Tổng quan luận án

Ung thư biểu mô tế bào gan (UTTBG) đại diện cho hơn 90% các trường hợp ung thư gan nguyên phát và là một vấn đề sức khỏe cộng đồng lớn trên phạm vi toàn cầu. Theo số liệu thống kê được luận án ghi nhận từ Globocan 2018, tại Việt Nam, UTTBG là bệnh lý ung thư đứng hàng đầu về cả tỷ lệ mắc mới (với hơn 24.000 ca, chiếm 20,8% tổng số các loại ung thư) và tỷ lệ tử vong. Trong đó, trên 80% bệnh nhân UTTBG tại Việt Nam có liên quan trực tiếp đến tình trạng nhiễm vi rút viêm gan B (HBV).

Phần lớn bệnh nhân UTTBG ở nước ta được phát hiện khi bệnh đã tiến triển sang giai đoạn muộn, làm mất đi cơ hội can thiệp ngoại khoa cắt bỏ khối u hoặc áp dụng các biện pháp điều trị triệt căn. Việc phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm khi kích thước khối u còn nhỏ là yếu tố quyết định để nâng cao hiệu quả điều trị. Tuy nhiên, các phương pháp sàng lọc và chẩn đoán cận lâm sàng truyền thống bộc lộ những khoảng trống đáng kể:

  • Dấu ấn sinh học Alpha-fetoprotein (AFP) kinh điển có độ nhạy và độ đặc hiệu còn hạn chế; khoảng 40% bệnh nhân UTTBG có nồng độ AFP trong giới hạn bình thường (≤ 20 ng/ml).
  • Các dấu ấn bổ sung như AFP-L3 và Des-γ-carboxyprothrombin (DCP) khi sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp vẫn bỏ sót một tỷ lệ đáng kể bệnh nhân; ghi nhận có tới 23,21% trường hợp UTTBG hoàn toàn không biến đổi ở cả ba dấu ấn AFP, AFP-L3 và DCP.
  • Tại Việt Nam, trước thời điểm thực hiện luận án, chưa có công trình nghiên cứu hệ thống nào đánh giá mức độ biểu hiện của các microRNA (miRNA) lưu hành trong huyết tương—cụ thể là miR-21 và miR-122—ở nhóm bệnh nhân UTTBG có nhiễm HBV.

Trước yêu cầu thực tiễn đó, luận án tiến sĩ y học của nghiên cứu sinh Đặng Chiều Dương với đề tài "Nghiên cứu biểu hiện microRNA-21, microRNA-122 huyết tương ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan nhiễm vi rút viêm gan B" xác định 2 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Đánh giá mức độ biểu hiện microRNA-21, microRNA-122 huyết tương ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan nhiễm vi rút viêm gan B.
  2. Phân tích mối liên quan giữa microRNA-21, microRNA-122 huyết tương với một số chỉ số lâm sàng, cận lâm sàng và giai đoạn bệnh ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan nhiễm vi rút viêm gan B.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Gồm 3 nhóm đối tượng: (1) Bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan có nhiễm vi rút viêm gan B; (2) Bệnh nhân viêm gan B mạn tính (VGBM); (3) Nhóm người khỏe mạnh (NKM) được tuyển chọn từ những người hiến máu tình nguyện nhân đạo làm nhóm chứng.
  • Không gian thực hiện: Học viện Quân y (Bộ môn Nội tiêu hóa, Phòng Sau đại học) phối hợp với Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 (Khoa Sinh học phân tử, Khoa Nội tiêu hóa, Khoa A4 Viện Lâm sàng các bệnh nhiệt đới) và Bệnh viện Hữu Nghị Việt Tiệp (Hải Phòng).
  • Thời gian công bố: Luận án hoàn thành và bảo vệ năm 2020.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các tài liệu khoa học trong nước và quốc tế về dịch tễ học, căn nguyên vi rút, cơ chế bệnh sinh phân tử, các công cụ chẩn đoán và đặc tính sinh học của microRNA trong ung thư biểu mô tế bào gan:

