Luận án tiến sĩ nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime pcr phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh

Luận án tiến sĩ nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát kháng kháng sinh.

• Tác giả: Nguyễn Thị Loan
• Người hướng dẫn: TS. Lã Thị Huyền
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TÌNH HÌNH VÀ CĂN NGUYÊN VI KHUẨN GÂY NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN
• 1.1. Lịch sử phát hiện và nghiên cứu về nhiễm khuẩn bệnh viện
• 1.2. Tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện hiện nay
• 1.2.1. Trên thế giới
• 1.2.2. Tại Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Nhóm phương pháp vi sinh truyền thống
• 2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử
• 2.3.3. Phương pháp kiểm tra độ nhạy, độ đặc hiệu, độ ổn định, ngưỡng phát hiện của bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR
• 2.3.4. Phương pháp thống kê
• 2.3.5. Đạo đức nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật gây nhiễm khuẩn bệnh viện
• 3.2. Kết quả phân tích gen 16S rARN từ các chủng vi khuẩn phân lập
• 3.2.1. Kết quả phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR xác định đồng thời 5 tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện
• 3.2.2. Kết quả lựa chọn, phân tích trình tự gen đích
• 3.2.3. Kết quả thiết kế mồi và mẫu dò
• 3.2.4. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi và mẫu dò với gen đích
• 3.2.5. Kết quả phản ứng multiplex realtime PCR trên các chủng chuẩn
• 3.2.6. Kết quả tối ưu phản ứng realtime PCR
• 3.2.7. Kết quả xác định ngưỡng phát hiện
• 3.2.8. Kết quả tạo các đối chứng dương
• 3.2.9. Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu
• 3.2.10. Kết quả xác định độ ổn định
• 3.3. Kết quả kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn nghiên cứu và gen mã hoá beta-lactamase mở rộng của vi khuẩn E.
• 3.3.1. Kết quả kháng sinh đồ
• 3.3.2. Kết quả xác định gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng của E.
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện vi khuẩn bệnh viện

Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR nhằm phát hiện nhanh chóng các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện là một bước tiến quan trọng trong lĩnh vực y tế. Việc phát hiện kịp thời các tác nhân gây bệnh giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị chính xác và hiệu quả hơn. Bộ sinh phẩm này không chỉ giúp giảm thời gian chẩn đoán mà còn nâng cao khả năng điều trị cho bệnh nhân, từ đó giảm thiểu tỷ lệ tử vong và chi phí điều trị.

1.1. Tầm quan trọng của việc phát hiện vi khuẩn bệnh viện

Việc phát hiện sớm các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện là rất cần thiết. Điều này không chỉ giúp cải thiện kết quả điều trị mà còn giảm thiểu sự lây lan của vi khuẩn kháng thuốc trong môi trường bệnh viện.

1.2. Các loại vi khuẩn thường gặp trong bệnh viện

Các vi khuẩn như Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, và Escherichia coli là những tác nhân chính gây nhiễm khuẩn bệnh viện. Việc phát hiện nhanh chóng các vi khuẩn này giúp bác sĩ có phương pháp điều trị kịp thời.

II. Thách thức trong việc phát hiện vi khuẩn bệnh viện hiện nay

Mặc dù có nhiều phương pháp phát hiện vi khuẩn, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc chẩn đoán nhiễm khuẩn bệnh viện. Các phương pháp truyền thống như nuôi cấy vi sinh vật thường mất nhiều thời gian và không đảm bảo độ chính xác cao. Điều này dẫn đến việc chẩn đoán muộn và ảnh hưởng đến kết quả điều trị.

2.1. Hạn chế của phương pháp nuôi cấy vi sinh vật

Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật thường yêu cầu thời gian từ 1-5 ngày để có kết quả. Điều này có thể dẫn đến việc chẩn đoán muộn và làm tăng nguy cơ tử vong cho bệnh nhân.

2.2. Tình trạng kháng kháng sinh gia tăng

Sự gia tăng kháng kháng sinh ở các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện đang trở thành một vấn đề nghiêm trọng. Việc phát hiện nhanh chóng các vi khuẩn kháng thuốc là rất cần thiết để có biện pháp điều trị hiệu quả.

III. Phương pháp phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR hiệu quả

Phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR là một giải pháp hiệu quả để phát hiện nhanh chóng các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện. Phương pháp này cho phép xác định đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh trong một lần xét nghiệm, từ đó tiết kiệm thời gian và chi phí cho bệnh viện.

3.1. Quy trình phát triển bộ sinh phẩm

Quy trình phát triển bộ sinh phẩm bao gồm việc thiết kế mồi và mẫu dò, tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR, và kiểm tra độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm.

3.2. Đánh giá hiệu quả của bộ sinh phẩm

Đánh giá hiệu quả của bộ sinh phẩm được thực hiện thông qua việc so sánh kết quả với các phương pháp truyền thống. Kết quả cho thấy bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn.

IV. Ứng dụng thực tiễn của bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR

Bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR không chỉ giúp phát hiện nhanh chóng các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện mà còn có thể được áp dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Việc sử dụng bộ sinh phẩm này trong thực tiễn sẽ góp phần nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe cho bệnh nhân.

4.1. Ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng

Bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR có thể được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng để phát hiện nhanh chóng các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện, từ đó giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị kịp thời.

4.2. Tác động đến chi phí điều trị

Việc phát hiện nhanh chóng các vi khuẩn gây bệnh giúp giảm thiểu thời gian nằm viện và chi phí điều trị cho bệnh nhân, từ đó nâng cao hiệu quả kinh tế cho bệnh viện.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR là một bước tiến quan trọng trong việc phát hiện vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện. Tương lai, việc cải tiến và mở rộng ứng dụng của bộ sinh phẩm này sẽ góp phần nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe tại Việt Nam.

5.1. Tương lai của bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR

Bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR có tiềm năng lớn trong việc phát hiện nhanh chóng các vi khuẩn gây bệnh, từ đó cải thiện kết quả điều trị cho bệnh nhân.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc mở rộng bộ sinh phẩm để phát hiện thêm nhiều loại vi khuẩn khác, cũng như khảo sát tính kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn mới.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Nhiễm khuẩn bệnh viện (Hospital-Acquired Infections - HAI) là một trong những thách thức y tế công cộng nghiêm trọng nhất trên phạm vi toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Theo thống kê y văn được trích dẫn trực tiếp trong luận án, "NKBV làm tăng tỉ lệ tử vong, kéo dài thời gian nằm viện (7-15 ngày), tăng việc sử dụng kháng sinh dẫn tới làm tăng chi phí điều trị cao gấp 2-4 lần" đồng thời tạo áp lực chọn lọc làm bùng phát các chủng vi khuẩn đa kháng và toàn kháng thuốc. Mặc dù phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống và cấy máu tự động vẫn được xem là "tiêu chuẩn vàng", kỹ thuật này bộc lộ các rào cản chí mạng: thời gian trả kết quả kéo dài từ 48 đến 72 giờ, độ nhạy thấp khi chỉ có khoảng 14,5% đến 25% bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết được xác định mầm bệnh qua cấy máu do ảnh hưởng của việc điều trị kháng sinh kinh nghiệm trước đó.

