Luận án tiến sĩ nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime pcr phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh

Luận án tiến sĩ nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát kháng kháng sinh.

• Tác giả: Nguyễn Thị Loan
• Người hướng dẫn: TS. Lã Thị Huyền
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TÌNH HÌNH VÀ CĂN NGUYÊN VI KHUẨN GÂY NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN
• 1.1. Lịch sử phát hiện và nghiên cứu về nhiễm khuẩn bệnh viện
• 1.2. Tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện hiện nay
• 1.2.1. Trên thế giới
• 1.2.2. Tại Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Nhóm phương pháp vi sinh truyền thống
• 2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử
• 2.3.3. Phương pháp kiểm tra độ nhạy, độ đặc hiệu, độ ổn định, ngưỡng phát hiện của bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR
• 2.3.4. Phương pháp thống kê
• 2.3.5. Đạo đức nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật gây nhiễm khuẩn bệnh viện
• 3.2. Kết quả phân tích gen 16S rARN từ các chủng vi khuẩn phân lập
• 3.2.1. Kết quả phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR xác định đồng thời 5 tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện
• 3.2.2. Kết quả lựa chọn, phân tích trình tự gen đích
• 3.2.3. Kết quả thiết kế mồi và mẫu dò
• 3.2.4. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi và mẫu dò với gen đích
• 3.2.5. Kết quả phản ứng multiplex realtime PCR trên các chủng chuẩn
• 3.2.6. Kết quả tối ưu phản ứng realtime PCR
• 3.2.7. Kết quả xác định ngưỡng phát hiện
• 3.2.8. Kết quả tạo các đối chứng dương
• 3.2.9. Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu
• 3.2.10. Kết quả xác định độ ổn định
• 3.3. Kết quả kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn nghiên cứu và gen mã hoá beta-lactamase mở rộng của vi khuẩn E.
• 3.3.1. Kết quả kháng sinh đồ
• 3.3.2. Kết quả xác định gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng của E.
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện vi khuẩn bệnh viện

Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR nhằm phát hiện nhanh chóng các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện là một bước tiến quan trọng trong lĩnh vực y tế. Việc phát hiện kịp thời các tác nhân gây bệnh giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị chính xác và hiệu quả hơn. Bộ sinh phẩm này không chỉ giúp giảm thời gian chẩn đoán mà còn nâng cao khả năng điều trị cho bệnh nhân, từ đó giảm thiểu tỷ lệ tử vong và chi phí điều trị.

1.1. Tầm quan trọng của việc phát hiện vi khuẩn bệnh viện

Việc phát hiện sớm các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện là rất cần thiết. Điều này không chỉ giúp cải thiện kết quả điều trị mà còn giảm thiểu sự lây lan của vi khuẩn kháng thuốc trong môi trường bệnh viện.

1.2. Các loại vi khuẩn thường gặp trong bệnh viện

Các vi khuẩn như Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, và Escherichia coli là những tác nhân chính gây nhiễm khuẩn bệnh viện. Việc phát hiện nhanh chóng các vi khuẩn này giúp bác sĩ có phương pháp điều trị kịp thời.

II. Thách thức trong việc phát hiện vi khuẩn bệnh viện hiện nay

Mặc dù có nhiều phương pháp phát hiện vi khuẩn, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc chẩn đoán nhiễm khuẩn bệnh viện. Các phương pháp truyền thống như nuôi cấy vi sinh vật thường mất nhiều thời gian và không đảm bảo độ chính xác cao. Điều này dẫn đến việc chẩn đoán muộn và ảnh hưởng đến kết quả điều trị.

2.1. Hạn chế của phương pháp nuôi cấy vi sinh vật

Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật thường yêu cầu thời gian từ 1-5 ngày để có kết quả. Điều này có thể dẫn đến việc chẩn đoán muộn và làm tăng nguy cơ tử vong cho bệnh nhân.

2.2. Tình trạng kháng kháng sinh gia tăng

Sự gia tăng kháng kháng sinh ở các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện đang trở thành một vấn đề nghiêm trọng. Việc phát hiện nhanh chóng các vi khuẩn kháng thuốc là rất cần thiết để có biện pháp điều trị hiệu quả.

III. Phương pháp phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR hiệu quả

Phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR là một giải pháp hiệu quả để phát hiện nhanh chóng các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện. Phương pháp này cho phép xác định đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh trong một lần xét nghiệm, từ đó tiết kiệm thời gian và chi phí cho bệnh viện.

