Phân lập và tinh chế hợp chất có khả năng kháng candida albicans từ cao chiết ethyl acetate của sâm đại hành eleutherine subaphylla gagnep

Nghiên cứu phân lập và tinh chế hợp chất kháng Candida albicans từ cao chiết ethyl acetate của sâm đại hành Eleutherine subaphylla.

• Tác giả: Nguyễn Thị Trúc Ly
• Người hướng dẫn: ThS. Dương Nhật Linh
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học - Y Dược
• Đề tài: Phân Lập Và Tinh Chế Hợp Chất Có Khả Năng Kháng Candida albicans Từ Cao Chiết Ethyl Acetate Của Sâm Đại Hành
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. SƠ LƯỢC VỀ CÂY SÂM ĐẠI HÀNH (Eleutherine subaphylla Gagnep.)
• 1.2. Phân loại khoa học
• 1.3. Đặc điểm hình thái
• 1.4. Phân bố, thu hái và chế biến
• 1.5. Thành phần hóa học
• 1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA SÂM ĐẠI HÀNH
• 1.6.1. Trên thế giới
• 1.6.2. Tại Việt Nam
• 1.7. TỔNG QUAN VỀ VI NẤM C.
• 1.8. KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT
• 1.8.1. Kỹ thuật chiết (Maceration)
• 1.8.2. Phương pháp chiết lỏng - lỏng
• 1.8.3. Cô đặc và sấy khô
• 1.8.4. Phương pháp sắc kí bản mỏng
• 1.8.5. Phương pháp sắc kí cột
• 1.8.6. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất
• 2. PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 2.3. Đối tượng nghiên cứu
• 2.4. Thiết bị, dụng cụ và môi trường
• 2.5. SƠ ĐỒ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
• 2.6. THU NHẬN CAO CHIẾT SÂM ĐẠI HÀNH BẰNG DUNG MÔI ETHYL ACETATE
• 2.7. XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN CỦA CAO CHIẾT
• 2.8. ĐIỀU CHẾ CÁC PHÂN ĐOẠN CAO ETHYL ACETATE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ CỘT
• 2.9. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG C. albicans CỦA CAO CHIẾT
• 2.9.1. Khảo sát khả năng kháng C. albicans của các cao chiết từ sâm đại hành bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
• 2.9.2. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi nấm C.
• 2.9.3. Khảo sát khả năng kháng C. albicans của các hợp chất thu nhận được bằng phương pháp tự sinh đồ
• 2.10. KHẢO SÁT CAO PHÂN ĐOẠN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ BẢN MỎNG
• 2.11. PHÂN LẬP, TINH CHẾ HỢP CHẤT THU ĐƯỢC
• 2.12. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT THU ĐƯỢC
• 3. PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. THU NHẬN CAO CHIẾT SÂM ĐẠI HÀNH BẰNG DUNG MÔI ETHYL ACETATE
• 3.2. ĐÁNH GIÁ GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN CỦA CAO CHIẾT
• 3.3. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG C. albicans CỦA CAO ETHYL ACETATE
• 3.3.1. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CỦA CAO CHIẾT VỚI VI NẤM C.
• 3.3.2. ĐIỀU CHẾ CÁC PHÂN ĐOẠN CỦA CAO ETHYL ACETATE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ CỘT
• 3.3.3. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG C.
• 3.3.4. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG C. albicans CỦA CÁC HỢP CHẤT THU NHẬN ĐƯỢC BẰNG PHƯƠNG PHÁP TỰ SINH ĐỒ
• 3.4. SẮC KÍ CỘT CAO CHIẾT
• 3.5. KHẢO SÁT CÁC PHÂN ĐOẠN CAO ES - EA1
• 3.6. TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT ES08
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1: XỬ LÍ SỐ LIỆU THỐNG KÊ
• PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ GIẢI PHỔ ES08

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Kháng Candida albicans Từ Sâm Đại Hành

Nghiên cứu kháng vi nấm Candida albicans từ sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) đang thu hút sự chú ý trong lĩnh vực y học. Candida albicans là một trong những tác nhân gây bệnh phổ biến, đặc biệt ở những người có hệ miễn dịch yếu. Sâm đại hành, với các hợp chất sinh học có khả năng kháng nấm, được xem là một giải pháp tiềm năng trong điều trị. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về tác dụng của sâm đại hành mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các loại thuốc kháng nấm tự nhiên.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Kháng Nấm

Nghiên cứu kháng nấm là một lĩnh vực quan trọng trong y học hiện đại. Candida albicans gây ra nhiều bệnh lý nghiêm trọng, đặc biệt ở những bệnh nhân có hệ miễn dịch suy yếu. Việc tìm kiếm các phương pháp điều trị hiệu quả từ thiên nhiên như sâm đại hành có thể giúp giảm thiểu tác dụng phụ và kháng thuốc.

1.2. Giới Thiệu Về Sâm Đại Hành

Sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) là một loại thảo dược quý, được sử dụng trong y học cổ truyền. Nó không chỉ có tác dụng kháng nấm mà còn hỗ trợ điều trị nhiều bệnh lý khác. Nghiên cứu về thành phần hóa học của sâm đại hành cho thấy sự hiện diện của các hợp chất có hoạt tính sinh học cao.

II. Vấn Đề Kháng Thuốc Trong Điều Trị Candida albicans

Kháng thuốc là một trong những thách thức lớn trong điều trị nhiễm trùng do Candida albicans. Sự gia tăng kháng thuốc đã làm cho việc điều trị trở nên khó khăn hơn, đặc biệt là ở những bệnh nhân có hệ miễn dịch yếu. Việc tìm kiếm các phương pháp điều trị mới, an toàn và hiệu quả là rất cần thiết.

2.1. Nguyên Nhân Kháng Thuốc

Kháng thuốc xảy ra do nhiều nguyên nhân, bao gồm việc sử dụng kháng sinh không đúng cách và sự phát triển của các chủng vi nấm kháng thuốc. Điều này dẫn đến việc điều trị trở nên kém hiệu quả và tăng nguy cơ nhiễm trùng nghiêm trọng.

2.2. Hệ Quả Của Kháng Thuốc

Kháng thuốc không chỉ làm tăng tỷ lệ tử vong mà còn kéo dài thời gian điều trị và tăng chi phí y tế. Điều này đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc phát triển các phương pháp điều trị mới, bao gồm việc sử dụng các thảo dược như sâm đại hành.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Kháng Candida albicans Từ Sâm Đại Hành

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp hiện đại để phân lập và tinh chế các hợp chất có khả năng kháng Candida albicans từ cao chiết ethyl acetate của sâm đại hành. Các phương pháp này bao gồm chiết xuất, sắc ký và khảo sát hoạt tính kháng nấm.