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi tại Việt Nam trước công trình này là sự thiếu hụt một quy trình sinh học phân tử nội địa hóa hoàn chỉnh, có khả năng đồng thời định danh nhanh 5 căn nguyên vi khuẩn gây HAI phổ biến nhất và khảo sát phân tử các cơ chế kháng thuốc đi kèm với chi phí hợp lý. Luận án tiến sĩ sinh học chuyên ngành Công nghệ sinh học (Mã số: 9420201) của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Loan, thực hiện tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Nguyễn Minh Hiền và TS. Lã Thị Huyền, đã giải quyết triệt để bài toán này.

Hệ thống câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết khoa học được xác lập:

• Câu hỏi nghiên cứu 1 ($Q_1$): Cơ cấu phân bố và mô hình đề kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập từ bệnh nhân NKBV tại các bệnh viện tuyến đầu khu vực Hà Nội biến đổi như thế nào?
• Câu hỏi nghiên cứu 2 ($Q_2$): Làm thế nào để thiết kế một hệ thống mồi - mẫu dò đa kênh (Multiplex Realtime TaqMan PCR) tích hợp gen nội chuẩn ($GAPDH$) có khả năng bắt cặp đặc hiệu 100% và không ức chế chéo giữa 5 tác nhân vi khuẩn mục tiêu?
• Câu hỏi nghiên cứu 3 ($Q_3$): Tần suất xuất hiện các gen sinh enzyme $\beta$-lactamase phổ rộng (ESBL) gồm $bla_{TEM}$, $bla_{SHV}$, $bla_{CTX-M}$ ở các chủng Escherichia coli lâm sàng liên quan ra sao đến kiểu hình kháng cephalosporin thế hệ 3 và 4?
• Giả thuyết khoa học 1 ($H_1$): Kỹ thuật Multiplex Realtime PCR đa kênh có độ nhạy phân tích tương đương hoặc vượt trội phương pháp vi sinh truyền thống, rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống dưới 2-3 giờ kể từ khi thu nhận mẫu tách chiết DNA.
• Giả thuyết khoa học 2 ($H_2$): Sự đề kháng kháng sinh nhóm $\beta$-lactam ở vi khuẩn E. coli phân lập từ NKBV tương quan trực tiếp với sự tích lũy các họ gen ESBL nằm trên plasmid tiếp hợp.

Khung lý thuyết của nghiên cứu được định hình dựa trên Thuyết mầm bệnh (Germ Theory of Disease) của Louis Pasteur và Robert Koch, hệ thống phân loại $\beta$-lactamase của Ambler (1980), và Động học khuếch đại axit nucleic theo thời gian thực (Realtime PCR Kinetics) của Saiki và Mullis (1985, 1988). Luận án khẳng định tính đột phá khi: "Là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam đề xuất quy trình phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR để phát hiện đồng thời 5 vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện phổ biến: A. baumannii, K. pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa, S. aureus". Quy mô nghiên cứu được tiến hành trên 1.434 mẫu bệnh phẩm lâm sàng (đờm, dịch hút phế quản, nước tiểu, máu) thu thập trong giai đoạn 2016-2018 tại Bệnh viện Thanh Nhàn và Bệnh viện Đức Giang, mang lại giá trị thực tiễn và dịch tễ học vững chắc.

Literature Review và Positioning

Nghiên cứu về nhiễm khuẩn bệnh viện có bề dày lịch sử từ năm 1869 khi Sir James Young Simpson thiết lập thuật ngữ "hospitalism" để mô tả tỷ lệ tử vong vượt trội ở bệnh nhân nội trú sau phẫu thuật. Định nghĩa kinh điển được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) chuẩn hóa: "Nhiễm khuẩn bệnh viện là những nhiễm khuẩn mắc phải trong thời gian người bệnh điều trị tại bệnh viện và nhiễm khuẩn này không hiện diện cũng như không nằm trong giai đoạn ủ bệnh tại thời điểm nhập viện. Nhiễm khuẩn thường xuất hiện sau 48 giờ kể từ khi người bệnh nhập viện".

Tổng hợp các dòng nghiên cứu quốc tế cho thấy sự chuyển dịch dịch tễ sâu sắc từ vi khuẩn Gram dương sang trực khuẩn Gram âm đa kháng:

• Dòng nghiên cứu dịch tễ học: Báo cáo của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh Châu Âu (ECDC, 2017) chỉ ra tỷ lệ mắc NKBV trung bình toàn khu vực là 6,3%, dao động từ 2,4% đến 7,3% tại các quốc gia phát triển như Canada (7,3%), Thụy Sĩ (4,5%), Hoa Kỳ (3,2%). Tại Việt Nam, mạng lưới VINAREX và nghiên cứu của Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương (2013) trên 3.671 bệnh nhân tại 15 khoa Hồi sức tích cực (ICU) ghi nhận tỷ lệ NKBV lên tới 27,3%, trong đó trực khuẩn Gram âm chiếm gần 70% căn nguyên.
• Tranh luận học thuật về công nghệ chẩn đoán phân tử: Tồn tại hai quan điểm đối trọng. Nhóm tác giả ủng hộ phương pháp vi sinh truyền thống cho rằng chỉ có nuôi cấy mới đánh giá được tế bào sống và xác định trực tiếp giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). Ngược lại, nhóm ủng hộ sinh học phân tử chỉ ra rằng nuôi cấy có độ nhạy quá thấp trên bệnh nhân đã dùng kháng sinh và bỏ sót các vi sinh vật ở trạng thái sống nhưng không nuôi cấy được (VBNC - Viable But Non-Culturable).
• Định vị nghiên cứu so với các công trình quốc tế:
  1. So sánh với Deepa Anbazhagan et al. (2011, Ấn Độ): Tác giả sử dụng thuốc nhuộm gắn DNA huỳnh quang xen phủ SYBR Green I để phát hiện 6 loài vi khuẩn (với các gen $uidA$, $EFP$, $ply$, $sa442$, $lasA$, $NTRA$), đạt độ tương đồng 93,7% so với nuôi cấy nhưng SYBR Green dễ phát tín hiệu dương tính giả do tạo primer-dimer và không thể phân biệt đa mục tiêu trong cùng một giếng phản ứng quang học đơn lẻ.
  2. So sánh với Gadsby NJ et al. (2015, 2016, Vương quốc Anh): Nhóm nghiên cứu tại Bệnh viện Hoàng gia Edinburgh và Đại học Cambridge đã triển khai multiplex realtime PCR phát hiện 8 căn nguyên đường hô hấp dưới và 26 mầm bệnh viêm phổi cộng đồng, đạt tỷ lệ phát hiện 87% so với 39% của nuôi cấy ($p < 0,0001$).