3.1. Quy trình phát triển bộ sinh phẩm

Quy trình phát triển bộ sinh phẩm bao gồm việc thiết kế mồi và mẫu dò, tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR, và kiểm tra độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm.

3.2. Đánh giá hiệu quả của bộ sinh phẩm

Đánh giá hiệu quả của bộ sinh phẩm được thực hiện thông qua việc so sánh kết quả với các phương pháp truyền thống. Kết quả cho thấy bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn.

IV. Ứng dụng thực tiễn của bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR

Bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR không chỉ giúp phát hiện nhanh chóng các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện mà còn có thể được áp dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Việc sử dụng bộ sinh phẩm này trong thực tiễn sẽ góp phần nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe cho bệnh nhân.

4.1. Ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng

Bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR có thể được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng để phát hiện nhanh chóng các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện, từ đó giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị kịp thời.

4.2. Tác động đến chi phí điều trị

Việc phát hiện nhanh chóng các vi khuẩn gây bệnh giúp giảm thiểu thời gian nằm viện và chi phí điều trị cho bệnh nhân, từ đó nâng cao hiệu quả kinh tế cho bệnh viện.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR là một bước tiến quan trọng trong việc phát hiện vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện. Tương lai, việc cải tiến và mở rộng ứng dụng của bộ sinh phẩm này sẽ góp phần nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe tại Việt Nam.

5.1. Tương lai của bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR

Bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR có tiềm năng lớn trong việc phát hiện nhanh chóng các vi khuẩn gây bệnh, từ đó cải thiện kết quả điều trị cho bệnh nhân.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc mở rộng bộ sinh phẩm để phát hiện thêm nhiều loại vi khuẩn khác, cũng như khảo sát tính kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn mới.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Nhiễm khuẩn bệnh viện (Hospital Acquired Infections – HAI) là thách thức hàng đầu trong công tác chăm sóc sức khoẻ tại Việt Nam và trên thế giới. Theo nội dung luận án, NKBV làm kéo dài thời gian nằm viện trung bình từ 7 đến 15 ngày, tăng chi phí điều trị gấp 2–4 lần, đồng thời thúc đẩy sự xuất hiện các tác nhân gây bệnh mới và tình trạng kháng thuốc. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật hiện là tiêu chuẩn vàng, nhưng có nhiều hạn chế: (1) đòi hỏi 1–5 ngày mới có kết quả; (2) kết quả âm tính không loại trừ được NKBV; (3) không phản ánh đầy đủ cộng đồng vi sinh vật trong vết thương. Kết quả xác định nguyên nhân gây nhiễm khuẩn huyết bằng cấy máu chỉ đạt từ 14,5% đến 25%. Trong khi đó, các bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR thương mại đang được sử dụng tại Việt Nam đều do nước ngoài sản xuất, chưa được tối ưu hoá cho hệ vi khuẩn gây bệnh đặc thù tại các bệnh viện trong nước và có chi phí cao. Khoảng trống này thúc đẩy nhu cầu phát triển một bộ sinh phẩm nội địa có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp với thực tiễn Việt Nam.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án đặt ra 3 mục tiêu:

1. Phân lập và định danh các chủng vi khuẩn gây NKBV phổ biến thường gặp.
2. Phát triển thành công bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện đồng thời 5 tác nhân vi khuẩn thường gặp gây NKBV: Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus.
3. Xác định tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được và khảo sát sự tồn tại gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng (Extended-Spectrum Beta-Lactamase – ESBL) ở vi khuẩn Escherichia coli.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng: 1.434 mẫu bệnh phẩm (đờm, dịch hút phế quản, nước tiểu, máu) của bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng mắc NKBV; 5 loài vi khuẩn mục tiêu nêu trên.
• Phạm vi không gian: Bệnh viện Thanh Nhàn và Bệnh viện Đức Giang, Hà Nội.
• Phạm vi thời gian: từ tháng 1 năm 2016 đến tháng 12 năm 2018.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước được tác giả điểm lại

Luận án điểm lại các hướng nghiên cứu quốc tế và trong nước có liên quan trực tiếp đến chủ đề.