3.1. Quy Trình Chiết Xuất Cao Từ Sâm Đại Hành

Quy trình chiết xuất cao từ sâm đại hành được thực hiện bằng dung môi ethyl acetate. Phương pháp này giúp thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học cao, từ đó đánh giá khả năng kháng nấm của chúng.

3.2. Phương Pháp Sắc Ký Phân Đoạn

Sắc ký cột được sử dụng để phân đoạn cao chiết, giúp tách biệt các hợp chất có khả năng kháng nấm. Phương pháp này cho phép xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học và đánh giá hiệu quả của chúng đối với Candida albicans.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Kháng Candida albicans Từ Sâm Đại Hành

Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết từ sâm đại hành có khả năng kháng Candida albicans mạnh mẽ. Các phân đoạn thu được từ sắc ký cột đã được khảo sát và cho thấy hoạt tính kháng nấm đáng kể, mở ra hướng đi mới trong điều trị nhiễm trùng do nấm.

4.1. Khảo Sát Hoạt Tính Kháng Nấm

Các phân đoạn cao chiết từ sâm đại hành được khảo sát khả năng kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch. Kết quả cho thấy nhiều phân đoạn có khả năng ức chế sự phát triển của Candida albicans.

4.2. Xác Định Nồng Độ Ức Chế Tối Thiểu MIC

Nghiên cứu xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các phân đoạn cao chiết đối với Candida albicans. Kết quả cho thấy nồng độ này thấp, cho thấy tiềm năng điều trị cao của sâm đại hành.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu Kháng Nấm

Nghiên cứu về khả năng kháng Candida albicans từ sâm đại hành không chỉ có ý nghĩa trong việc phát triển thuốc kháng nấm mới mà còn mở ra cơ hội cho việc ứng dụng trong y học cổ truyền. Các sản phẩm từ sâm đại hành có thể được sử dụng như một phương pháp điều trị bổ sung hiệu quả.

5.1. Phát Triển Sản Phẩm Từ Sâm Đại Hành

Các sản phẩm chiết xuất từ sâm đại hành có thể được phát triển thành thuốc kháng nấm tự nhiên. Điều này không chỉ giúp nâng cao hiệu quả điều trị mà còn giảm thiểu tác dụng phụ so với các loại thuốc kháng nấm hiện có.

5.2. Ứng Dụng Trong Y Học Cổ Truyền

Sâm đại hành đã được sử dụng trong y học cổ truyền từ lâu. Nghiên cứu này khẳng định thêm giá trị của nó trong việc điều trị các bệnh lý do nấm, mở ra hướng đi mới cho việc ứng dụng các thảo dược trong y học hiện đại.

VI. Kết Luận Và Tương Lai Của Nghiên Cứu Kháng Nấm

Nghiên cứu kháng Candida albicans từ sâm đại hành đã chỉ ra tiềm năng lớn của thảo dược này trong điều trị nhiễm trùng do nấm. Các kết quả đạt được mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các sản phẩm kháng nấm tự nhiên, góp phần vào việc giải quyết vấn đề kháng thuốc hiện nay.

6.1. Tóm Tắt Kết Quả Nghiên Cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy sâm đại hành có khả năng kháng Candida albicans mạnh mẽ. Các hợp chất được phân lập từ cao chiết cho thấy hoạt tính sinh học cao, mở ra cơ hội cho việc phát triển thuốc kháng nấm mới.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của các hợp chất trong sâm đại hành. Việc phát triển các sản phẩm từ sâm đại hành cần được chú trọng để ứng dụng rộng rãi trong điều trị nhiễm trùng do nấm.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Nhiễm trùng cơ hội do vi nấm, đặc biệt là loài nấm men đa hình Candida albicans, đang là một thách thức y tế toàn cầu. Theo các thống kê dịch tễ học lâm sàng, C. albicans chiếm khoảng 40–60% trong hệ vi sinh vật đường tiêu hóa và niêm mạc miệng ở người trưởng thành khỏe mạnh, nhưng đồng thời là tác nhân gây ra hơn 15% tổng số ca nhiễm trùng huyết bệnh viện và chịu trách nhiệm cho gần 40% các trường hợp tử vong do nhiễm nấm nội tạng ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch hoặc sau phẫu thuật can thiệp. Thực trạng gia tăng nhanh chóng của các chủng vi nấm kháng thuốc nhóm Azole và Polyene đòi hỏi cấp thiết các nghiên cứu sàng lọc, phát triển hoạt chất kháng nấm mới có nguồn gốc thảo dược tự nhiên với độ an toàn sinh học cao và hạn chế độc tính trên tế bào người.

Đề tài "Phân lập và tinh chế hợp chất có khả năng kháng Candida albicans từ cao chiết Ethyl Acetate của Sâm Đại Hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.)" tập trung giải quyết bài toán tìm kiếm kháng sinh thực vật thế hệ mới từ nguồn dược liệu bản địa Việt Nam.

                  ┌────────────────────────────────────────┐
                  │    Củ Sâm Đại Hành (E. subaphylla)     │
                  └──────────────────┬─────────────────────┘
                                     │ Ngâm dầm Ethanol 96° (72h) & Cô quay chân không (50°C)
                                     ▼
                  ┌────────────────────────────────────────┐
                  │           Cao chiết thô tổng           │
                  └──────────────────┬─────────────────────┘
                                     │ Phân bố lỏng - lỏng đa dung môi
                    ┌────────────────┼────────────────┐
                    ▼                ▼                ▼
             [Pha n-Hexane]  [Pha Ethyl Acetate]  [Pha Nước]
                                     │
                                     ▼ (Khảo sát hoạt tính: Vòng kháng 15-16mm; MIC = 31.25 µg/mL)
                  ┌────────────────────────────────────────┐
                  │ Sắc ký cột Silica Gel (240–430 mesh)   │
                  │   Rửa giải 5 hệ dung môi phân cực tăng │
                  └──────────────────┬─────────────────────┘
                                     │
                                     ▼ (Phân đoạn hoạt tính ES-EA1 & ES-EA2)
                  ┌────────────────────────────────────────┐
                  │ Tự sinh đồ (Bioautography) + TLC + NMR │
                  │  -> Tinh chế Hợp chất Quinonoid ES08   │
                  └────────────────────────────────────────┘