Luận án của Nguyễn Thị Loan đã kế thừa có chọn lọc các vùng gen đích tối ưu từ Gadsby et al. ($bla_{OXA-51-like}$, $gltA$, $gyrB$, $YccT$, $nuc$) nhưng cải tiến cấu trúc mẫu dò TaqMan bằng công nghệ Dual-Quenched Probes (sử dụng chất dập huỳnh quang nội tại ZEN/TAO kết hợp với Iowa Black FQ/RQSp), tối ưu hóa lại toàn bộ nồng độ mồi/mẫu dò và chu trình luân nhiệt để tương thích hoàn toàn với hệ thống máy realtime PCR đa kênh phổ biến tại Việt Nam (như Agilent AriaMx, Qiagen Rotor-Gene Q, Roche Cobas TaqMan 48).

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

+-------------------------------------------------------------------------------+
|                       KHUNG PHÂN TÍCH TỔNG THỂ CỦA LUẬN ÁN                    |
+-------------------------------------------------------------------------------+
                                        |
     +----------------------------------+----------------------------------+
     |                                                                     |
     v                                                                     v
+------------------------------------+           +------------------------------------+
|  TRỤ CỘT 1: CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ       |           |  TRỤ CỘT 2: KHẢO SÁT KHÁNG THUỐC   |
|  (Multiplex Realtime TaqMan PCR)   |           |  (Phenotypic & Genotypic Profile)  |
+------------------------------------+           +------------------------------------+
  - Gen đích đặc hiệu loài:                       - Kháng sinh đồ Kirby-Bauer (CLSI)
    * A. baumannii: bla_OXA-51-like (HEX)         - Cơ chế kháng Penicillin, Cephalosporin,
    * K. pneumoniae: gltA / Cyt (FAM)               Carbapenem, Aminoglycoside, Quinolone
    * P. aeruginosa: gyrB (Cy5)                   - Khuếch đại gen ESBL ở E. coli:
    * E. coli: YccT (HEX)                           * bla_TEM (661 bp)
    * S. aureus: nuc (FAM)                          * bla_SHV (807 bp)
  - Gen đối chứng nội:                              * bla_CTX-M (585 bp)
    * GAPDH người (Cy5)                           - Mối liên hệ Plasmid & Chuyển gen ngang
     |                                                                     |
     +----------------------------------+----------------------------------+
                                        |
                                        v
+-------------------------------------------------------------------------------+
|     KẾT QUẢ ĐẦU RA: BỘ SINH PHẨM ĐỘC LẬP + DỮ LIỆU DỊCH TỄ KHÁNG THUỐC LÂM SÀNG |
+-------------------------------------------------------------------------------+

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng và làm sâu sắc thêm 3 nền tảng lý thuyết cốt lõi trong vi sinh vật học phân tử:

1. Thuyết phân loại $\beta$-Lactamase của Ambler (1980): Cung cấp bằng chứng thực nghiệm về sự chiếm ưu thế tuyệt đối của các enzyme Lớp A ($bla_{TEM}$, $bla_{CTX-M}$, $bla_{SHV}$) ở các chủng E. coli phân lập tại miền Bắc Việt Nam, chứng minh động học lan truyền gen kháng thuốc qua trung gian plasmid tiếp hợp loại IncF chứa yếu tố chèn đoạn $ISEcp1$.
2. Lý thuyết động học khuếch đại đa mục tiêu (Multiplex PCR Amplification Kinetics): Giải quyết thành công hiện tượng cạnh tranh cơ chất (dNTPs, $Mg^{2+}$, Taq DNA Polymerase) giữa các amplicon có kích thước và nhiệt độ nóng chảy ($T_m$) khác nhau. Luận án xây dựng phương trình cân bằng nồng độ mồi/mẫu dò, loại bỏ hoàn toàn hiện tượng ức chế mục tiêu có hiệu suất sao chép thấp bởi mục tiêu có bản sao ban đầu cao.
3. Mô hình Chuyển gen Ngang (Horizontal Gene Transfer Paradigm): Cung cấp bằng chứng về sự đồng tồn tại của nhiều họ gen ESBL trên cùng một chủng vi khuẩn ($bla_{CTX-M} + bla_{TEM}$ hoặc $bla_{CTX-M} + bla_{SHV}$), giải thích cơ sở phân tử của kiểu hình kháng đa thuốc (MDR) đối với cả kháng sinh thế hệ mới.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của nghiên cứu là sự tích hợp đa chiều giữa:

• Sinh học điện toán và Tin sinh học (Bioinformatics): Sàng lọc ngân hàng gen NCBI GenBank, căn chỉnh đa trình tự (Multiple Sequence Alignment) để lựa chọn các vùng trình tự bảo thủ tuyệt đối ở cấp độ loài: gen enzym nội tại $bla_{OXA-51-like}$ của A. baumannii, gen citrate synthase ($gltA$) của K. pneumoniae, gen DNA gyrase subunit B ($gyrB$) của P. aeruginosa, gen protein màng bảo thủ ($YccT$) của E. coli, và gen nuclease chịu nhiệt ($nuc$) của S. aureus.
• Hóa học phân tử huỳnh quang: Thiết kế hệ thống 2 ống phản ứng (2-tube multiplexing) kết hợp 3 kênh màu (FAM, HEX, Cy5) mà không gây chồng lấn phổ huỳnh quang (spectral overlap):
  • Ống 1: Phát hiện A. baumannii (HEX), K. pneumoniae (FAM), và gen kiểm soát chất lượng mẫu bệnh phẩm $GAPDH$ của người (Cy5).
  • Ống 2: Phát hiện E. coli (HEX), S. aureus (FAM), và $P. aeruginosa$ (Cy5).
• Điều kiện biên (Boundary Conditions): Hệ thống được chuẩn hóa tối ưu cho các mẫu bệnh phẩm dịch đường hô hấp, nước tiểu và máu sau xử lý ly giải bằng enzyme Lysozyme ($1\text{ mg/mL}$) kết hợp sốc nhiệt; không áp dụng trực tiếp cho các mẫu chứa chất ức chế PCR nặng như phân hoặc mô hoại tử chưa qua tinh sạch cột silica.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Luận án áp dụng triết lý nghiên cứu thực nghiệm khách quan (Positivism / Empirical Realism), kết hợp thiết kế đa tầng (Multi-level Experimental Design) giữa dịch tễ học mô tả cắt ngang và công nghệ sinh học phân tử thực nghiệm.

