mình hoặc kết hợp với L2 [7, 26].

Hạt virus của HPV [13] 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Đặc điểm về hệ gen HPV 1. Cấu trúc hệ gen Cấu trúc hệ gen của nhóm Pappilomavirus nói chung tƣơng tự nhau, tất cả các khung đọc mở ORF (Open Reading Frame) của virus đều trên một chuỗi ADN, điều này có nghĩa là quá trình phiên mã chỉ xảy ra trên một mạch duy nhất. Hệ gen của HPV có 8 khung đọc mở ORF, có thể chia thành 3 vùng chức năng [5, 15].

Sơ đồ bộ gen HPV [40] Vùng mã hóa sớm (Early region) gồm 6 gen mã hóa, ký hiệu là E1, E2, E4, E5, E6, E7 và các khung đọc mở ORF tƣơng ứng.