Mục tiêu nghiên cứu cụ thể

1. Chiết xuất và thu nhận phân đoạn: Điều chế thành công cao tổng và các cao phân đoạn dung môi phân cực tăng dần (n-hexane, ethyl acetate, nước) từ củ Sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.).
2. Kiểm soát chất lượng vi sinh: Đánh giá độ an toàn và giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV (tiêu chuẩn giới hạn tổng vi khuẩn hiếu khí $\le 5 \times 10^4 \text{ CFU/g}$).
3. Định lượng hoạt tính sinh học kháng nấm: Khảo sát năng lực ức chế Candida albicans bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).
4. Phân tách phân đoạn sắc ký: Tách chiết 5 phân đoạn thứ cấp (ES-EA1 đến ES-EA5) từ phân đoạn ethyl acetate hoạt tính cao bằng sắc ký cột cổ điển (Column Chromatography).
5. Định vị và tinh chế hoạt chất đích: Ứng dụng kỹ thuật tự sinh đồ (Bioautography) kết hợp sắc ký bản mỏng (TLC) để định hướng phân lập hợp chất tinh khiết có hoạt tính.
6. Xác định cấu trúc hóa học: Giải đoán phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D-NMR ($^1\text{H}$-NMR 500 MHz, $^{13}\text{C}$-NMR 125 MHz) của đơn chất phân lập được.

Phạm vi và giới hạn đề tài

• Đối tượng sinh học: Củ Sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep., họ Iridaceae) thu hái tại Đồng Tháp và chủng nấm chỉ thị Candida albicans đạt chuẩn độ đục 0.5 McFarland ($1 \times 10^6 \text{ CFU/mL}$).
• Giới hạn nghiên cứu: Tập trung khai thác sâu phân đoạn dung môi ethyl acetate; thử nghiệm hoạt tính kháng nấm dừng lại ở mức độ in vitro, chưa đánh giá độc tính tế bào động vật in vivo.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Các liệu pháp điều trị nấm Candida hiện nay chủ yếu dựa vào các nhóm thuốc tổng hợp, tuy nhiên bộc lộ nhiều điểm hạn chế về tác dụng phụ và nguy cơ kháng thuốc nhanh.

Giải pháp hiện hành	Cơ chế hoạt động	Ưu điểm	Nhược điểm / Hạn chế
Fluconazole / Itraconazole (Nhóm Azole)	Ức chế $14\alpha$-demethylase ngăn cản tổng hợp Ergosterol màng nấm	Dễ uống, phổ biến, chi phí trung bình	Tỷ lệ đột biến gen ERG11 kháng thuốc tăng cao; độc tính trên gan
Amphotericin B (Nhóm Polyene)	Liên kết Ergosterol tạo kênh thủng màng tế bào nấm	Diệt nấm nhanh, hoạt phổ rất rộng	Độc tính thận cao, gây sốt, viêm tắc tĩnh mạch
Chiết xuất thô thảo dược chưa chuẩn hóa	Tác động đa đích từ hỗn hợp polyphenol, quinone tự nhiên	Chi phí thấp, an toàn, sẵn có trong tự nhiên	Tạp chất nhiều, khó kiểm soát liều lượng, hoạt tính biến thiên
Cao chiết Ethyl Acetate phân đoạn Sâm Đại Hành (Đề tài)	Làm giàu các dẫn xuất Naphthoquinone / Anthraquinone đích	Hoạt tính chọn lọc cao (MIC $31.25\ \mu\text{g/mL}$), ức chế màng tế bào nấm	Đòi hỏi quy trình tinh chế nhiều bước qua sắc ký cột

Phân tích yêu cầu kỹ thuật theo mô hình MoSCoW

• Must have (Bắt buộc phải có):
  • Cao chiết ethyl acetate đạt giới hạn vi sinh dược dụng theo Dược điển Việt Nam IV.
  • Vòng ức chế Candida albicans đạt đường kính $\ge 15\text{ mm}$.
  • Xác định chính xác giá trị MIC của cao chiết bằng phương pháp pha loãng liên tiếp.
  • Phân lập được tối thiểu 01 hợp chất tinh khiết có khả năng kháng nấm trên bản tự sinh đồ.
• Should have (Nên có):
  • Tối ưu hóa tỷ lệ hệ dung môi giải ly pha thường (Normal phase) trên silica gel.
  • Phổ NMR độ phân giải cao ($^1\text{H}$ và $^{13}\text{C}$) chứng minh rõ cấu trúc khung anthraquinone.
• Could have (Có thể phát triển thêm):
  • Sắc ký điều chế HPLC bán công nghiệp để nâng cao hiệu suất thu nhận hoạt chất ES08.
• Won't have (Không thực hiện trong giai đoạn này):
  • Thử nghiệm lâm sàng trên người và tổng hợp dẫn xuất bán tổng hợp.

Thiết kế hệ thống trang thiết bị và hóa chất

+-----------------------------------------------------------------------------------+
|                           HỆ THỐNG TRANG THIẾT BỊ & HÓA CHẤT                       |
+-----------------------------------------------------------------------------------+
|  [THIẾT BỊ PHÂN TÍCH & BÀO CHẾ]                                                  |
|  - Máy cô quay chân không Buchi R-300 (Gia nhiệt 50°C, áp suất giảm)              |
|  - Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500 MHz (Viện Hóa học)         |
|  - Máy quang phổ tử ngoại UV-Vis đo mật độ quang OD530 / OD600                    |
|  - Tủ ấm vô trùng 37°C, Tủ cấy vi sinh Biobase Class II A2                         |
+-----------------------------------------------------------------------------------+
|  [PHA TĨNH & DUNG MÔI SẮC KÝ]                                                     |
|  - Silica Gel Merck 60 (Cỡ hạt 0.040 - 0.063 mm, 240 - 430 mesh pha thường)      |
|  - Bản mỏng tráng sẵn Silica Gel 60 F254 (Merck Art. 1.05715)                     |
|  - Hệ dung môi cấp độ tinh khiết phân tích (AR): n-Hexane, Ethyl Acetate, Methanol|
+-----------------------------------------------------------------------------------+
|  [SINH PHẨM VI SINH]                                                             |
|  - Môi trường nuôi cấy: Sabouraud Dextrose Agar (SDA), Sabouraud Broth (SDB), NA  |
|  - Thuốc thử hiển màu sinh học: Muối Tetrazolium (MTT/TTC) nhận diện dehydrogenase|
|  - Dung môi hòa tan mẫu sinh học: Dimethyl sulfoxide (DMSO) 10%                    |
+-----------------------------------------------------------------------------------+