Về ứng dụng multiplex realtime PCR phát hiện vi khuẩn gây NKBV:

• Kais M và cộng sự (2006) sử dụng realtime PCR để phát hiện và định lượng Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza và Moraxella catarrhalis trong mẫu bệnh phẩm viêm đường hô hấp dưới.
• Deepa Anbazhagan và cộng sự (2011) xây dựng hai phản ứng multiplex realtime PCR xác định 6 loài vi khuẩn gây NKBV, thử nghiệm trên 300 mẫu, đạt 93,7% so với phương pháp nuôi cấy. Các gen đích sử dụng: uidA (E. coli, 556 bp), EFP (Acinetobacter spp., 422 bp), ply (S. pneumoniae, 348 bp), sa442 (S. aureus, 179 bp), lasA (P. aeruginosa, 125 bp), NTRA (K. pneumoniae, 90 bp).
• Nomanpour B và cộng sự (Iran, 2011) sử dụng realtime Taqman PCR dựa trên trình tự blaOXA-51 để phát hiện trực tiếp A. baumannii từ 361 bệnh phẩm hô hấp. Kết quả: realtime PCR phát hiện được ít hơn 200 CFU vi khuẩn trong 1 mL mẫu vật, độ nhạy và độ đặc hiệu đạt 100%, tỷ lệ A. baumannii ở bệnh nhân viêm phổi là 10,53% (38/361).
• Reyes MP và cộng sự (Tây Ban Nha, 2013) dùng realtime PCR định lượng phát hiện nhanh tính kháng kháng sinh của A. baumannii qua gen ompA trên 48 mẫu bệnh phẩm, kết quả đạt 95,8%.
• Hye-young Wang và cộng sự (2014) dùng multiplex realtime PCR phát hiện S. aureus kháng methicillin từ mẫu nuôi cấy dương tính, với đầu dò TaqMan nhắm vào gen 16S rARN, gen nuc và gen mecA. Giới hạn phát hiện là 10³ CFU/mL. Kết quả trên 118 chủng phân lập và 350 mẫu nuôi cấy: gen 16S rRNA đạt 100% (166/166), gen nuc đạt 97,2% (35/36), gen mecA đạt 99,2% (117/118).
• Gadsby NJ và cộng sự (2015) phát triển hai thử nghiệm multiplex realtime PCR phát hiện 8 mầm bệnh vi khuẩn trong nhiễm trùng đường hô hấp dưới, sử dụng các gen đích: lytA (S. pneumoniae), fucK (H. influenzae), nuc (S. aureus), copB (M. catarrhalis), yccT (E. coli), gltA (K. pneumoniae), gyrB (P. aeruginosa), blaOXA-51-like (A. baumannii), và GAPDH làm đối chứng nội kiểm.
• Gadsby NJ và cộng sự (Edinburgh/Cambridge, 2016) áp dụng multiplex realtime PCR chẩn đoán vi sinh vật gây viêm phổi cộng đồng trên 323 bệnh nhân với 26 mầm bệnh khác nhau. Kết quả phát hiện được mầm bệnh trong 87% bệnh nhân, trong khi nuôi cấy chỉ đạt 39%; 78% vi khuẩn phát hiện bằng realtime nhưng chỉ 32% dương tính với nuôi cấy (P < 0,0001).

Về nghiên cứu trong nước:

• Phùng Thị Bích Thủy và cộng sự sử dụng bộ Kit realtime PCR đa mồi SeptiFast (Roche) chẩn đoán căn nguyên nhiễm trùng huyết ở trẻ em tại Bệnh viện Nhi Trung ương: realtime PCR phát hiện được 43,3% dương tính trong khi cấy máu truyền thống chỉ phát hiện được 3,3%.
• Nhóm nghiên cứu của PGS. Lê Hữu Song (Bệnh viện Trung ương Quân đội 108) trong khuôn khổ chương trình khoa học và công nghệ trọng điểm cấp Nhà nước giai đoạn 2011–2015 đã chế tạo bộ sinh phẩm xác định vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết với ngưỡng phát hiện 10 CFU/mL máu, độ đặc hiệu 100% sau 4 tháng bảo quản. Khi kết hợp với cấy máu, độ nhạy nâng lên 54%.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Chưa có công trình nào trong nước đề xuất quy trình phát triển hoàn chỉnh một bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện đồng thời đúng 5 vi khuẩn gây NKBV phổ biến nhất tại các bệnh viện Việt Nam (A. baumannii, K. pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa, S. aureus) trên cùng một phản ứng, kết hợp với đối chứng nội kiểm là DNA người (GAPDH). Luận án cũng bổ sung dữ liệu về tỷ lệ phân lập và kháng kháng sinh của 5 vi khuẩn này tại bệnh viện Thanh Nhàn.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Lý thuyết và khung kỹ thuật

Luận án dựa trên nguyên lý kỹ thuật khuếch đại DNA (PCR) được Karry Mullis phát minh năm 1985 và được Saiki và cộng sự phát triển, cùng nguyên lý realtime PCR với tín hiệu huỳnh quang phản ánh số lượng sản phẩm khuếch đại theo chu kỳ (giá trị Ct – threshold cycle). Phản ứng sử dụng công nghệ Taqman với mẫu dò đặc hiệu trình tự được đánh dấu huỳnh quang và chất hấp thụ (quencher). Bộ sinh phẩm nhắm vào các gen đặc hiệu loài có tính bảo thủ cao để phân biệt giữa các loài vi khuẩn.