1. Dịch tễ học và các yếu tố nguy cơ

  • Dịch tễ học toàn cầu: Trích dẫn các số liệu của El-Serag H. (2012) và các báo cáo dịch tễ học quốc tế, ghi nhận ung thư gan có tỷ lệ mắc cao thứ 5 đến thứ 6 và tỷ lệ tử vong đứng hàng thứ 2 đến thứ 4 trên thế giới (khoảng 810.000 ca tử vong/năm). Tỷ lệ mắc ở nam giới cao hơn nữ giới từ 2 đến 5 lần.
  • Dịch tễ học tại Việt Nam: Tác giả điểm lại số liệu của Mai Hồng Bàng (dẫn số liệu Bộ Y tế năm 1999), số liệu Hà Nội giai đoạn 1991–1993 (15,9/100.000 ở nam; 4,24/100.000 ở nữ), số liệu Bệnh viện Bình Dân và Trung tâm Ung bướu TP. Hồ Chí Minh giai đoạn 1995–2000 (3.061 ca UTTBG), cùng thống kê của Bệnh viện Trung ương Huế giai đoạn 2001–2004 (nam mắc thô 11,3/100.000, chuẩn tuổi 16,6/100.000).
  • Vai trò của HBV và các yếu tố nguy cơ khác: IARC (1994) xếp HBV là yếu tố nguy cơ hàng đầu (tăng nguy cơ mắc UTTBG từ 5 đến 103 lần). Người có kháng nguyên HBeAg dương tính có nguy cơ mắc bệnh tăng 60 lần (so với 10 lần ở người chỉ có HBsAg dương tính). Tải lượng HBV-DNA > $10^5$ bản sao/ml làm tăng nguy cơ mắc bệnh từ 2,5 đến 3 lần. Các yếu tố nguy cơ khác bao gồm HCV (tăng nguy cơ 15–20 lần), độc tố Aflatoxin B1 (gây đột biến codon 249 trên gen TP53), lạm dụng rượu, đái tháo đường, béo phì và gan nhiễm mỡ không do rượu.

2. Cơ chế bệnh sinh phân tử và biến đổi di truyền

  • Tác giả tổng hợp mô hình cơ chế bệnh sinh của Dhanasekaran R. và cộng sự (2016): Quá trình viêm mạn tính và xơ hóa dẫn tới hình thành nốt loạn sản và UTTBG. 80–90% UTTBG phát sinh trên nền gan xơ.
  • Vai trò của protein HBx (kích thước 154 acid amin) của HBV trong việc kích hoạt dòng thác tín hiệu nội bào, điều hòa DNA methyltransferase 3A/3B, tăng methyl hóa đảo SOCS-1CpG, tác động lên gen ATAD5 và gắn kết ức chế chức năng của protein ức chế khối u P53.
  • Các đột biến cấu trúc gen: Đột biến vùng khởi động TERT promoter (gặp ở 30–60% trường hợp UTTBG), đột biến gen TP53 (18–50%), cùng sự tích hợp DNA của HBV vào hệ gen vật chủ tại các vị trí gen như TERT, MLL4, CCNE1, Cyclin A2, ROCK1.
  • Biến đổi di truyền ngoại gen (epigenetics): Rối loạn methyl hóa DNA (methyl hóa GSTP1, E-cadherin) và biến đổi phân tử histone (H3K4me3, H3K27me3, tương tác HBx với phức hợp p300/CREB).
Yếu tố phân tử / Dấu ấn Tác giả / Nguồn trích dẫn Vai trò và đặc điểm ghi nhận trong luận án
Tải lượng HBV-DNA El-Serag H. (2012) Mức > $10^5$ bản sao/ml tăng 2,5–3 lần nguy cơ UTTBG sau 8–10 năm
Protein HBx Luận án tổng quan (2020) Điều hòa methyl hóa SOCS-1CpG, tác động ATAD5, ức chế P53
Đột biến TERT promoter Dhanasekaran R. và cs (2016) Xuất hiện ở 30–60% trường hợp UTTBG, kích hoạt telomerase
Đột biến gen TP53 Dhanasekaran R. và cs (2016) Tần số 18–50%, liên quan chặt chẽ với tiếp xúc Aflatoxin B1
AFP (> 500 ng/ml) Vũ Văn Khiên (2003) Độ nhạy 50%, độ đặc hiệu 100%, giá trị dự báo dương tính 100%
AFP-L3 Marrero J. và cs (2009) Độ đặc hiệu 97% nhưng độ nhạy chỉ đạt 28% ở giai đoạn BCLC 0/A
DCP (PIVKA II) Liebman và cs (1984) Tăng ở 67% BN UTTBG (> 300 ng/ml); nhạy 56% ở giai đoạn sớm
Phối hợp 3 dấu ấn Nghiên cứu tổng quan (2015) 159/685 BN (23,21%) không tăng bất kỳ dấu ấn nào trong AFP, AFP-L3, DCP