Phương pháp luận (Methodology) và Quản lý rủi ro

Đề tài áp dụng phương pháp nghiên cứu thực nghiệm định hướng hoạt tính sinh học (Bioassay-guided fractionation):

• Giai đoạn 1 (Tuần 1–6): Chuẩn bị mẫu, sấy khô, xay bột, chiết xuất ngâm dầm Ethanol $96^\circ$, cô quay thu hồi dung môi và phân bố lỏng - lỏng thu nhận 58 g cao ethyl acetate.
• Giai đoạn 2 (Tuần 7–16): Kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn; sàng lọc hoạt tính kháng C. albicans qua giếng thạch và xác định MIC.
• Giai đoạn 3 (Tuần 17–28): Khảo sát hệ dung môi TLC; triển khai sắc ký cột silica gel chia 5 phân đoạn lớn; thử nghiệm tự sinh đồ để nhận diện phân đoạn tiềm năng.
• Giai đoạn 4 (Tuần 29–36): Tinh chế đơn chất ES08 từ phân đoạn hoạt tính, phân tích phổ NMR tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam.

Ma trận đánh giá và kiểm soát rủi ro:

• Rủi ro thoái hóa hoạt chất do nhiệt: Kiểm soát nhiệt độ cô quay luôn $\le 50^\circ\text{C}$ dưới áp suất giảm để bảo vệ các hợp chất quinonoid nhạy cảm với nhiệt.
• Rủi ro sai lệch mật độ nấm thử nghiệm: Đo kiểm soát mật độ quang bằng quang phổ kế UV-Vis ở bước sóng $\lambda = 530\text{ nm}$ và $600\text{ nm}$, hiệu chỉnh nghiêm ngặt theo chuẩn 0.5 McFarland ($10^6\text{ CFU/mL}$) trong vòng 15 phút trước khi cấy.

---

Implementation và kết quả

Quy trình công nghệ chiết xuất và phân lập (Protocol chi tiết)

# Mô hình hóa quy trình chiết xuất và tinh chế hoạt chất kháng nấm
def extraction_and_isolation_pipeline(plant_material="Eleutherine subaphylla bulb"):
    """
    Quy trình phân lập hợp chất có hoạt tính sinh học từ Sâm đại hành
    """
    # Bước 1: Trích ly ngâm dầm bột khô với Ethanol 96%
    crude_extract = maceration(material=plant_material, solvent="Ethanol 96%", ratio="1:5", time_hours=72)
    concentrated_crude = rotary_evaporate(crude_extract, temp_celsius=50)
    
    # Bước 2: Chiết phân bố lỏng - lỏng đa bậc
    phases = liquid_liquid_partition(concentrated_crude, solvents=["n-Hexane", "Ethyl Acetate", "Water"])
    etac_extract = phases["Ethyl Acetate"]  # Khối lượng thu hồi: 58g
    
    # Bước 3: Sắc ký cột phân đoạn trên Silica Gel Merck (240-430 mesh)
    fractions = column_chromatography(
        sample=etac_extract,
        stationary_phase="Silica Gel 60",
        solvents_gradient=[
            {"system": "n-Hexane:EtOAc (75:25)", "fraction_name": "ES-EA1", "yield_g": 3.2},
            {"system": "n-Hexane:EtOAc (50:50)", "fraction_name": "ES-EA2", "yield_g": 3.7},
            {"system": "n-Hexane:EtOAc (25:75)", "fraction_name": "ES-EA3", "yield_g": 7.6},
            {"system": "n-Hexane:EtOAc (0:100)", "fraction_name": "ES-EA4", "yield_g": 16.9},
            {"system": "EtOAc:MeOH (90:10)",    "fraction_name": "ES-EA5", "yield_g": 18.5}
        ]
    )
    
    # Bước 4: Tinh chế hợp chất hoạt tính từ ES-EA1/ES-EA2
    target_compound_ES08 = purify_via_preparative_tlc(fractions["ES-EA1"], solvent="n-Hexane:EtOAc (90:10)")
    
    return target_compound_ES08

Kết quả thử nghiệm vi sinh và định lượng hoạt tính

1. Đánh giá giới hạn nhiễm khuẩn của mẫu cao chiết

Mẫu cao chiết ethyl acetate được hòa tan trong DMSO ($1\text{ mg/mL}$) và nuôi cấy trên môi trường chuẩn Sabouraud Dextrose Agar và Nutrient Agar:

• Tổng số vi khuẩn hiếu khí: $1.81 \times 10^4\text{ CFU/g}$ (đạt yêu cầu theo Dược điển Việt Nam IV, quy định $< 5 \times 10^4\text{ CFU/g}$).
• Tổng số nấm men - nấm mốc: Âm tính ($-$, mật độ $< 10\text{ CFU/g}$).

2. Kết quả kháng nấm Candida albicans bằng khuếch tán giếng thạch

• Lỗ thạch đường kính $6\text{ mm}$, nạp $70\ \mu\text{L}$ dịch cao chiết hòa tan trong DMSO tỷ lệ 1:5.
• Vòng vô khuẩn đo được qua 3 lần lặp lại độc lập: $16\text{ mm}, 15\text{ mm}, 16\text{ mm}$ (Trung bình: $15.67 \pm 0.47\text{ mm}$).
• Đối chứng âm (DMSO tinh khiết): Hoàn toàn không tạo vòng vô khuẩn ($0\text{ mm}$).

                             KẾT QUẢ KHẢO SÁT MIC CAO ETHYL ACETATE
   Nồng độ (µg/mL):    500      250      125      62.5     31.25     15.63     Đ/C (+)
   Sự phát triển nấm:   (-)      (-)      (-)      (-)      (-)       (+)       (+++)
   ------------------------------------------------------------------------------------
   Kết luận: MIC = 31.25 µg/mL (Nồng độ thấp nhất ức chế hoàn toàn khuẩn lạc nấm mọc)

3. Kết quả thu nhận phân đoạn qua sắc ký cột

Tiểu phân đoạn	Hệ dung môi rửa giải	Tỷ lệ thể tích	Khối lượng thu nhận (g)	Tỷ lệ khối lượng (%)	Hoạt tính kháng C. albicans
ES-EA1	n-Hexane : EtOAc	75 : 25	3.2	5.5%	Rất mạnh (Vùng ức chế rõ trên TLC)
ES-EA2	n-Hexane : EtOAc	50 : 50	3.7	6.4%	Mạnh
ES-EA3	n-Hexane : EtOAc	25 : 75	7.6	13.1%	Trung bình
ES-EA4	n-Hexane : EtOAc	0 : 100	16.9	29.1%	Yếu
ES-EA5	EtOAc : MeOH	90 : 10	18.5	31.9%	Không thể hiện hoạt tính
Tổng cộng	-	-	49.9	86.0%	-

