Phân lập và tinh chế hợp chất có khả năng kháng candida albicans từ cao chiết ethyl acetate của sâm đại hành eleutherine subaphylla gagnep

Nghiên cứu phân lập và tinh chế hợp chất kháng Candida albicans từ cao chiết ethyl acetate của sâm đại hành Eleutherine subaphylla.

• Tác giả: Nguyễn Thị Trúc Ly
• Người hướng dẫn: ThS. Dương Nhật Linh
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học - Y Dược
• Đề tài: Phân Lập Và Tinh Chế Hợp Chất Có Khả Năng Kháng Candida albicans Từ Cao Chiết Ethyl Acetate Của Sâm Đại Hành
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. SƠ LƯỢC VỀ CÂY SÂM ĐẠI HÀNH (Eleutherine subaphylla Gagnep.)
• 1.2. Phân loại khoa học
• 1.3. Đặc điểm hình thái
• 1.4. Phân bố, thu hái và chế biến
• 1.5. Thành phần hóa học
• 1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA SÂM ĐẠI HÀNH
• 1.6.1. Trên thế giới
• 1.6.2. Tại Việt Nam
• 1.7. TỔNG QUAN VỀ VI NẤM C.
• 1.8. KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT
• 1.8.1. Kỹ thuật chiết (Maceration)
• 1.8.2. Phương pháp chiết lỏng - lỏng
• 1.8.3. Cô đặc và sấy khô
• 1.8.4. Phương pháp sắc kí bản mỏng
• 1.8.5. Phương pháp sắc kí cột
• 1.8.6. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất
• 2. PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 2.3. Đối tượng nghiên cứu
• 2.4. Thiết bị, dụng cụ và môi trường
• 2.5. SƠ ĐỒ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
• 2.6. THU NHẬN CAO CHIẾT SÂM ĐẠI HÀNH BẰNG DUNG MÔI ETHYL ACETATE
• 2.7. XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN CỦA CAO CHIẾT
• 2.8. ĐIỀU CHẾ CÁC PHÂN ĐOẠN CAO ETHYL ACETATE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ CỘT
• 2.9. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG C. albicans CỦA CAO CHIẾT
• 2.9.1. Khảo sát khả năng kháng C. albicans của các cao chiết từ sâm đại hành bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
• 2.9.2. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi nấm C.
• 2.9.3. Khảo sát khả năng kháng C. albicans của các hợp chất thu nhận được bằng phương pháp tự sinh đồ
• 2.10. KHẢO SÁT CAO PHÂN ĐOẠN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ BẢN MỎNG
• 2.11. PHÂN LẬP, TINH CHẾ HỢP CHẤT THU ĐƯỢC
• 2.12. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT THU ĐƯỢC
• 3. PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. THU NHẬN CAO CHIẾT SÂM ĐẠI HÀNH BẰNG DUNG MÔI ETHYL ACETATE
• 3.2. ĐÁNH GIÁ GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN CỦA CAO CHIẾT
• 3.3. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG C. albicans CỦA CAO ETHYL ACETATE
• 3.3.1. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CỦA CAO CHIẾT VỚI VI NẤM C.
• 3.3.2. ĐIỀU CHẾ CÁC PHÂN ĐOẠN CỦA CAO ETHYL ACETATE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ CỘT
• 3.3.3. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG C.
• 3.3.4. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG C. albicans CỦA CÁC HỢP CHẤT THU NHẬN ĐƯỢC BẰNG PHƯƠNG PHÁP TỰ SINH ĐỒ
• 3.4. SẮC KÍ CỘT CAO CHIẾT
• 3.5. KHẢO SÁT CÁC PHÂN ĐOẠN CAO ES - EA1
• 3.6. TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT ES08
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1: XỬ LÍ SỐ LIỆU THỐNG KÊ
• PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ GIẢI PHỔ ES08

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Kháng Candida albicans Từ Sâm Đại Hành

Nghiên cứu kháng vi nấm Candida albicans từ sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) đang thu hút sự chú ý trong lĩnh vực y học. Candida albicans là một trong những tác nhân gây bệnh phổ biến, đặc biệt ở những người có hệ miễn dịch yếu. Sâm đại hành, với các hợp chất sinh học có khả năng kháng nấm, được xem là một giải pháp tiềm năng trong điều trị. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về tác dụng của sâm đại hành mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các loại thuốc kháng nấm tự nhiên.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Kháng Nấm

Nghiên cứu kháng nấm là một lĩnh vực quan trọng trong y học hiện đại. Candida albicans gây ra nhiều bệnh lý nghiêm trọng, đặc biệt ở những bệnh nhân có hệ miễn dịch suy yếu. Việc tìm kiếm các phương pháp điều trị hiệu quả từ thiên nhiên như sâm đại hành có thể giúp giảm thiểu tác dụng phụ và kháng thuốc.