3. Sinh học microRNA và các nghiên cứu liên quan

  • Luận án điểm lại lịch sử phát hiện miRNA từ lin-4 của Ambros V. và cộng sự (1993), let-7 của Ruvkun (2000), thuật ngữ miRNA (Ruvkun, 2001) đến khi xác định 2.588 miRNA ở người vào năm 2014.
  • Hayes C. và cộng sự (2016): Mô tả chu trình sinh tổng hợp (pri-miRNA $\rightarrow$ pre-miRNA nhờ phức hợp Drosha/DGCR8 $\rightarrow$ vận chuyển qua màng nhân nhờ Exportin-5/RAN-GTP $\rightarrow$ cắt bởi Dicer trong bào tương $\rightarrow$ kết hợp vào phức hợp RISC gắn đầu 3' UTR hoặc 5' UTR của mRNA đích).
  • Đặc tính miRNA lưu hành trong tuần hoàn: Lawrie C. và cộng sự (2008) lần đầu phát hiện miRNA trong huyết thanh. MiRNA có tính bền vững cao trước enzym RNAse, điều kiện pH và nhiệt độ lưu trữ âm sâu; được giải phóng qua thể apoptotic, hoại tử tế bào hoặc thể ngoại bào (exosomes).
  • Liu A. và cộng sự chứng minh miR-21, miR-15b, miR-130b có nguồn gốc trực tiếp từ tế bào khối u gan. MiR-122 là miRNA chiếm ưu thế đặc hiệu tại mô gan.

Vị trí của luận án: Luận án giải quyết khoảng trống thực tiễn bằng cách thiết lập quy trình định lượng đồng thời miR-21 và miR-122 trong huyết tương bằng kỹ thuật RT-PCR định lượng trên bệnh nhân Việt Nam, đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, diện tích dưới đường cong (AUC) của từng miRNA đơn độc cũng như mô hình kết hợp giữa miR-21, miR-122 và AFP, tập trung làm rõ nhóm bệnh nhân có nồng độ AFP bình thường (≤ 20 ng/ml) và giai đoạn sớm (BCLC A).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

1. Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết sinh học phân tử về sự biểu hiện bất thường của các phân tử RNA không mã hóa nhỏ trong quá trình sinh ung thư tế bào gan dưới tác động của HBV. Phân tử miR-21 đóng vai trò như một oncomiR (thúc đẩy tăng sinh, ức chế apoptosis), trong khi miR-122 là phân tử đặc hiệu mô gan tham gia điều hòa chuyển hóa và ức chế khối u. Sự biến đổi nồng độ của hai miRNA này trong máu ngoại vi phản ánh tình trạng tổn thương mô gan và sự hiện diện của khối u ác tính.

2. Phương pháp nghiên cứu thực tế

  • Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang, có đối chứng, so sánh giữa nhóm bệnh lý (UTTBG nhiễm HBV, VGBM) và nhóm chứng người khỏe mạnh.
  • Tiêu chuẩn chẩn đoán UTTBG: Dựa trên hướng dẫn của Bộ Y tế Việt Nam, AASLD, EASL và APASL (kết hợp chẩn đoán hình ảnh cắt lớp vi tính đa dãy, cộng hưởng từ có tiêm thuốc đối quang từ, mô bệnh học/tế bào học và xét nghiệm AFP).
  • Phân loại giai đoạn và chức năng: Phân loại giai đoạn ung thư theo hệ thống BCLC (Barcelona Clinic Liver Cancer); đánh giá chức năng gan theo phân loại Child-Pugh; phân loại mức độ viêm mô học ở nhóm VGBM theo chỉ số mô học Knodell HAI (Histology Activity Index).