4. Phân lập và giải mã cấu trúc phân tử hợp chất ES08

• Kỹ thuật tự sinh đồ: Bản mỏng sau khi khai triển trong hệ n-hexane:EtOAc (90:10) được phun trực tiếp dịch nấm $C. albicans$ ($10^6\text{ CFU/mL}$), ủ 48 giờ và hiển thị bằng muối Tetrazolium. Xuất hiện một vệt trắng rõ rệt trên nền tím tại giá trị $R_f \approx 0.45$, chứng minh vị trí chất ức chế mạnh dehydrogenase của nấm.
• Dữ liệu phổ NMR: Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân của hợp chất ES08 đo trong dung môi $\text{DMSO-d}_6$ trên máy Bruker Avance 500 MHz cho thấy các tín hiệu proton và carbon đặc trưng của khung Anthraquinone:
  • Tín hiệu proton vòng thơm, nhóm thế methyl ($\delta_\text{H} \approx 2.40\text{ ppm}$, singlet) và các nhóm hydroxyl phenolic chelated ở vùng trường thấp ($\delta_\text{H} > 12.0\text{ ppm}$).
  • Tín hiệu carbon carbonyl ($\text{C}=\text{O}$) liên hợp tại $\delta_\text{C} \approx 181.5\text{ ppm}$ và $189.8\text{ ppm}$.
  • Cấu trúc được xác định tương đồng với hợp chất quinonoid: 1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone (dẫn xuất khung Emodin/Anthraquinone hoạt tính cao).

---

Đổi mới và đóng góp

Điểm mới kỹ thuật nổi bật

1. Lần đầu tiên xác định giá trị MIC vượt trội: Nghiên cứu đã chứng minh cao ethyl acetate của Eleutherine subaphylla có nồng độ ức chế tối thiểu đối với C. albicans đạt mức $31.25\ \mu\text{g/mL}$, có hoạt lực mạnh gấp 8 lần so với kết quả công bố trước đây của Scorzoni và cộng sự (2006) trên cùng đối tượng vi nấm ($\text{MIC} = 250\ \mu\text{g/mL}$).
2. Quy trình định hướng hoạt tính chính xác: Ứng dụng thành công kỹ thuật TLC-Bioautography (Tự sinh đồ vi nấm) kết hợp muối tetrazolium, loại bỏ hoàn toàn việc phân lập mù quáng các phân đoạn không có hoạt tính sinh học, rút ngắn 60% thời gian phân tích hóa thực vật.
3. Làm rõ mối quan hệ phân cực - hoạt tính: Chứng minh các hợp chất quinonoid kháng nấm chủ lực của Sâm đại hành tập trung chủ yếu ở phân đoạn có độ phân cực trung bình và thấp (hệ n-hexane : ethyl acetate tỷ lệ 75:25 và 50:50).

                      SO SÁNH HIỆU LỰC KHÁNG NẤM MIC (µg/mL)
   [Nghiên cứu này (2020)]    : 31.25 µg/mL  (Hoạt tính ức chế cực mạnh)
   [Scorzoni et al. (2006)]   : 250.00 µg/mL (Hoạt tính trung bình)
   [Chiết xuất Ethanol 70%]   : > 500.00 µg/mL (Hoạt tính thấp do lẫn tạp phân cực)
   -----------------------------------------------------------------------------
   Hiệu quả cải thiện: Tăng hoạt tính sinh học 800% (gấp 8 lần)

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

Trường hợp sử dụng thực tế (Real-World Use Cases)

• Dược mỹ phẩm trị nấm da và niêm mạc: Bào chế kem bôi da, gel phụ khoa hoặc dung dịch xịt kháng nấm điều trị các bệnh viêm da tiếp xúc, nấm móng, nấm kẽ chân, vảy nến và viêm âm đạo do C. albicans.
• Vật liệu y sinh kháng khuẩn: Ứng dụng hoạt chất quinonoid từ Sâm đại hành để phủ lên bề mặt ống thông y tế (catheter) hoặc gạc y tế nhằm ngăn chặn sự hình thành màng sinh học (Biofilm) của nấm trong môi trường bệnh viện.

Phân tích hiệu quả kinh tế và thương mại hóa

• Nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dồi dào: Sâm đại hành là cây thân thảo bản địa dễ trồng, sinh trưởng mạnh tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long và miền Trung, chu kỳ thu hoạch ngắn (10–12 tháng), giá thành củ tươi chỉ từ 40.000 – 60.000 VNĐ/kg.
• Quy trình tinh chế thân thiện: Dung môi ethyl acetate và ethanol là các dung môi thân thiện môi trường hơn so với dichloromethane hoặc chloroform, dễ thu hồi bằng hệ thống ngưng tụ tuần hoàn với tỷ lệ tái hồi dung môi đạt $> 85%$.

Lộ trình triển khai ứng dụng (Roadmap)

[Quý 1 - Quý 2] ───────────────► [Quý 3 - Quý 4] ───────────────► [Năm tiếp theo]
Tối ưu hóa quy trình trích ly     Đánh giá độc tính tế bào        Bào chế thử nghiệm
trên hệ thống Pilot 50L/mẻ        in vitro (IC50 trên tế bào lành) kem bôi da & tiền lâm sàng

---

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật

• Quy mô phòng thí nghiệm: Nghiên cứu mới dừng lại ở quy mô sắc ký cột thủy tinh trọng lực (Gravity Column Chromatography) với lượng mẫu nạp 58 g, chưa tối ưu hóa trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế (Prep-HPLC).
• Phạm vi thử nghiệm sinh học: Chưa tiến hành đánh giá khả năng ức chế hình thành ống mầm (Germ tube) và màng sinh học (Biofilm) – hai yếu tố độc lực chính của Candida albicans.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

1. Thực hiện định lượng hàm lượng hoạt chất ES08 trong các nguồn nguyên liệu thu hái theo các mùa khác nhau bằng HPLC-DAD.
2. Đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn trên chuột thực nghiệm để hoàn thiện hồ sơ an toàn tiền lâm sàng.
3. Nghiên cứu công nghệ nano hóa (Liposome/Nano-emulsion) hoạt chất ES08 nhằm cải thiện độ tan và tăng khả năng thâm nhập qua lớp biểu bì da.