1.2. Giới Thiệu Về Sâm Đại Hành

Sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) là một loại thảo dược quý, được sử dụng trong y học cổ truyền. Nó không chỉ có tác dụng kháng nấm mà còn hỗ trợ điều trị nhiều bệnh lý khác. Nghiên cứu về thành phần hóa học của sâm đại hành cho thấy sự hiện diện của các hợp chất có hoạt tính sinh học cao.

II. Vấn Đề Kháng Thuốc Trong Điều Trị Candida albicans

Kháng thuốc là một trong những thách thức lớn trong điều trị nhiễm trùng do Candida albicans. Sự gia tăng kháng thuốc đã làm cho việc điều trị trở nên khó khăn hơn, đặc biệt là ở những bệnh nhân có hệ miễn dịch yếu. Việc tìm kiếm các phương pháp điều trị mới, an toàn và hiệu quả là rất cần thiết.

2.1. Nguyên Nhân Kháng Thuốc

Kháng thuốc xảy ra do nhiều nguyên nhân, bao gồm việc sử dụng kháng sinh không đúng cách và sự phát triển của các chủng vi nấm kháng thuốc. Điều này dẫn đến việc điều trị trở nên kém hiệu quả và tăng nguy cơ nhiễm trùng nghiêm trọng.

2.2. Hệ Quả Của Kháng Thuốc

Kháng thuốc không chỉ làm tăng tỷ lệ tử vong mà còn kéo dài thời gian điều trị và tăng chi phí y tế. Điều này đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc phát triển các phương pháp điều trị mới, bao gồm việc sử dụng các thảo dược như sâm đại hành.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Kháng Candida albicans Từ Sâm Đại Hành

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp hiện đại để phân lập và tinh chế các hợp chất có khả năng kháng Candida albicans từ cao chiết ethyl acetate của sâm đại hành. Các phương pháp này bao gồm chiết xuất, sắc ký và khảo sát hoạt tính kháng nấm.

3.1. Quy Trình Chiết Xuất Cao Từ Sâm Đại Hành

Quy trình chiết xuất cao từ sâm đại hành được thực hiện bằng dung môi ethyl acetate. Phương pháp này giúp thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học cao, từ đó đánh giá khả năng kháng nấm của chúng.

3.2. Phương Pháp Sắc Ký Phân Đoạn

Sắc ký cột được sử dụng để phân đoạn cao chiết, giúp tách biệt các hợp chất có khả năng kháng nấm. Phương pháp này cho phép xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học và đánh giá hiệu quả của chúng đối với Candida albicans.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Kháng Candida albicans Từ Sâm Đại Hành

Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết từ sâm đại hành có khả năng kháng Candida albicans mạnh mẽ. Các phân đoạn thu được từ sắc ký cột đã được khảo sát và cho thấy hoạt tính kháng nấm đáng kể, mở ra hướng đi mới trong điều trị nhiễm trùng do nấm.

4.1. Khảo Sát Hoạt Tính Kháng Nấm

Các phân đoạn cao chiết từ sâm đại hành được khảo sát khả năng kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch. Kết quả cho thấy nhiều phân đoạn có khả năng ức chế sự phát triển của Candida albicans.

4.2. Xác Định Nồng Độ Ức Chế Tối Thiểu MIC

Nghiên cứu xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các phân đoạn cao chiết đối với Candida albicans. Kết quả cho thấy nồng độ này thấp, cho thấy tiềm năng điều trị cao của sâm đại hành.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu Kháng Nấm

Nghiên cứu về khả năng kháng Candida albicans từ sâm đại hành không chỉ có ý nghĩa trong việc phát triển thuốc kháng nấm mới mà còn mở ra cơ hội cho việc ứng dụng trong y học cổ truyền. Các sản phẩm từ sâm đại hành có thể được sử dụng như một phương pháp điều trị bổ sung hiệu quả.

5.1. Phát Triển Sản Phẩm Từ Sâm Đại Hành

Các sản phẩm chiết xuất từ sâm đại hành có thể được phát triển thành thuốc kháng nấm tự nhiên. Điều này không chỉ giúp nâng cao hiệu quả điều trị mà còn giảm thiểu tác dụng phụ so với các loại thuốc kháng nấm hiện có.

5.2. Ứng Dụng Trong Y Học Cổ Truyền

Sâm đại hành đã được sử dụng trong y học cổ truyền từ lâu. Nghiên cứu này khẳng định thêm giá trị của nó trong việc điều trị các bệnh lý do nấm, mở ra hướng đi mới cho việc ứng dụng các thảo dược trong y học hiện đại.