3. Quy trình kỹ thuật và phương tiện nghiên cứu

  • Tách chiết và bảo quản mẫu: Thu thập huyết tương từ máu ngoại vi chống đông bằng EDTA, ly tâm tách huyết tương và bảo quản ở nhiệt độ âm sâu.
  • Kỹ thuật Stem-loop RT-PCR định lượng:
    • Sử dụng mồi thân cuộn (stem-loop primer) thiết kế chuyên biệt cho miR-21 và miR-122 theo nguyên lý của Varkonyi-Gasic E. và cộng sự (2007). Mồi gắn đặc hiệu 6 nucleotide tại đầu 3' của trình tự đích.
    • Phản ứng tổng hợp chuỗi bổ sung cDNA bằng enzym phiên mã ngược thực hiện trên máy PCR 9700 (hãng Applied Biosystems).
    • Phản ứng Realtime PCR khuếch đại cDNA thực hiện trên hệ thống máy Realtime PCR 7500 (hãng Applied Biosystems), sử dụng chất huỳnh quang SYBR Green kết hợp mẫu dò UPL (Universal ProbeLibrary) nhằm tối ưu hóa độ nhạy và tính đặc hiệu ở mức nucleotid đơn.
  • Kỹ thuật cận lâm sàng khác: Định lượng AFP huyết thanh bằng phương pháp miễn dịch hóa phát quang/ELISA; xác định tải lượng HBV-DNA huyết thanh bằng kỹ thuật Realtime PCR; đánh giá hình ảnh u bằng siêu âm bụng, chụp cắt lớp vi tính (CLVT) 3 thì và cộng hưởng từ (CHT).

4. Xử lý số liệu và kiểm soát sai số

  • Xử lý số liệu y sinh học bằng các thuật toán thống kê y học: Phân tích đường cong đặc tính hoạt động máy thu (ROC), xác định diện tích dưới đường cong (AUC), khoảng tin cậy 95% (95% CI), độ nhạy, độ đặc hiệu tại các điểm cắt (cut-off) tối ưu.
  • Phân tích tương quan giữa mức độ biểu hiện miRNA với các chỉ số liên tục (tuổi, nồng độ enzym gan AST, ALT, tải lượng HBV-DNA) và biến phân loại (giới tính, số lượng u, kích thước u, huyết khối tĩnh mạch cửa, độ biệt hóa mô bệnh học, phân loại Child-Pugh và giai đoạn BCLC).
  • Kiểm soát sai số thông qua quy trình thao tác chuẩn (SOP), chạy mẫu lặp lại, sử dụng chứng âm và chứng dương trong toàn bộ các mẻ phản ứng PCR. Nghiên cứu tuân thủ đầy đủ các chuẩn mực đạo đức trong nghiên cứu y sinh học.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 tổng hợp toàn diện các cơ sở lý luận và bằng chứng thực nghiệm về UTTBG và miRNA:

  1. Dịch tễ học UTTBG: Phân tích thực trạng gia tăng tỷ lệ mắc và tử vong do UTTBG trên thế giới và tại Việt Nam. Trình bày số liệu dịch tễ phân bố theo giới, lứa tuổi và vùng địa lý, nhấn mạnh vai trò của nhiễm HBV mạn tính tại Việt Nam (>80% ca bệnh).
  2. Cơ chế bệnh sinh và vai trò của HBV: Phân tích chi tiết các biến đổi di truyền (đột biến TERT promoter, TP53, điểm đột biến promoter kép T1762/A1764) và biến đổi ngoại gen (methyl hóa DNA do protein HBx điều hòa, sửa đổi histone H3K4me3, H3K27me3).
  3. Các phương pháp chẩn đoán: Đánh giá ưu nhược điểm của các kỹ thuật chẩn đoán hình ảnh (siêu âm thường, siêu âm cản âm, CLVT 3 thì, CHT), phương pháp chọc hút tế bào kim nhỏ (nhuộm Giemsa), sinh thiết mô bệnh học (thể bè, thể ống tuyến, thể đảo, thể nhú, thể không điển hình) và các dấu ấn sinh học cổ điển (AFP, AFP-L3, DCP). So sánh các khuyến cáo chẩn đoán của AASLD, EASL, APASL và Bộ Y tế Việt Nam.
  4. Sinh học phân tử của MicroRNA: Trình bày cấu trúc, cơ chế sinh tổng hợp (từ pri-miRNA, pre-miRNA đến phức hợp RISC), cơ chế tác động làm câm gen mục tiêu (cắt phân tử mRNA, khử đuôi poly-A hoặc ức chế dịch mã) và độ bền vững của miRNA trong tuần hoàn máu. Phân tích nguyên lý kỹ thuật stem-loop RT-PCR trong phát hiện và định lượng miRNA.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày chi tiết quy trình tổ chức nghiên cứu thực nghiệm:

  1. Tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ:
    • Nhóm UTTBG: Bệnh nhân được chẩn đoán xác định UTTBG theo tiêu chuẩn của Bộ Y tế/quốc tế, có nhiễm HBV (HBsAg dương tính). Loại trừ các trường hợp đồng nhiễm HCV/HIV, ung thư biểu mô đường mật, hoặc ung thư di căn gan.
    • Nhóm VGBM: Bệnh nhân có HBsAg dương tính kéo dài trên 6 tháng, có tổn thương gan mạn tính nhưng không có khối u gan trên chẩn đoán hình ảnh.
    • Nhóm chứng (NKM): Người tình nguyện hiến máu nhân đạo khỏe mạnh, HBsAg âm tính, không có tiền sử bệnh gan và xét nghiệm chức năng gan bình thường.
  2. Phương tiện và hóa chất: Sử dụng hệ thống máy luân nhiệt GeneAmp PCR System 9700 và máy Realtime PCR 7500 của Applied Biosystems. Thiết kế các cặp mồi xuôi, mồi ngược và mồi stem-loop chuyên biệt cho miR-21 và miR-122.
  3. Thu thập chỉ tiêu nghiên cứu: Đầy đủ các chỉ tiêu lâm sàng (triệu chứng cơ năng, thực thể), cận lâm sàng huyết học, sinh hóa (AST, ALT, Bilirubin, Albumin), miễn dịch (AFP, HBsAg, HBeAg), tải lượng HBV-DNA, đặc điểm u trên CLVT/CHT/siêu âm (kích thước u, số lượng nốt u, tình trạng xâm lấn huyết khối tĩnh mạch cửa), mô bệnh học (độ biệt hóa cao, vừa, thấp) và phân loại giai đoạn bệnh theo hệ thống BCLC và Child-Pugh.
  4. Khâu xử lý thống kê và đạo đức y sinh: Trình bày các thuật toán tính giá trị Ct, biểu hiện tương đối của miRNA, xây dựng mô hình hồi quy đa biến và kiểm soát sai số thực nghiệm.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thu thập được từ thực nghiệm:

  1. Đặc điểm nhóm nghiên cứu: Phân tích cơ cấu phân bố tuổi, tỷ lệ giới tính (nam chiếm ưu thế), tần suất các triệu chứng lâm sàng và các biến đổi huyết học, sinh hóa ở nhóm UTTBG so với nhóm VGBM và NKM. Trình bày đặc điểm u gan (phần lớn u có kích thước > 3cm, số lượng u đơn độc hoặc nhiều ổ, tỷ lệ có huyết khối tĩnh mạch cửa và phân bố mức độ biệt hóa tế bào trên mô bệnh học).
  2. Biểu hiện miR-21 và miR-122 huyết tương:
    • Nồng độ miR-21 huyết tương ở nhóm UTTBG tăng cao rõ rệt so với nhóm VGBM và nhóm NKM.
    • Nồng độ miR-122 huyết tương có sự biến đổi khác biệt có ý nghĩa giữa các nhóm đối tượng nghiên cứu.
    • Đánh giá trên phân nhóm bệnh nhân UTTBG có nồng độ AFP bình thường (AFP ≤ 20 ng/ml): Biểu hiện của miR-21 và miR-122 vẫn duy trì sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng, chứng minh khả năng phát hiện ung thư ở nhóm không tăng AFP.
    • Đánh giá trên phân nhóm bệnh nhân UTTBG giai đoạn sớm (BCLC A): Nồng độ miR-21 và miR-122 phân định rõ ràng giữa nhóm bệnh nhân giai đoạn sớm với nhóm VGBM và NKM.
  3. Giá trị chẩn đoán qua phân tích đường cong ROC:
    • Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và diện tích dưới đường cong (AUC) của miR-21 đơn độc và miR-122 đơn độc trong việc phân biệt UTTBG với VGBM và NKM.
    • Mô hình phối hợp hai dấu ấn miR-21 và miR-122 làm tăng đáng kể giá trị AUC so với từng chỉ dấu đơn lẻ.
    • Mô hình kết hợp đồng thời miR-21, miR-122 với AFP đạt diện tích dưới đường cong (AUC) và độ nhạy chẩn đoán cao hơn vượt trội so với việc chỉ sử dụng AFP đơn độc trong chẩn đoán UTTBG nói chung và UTTBG giai đoạn sớm nói riêng.
  4. Mối liên quan giữa miR-21, miR-122 với các yếu tố lâm sàng và cận lâm sàng:
    • Phân tích tương quan giữa biểu hiện miRNA với tuổi, giới tính và triệu chứng lâm sàng.
    • Tương quan với các chỉ số men gan AST, ALT và tải lượng vi rút HBV-DNA huyết thanh.
    • Mối liên quan chặt chẽ giữa mức độ biểu hiện miRNA với kích thước khối u, số lượng khối u, tình trạng xâm lấn huyết khối tĩnh mạch cửa, độ biệt hóa mô học và giai đoạn bệnh theo hệ thống phân loại BCLC.

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 biện giải các kết quả nghiên cứu trong mối tương quan với y văn:

  1. Về đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng: Luận giải cơ cấu tuổi và ưu thế giới tính nam ở bệnh nhân UTTBG nhiễm HBV tại Việt Nam, phù hợp với đặc điểm dịch tễ học khu vực châu Á.
  2. Về sự thay đổi biểu hiện của miR-21 và miR-122: Phân tích cơ chế tăng nồng độ miR-21 huyết tương bắt nguồn từ việc giải phóng quá mức của tế bào u gan ác tính vào tuần hoàn máu ngoại vi. Luận giải biến đổi của miR-122 như một chỉ báo sinh học đặc hiệu cho tình trạng hoại tử tế bào gan và sự tái cấu trúc mô gan do HBV.
  3. Về giá trị chẩn đoán kết hợp: Khẳng định giá trị gia tăng của miR-21 và miR-122 khi kết hợp với AFP. Phân tích cơ chế giúp khắc phục nhược điểm "âm tính giả" của AFP ở nhóm bệnh nhân có nồng độ AFP ≤ 20 ng/ml và nâng cao độ nhạy chẩn đoán UTTBG ở giai đoạn sớm (BCLC A).
  4. Về mối liên quan với tiến triển bệnh: Luận giải sự tăng cao của miR-21 ở các bệnh nhân có khối u kích thước lớn, đa ổ, có huyết khối tĩnh mạch cửa hoặc biệt hóa kém, khẳng định miR-21 phản ánh mức độ ác tính và gánh nặng khối u trên lâm sàng.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã đạt được các đóng góp khoa học và thực tiễn cụ thể:

1. Đóng góp về mặt khoa học lý luận

  • Cung cấp dữ liệu thực nghiệm đầu tiên tại Việt Nam về đặc điểm biểu hiện của hai phân tử microRNA lưu hành trong huyết tương (miR-21 và miR-122) ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan có nhiễm vi rút viêm gan B.
  • Làm sáng tỏ mối liên quan giữa mức độ biểu hiện của miR-21, miR-122 trong huyết tương với các đặc điểm sinh học của khối u (kích thước, số lượng nốt, mức độ biệt hóa tế bào, tình trạng xâm lấn mạch máu cửa) và tải lượng vi rút HBV-DNA.