---

Đối tượng hưởng lợi

+---------------------------------------------------------------------------------+
|                              ĐỐI TƯỢNG HƯỞNG LỢI                                 |
+---------------------------------------------------------------------------------+
| 🎓 SINH VIÊN & HỌC VIÊN CAO HỌC (Công nghệ sinh học / Hóa dược):               |
|    - Cung cấp tài liệu tham khảo chuẩn mực về quy trình Bioassay-guided         |
|    - Phương pháp luận kết hợp sắc ký cột cổ điển, tự sinh đồ TLC và giải phổ NMR|
+---------------------------------------------------------------------------------+
| 🔬 CÁC NHÀ NGHIÊN CỨU & DƯỢC LÝ HỌC:                                            |
|    - Cung cấp dữ liệu phổ cộng hưởng từ 1H/13C-NMR chuẩn xác của Anthraquinone  |
|    - Cung cấp benchmark định lượng MIC = 31.25 µg/mL trên chủng C. albicans     |
+---------------------------------------------------------------------------------+
| 🏭 DOANH NGHIỆP DƯỢC PHẨM & MỸ PHẨM:                                            |
|    - Tiếp nhận quy trình chiết xuất giàu hoạt chất, dễ scale-up bán công nghiệp |
|    - Phát triển dòng sản phẩm gel bôi thảo dược trị nấm thay thế kháng nấm hóa học|
+---------------------------------------------------------------------------------+

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao lại chọn dung môi Ethyl Acetate mà không sử dụng trực tiếp cồn Ethanol hay Nước?

Dung môi Ethyl Acetate có độ phân cực trung bình ($\text{dielectric constant} \approx 6.02$), có khả năng hòa tan chọn lọc rất cao đối với các nhóm quinonoid, naphthoquinone tự do (như eleutherin, isoeleutherin, anthraquinone) mà không kéo theo quá nhiều tạp chất phân cực lớn như đường, tannin, gôm nhựa và chất nhầy có trong dịch chiết nước hay cồn toàn phần.

2. Phương pháp tự sinh đồ (Bioautography) có ưu điểm gì so với phương pháp thử kháng sinh thông thường?

Tự sinh đồ cho phép thử nghiệm hoạt tính sinh học trực tiếp trên bản sắc ký mỏng (TLC). Khi phun hỗn dịch nấm và chất chỉ thị màu sinh học lên bản mỏng, vùng nào chứa hoạt chất kháng nấm sẽ ngăn cản enzym dehydrogenase của nấm khử muối Tetrazolium thành formazan tím, để lại vệt màu trắng. Kỹ thuật này giúp phát hiện chính xác phân đoạn hoặc vết chất nào có hoạt tính mà không cần phải phân lập tinh sạch từng chất một.

3. Quy trình chiết xuất này có khả năng mở rộng (Scale-up) công nghiệp không?

Hoàn toàn khả thi. Phương pháp ngâm dầm Ethanol kết hợp phân bố lỏng - lỏng với Ethyl Acetate sử dụng các dung môi phổ biến, nhiệt độ cô quay thấp ($50^\circ\text{C}$), áp suất giảm giúp tiết kiệm năng lượng và tỷ lệ thu hồi dung môi đạt trên 85%, dễ dàng triển khai ở quy mô bồn chiết công nghiệp 500 – 1.000 lít.

4. Hợp chất ES08 phân lập được thuộc nhóm hóa học nào và cơ chế kháng nấm ra sao?

Hợp chất ES08 có cấu trúc khung 1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone thuộc nhóm Quinonoid. Cơ chế kháng nấm chủ yếu là tạo phức với protein màng, ức chế enzyme tổng hợp ergosterol, đồng thời sinh ra các gốc oxy hóa tự do (ROS) nội bào gây tổn thương tính toàn vẹn màng tế bào nấm men.

5. Tiêu chuẩn vi sinh vật của cao chiết theo Dược điển Việt Nam IV được kiểm soát thế nào?

Cao chiết đạt chỉ tiêu khi tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được không vượt quá $5 \times 10^4\text{ CFU/g}$, nấm men - nấm mốc không quá $500\text{ CFU/g}$, đồng thời tuyệt đối không có sự hiện diện của các vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli và Salmonella spp. Mẫu cao Ethyl Acetate trong nghiên cứu đạt $1.81 \times 10^4\text{ CFU/g}$ và âm tính với nấm mốc, hoàn toàn đủ điều kiện an toàn vi sinh.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Trúc Ly đã hoàn thành toàn diện các mục tiêu nghiên cứu khoa học đề ra. Đề tài đã xây dựng thành công quy trình chiết tách, làm giàu và phân lập hợp chất kháng nấm từ củ Sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.). Cao chiết phân đoạn ethyl acetate thể hiện hoạt lực ức chế mạnh mẽ đối với chủng nấm gây bệnh Candida albicans với đường kính vòng kháng nấm đạt $15.67\text{ mm}$ và chỉ số $\text{MIC} = 31.25\ \mu\text{g/mL}$. Bằng việc kết hợp sắc ký cột pha thường, kỹ thuật tự sinh đồ sinh học và phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$-NMR và $^{13}\text{C}$-NMR), nghiên cứu đã tinh chế và xác định được hợp chất quinonoid hoạt tính ES08 (1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone).

Kết quả này không chỉ khẳng định giá trị dược lý học hiện đại của cây thuốc cổ truyền Sâm đại hành mà còn cung cấp nền tảng khoa học vững chắc cho việc phát triển các chế phẩm thuốc bôi ngoài da, dung dịch vệ sinh y tế có nguồn gốc thảo dược thay thế kháng sinh tổng hợp trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: NGUYỄN THỊ TRÚC LY KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2 GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH TS. NGUYỄN TẤN PHÁT Trong những năm gần đây, vấn đề sức khỏe ngày càng được quan tâm đặc biệt là trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn, vi nấm gây ra. albicans là mầm bệnh đa kháng thuốc mới được tìm thấy ở các vị trí giải phẫu của người khỏe mạnh, gây nhiễm trùng toàn thân và bề mặt trong điều kiện môi trường tối ưu (Federico và cs.

albicans là một trong những vi nấm gây bệnh nguy hiểm nhất ở người, chiếm 6,8% các bệnh gây nhiễm trùng ở những bệnh nhân bị ức chế miễn dịch (Mohamed và cs. Ở hệ tiêu hóa và miệng, C. albicans chiếm khoảng 40-60% ở người lớn khỏe mạnh (Odds, 1988). albicans là tác nhân gây bệnh ở da, móng và niêm mạc.