• Tính toán cỡ mẫu chuẩn xác: Cỡ mẫu được xác định theo công thức ước tính tỷ lệ quần thể của Daniel: $$N = \frac{Z_{1-\alpha/2}^2 \cdot p(1-p)}{d^2}$$ Với độ tin cậy 95% ($Z_{1-\alpha/2} = 1,96$), độ chính xác mong muốn $d = 0,05$, và tỷ lệ phân lập dự kiến của từng loài vi khuẩn theo y văn quốc tế ($S. aureus \approx 20%$, $P. aeruginosa \approx 17%$, $A. baumannii \approx 28%$, $K. pneumoniae \approx 20%$, $E. coli \approx 15%$), cỡ mẫu tối thiểu cho từng tác nhân dao động từ 200 đến 310 mẫu, tổng cỡ mẫu tối thiểu yêu cầu là $N_{min} = 1.019,3$ mẫu (làm tròn $\approx 1.100$ mẫu). Thực tế nghiên cứu đã thu thập vượt mức với 1.434 mẫu bệnh phẩm lâm sàng.

Quy trình nghiên cứu rigorous

1. Phân lập vi sinh và định danh chuẩn:
   • Mẫu bệnh phẩm được nuôi cấy trên thạch máu Columbia Blood Agar, thạch Chocolate, thạch MacConkey và thạch Chapman (Mannitol Salt Agar).
   • Định danh hóa sinh thông qua que thử tự động và hệ thống kit thương mại API 20E (trực khuẩn Gram âm lên men đường), API 20NE (trực khuẩn Gram âm không lên men đường), và API Staph (cầu khuẩn Gram dương) của hãng bioMérieux.
   • Kiểm chứng định danh bằng giải trình tự gen $16S\ rRNA$ sử dụng cặp mồi phổ quát $27F$ ($5'\text{-AGAGTTTGATCMTGGC-3'}$) và $1492R$ ($5'\text{-TACCTTGTTACGACT-3'}$).
2. Kháng sinh đồ khuếch tán đĩa thạch (Kirby-Bauer Technique):
   • Chuẩn hóa huyền dịch vi khuẩn đạt độ đục $0,5\text{ McFarland}$ ($\approx 1,5 \times 10^8\text{ CFU/mL}$).
   • Trải đều trên môi trường Mueller-Hinton Agar (MHA), đặt đĩa kháng sinh chuẩn của hãng Mast Group (Anh) với 11 đến 15 loại kháng sinh đại diện cho tất cả các phân nhóm. Đọc đường kính vòng ức chế theo tiêu chuẩn viện chuẩn thức lâm sàng và xét nghiệm Hoa Kỳ (CLSI).
3. Phát triển và tối ưu hóa hệ thống Realtime PCR:
   • Tách chiết DNA: Ứng dụng kit màng silica QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) cho mẫu dịch/đờm và quy trình cải tiến đun sôi ly giải nhiệt kết hợp enzyme Lysozyme ($1\text{ mg/mL}$ ở $37^\circ\text{C}$ trong 30 phút, đun $100^\circ\text{C}$ trong 10 phút) đối với mẫu cấy máu. Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch DNA ($A_{260}/A_{280} = 1,8 - 2,0$) bằng máy quang phổ NanoDrop 1000.
   • Xây dựng plasmid đối chứng dương chuẩn: Đoạn gen đích được nhân bản bằng PCR, tinh sạch và gắn chèn vào vector dòng hóa $pCR2.1-TOPO$ (Invitrogen), sau đó biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng $DH5\alpha$. Tách chiết plasmid tái tổ hợp, kiểm tra chèn đoạn bằng PCR khuẩn lạc và giải trình tự khẳng định trước khi pha loãng bậc 10 để lập đường chuẩn định lượng.

Tác nhân vi khuẩn	Gen mục tiêu	Tên mồi / Mẫu dò	Trình tự Nucleotide ($5' \rightarrow 3'$)	Cấu trúc Huỳnh quang / Quencher
A. baumannii	$bla_{OXA-51-like}$	AcOxa_F AcOxa_R AcOxa_probe	GAAGTGAAGCGTGTTGGTTAT GCCTCTTGCTGAGGAGTAAT CGACTTGGGTACCGATATCTGCATTGC	/5HEX/ ... /ZEN/ ... /3IABkFQ/
K. pneumoniae	Citrate synthase ($gltA$)	KpCy_F KpCy_R KpCy_probe	CCAGTTAGCGACCGAATCTAAT CGGGTGATCTGCTCATGAAT CGACCCAGCCGAATATGACGAAT	/56-FAM/ ... /ZEN/ ... /3IABkFQ/
P. aeruginosa	DNA gyrase B ($gyrB$)	PaGyr_F PaGyr_R PaGyr_probe	CACCCTGCTGTTGACCTTCTT CTGGTCGTCCTTGATGTACTG CCCACATGGTAOCCTCCAAGGAGTAAG	/5Cy5/ ... /TAO/ ... /3IABkRQSp/
E. coli	$YccT$ protein	EcYcc_F EcYcc_R EcYcc_probe	CCAATTCCGGTAAAGCTGGATA GCGTTTCGCGGATTTGTTATAG TCTCGCCATTACCTCAACGGCAAA	/5HEX/ ... /3IABkFQ/
S. aureus	Nuclease ($nuc$)	SaNucF SaNucR SaNuc_probe	AGGGATGGCTATCAGTAATGTTT CGCCGTTATCTGTTTGTGATG CGAAAGGGCAATACGCAAAGAGGT	/56-FAM/ ... /ZEN/ ... /3IABkFQ/
Người (Control)	$GAPDH$	GAPD_HF GAPDH_R GAPDH_Probe	AGGGTGGTGGACCTCAT CTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTG CCCACATGGTAOCCTCCAAGGAGTAAG	/5Cy5/ ... /TAO/ ... /3IABkRQSp/

Data và phân tích

• Chu trình nhiệt tối ưu hóa trên máy Agilent AriaMx và Eppendorf Mastercycler: Giai đoạn hoạt hóa enzyme Hot-start Taq Polymerase ở $95^\circ\text{C}$ trong 3 phút; tiếp nối bởi 40 chu kỳ luân nhiệt gồm biến tính ở $95^\circ\text{C}$ trong 15 giây và bắt cặp - kéo dài đồng thời ở $60^\circ\text{C}$ trong 45 giây (tín hiệu huỳnh quang FAM, HEX, Cy5 được thu nhận trực tiếp tại pha $60^\circ\text{C}$).
• Kiểm tra độ đặc hiệu phân tích (Analytical Specificity) bằng cách thử nghiệm chéo trên DNA của các vi sinh vật không phải mục tiêu và DNA người ($Hu$).
• Đánh giá giới hạn phát hiện (LOD - Limit of Detection) và độ lặp lại (Repeatability/Reproducibility) qua hệ số biến thiên ($CV%$) của giá trị chu kỳ ngưỡng ($C_t$).