2. Đóng góp về mặt thực tiễn lâm sàng

  • Ứng dụng thành công quy trình kỹ thuật stem-loop RT-PCR định lượng sử dụng mẫu dò huỳnh quang UPL trên hệ thống máy Realtime PCR 7500 (Applied Biosystems) để định lượng chính xác miR-21 và miR-122 huyết tương từ mẫu máu ngoại vi ít xâm lấn.
  • Chứng minh mô hình phối hợp giữa miR-21, miR-122 và AFP giúp cải thiện rõ rệt độ nhạy, độ đặc hiệu và diện tích dưới đường cong ROC trong chẩn đoán UTTBG so với việc chỉ sử dụng một dấu ấn AFP đơn độc.
  • Cung cấp công cụ dấu ấn sinh học có giá trị bổ trợ then chốt cho việc phát hiện UTTBG ở những trường hợp nồng độ AFP không tăng (AFP ≤ 20 ng/ml) và các trường hợp UTTBG ở giai đoạn sớm (BCLC A), góp phần mở rộng cơ hội điều trị can thiệp triệt căn cho người bệnh.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của đề tài (trang 137):
    • Nghiên cứu được tiến hành trên nhóm đối tượng bệnh nhân thu dung tại các bệnh viện tuyến trung ương (Bệnh viện Trung ương Quân đội 108, Bệnh viện Hữu Nghị Việt Tiệp), chưa phản ánh toàn diện quần thể bệnh nhân tại tuyến y tế cơ sở.
    • Phạm vi đề tài tập trung chuyên sâu vào nhóm bệnh nhân UTTBG có căn nguyên nhiễm vi rút viêm gan B (HBV), chưa mở rộng khảo sát trên các nhóm căn nguyên khác như nhiễm vi rút viêm gan C (HCV), viêm gan do rượu hoặc viêm gan thoái hóa mỡ không do rượu.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Tiếp tục thực hiện các nghiên cứu theo dõi dọc (longitudinal studies) đánh giá động thái biến đổi nồng độ miR-21 và miR-122 huyết tương ở các thời điểm trước và sau phẫu thuật cắt gan hoặc nút mạch hóa chất (TACE) nhằm xác định giá trị tiên lượng tái phát và đánh giá đáp ứng điều trị.
    • Mở rộng nghiên cứu đa trung tâm với cỡ mẫu lớn hơn trên nhiều căn nguyên gây ung thư gan khác nhau để hoàn thiện bộ công cụ dấu ấn sinh học miRNA trong thực hành lâm sàng.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị ứng dụng cao đối với:

  • Bác sĩ lâm sàng chuyên ngành Nội tiêu hóa, Gan mật, Truyền nhiễm và Ung bướu: Tham khảo căn cứ khoa học để chỉ định và biện giải các dấu ấn sinh học phân tử miRNA mới trong chẩn đoán sớm và đánh giá giai đoạn tiến triển của UTTBG nhiễm HBV, đặc biệt đối với các ca bệnh có AFP không tăng.
  • Cán bộ nghiên cứu chuyên ngành Sinh học phân tử và Hóa sinh y học: Tham khảo quy trình kỹ thuật stem-loop RT-PCR định lượng miRNA từ mẫu huyết tương ngoại vi sử dụng hệ thống máy Applied Biosystems và mẫu dò UPL.
  • Nghiên cứu sinh, học viên sau đại học: Làm tài liệu tham khảo phương pháp luận nghiên cứu kết hợp giữa lâm sàng, chẩn đoán hình ảnh và kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại.