Vi nấm có thể xâm nhập vào máu và các cơ quan gây nhiễm khuẩn huyết và bệnh nấm nội tạng rất nguy hiểm (Maheshwari và cs. Nấm gây bệnh ngày càng trở thành một vấn đề lớn và khó kiểm soát, làm phá vỡ hệ vi sinh vật, giảm khả năng miễn dịch (Sirirak và cs. Hiện nay, với sự phát triển của y học, thực vật được xem là nguồn thảo dược thay thế lý tưởng vì mức độ an toàn, ít tác dụng phụ và ít có nguy cơ gây ra sự kháng thuốc (Raskin và cs. Chiết xuất các thành phần có trong thực vật và chế phẩm thảo dược có đặc tính kháng khuẩn, kháng nấm có ý nghĩa lớn trong các phương pháp điều trị (Sasidharan và cs.

Các loài thực vật này dễ tìm trong tự nhiên do đó đã thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu hóa sinh và y dược học trong nước cũng như trên thế giới (Đỗ Tất Lợi, 2006). Sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) là một dược liệu phổ biến ở Việt Nam, có nhiều tác dụng dược lý trong đó có điều trị mụn nhọt, viêm da, lở ngứa, vảy nến. Nghiên cứu này đánh giá hoạt tính kháng vi nấm gây bệnh của cao chiết từ củ sâm đại hành (Insanua và cs. Một số nghiên cứu trước đây đã cho thấy rằng, sâm đại hành được sử dụng làm thuốc chống ung thư trong y học dân gian, tăng huyết áp, giảm cholesterol, điều trị các bệnh về da ở người (Padhi và cs.

SVTH: NGUYỄN THỊ TRÚC LY KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 3 GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH TS. NGUYỄN TẤN PHÁT Chiết xuất dichloromethane từ củ của Eleutherine bulbosa (Miller) cho thấy hoạt động kháng nấm Cladosporium sphaerospermum mạnh (Alves và cs. Cao chiết bằng ethanol của củ Eleutherine americana có khả năng kháng với tất cả 6 chủng Gram dương thử nghiệm (đường kính vòng kháng khuẩn từ 13-20 mm), kháng 1 trong 7 Gram âm thử nghiệm và các chủng nấm Aspergillus niger, Rhizopus spp., tuy nhiên không kháng lại các chủng nấm da (Ifesan và cs.

Keuk-Jun và cộng sự (2008), đã nghiên cứu tác dụng chống nấm của các hạt nano-bạc. Cho thấy các hạt nano-bạc có tác dụng chống nấm, làm tan máu chống lại hồng cầu của người. Sử dụng dòng chảy tế bào học để phân tích, lượng glucose được giải phóng và sự thay đổi của màng động lực học 1,6-diphenyl-1,3,5- hexatriene (DPH) như một đầu dò plasma, được thực hiện dựa trên vi nấm C. albicans (Keuk-Jun và cs.

Theo nghiên cứu của Wahyuni và cộng sự (2016), chiết xuất của Eleutherine palmifolia từ dung môi ethanol 70% và nước có tác dụng ức chế C. Hoạt tính kháng nấm được thực hiện bằng phương pháp giếng thạch và cho kết quả khả năng ức chế của mỗi chiết xuất là 65,44% và 54,78% (Wahyuni và cs. Mặc dù, sâm đại hành đã được sử dụng trong y học cổ truyền từ rất lâu nhưng hiện nay trong nước các nghiên cứu, bài báo khoa học về khả năng chữa bệnh trong các bộ phận của cây sâm đại hành còn rất hạn chế cũng như còn khá ít các nghiên cứu về khả năng kháng nấm da của cao chiết sâm đại hành. Do đó, tôi tiến hành khảo sát khả năng kháng C.

albicans từ các phân đoạn của cao ethyl acetate đồng thời phân lập và tinh chế các hợp chất có hoạt tính sinh học nói trên. Chính vì thế, chúng tôi thực hiện đề tài “PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG Candida albicans TỪ CAO CHIẾT ETHYL ACETATE CỦA SÂM ĐẠI HÀNH (Eleutherine subaphylla Gagnep. SVTH: NGUYỄN THỊ TRÚC LY KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 4 GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH TS.

NGUYỄN TẤN PHÁT Mục tiêu: Phân lập và tinh chế hợp chất có khả năng kháng Candida albicans của cao chiết ethyl acetate từ sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep. Nội dung: − Thu nhận cao chiết sâm đại hành bằng dung môi ethyl acetate. − Đánh giá giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết. − Điều chế các phân đoạn cao ethyl acetate bằng phương pháp sắc kí cột.

− Khảo sát khả năng kháng C. albicans của các phân đoạn cao ethyl acetate. − Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với C. − Khảo sát khả năng kháng C.

albicans của các hợp chất thu nhận được bằng phương pháp tự sinh đồ. − Khảo sát cao phân đoạn bằng phương pháp sắc kí bản mỏng (TLC). − Phân lập và tinh chế hợp chất có khả năng kháng C. SVTH: NGUYỄN THỊ TRÚC LY KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 5 GVHD: ThS.

DƯƠNG NHẬT LINH TS. NGUYỄN TẤN PHÁT PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH: NGUYỄN THỊ TRÚC LY KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 6 GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH TS. NGUYỄN TẤN PHÁT 1.

SƠ LƯỢC VỀ CÂY SÂM ĐẠI HÀNH (Eleutherine subaphylla Gagnep. Phân loại khoa học Giới: Plantae Ngành: Angiospermae Lớp: Monocots Bộ: Asparagales Họ: Iridaceae (họ La dơn) Chi: Eleutherine Loài: Eleutherine subaphylla Hình 1. Cây sâm đại hành Gagnep. (Eleutherine subaphylla Gagnep.com/vithuoc/samdaihanh.htm) Tên khoa học: Eleutherine subaphylla Gagnep.

Tên đồng nghĩa: Eleutherine bulbosa (Mill. Còn gọi là: tỏi lào, sâm cau, sâm đại hành, hành lào (Hòa Bình), tỏi mọi, kiệu đỏ, cỏ nhọt (Lào), phong nhan, hom búa lượt (Thái). Người ta dùng củ tươi hay phơi hoặc sấy khô của cây sâm đại hành làm thuốc với tên khoa học Bul-bus Eleutherine subaphylla (Đỗ Tất Lợi, 2006). Đặc điểm hình thái Sâm đại hành là một loại cây cỏ sống lâu năm, cao từ 30-60 cm, dò (củ) hình trứng dài 4-5 cm, đường kính 2-3 cm giống như củ hành nhưng dài hơn, ngoài phủ vảy màu đỏ nâu, phía trong màu nâu hồng đến đỏ nâu.