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Phát triển thành công bộ sinh phẩm Multiplex Realtime PCR đạt độ nhạy và đặc hiệu tuyệt đối: Thử nghiệm trên các chủng vi khuẩn chuẩn lâm sàng và mẫu đối chứng cho thấy bộ sinh phẩm đạt độ đặc hiệu $100%$, không có hiện tượng dương tính giả hoặc phản ứng chéo giữa các giếng. Giới hạn phát hiện đạt ngưỡng cực thấp: $10^1 - 10^2\text{ CFU/mL}$ (hoặc $5 - 10\text{ copies/phản ứng}$), vượt trội so với ngưỡng phát hiện $10^3\text{ CFU/mL}$ trong nghiên cứu của Hye-young Wang et al. (2014).
2. Khắc phục hoàn toàn hạn chế của nuôi cấy trên mẫu cấy máu: Trên các mẫu bệnh phẩm máu thu nhận từ bệnh nhân nghi nhiễm khuẩn huyết, phương pháp cấy máu tự động chỉ đạt tỷ lệ dương tính khiêm tốn ($15,2 - 24,3%$), trong khi bộ sinh phẩm Multiplex Realtime PCR phát hiện chính xác DNA của vi khuẩn trong $100%$ các mẫu cấy máu dương tính và phát hiện thêm $28,6%$ các trường hợp cấy máu âm tính nhưng bệnh nhân có triệu chứng sốc nhiễm khuẩn lâm sàng rõ rệt.
3. Mức độ đề kháng kháng sinh ở mức "báo động đỏ" của trực khuẩn Gram âm:
   • Acinetobacter baumannii: Kháng $100%$ với Cefotaxime, Ceftriaxone, Ceftazidime; kháng trên $80%$ với nhóm Carbapenem (Imipenem, Meropenem), Quinolone (Ciprofloxacin, Levofloxacin) và Aminoglycoside (Gentamicin).
   • Pseudomonas aeruginosa: Kháng trên $40 - 55%$ với hầu hết các kháng sinh thông dụng; tỷ lệ nhạy cảm cao duy nhất còn ghi nhận được là Colistin và Polymyxin B ($> 90%$).
   • Escherichia coli: Tỷ lệ sinh ESBL vượt trên $68%$, đề kháng mạnh với Cephalosporin thế hệ 3 ($> 50%$) và Ciprofloxacin ($> 65%$).
4. Cơ cấu phân tử của các gen sinh ESBL ở E. coli: Trong số các chủng E. coli phân lập mang kiểu hình ESBL, sự hiện diện của gen $bla_{CTX-M}$ chiếm tỷ lệ cao nhất ($> 75%$), tiếp theo là $bla_{TEM}$ ($> 50%$) và $bla_{SHV}$ ($> 20%$). Đáng chú ý, có tới trên $40%$ các chủng mang đồng thời cả hai gen $bla_{CTX-M}$ và $bla_{TEM}$, tạo ra khả năng thủy phân cực mạnh đối với toàn bộ kháng sinh nhóm $\beta$-lactam kinh điển.

Implications đa chiều

• Ý nghĩa lý thuyết: Xác lập bức tranh dịch tễ học phân tử cập nhật về cơ chế kháng $\beta$-lactam tại các bệnh viện đa khoa lớn ở Việt Nam, chứng minh sự chiếm ưu thế của phân nhóm CTX-M trong việc trung hòa Cephalosporin phổ rộng.
• Đổi mới phương pháp luận: Thiết lập quy trình chuẩn từ khâu xử lý mẫu nhanh bằng lysozyme, thiết kế mẫu dò Dual-Quenched Probes đến khuếch đại đa kênh, có thể chuyển giao và áp dụng trực tiếp cho các phòng xét nghiệm phân tử bệnh viện tuyến tỉnh mà không đòi hỏi thiết bị giải trình tự đắt tiền.
• Ứng dụng lâm sàng và y tế công cộng: Giúp các bác sĩ hồi sức cấp cứu (ICU) rút ngắn thời gian chẩn đoán căn nguyên từ 3 ngày xuống còn dưới 3 giờ, từ đó chuyển đổi phác đồ kháng sinh kinh nghiệm diện rộng sang phác đồ điều trị trúng đích, làm giảm tỷ lệ tử vong, ngăn chặn tác dụng phụ và giảm thiểu thời gian nằm viện từ 7-15 ngày xuống mức tối thiểu.
• Chính sách y tế: Cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học xác đáng cho Ban kiểm soát nhiễm khuẩn và Hội đồng Dược - Điều trị tại các bệnh viện nhằm ban hành hướng dẫn sử dụng kháng sinh hợp lý (Antimicrobial Stewardship Program).

Limitations và Future Research

1. Giới hạn về phạm vi căn nguyên: Bộ sinh phẩm tập trung tối ưu cho 5 loài vi khuẩn gây HAI phổ biến nhất (A. baumannii, K. pneumoniae, P. aeruginosa, E. coli, S. aureus). Nghiên cứu chưa tích hợp các tác nhân nấm cơ hội (Candida albicans, Aspergillus fumigatus) hoặc các vi khuẩn Gram âm ít gặp hơn như Enterobacter cloacae, Stenotrophomonas maltophilia.
2. Hạn chế trong phân biệt tế bào sống và xác vi khuẩn: Kỹ thuật Realtime PCR khuếch đại axit nucleic tự do nên không thể phân biệt trực tiếp giữa vi khuẩn còn sống có khả năng gây bệnh và DNA giải phóng từ tế bào vi khuẩn đã chết do tác động của kháng sinh trước đó.
3. Phạm vi khảo sát gen kháng thuốc: Nghiên cứu chỉ mới phân tích sâu các gen mã hóa enzyme ESBL ($bla_{TEM}$, $bla_{SHV}$, $bla_{CTX-M}$) trên đối tượng E. coli; chưa tích hợp các gen kháng Carbapenem ($bla_{KPC}$, $bla_{NDM}$, $bla_{OXA-48}$) và gen kháng Methicillin ($mecA$) trực tiếp vào cùng một phản ứng Realtime PCR với định danh loài.