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao việc tìm kiếm các dấu ấn sinh học mới như miR-21 và miR-122 lại cần thiết khi đã có xét nghiệm AFP?
Xét nghiệm AFP cổ điển có độ nhạy hạn chế, có tới khoảng 40% bệnh nhân UTTBG có nồng độ AFP ở mức bình thường (≤ 20 ng/ml). Ngoài ra, hơn 23% trường hợp UTTBG không có sự biến đổi ở cả 3 dấu ấn AFP, AFP-L3 và DCP. Do đó, việc định lượng các miRNA lưu hành bền vững trong máu như miR-21 và miR-122 giúp bổ sung công cụ phát hiện bệnh, tránh bỏ sót các trường hợp UTTBG có AFP âm tính.

2. Kỹ thuật sinh học phân tử cụ thể nào được tác giả sử dụng để định lượng miR-21 và miR-122 trong huyết tương?
Tác giả sử dụng kỹ thuật Stem-loop RT-PCR định lượng (sử dụng mồi thân cuộn chuyên biệt gắn 6 nucleotide tại đầu 3' của trình tự đích). Quá trình phiên mã ngược tạo cDNA được thực hiện trên máy PCR 9700, sau đó phản ứng Realtime PCR được thực hiện trên máy Realtime PCR 7500 của hãng Applied Biosystems, sử dụng chất huỳnh quang SYBR Green kết hợp mẫu dò UPL (Universal ProbeLibrary).

3. Luận án thực hiện nghiên cứu trên những nhóm đối tượng nào?
Nghiên cứu được thực hiện trên 3 nhóm đối tượng: (1) Nhóm bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan có nhiễm vi rút viêm gan B; (2) Nhóm bệnh nhân viêm gan B mạn tính (VGBM); (3) Nhóm chứng gồm những người khỏe mạnh (NKM) được tuyển chọn từ người hiến máu tình nguyện.

4. Luận án tổng quan vai trò của protein HBx của HBV trong cơ chế sinh ung thư gan như thế nào?
Protein HBx (gồm 154 acid amin) là protein không cấu trúc của HBV. HBx kích hoạt các dòng thác tín hiệu nội bào, điều hòa enzym DNA methyltransferase 3A/3B làm tăng methyl hóa đảo SOCS-1CpG, tác động lên gen ATAD5 và trực tiếp gắn kết với protein ức chế khối u P53 để ức chế chức năng của P53, từ đó thúc đẩy quá trình sinh ung thư tế bào gan.

5. Luận án đánh giá giá trị chẩn đoán của miR-21 và miR-122 ở những phân nhóm bệnh nhân đặc thù nào?
Luận án tiến hành phân tích chuyên biệt giá trị chẩn đoán của miR-21 và miR-122 ở hai phân nhóm quan trọng: phân nhóm bệnh nhân UTTBG có nồng độ AFP bình thường (AFP ≤ 20 ng/ml) và phân nhóm bệnh nhân UTTBG ở giai đoạn sớm theo phân loại BCLC (BCLC giai đoạn A). Kết quả cho thấy các miRNA này duy trì độ nhạy và diện tích dưới đường cong ROC cao ở cả hai phân nhóm trên.

Kết luận

Luận án tiến sĩ y học của tác giả Đặng Chiều Dương đã xác lập thành công quy trình định lượng microRNA-21 và microRNA-122 huyết tương bằng kỹ thuật stem-loop RT-PCR ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan nhiễm vi rút viêm gan B tại Việt Nam. Kết quả nghiên cứu chứng minh nồng độ miR-21 và miR-122 huyết tương có sự biến đổi đặc trưng, tương quan chặt chẽ với kích thước u, mức độ xâm lấn mạch máu, độ biệt hóa mô bệnh học và giai đoạn bệnh theo hệ thống BCLC. Việc phối hợp miR-21, miR-122 cùng với AFP tạo thành mô hình dấu ấn sinh học có giá trị chẩn đoán vượt trội, giải quyết hiệu quả khoảng trống chẩn đoán ở các trường hợp UTTBG có AFP bình thường và UTTBG ở giai đoạn sớm.