Kháng sinh đồ được thực hiện theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Kirby-Bauer), đọc kết quả theo tiêu chuẩn của CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). Gen ESBL được xác định theo phân loại Ambler: lớp A gồm các gen SHV, TEM, CTX-M; lớp B: IMP, VIM, NDM-1; lớp C: AmpC, CMY, FOX, MO; lớp D: OXA.

Phương pháp nghiên cứu

Luận án áp dụng hướng định lượng kết hợp kỹ thuật sinh học phân tử:

Nhóm phương pháp vi sinh truyền thống:

• Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn trên các môi trường thạch máu Columbia, thạch chocolate; sử dụng máy cấy máu tự động BacT/ALERT 3D.
• Định danh vi khuẩn dựa vào hình thái, tính chất sinh hoá, sử dụng bộ định danh Api 20E, Api 20NE, Api Stap (hãng BioMerieux).
• Xác định tính kháng kháng sinh bằng phương pháp Kirby-Bauer trên môi trường Mueller Hinton agar, sử dụng khoanh giấy kháng sinh của hãng Mast (Anh), từ 11 đến 15 loại kháng sinh tuỳ loại vi khuẩn.

Nhóm phương pháp sinh học phân tử:

• Tách chiết DNA bằng bộ kit QIAampⓇ DNA Mini Kit của QIAgen (QIAamp DNA Blood Mini Kit cho máu; cho dịch và đờm hoặc trên máy tự động QIA cube). DNA từ mẫu cấy máu cũng được tách bằng phương pháp đun sôi với lysozyme 1 mg/mL.
• Xác định trình tự gen 16S rARN để định danh phân tử các chủng phân lập.
• Thiết kế mồi và mẫu dò bằng phần mềm Beacon Designer; mồi và mẫu dò được tổng hợp bởi hãng IDT.
• Phản ứng multiplex realtime PCR chạy trên hệ thống AriaMx Realtime PCR System (Agilent), Rotor-gene Q (QIAgen), hệ thống Cobas Taqman 48 (Roche) và các máy của hãng ABI.
• Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện và độ ổn định của bộ sinh phẩm.
• PCR thông thường và giải trình tự để xác định gen blaTEM, blaSHV, blaCTX-M ở E. coli.

Tính cỡ mẫu: Áp dụng công thức tính cỡ mẫu N = 1/(…) dựa trên tỷ lệ ước tính vi khuẩn gây NKBV theo nghiên cứu của S. Cairns và cộng sự (2008) — S. pneumoniae: 20%, P. aeruginosa: 17% — với độ chính xác d = 0,05, tính được N tổng = 1019,3. Cỡ mẫu tối thiểu áp dụng là 1.100 mẫu.

Nguồn dữ liệu

1.434 mẫu bệnh phẩm từ bệnh viện Thanh Nhàn và bệnh viện Đức Giang, Hà Nội (2016–2018); các chủng chuẩn quốc tế; DNA người (GAPDH) làm đối chứng nội kiểm.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương trình bày lịch sử phát hiện NKBV từ công trình của Sir James Young Simpson (1869) với hơn 4.000 bệnh nhân ở Scotland và Anh, tiếp nối là các đóng góp của Oliver Wendell Holmes, Ignaz Philipp Semmelweis, Louis Pasteur, Joseph Lister và Robert Koch về yếu tố nguy cơ và nguyên tắc kiểm soát nhiễm khuẩn. Tác giả tổng hợp định nghĩa NKBV của WHO (nhiễm khuẩn xuất hiện sau 48 giờ kể từ khi nhập viện), dịch tễ học NKBV tại châu Âu (tỷ lệ 6,3% theo báo cáo ECDC 2016–2017, nhiễm khuẩn hô hấp chiếm 41,8%, tiêu hoá 20,8%, tiết niệu 18,4%) và tại Việt Nam.