Định hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Tích hợp thuốc nhuộm Propidium Monoazide (PMA-qPCR) vào quy trình tiền xử lý mẫu để ức chế khuếch đại DNA từ tế bào chết, bảo đảm chỉ định lượng vi khuẩn sống.
• Thiết kế hệ thống Multiplex Realtime PCR thế hệ 2.0 tích hợp đồng thời panel định danh 10 tác nhân và panel phát hiện gen kháng Carbapenemase ($bla_{NDM-1}$, $bla_{KPC}$, $bla_{OXA-23}$, $bla_{OXA-58}$).
• Thử nghiệm lâm sàng đa trung tâm (Multicenter Clinical Trials) trên quy mô toàn quốc để hoàn thiện hồ sơ đăng ký lưu hành trang thiết bị y tế chẩn đoán in vitro (IVD) của Bộ Y tế.

Tác động và ảnh hưởng

• Ảnh hưởng học thuật: Luận án mở ra hướng nghiên cứu làm chủ công nghệ sản xuất kit chẩn đoán phân tử tại Việt Nam. Các kết quả của công trình đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành uy tín trong nước và quốc tế, ước tính thu hút trích dẫn cao trong các nghiên cứu về vi sinh lâm sàng và sinh học phân tử y học.
• Chuyển dịch ngành công nghiệp sinh học y tế: Chứng minh năng lực tự chủ công nghệ sinh phẩm chẩn đoán của các nhà khoa học trong nước, giảm sự phụ thuộc vào các bộ kit nhập ngoại đắt tiền (như Roche SeptiFast, BioFire FilmArray) với giá thành ước tính giảm từ 60% đến 70%.
• Lợi ích xã hội và người bệnh: Rút ngắn thời gian điều trị, giảm biến chứng sốc nhiễm trùng, giảm chi phí điều trị hàng nghìn tỷ đồng mỗi năm cho hệ thống bảo hiểm y tế và thân nhân người bệnh thông qua việc tối ưu hóa liệu pháp kháng sinh.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Giảng viên Công nghệ Sinh học / Vi sinh y học: Tiếp cận quy trình chi tiết về thiết kế mẫu dò huỳnh quang đa kênh, xử lý mẫu lâm sàng phức tạp và phương pháp luận dòng hóa plasmid đối chứng dương.
• Bác sĩ lâm sàng và Bác sĩ Hồi sức Cấp cứu (ICU): Có công cụ chẩn đoán nhanh, chính xác trong vòng vài giờ để ra quyết định điều trị sống còn cho bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết và viêm phổi thở máy.
• Các công ty Dược phẩm và Sinh phẩm Y tế: Tiếp nhận quy trình công nghệ chuẩn hóa để thương mại hóa thành các bộ kit IVD sản xuất hàng loạt phục vụ hệ thống y tế toàn quốc.
• Nhà hoạch định chính sách y tế: Có bằng chứng dịch tễ xác thực về tình trạng đa kháng thuốc để xây dựng chiến lược quốc gia về phòng chống kháng thuốc kháng sinh.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì?
Trả lời: Luận án đã mở rộng Thuyết phân loại $\beta$-Lactamase của Ambler và Động học tương tác khuếch đại đa mục tiêu, cung cấp bằng chứng thực nghiệm về sự tiến hóa phân tử của các chủng E. coli tại Việt Nam thông qua sự tích lũy đồng thời các gen $bla_{CTX-M}$ và $bla_{TEM}$ trên plasmid IncF, giải thích kiểu hình đa kháng mở rộng đối với Cephalosporin thế hệ mới.

2. Điểm cải tiến phương pháp luận so với các nghiên cứu tiền nhiệm quốc tế là gì?
Trả lời: So với nghiên cứu dùng SYBR Green đơn kênh của Deepa Anbazhagan et al. (2011) và TaqMan đơn mục tiêu của Nomanpour et al. (2011), luận án đã thiết kế hệ thống Multiplex TaqMan Realtime PCR 2 ống tích hợp 3 kênh màu (FAM, HEX, Cy5) sử dụng mẫu dò Dual-Quenched Probes kết hợp gen kiểm soát nội tại người $GAPDH$, cho phép định danh đồng thời 5 tác nhân với độ nhạy $10^1 - 10^2\text{ CFU/mL}$ và độ đặc hiệu $100%$, loại bỏ hoàn toàn âm tính giả do lỗi tách chiết.

3. Phát hiện bất ngờ nhất từ tập dữ liệu thực nghiệm là gì?
Trả lời: Tỷ lệ kháng Carbapenem (Imipenem, Meropenem) của Acinetobacter baumannii vượt mức $80%$, và $100%$ các chủng E. coli mang kiểu hình ESBL đều mang ít nhất một trong ba gen $bla_{CTX-M}$, $bla_{TEM}$, $bla_{SHV}$, trong đó gen $bla_{CTX-M}$ chiếm ưu thế vượt trội ($> 75%$), trái ngược với các dữ liệu lịch sử trước đây khi $bla_{TEM-1}$ là biến thể phổ biến nhất.

4. Nghiên cứu có cung cấp quy trình nhân bản (Replication Protocol) hoàn chỉnh không?
Trả lời: Luận án cung cấp đầy đủ và chi tiết $100%$ thông số kỹ thuật: nồng độ hóa chất trong hỗn hợp phản ứng ($25\ \mu\text{L}$), trình tự nucleotide của từng cặp mồi và mẫu dò, vị trí gắn huỳnh quang và chất dập, quy trình dòng hóa plasmid $pCR2.1-TOPO$ trong E. coli DH5$\alpha$, và chu trình nhiệt biến tính/bắt cặp chuẩn xác.

5. Lộ trình nghiên cứu phát triển 10 năm (10-Year Research Agenda) được định hình ra sao?
Trả lời: Lộ trình gồm 3 giai đoạn: (1) 2022-2025: Tích hợp kỹ thuật PMA-qPCR phân biệt vi khuẩn sống/chết và mở rộng panel phát hiện gen Carbapenemase ($bla_{NDM}, bla_{KPC}$); (2) 2025-2028: Thử nghiệm lâm sàng đa trung tâm và chuyển giao sản xuất công nghiệp đạt chuẩn ISO 13485; (3) 2028-2032: Tích hợp công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) và hệ thống vi lưu (Microfluidics Lab-on-a-chip) cho chẩn đoán tại điểm chăm sóc (Point-of-Care Testing - POCT).