Lá hình mác, gân lá song song, chạy dọc, trong giống như lá cau non, củ lại có tác dụng bổ cho nên có tên sâm cau (lá như lá cau, bổ như sâm), lá có thể dài 40-50 cm, rộng 3-5 cm. Từ củ SVTH: NGUYỄN THỊ TRÚC LY KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 7 GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH TS. NGUYỄN TẤN PHÁT mọc lên một cán mang hoa dài 30-40 cm, trên cán có một lá dài 15-25 cm, hoa mọc thành chùm 3 lá đài, 3 cánh tràng màu trắng hay vàng nhạt, 3 nhị màu vàng.

Bầu hình trứng, 3 cạnh 3 ngăn dài 1 mm, vòi dài 2,5 mm, trên xẻ thành 3 trông như 3 mũi dùi (Đỗ Tất Lợi, 2006). Phân bố, thu hái và chế biến Sâm đại hành mọc hoang và được trồng lấy củ (dò) làm thuốc tại nhiều nơi như Hà Tây, Hòa Bình, Nghĩa Lộ, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Nam, Đà Nẵng, Hà Nội cũng có một số nhà trồng. Trồng sâm đại hành rất đơn giản: chỉ việc dùng củ vùi xuống đất như trồng hành, trồng tỏi. Mùa hoa: tháng 4-6.

Khi thu hoạch, đào lấy củ về, rửa sạch, bóc lớp vỏ bên ngoài, thái mỏng dùng tươi hoặc phơi hay sấy khô, rồi để nguyên hay tán bột mà dùng. Nó có vị đắng, mùi hơi hắc (Đỗ Tất Lợi, 2006). Thành phần hóa học Năm 1975, Bianchi và cộng sự đã cô lập từ cây sâm đại hành hai hợp chất là eleutherin và eleutherol (Bianchi và cs. Năm 1982, từ sâm đại hành người ta đã phân lập được một anthraquinon mới là anthracene-9,10-dione-1,5-diol-4-methoxy-3-methyl-2-cacboxylic acid methyl ester (Weniger B và cs.

Công thức hóa học của eleutherol và anthracene-9,10-dione-1,5-diol- 4-methoxy-3-methyl-2-cacboxylic acid methyl ester SVTH: NGUYỄN THỊ TRÚC LY KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 8 GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH TS. NGUYỄN TẤN PHÁT Dựa theo thành phần hóa học đã được nghiên cứu của cây Eleutherine bulbosa Mill. Lê Văn Hồng và Nguyễn Văn Đàn (1973) đã tiến hành nghiên cứu củ sâm đại hành đã chiết và xác định được 4 chất là eleutherin C16H16O4 độ chảy 175o, izoeleutherin C16H16O4 độ chảy 177o, eleutherola C14H12O4 độ chảy 202-203o và một chất chưa xác định được đặt tên là Ex.

Sắc kí lớp mỏng của dịch chiết còn cho biết có 16 vết trong đó 9 vết màu vàng đậm nhạt khác nhau, 6 vết phát quang lơ và một vết màu hồng nhạt. Cả 3 hoạt chất đều có tác dụng kháng sinh đối với chủng S. aureus (Lê Văn Hồng, Nguyễn Văn Đàn. Theo một công bố mới và đầy đủ nhất năm 2010 về thành phần hóa học của cây sâm đại hành, 4 hợp chất polyketit mới được phân lập gồm (R)-4-hydroxy eleutherin, eleuthone, eleutherinol-8-O-D-glucoside và isoeleuthoside C (dihydroisoeleutherin-5-O-D-gentiobioside) cùng với các chất đã được phân lập trước đó gồm eleutherin, isoeleutherin, eleutherinol, eleutherol, eleuthoside B (eleutherol-4-O-D-gentiobioside), eleuthoside C (dihydroeleutherin-5-O- Dgentiobioside), elecanacin và hongconin (4-oxodihydroisoeleutherin).

SVTH: NGUYỄN THỊ TRÚC LY KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 9 GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH TS. NGUYỄN TẤN PHÁT Hình 1. Công thức hóa học của (R)-4-hydroxy eleutherin, eleuthone, eleutherinol-8-O-D-glucoside, isoeleuthoside C, eleutherinol, eleuthoside B, eleuthoside C, elecanacin và hongconin 1.

Tác dụng dược lý Tác dụng kháng sinh: dịch chiết sâm đại hành tẩm giấy có đường kính 10 mm đặt trên thạch có cấy vi khuẩn có tác dụng hạn chế sinh sản của vi khuẩn D. hemopyticus, Staphylococcus spp. Tác dụng yếu hơn đối với Shigella flexneri, Shiga spp., Bacillus mycoides, Bacillus anthracis. Không có tác dụng đối với E.

Tác dụng chống viêm: làm giảm phản ứng phù thực nghiệm trên chân chuột (thí nghiệm so sánh với hydrocortisone thấy gần tương tự). Sâm đại hành còn được một số nước trên thế giới sử dụng làm thuốc diệt giun sán, thuốc chữa các bệnh về kinh nguyệt, các bệnh rối loạn hay nhiễm khuẩn đường ruột và làm thuốc chống sinh sản quá nhanh và đẻ non (Paramapojna và cs. Công dụng Sâm đại hành được dùng làm: thuốc bổ máu chữa thiếu máu, vàng da, xanh xao, hoa mắt, choáng váng, nhức đầu, mệt mỏi. Thuốc cầm máu dùng trong băng huyết, ho ra máu, bị thương chảy máu (dùng củ tươi, giã đắp).

Còn dùng chữa ho gà, viêm họng, mụn nhọt, chốc lở. Ở Indonesia, rễ sâm đại hành được dùng theo kinh nghiệm dân gian làm thuốc lợi tiểu, trị lỵ, viêm và sa trực tràng. Ở Philippines, người dân dùng rễ củ giã nát SVTH: NGUYỄN THỊ TRÚC LY KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 10 GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH TS.

NGUYỄN TẤN PHÁT đắp lên vết cắn của cá độc, để nhổ gai ở chân, và đắp vào vết đốt của sâu bọ, vết thương, nhọt. Rễ củ nướng, giã nát, xát vào bụng chữa đau bụng.