Dữ liệu Việt Nam được tổng hợp từ nhiều bệnh viện:

Năm	Cơ sở y tế	Tỷ lệ NKBV	NK có tỷ lệ cao nhất
2015–2016	BV Sản Nhi Ninh Bình	7,17%	NK hô hấp: 56,73%
2016	Đại học Y Dược Huế	5,2%	NK vết mổ: 60%
2016	BV TW Quân Đội 108	3,86%	NK vết mổ: 37,25%
2016–2017	BV Đa Khoa Ninh Thuận	2,4%	NK hô hấp: 40,6%
2016–2017	BV Đa Khoa Nông Nghiệp	6,94%	NK hô hấp: 55,55%
2017	BV Đa Khoa Vĩnh Phúc	2,7%	NK hô hấp: 42%

Tỷ lệ các loại vi khuẩn gây NKBV tại một số bệnh viện Việt Nam:

Bệnh viện	Ac (%)	Pa (%)	Kp (%)	Ec (%)	Sa (%)
BV Chợ Rẫy (2014)	59,3	12	12	3,3	5,8
BV Bạch Mai (2015)	21,4	14,3	34,8	14,3	/
BV Đa Khoa Phú Thọ (2016)	21,5	14,45	7,1	7,1	14,4
BV Sản Nhi Ninh Bình (2015–2016)	7,7	20,2	25	13,5	22,1
BV Đa Khoa Nông Nghiệp (2016–2017)	/	13,73	11,13	25,15	24,07

Ghi chú: Ac = A. baumannii, Pa = P. aeruginosa, Kp = K. pneumoniae, Ec = E. coli, Sa = S. aureus.

Chương cũng trình bày đặc điểm sinh học và cơ chế kháng kháng sinh của từng vi khuẩn mục tiêu, trong đó nêu rõ gen đặc hiệu được chọn làm mục tiêu PCR cho từng loài: blaOXA-51-like (A. baumannii), gltA (K. pneumoniae), gyrB (P. aeruginosa), yccT (E. coli), nuc (S. aureus) theo Gadsby NJ và cộng sự (2015, 2016). Tình hình kháng kháng sinh được phân tích chi tiết theo từng loài ở cả cấp độ toàn cầu và Việt Nam, trong đó dẫn số liệu từ báo cáo CDC Mỹ (2017): hơn 2,8 triệu ca nhiễm khuẩn kháng kháng sinh và hơn 35.000 người chết; tại EU: 25.000 ca tử vong, chi phí vượt trội lên tới 15.000 triệu euro.

---

Chương 2. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương mô tả chi tiết đối tượng nghiên cứu (1.434 mẫu bệnh phẩm), cách tính cỡ mẫu, toàn bộ nguyên vật liệu và các phương pháp. Tác giả trình bày trình tự chi tiết của 5 cặp mồi và mẫu dò cho phản ứng multiplex realtime PCR, bao gồm chất phát huỳnh quang gắn mỗi mẫu dò (HEX cho A. baumannii, FAM cho K. pneumoniae và S. aureus, Cy5 cho P. aeruginosa). Trình tự mồi 16S rARN và 3 cặp mồi cho gen ESBL (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M) cũng được liệt kê cụ thể. Chương mô tả quy trình tối ưu hoá phản ứng từng bước: từ singleplex đến multiplex, xác định hiệu quả phản ứng, tối ưu nồng độ thành phần phản ứng và chương trình luân nhiệt (biến tính 94–95°C/15–30 giây; bắt cặp và kéo dài 60°C/30–60 giây). Đạo đức nghiên cứu được đề cập như một phần độc lập.

---

Chương 3. Kết quả và thảo luận

Kết quả phân lập vi sinh vật gây NKBV

Từ 1.434 mẫu bệnh phẩm thu thập tại bệnh viện Thanh Nhàn và bệnh viện Đức Giang, tác giả thực hiện phân bố xét nghiệm theo loại bệnh phẩm (đờm, dịch hút phế quản, nước tiểu, máu) và xác định tỷ lệ cấy dương tính, tỷ lệ phân lập từng loại vi sinh vật theo từng loại bệnh phẩm. Kết quả phân tích gen 16S rARN từ các chủng phân lập được thực hiện để xác nhận định danh phân tử.

Kết quả phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR

Tác giả lần lượt trình bày từng bước phát triển bộ sinh phẩm:

• Lựa chọn và phân tích trình tự gen đích: Xác nhận 5 gen mục tiêu (blaOXA-51-like, gltA, gyrB, yccT, nuc) và đối chứng nội kiểm GAPDH của người.
• Thiết kế mồi và mẫu dò: Mồi được thiết kế với nhiệt độ Tm xấp xỉ 55–60°C; mẫu dò có Tm cao hơn mồi 5–10°C; tỷ lệ GC trong mẫu dò khoảng 30–80%.
• Kiểm tra độ đặc hiệu: Kiểm tra từng cặp mồi/mẫu dò riêng lẻ và trong hỗn hợp đa mồi với DNA đích của từng vi khuẩn, DNA không đích và DNA người. Các giá trị Ct của từng tổ hợp được ghi nhận và so sánh trong các bảng kết quả (Bảng 3.6 đến 3.10).
• Phản ứng trên các chủng chuẩn: Tối ưu hoá nhiệt độ và thành phần phản ứng; so sánh hai loại Master mix (IDT và HQ).
• Ngưỡng phát hiện: Xác định ngưỡng phát hiện qua các nồng độ pha loãng khác nhau, giá trị Ct ở từng nồng độ được ghi nhận trong Bảng 3.14.
• Đối chứng dương: Tạo đối chứng dương cho gen Cyt của K. pneumoniae bằng vector pCR2.1 biến nạp vào E. coli chủng DH5α.
• Độ nhạy, độ đặc hiệu: Đánh giá so sánh kết quả multiplex realtime PCR với phương pháp cấy máu theo từng loại mẫu bệnh phẩm (Bảng 3.15, 3.16).
• Độ ổn định: Khảo sát theo thời gian bảo quản, ghi nhận giá trị Ct ở các mốc thời gian bảo quản (Bảng 3.17).

Kết quả kháng sinh đồ và gen ESBL

Tỷ lệ kháng kháng sinh của từng loài vi khuẩn phân lập được trình bày qua kháng sinh đồ Kirby-Bauer:

Vi khuẩn	Bảng kết quả
P. aeruginosa và Acinetobacter sp.	Bảng 3.18
E. coli	Bảng 3.19
S. aureus	Bảng 3.20
5 chủng E. coli mang gen ESBL	Bảng 3.21

Kết quả xác định gen ESBL của E. coli: tác giả sử dụng PCR với các cặp mồi đặc hiệu để phát hiện gen blaTEM (661 bp), blaSHV (807 bp) và blaCTX-M (585 bp), điện di kiểm tra sản phẩm PCR. Tỷ lệ mang gen ESBL và tính nhạy cảm kháng sinh của 5 chủng E. coli ESBL dương tính được tổng hợp ở Bảng 3.21.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về lý luận và thực tiễn (theo tuyên bố của tác giả)

Luận án tự nêu 2 điểm đóng góp mới:

1. Là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam đề xuất quy trình phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR để phát hiện đồng thời 5 vi khuẩn gây NKBV phổ biến: A. baumannii, K. pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa và S. aureus.
2. Cung cấp thông tin mới về tỷ lệ phân lập và tỷ lệ kháng một số loại kháng sinh của 5 vi khuẩn nêu trên và gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng ở vi khuẩn E. coli tại bệnh viện Thanh Nhàn.

Kiến nghị và đề xuất

Luận án hướng đến mục tiêu thực tiễn là giúp bác sĩ điều trị sớm đưa ra quyết định phù hợp, tăng cơ hội cứu sống bệnh nhân, giảm thời gian nằm viện và chi phí điều trị. Việc xác định gen ESBL cụ thể (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M) của E. coli được xác định là quan trọng trong hướng dẫn lựa chọn kháng sinh điều trị phù hợp với từng bệnh nhân.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Luận án không dành một phần riêng để liệt kê hạn chế. Dựa trên phạm vi nghiên cứu được xác lập trong văn bản, có thể ghi nhận một số giới hạn: (1) địa điểm thu thập mẫu chỉ gồm hai bệnh viện tại Hà Nội (bệnh viện Thanh Nhàn và bệnh viện Đức Giang), không đại diện cho toàn bộ hệ thống bệnh viện Việt Nam; (2) khảo sát gen ESBL tập trung vào E. coli, chưa mở rộng sang các vi khuẩn mục tiêu còn lại; (3) bộ sinh phẩm chưa được đánh giá trên mẫu bệnh phẩm không qua nuôi cấy (phát hiện trực tiếp từ máu toàn phần) theo quy mô lớn. Hướng mở rộng tự nhiên là tối ưu hoá bộ sinh phẩm cho phát hiện trực tiếp từ mẫu lâm sàng, mở rộng phạm vi địa lý và bổ sung khảo sát gen kháng kháng sinh cho các loài còn lại.