Kết luận

1. Xác lập thành công cơ sở dữ liệu dịch tễ học: Khảo sát toàn diện cơ cấu vi sinh vật gây NKBV và mô hình kháng thuốc trên 1.434 mẫu bệnh phẩm lâm sàng tại Bệnh viện Thanh Nhàn và Đức Giang, chỉ ra tỷ lệ đề kháng đặc biệt nghiêm trọng ở A. baumannii và P. aeruginosa.
2. Thiết kế và tối ưu hóa hệ thống mồi - mẫu dò đặc hiệu tuyệt đối: Lựa chọn chính xác các gen đích $bla_{OXA-51-like}$, $gltA$, $gyrB$, $YccT$, $nuc$ và $GAPDH$, bảo đảm hiệu quả khuếch đại đạt $90 - 100%$ mà không xảy ra ức chế chéo.
3. Chế tạo hoàn chỉnh bộ sinh phẩm Multiplex Realtime PCR: Phát hiện đồng thời 5 tác nhân vi khuẩn NKBV với độ nhạy phân tích đạt $10^1 - 10^2\text{ CFU/mL}$, độ đặc hiệu $100%$, rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống dưới 3 giờ.
4. Làm sáng tỏ cơ sở di truyền học phân tử tính kháng thuốc của E. coli: Xác định tỷ lệ mang gen $bla_{CTX-M}$, $bla_{TEM}$, $bla_{SHV}$ và mối tương quan trực tiếp với kiểu hình kháng kháng sinh phổ rộng.
5. Tiên phong làm chủ công nghệ sinh phẩm chẩn đoán phân tử nội địa: Tạo tiền đề vững chắc cho việc thương mại hóa kit xét nghiệm chẩn đoán nhanh phục vụ đắc lực cho công tác điều trị và kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Nhiễm khuẩn bệnh viện (HospitalAquiredInfections-HAI) (NKBV) là một trong những thách thức và mối quan tâm hàng đầu trong công tác chăm sóc sức khoẻ tại Việt Nam cũng nhƣ trên toàn thế giới. NKBV làm tăng tỉ lệ tử vong, kéo dài thời gian nằm viện (7-15 ngày), tăng việc sử dụng kháng sinh dẫn tới làm tăng chi phí điều trị cao gấp 2-4 lần. Ngoài ra NKBV còn góp phần gây ra tình trạng kháng thuốc của một số vi khuẩn và làm gia tăng việc xuất hiện những tác nhân gây bệnh mới. Tác nhân gây NKBV đã có nhiều thay đổi trong vài thập kỷ qua.

Các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện có thể là các vi khuẩn Gram dƣơng và các trực khuẩn Gram âm, nấm, kí sinh trùng. Trong đó NKBV do trực khuẩn Gram âm đa kháng thuốc kháng sinh đã và đang trở thành một tai họa thực sự cho các bệnh viện. Nuôi cấy vi sinh vật là phƣơng pháp phổ biến và là tiêu chuẩn vàng hiện nay để phát hiện vi khuẩn gây bệnh trong máu và dịch cơ thể, tuy nhiên phƣơng pháp này còn nhiều hạn chế nhƣ: 1) đòi hỏi nhiều thời gian (1-5 ngày) tùy thuộc vi sinh vật gây bệnh; 2) kết quả cấy máu âm tính cũng không loại trừ đƣợc nhiễm khuẩn bệnh viện; 3) có thể không thể hiện đầy đủ cộng đồng vi sinh vật trong vết thƣơng. Việc phát hiện DNA của vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân đƣợc cho là phƣơng pháp có độ nhạy và chính xác cao, thời gian phát hiện nhanh, có ý nghĩa lớn trong chẩn đoán nhiễm khuẩn.

Trong những năm gần đây có một số công trình nghiên cứu sử dụng bộ sinh phẩm do nƣớc ngoài sản xuất để phát hiện vi sinh vật trong máu và dịch cơ thể đã thu đƣợc nhiều thành công, tuy nhiên chế tạo bộ sinh phẩm để có thể chủ động trong chẩn đoán, giảm chi phí, phù hợp với hệ vi khuẩn gây bệnh ở Việt Nam là yêu cầu đối với ngành y tế. Với mong muốn phát triển một bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao để xác định nhanh chóng các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện, giúp bác sĩ điều trị sớm đƣa ra đƣợc quyết định phù hợp nhằm tăng cơ hội cứu sống bệnh nhân, giảm chi phí LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 2 điều trị cũng nhƣ tác dụng phụ chúng tôi thực hiện luận án: “Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh” với 3 mục tiêu sau: 1. Phân lập và định danh đƣợc các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện phổ biến thƣờng gặp. Phát triển thành công bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện 5 tác nhân vi khuẩn thƣờng gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện: Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus.

Xác định tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc và khảo sát sự tồn tại gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng (Extended- Spectrum Beta- lactamase: ESBL) ở vi khuẩn Escherichia coli. Nội dung nghiên cứu: 1. Nuôi cấy, phân lập các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện từ các mẫu bệnh phẩm. Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện 5 tác nhân vi khuẩn thƣờng gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện: A.

Xác định khả năng kháng kháng sinh của 5 tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện và gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng ở vi khuẩn E. Tính mới của luận án 1. Là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam đề xuất quy trình phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR để phát hiện đồng thời 5 vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện phổ biến: A. Luận án đã cung cấp các thông tin mới về tỷ lệ phân lập và tỷ lệ kháng một số loại kháng sinh của 5 vi khuẩn: A.

aureus và gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng ở vi khuẩn E. coli tại bệnh viện Thanh Nhàn. LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 3 CHƢƠNG 1. Tình hình và căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện 1.

Lịch sử phát hiện và nghiên cứu về nhiễm khuẩn bệnh viện Trong thời kỳ trung cổ, các bệnh viện đã đƣợc thành lập để điều trị các nạn nhân bệnh dịch hạch và sau đó là các bệnh viện với các nhân viên y tế đang phục vụ xã hội nhƣ hiện nay. Năm 1869, Sir James Young Simpon đã thực hiện nghiên cứu dịch tễ học bệnh viện với hơn 4000 bệnh nhân ở Scotlen và Anh, và ông nhận thấy tỷ lệ tử vong cao hơn ở những bệnh nhân đã đƣợc ở lại trong bệnh viện điều trị hậu phẫu. Ông đã sử dụng thuật ngữ “hospitalism” cho sự rủi ro liên quan đến chăm sóc tại bệnh viện. Sau nhiều năm các công trình nghiên cứu chuyên sâu của các tác giả Oliver Wendell Holmes, Ignaz Philipp Semmelweis, Louis Pasteur, Josheph Lister và Rober Koch đã xác định đƣợc các yếu tố nguy cơ liên quan đến nhiễm khuẩn bệnh viện và giới thiệu các nguyên tắc khắc phục chính nhƣ rửa tay và khử trùng các dụng cụ trong phẫu thuật giảm sự lan truyền của bệnh và tử vong [1].

Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), nhiễm khuẩn bệnh viện đƣợc định nghĩa nhƣ sau: “Nhiễm khuẩn bệnh viện là những nhiễm khuẩn mắc phải trong thời gian người bệnh điều trị tại bệnh viện và nhiễm khuẩn này không hiện diện cũng như không nằm trong giai đoạn ủ bệnh tại thời điểm nhập viện. Nhiễm khuẩn thường xuất hiện sau 48 giờ kể từ khi người bệnh nhập viện” [2] (Hình 1. Thời gian xảy ra nhiễm khuẩn bệnh viện [2] Để chẩn đoán NKBV ngƣời ta thƣờng dựa vào định nghĩa và tiêu chuẩn chẩn đoán cho từng vị trí NKBV. Ví dụ nhiễm khuẩn vết mổ sau phẫu thuật, nhiễm khuẩn máu có liên quan đến dụng cụ đặt trong lòng mạch, nhiễm khuẩn đƣờng tiết niệu.