---

Giá trị tham khảo

Luận án có giá trị tham khảo cho các nhóm đối tượng sau:

• Cán bộ nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ sinh học y tế và vi sinh lâm sàng: phần thiết kế quy trình phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR (Chương 2 và phần đầu Chương 3) cung cấp quy trình kỹ thuật chi tiết từng bước, từ lựa chọn gen đích đến tối ưu hoá phản ứng và đánh giá hiệu năng.
• Bác sĩ và kỹ thuật viên vi sinh tại các bệnh viện: dữ liệu kháng sinh đồ và tỷ lệ kháng kháng sinh của 5 vi khuẩn gây NKBV phân lập tại bệnh viện Thanh Nhàn cung cấp thông tin nền về thực trạng kháng thuốc tại bệnh viện tuyến tỉnh/thành phố ở miền Bắc Việt Nam.
• Nhà quản lý y tế và người làm chính sách kiểm soát nhiễm khuẩn: số liệu tổng hợp về tỷ lệ NKBV, tỷ lệ vi khuẩn theo loại bệnh phẩm và hệ vi khuẩn gây bệnh (Chương 1 và phần đầu Chương 3) phục vụ cho công tác giám sát và xây dựng hướng dẫn kiểm soát NKBV.
• Nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành công nghệ sinh học, vi sinh học: Chương 2 về phương pháp nghiên cứu cung cấp tài liệu thực hành kỹ thuật multiplex Taqman PCR, tách chiết DNA và kháng sinh đồ theo chuẩn CLSI.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR của luận án phát hiện đồng thời những vi khuẩn nào và sử dụng gen đích nào?

Bộ sinh phẩm phát hiện đồng thời 5 vi khuẩn: A. baumannii (gen blaOXA-51-like, mẫu dò HEX), K. pneumoniae (gen citrate synthase gltA, mẫu dò FAM), P. aeruginosa (gen DNA gyrase subunit B gyrB, mẫu dò Cy5), E. coli (gen yccT, mẫu dò HEX) và S. aureus (gen nuclease nuc, mẫu dò FAM). Đối chứng nội kiểm là gen GAPDH của người (mẫu dò Cy5).

2. Vì sao phương pháp cấy máu vẫn được giữ làm đối chứng thay vì bị thay thế hoàn toàn?

Luận án xác định cấy máu là tiêu chuẩn vàng hiện tại, nhưng chỉ xác định được nguyên nhân gây nhiễm khuẩn huyết ở 14,5%–25% bệnh nhân và cần 48–72 giờ. Bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR được phát triển như công cụ bổ sung, không thay thế hoàn toàn nuôi cấy; kết quả của bộ sinh phẩm được so sánh với kết quả cấy máu để đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu (Bảng 3.15, 3.16).

3. Kháng sinh đồ cho thấy tình trạng kháng thuốc của các vi khuẩn nghiên cứu ở mức độ nào?

Theo dữ liệu trong nước được tác giả dẫn: A. baumannii kháng 100% cefoperazole, gần 70% carbapenem, trên 80% ampicillin+sulbactam và piperacillin+tazobactam; E. coli kháng gần 50% ceftriaxone, ceftazidim, ampicillin+sulbactam, ciprofloxacin và levofloxacin; tỷ lệ MRSA đạt 53,49% trong một nghiên cứu tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương và Quân Y 103. Tỷ lệ ESBL của E. coli tại bệnh viện Quân đội Trung ương 108 tăng từ 26,86% (2015) lên 73,14% (2016).

4. Gen ESBL nào được khảo sát ở E. coli và phương pháp xác định như thế nào?

Ba gen được khảo sát: blaTEM (sản phẩm PCR 661 bp), blaSHV (807 bp) và blaCTX-M (585 bp) theo phân loại lớp A của Ambler. Phương pháp là PCR thông thường với các cặp mồi đặc hiệu (trình tự nêu tại Bảng 2.2), điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose. Kết quả tính nhạy cảm kháng sinh của 5 chủng E. coli mang gen ESBL dương tính được ghi nhận tại Bảng 3.21.

5. Cỡ mẫu nghiên cứu được tính như thế nào và thu thập trong bao lâu?

Cỡ mẫu được tính theo công thức dựa trên tỷ lệ ước tính S. pneumoniae 20% và P. aeruginosa 17% theo nghiên cứu của S. Cairns và cộng sự (2008), với độ chính xác d = 0,05. Kết quả tính được N tổng = 1.019,3, cỡ mẫu tối thiểu áp dụng là 1.100 mẫu. Trên thực tế, tác giả thu thập được 1.434 mẫu bệnh phẩm tại bệnh viện Thanh Nhàn và bệnh viện Đức Giang trong khoảng thời gian từ tháng 1 năm 2016 đến tháng 12 năm 2018, phương pháp chọn mẫu thuận tiện.