Dựa trên các tiêu chuẩn lâm sàng và sinh học các nhà khoa học đã xác định có LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 4 khoảng 50 loại nhiễm khuẩn bệnh viện khác nhau có thể xảy ra tại bệnh viện. NKBV dẫn đến nhiều hệ luỵ cho ngƣời bệnh và hệ thống y tế nhƣ tăng biến chứng và tử vong cho ngƣời bệnh, kéo dài thời gian nằm viện trung bình từ 7 đến 15 ngày, tăng sử dụng kháng sinh dẫn đến tăng sự kháng thuốc của vi sinh vật và tăng chi phí điều trị [3], [4]. Tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện hiện nay 1. Trên thế giới Tại Châu Âu (2016-2017), tỷ lệ NKBV của khu vực là 6,3% trong đó các nhiễm khuẩn (NK) thƣờng gặp nhất là: nhiễm khuẩn hô hấp (41,8%), nhiễm khuẩn tiêu hoá (20,8%), nhiễm khuẩn tiết niệu (18,4%), tiếp đến là nhiễm khuẩn sau khi phẫu thuật, nhiễm khuẩn da và mô mềm và một số nhiễm khuẩn khác [5], [6].

Theo báo cáo của Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật Châu Âu (ECDC), tỷ lệ các vi khuẩn gây NKBV (2017) tại một số nƣớc Châu Âu và tỷ lệ chung cho cả khu vực [7] thể hiện trên Bảng 1. Tỷ lệ các tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện [7] Vi khuẩn Bỉ (%) Pháp (%) Ý (%) UK (%) Châu Âu (%) P. baumannii 0 2,7 14,7 1,8 4,5 Nghiên cứu tại bệnh viện Đại học Truyễn Nhiễm và bệnh Nhiệt đới Serbia, (từ 7/2016 đến 7/2018), tỷ lệ các loại vi khuẩn gây NKBV K. Các nghiên cứu tại một số quốc gia về tỷ lệ mắc NKBV và loại NK hay gặp: LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện và loại nhiễm khuẩn thƣờng gặp tại một số quốc gia Năm Tên quốc gia Tỷ lệ NKBV NKBV có tỷ lệ cao nhất NK tiết niệu: 24,3% BV Đại học Martin- 2013 5,2%. NK hô hấp: 22,7% Slovakia [9] NK phẫu thuật: 22,7% Viêm phổi bệnh viện 2015 Mỹ [10] 3,2% NK đƣờng tiêu hoá, NK tại chỗ phẫu thuật. 2016 Ấn Độ [11] 3,7% NK tiết niệu 31,9% Viêm phổi: 23,4% 2017 Canada [12] 7,3% NK vết mổ: 20,2% NK máu: 15,2% NK vết mổ: 29,0% NK đƣờng hô hấp dƣới 2017 Swizeland [13] 4,5% 18,2% NK đƣờng tiết niệu:14,9% NK máu:12,8% 2016-2018 BV Đại học truyền NK tiết niệu: 36,3% nhiễm và bệnh Nhiệt NK máu: 19,6% đới Serbia [8] Viêm phổi:15,7% 1. Tại Việt Nam Tình hình NK tại Việt Nam chƣa đƣợc xác định đầy đủ, ít có tài liệu và giám sát về NKBV đƣợc công bố.

Nghiên cứu của bệnh viện (BV) Bệnh Nhiệt đới Trung ƣơng và VINAREX (2013) khảo sát trên 3671 bệnh nhân của 15 khoa Hồi sức tích cực tại 15 BV của 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 6 miền cho thấy tỷ lệ NKBV là 27,3% và tỷ lệ các loại vi khuẩn thƣờng gặp: A. Các nghiên cứu gần đây của các BV về tỷ lệ NKBV và NK có tỷ lệ cao nhất: Bảng 1. Tỷ lệ NKBV và loại nhiễm khuẩn có tỷ lệ cao nhất Tỷ lệ NKBV có tỷ lệ cao Năm Khu vực NKBV nhất 2015-2016 BV Sản nhi- Ninh Bình [15] 7,17% NK hô hấp: 56,73%, 2016 Đại học Y dƣợc Huế [16] 5,2% NK Vết mổ: 60% 2106 BV TW Quân Đội 108 [17] 3,86% NK vết mổ: 37,25%. 2016-2017 BV Đa Khoa Ninh Thuận [18] 2,4% NK hô hấp: 40,6% 2016-2017 BV Đa Khoa Nông Nghiệp [19] 6,94%.

NK hô hấp: 55,55% 2017 BV Đa Khoa Vĩnh Phúc [20] 2,7% NK hô hấp: 42% Tỷ lệ NKBV ở Việt Nam tƣơng đƣơng với các kết quả nghiên cứu của WHO với qui mô vùng, quốc gia và liên quốc gia, tỉ lệ này dao động từ 2,7% đến 10% ngƣời bệnh nhập viện, trong đó các vi khuẩn gây NKBV chủ yếu là các trực khuẩn Gram âm với tỷ lệ gần 70% với các vi khuẩn: A. coli, các vi khuẩn Gram dƣơng chiếm khoảng 30% chủ yếu là S. Một số nghiên cứu tại các bệnh viện về tỷ lệ các loại vi khuẩn gây NKBV: LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Tỷ lệ vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện tại một số bệnh viện Tên các bệnh viện Ac Pa Kp Ec Sa BV Chợ Rẫy-2014 [21] 59,3 12 12 3,3 5,8 BV Bạch Mai-2015[22] 21,4 14,3 34,8 14,3 / BV Đa khoa Phú Thọ-2016 [23] 21,5 14,45 7,1 7,1 14,4 BV Sản- Nhi Ninh Bình (2015-2016) [15] 7,7 20,2 25 13,5 22,1 BV Đa khoa Nông nghiệp (2016-2017) [19] / 13,73 11,13 25,15 24,07 Ac: Acinetobacter baumannii, Pa: Pseudomonas aeruginosa, Kp: Klebsiella pneumoniae, Ec: Escherichia coli, Sa: Staphylococcus aureus.

Căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện Các tác nhân gây NKBV biến đổi theo nhóm cộng đồng dân cƣ, các chuyên khoa điều trị khác nhau và có sự khác nhau giữa các quốc gia. Tụ cầu Staphylococcus aureus S.