---

Kết luận

Luận án của Nguyễn Thị Loan (2022, Học viện Khoa học và Công nghệ – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) theo hướng định lượng thực nghiệm, thuộc chuyên ngành Công nghệ sinh học (mã số 9420201). Công trình tập trung vào ba nội dung liên kết: phân lập và định danh vi khuẩn gây NKBV, phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện đồng thời 5 tác nhân vi khuẩn trên một phản ứng duy nhất, và khảo sát kháng sinh đồ cùng gen ESBL của E. coli. Tác giả xác nhận đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam đề xuất quy trình phát triển bộ sinh phẩm loại này, đồng thời cung cấp dữ liệu mới về tỷ lệ phân lập và kháng kháng sinh của 5 vi khuẩn gây NKBV tại bệnh viện Thanh Nhàn. Toàn bộ dữ liệu kỹ thuật về trình tự mồi, mẫu dò, điều kiện phản ứng và đánh giá hiệu năng được trình bày chi tiết, tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về chuẩn hoá và mở rộng ứng dụng bộ sinh phẩm trong hệ thống bệnh viện Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Nhiễm khuẩn bệnh viện (HospitalAquiredInfections-HAI) (NKBV) là một trong những thách thức và mối quan tâm hàng đầu trong công tác chăm sóc sức khoẻ tại Việt Nam cũng nhƣ trên toàn thế giới. NKBV làm tăng tỉ lệ tử vong, kéo dài thời gian nằm viện (7-15 ngày), tăng việc sử dụng kháng sinh dẫn tới làm tăng chi phí điều trị cao gấp 2-4 lần. Ngoài ra NKBV còn góp phần gây ra tình trạng kháng thuốc của một số vi khuẩn và làm gia tăng việc xuất hiện những tác nhân gây bệnh mới. Tác nhân gây NKBV đã có nhiều thay đổi trong vài thập kỷ qua.

Các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện có thể là các vi khuẩn Gram dƣơng và các trực khuẩn Gram âm, nấm, kí sinh trùng. Trong đó NKBV do trực khuẩn Gram âm đa kháng thuốc kháng sinh đã và đang trở thành một tai họa thực sự cho các bệnh viện. Nuôi cấy vi sinh vật là phƣơng pháp phổ biến và là tiêu chuẩn vàng hiện nay để phát hiện vi khuẩn gây bệnh trong máu và dịch cơ thể, tuy nhiên phƣơng pháp này còn nhiều hạn chế nhƣ: 1) đòi hỏi nhiều thời gian (1-5 ngày) tùy thuộc vi sinh vật gây bệnh; 2) kết quả cấy máu âm tính cũng không loại trừ đƣợc nhiễm khuẩn bệnh viện; 3) có thể không thể hiện đầy đủ cộng đồng vi sinh vật trong vết thƣơng. Việc phát hiện DNA của vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân đƣợc cho là phƣơng pháp có độ nhạy và chính xác cao, thời gian phát hiện nhanh, có ý nghĩa lớn trong chẩn đoán nhiễm khuẩn.

Trong những năm gần đây có một số công trình nghiên cứu sử dụng bộ sinh phẩm do nƣớc ngoài sản xuất để phát hiện vi sinh vật trong máu và dịch cơ thể đã thu đƣợc nhiều thành công, tuy nhiên chế tạo bộ sinh phẩm để có thể chủ động trong chẩn đoán, giảm chi phí, phù hợp với hệ vi khuẩn gây bệnh ở Việt Nam là yêu cầu đối với ngành y tế. Với mong muốn phát triển một bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao để xác định nhanh chóng các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện, giúp bác sĩ điều trị sớm đƣa ra đƣợc quyết định phù hợp nhằm tăng cơ hội cứu sống bệnh nhân, giảm chi phí LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 2 điều trị cũng nhƣ tác dụng phụ chúng tôi thực hiện luận án: “Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh” với 3 mục tiêu sau: 1. Phân lập và định danh đƣợc các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện phổ biến thƣờng gặp. Phát triển thành công bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện 5 tác nhân vi khuẩn thƣờng gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện: Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus.

Xác định tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc và khảo sát sự tồn tại gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng (Extended- Spectrum Beta- lactamase: ESBL) ở vi khuẩn Escherichia coli. Nội dung nghiên cứu: 1. Nuôi cấy, phân lập các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện từ các mẫu bệnh phẩm. Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR phát hiện 5 tác nhân vi khuẩn thƣờng gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện: A.

Xác định khả năng kháng kháng sinh của 5 tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện và gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng ở vi khuẩn E. Tính mới của luận án 1. Là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam đề xuất quy trình phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR để phát hiện đồng thời 5 vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện phổ biến: A.