VI. Kết Luận Và Tương Lai Của Nghiên Cứu Kháng Nấm

Nghiên cứu kháng Candida albicans từ sâm đại hành đã chỉ ra tiềm năng lớn của thảo dược này trong điều trị nhiễm trùng do nấm. Các kết quả đạt được mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các sản phẩm kháng nấm tự nhiên, góp phần vào việc giải quyết vấn đề kháng thuốc hiện nay.

6.1. Tóm Tắt Kết Quả Nghiên Cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy sâm đại hành có khả năng kháng Candida albicans mạnh mẽ. Các hợp chất được phân lập từ cao chiết cho thấy hoạt tính sinh học cao, mở ra cơ hội cho việc phát triển thuốc kháng nấm mới.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của các hợp chất trong sâm đại hành. Việc phát triển các sản phẩm từ sâm đại hành cần được chú trọng để ứng dụng rộng rãi trong điều trị nhiễm trùng do nấm.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Nhiễm trùng do vi nấm gây ra, đặc biệt là các chủng nấm cơ hội như Candida albicans, đang trở thành mối đe dọa nghiêm trọng đối với sức khỏe cộng đồng. C. albicans là loại vi nấm men đa hình (có khả năng tồn tại ở dạng nấm men hình trứng, giả sợi hoặc sợi nấm thực thụ), ký sinh thông thường tại niêm mạc miệng, đường tiêu hóa và âm đạo ở 40–60% người khỏe mạnh. Tuy nhiên, khi hệ miễn dịch của vật chủ suy giảm hoặc hệ vi sinh vật tự nhiên bị mất cân bằng, C. albicans có thể xâm nhập sâu vào các mô, gây nhiễm trùng bề mặt (da, móng, niêm mạc) hoặc đi vào tuần hoàn máu gây nhiễm nấm nội tạng và nhiễm khuẩn huyết nguy hiểm. Theo các thống kê lâm sàng được tác giả trích dẫn, C. albicans chiếm 6,8% các ca nhiễm trùng ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch, chịu trách nhiệm cho 15% tổng số ca nhiễm trùng huyết và tới 40% các trường hợp nhiễm trùng máu trong môi trường bệnh viện.

Sự gia tăng nhanh chóng của các chủng C. albicans kháng thuốc tổng hợp và các tác dụng phụ không mong muốn của phác đồ điều trị hiện hành thúc đẩy nhu cầu tìm kiếm các hoạt chất kháng nấm mới có nguồn gốc từ tự nhiên. Trong số các thảo dược bản địa tại Việt Nam, sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep., đồng nghĩa Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb., thuộc họ La dơn - Iridaceae) là cây thuốc dân gian lâu đời, thường dùng trong điều trị viêm da, mụn nhọt, lở ngứa, vảy nến, thiếu máu và cầm máu. Các nghiên cứu hóa thực vật trước đây chỉ ra rằng thân hành (củ) của chi Eleutherine chứa nhiều hợp chất nhóm quinonoid, anthraquinone và polyketit có hoạt tính kháng khuẩn, chống oxy hóa. Mặc dù vậy, các nghiên cứu chuyên sâu tại Việt Nam về hoạt tính ức chế vi nấm gây bệnh trên da, đặc biệt là việc phân lập định danh hoạt chất kháng C. albicans từ phân đoạn cao ethyl acetate của sâm đại hành, còn rất hạn chế. Xuất phát từ thực tế đó, đề tài "Phân lập và tinh chế hợp chất có khả năng kháng Candida albicans từ cao chiết ethyl acetate của sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.)" được tác giả Nguyễn Thị Trúc Ly thực hiện.

Mục tiêu tổng quát của khóa luận là phân lập và tinh chế hợp chất có hoạt tính kháng vi nấm C. albicans từ cao chiết ethyl acetate của củ sâm đại hành. Để đạt được mục tiêu này, nghiên cứu đặt ra 8 nội dung và nhiệm vụ cụ thể:

1. Thu nhận cao chiết sâm đại hành bằng dung môi ethyl acetate.
2. Đánh giá giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết theo tiêu chuẩn Dược điển.
3. Điều chế các phân đoạn cao ethyl acetate bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển.
4. Khảo sát khả năng kháng C. albicans của các phân đoạn cao ethyl acetate.
5. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết đối với vi nấm C. albicans.
6. Khảo sát khả năng kháng C. albicans của các hợp chất thu nhận được bằng phương pháp tự sinh đồ.
7. Khảo sát cao chiết phân đoạn bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC).
8. Phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc hóa học của hợp chất sạch thu nhận được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng thực vật: Mẫu củ cây sâm đại hành tươi thu mua tại tỉnh Đồng Tháp, được giám định khoa học chính xác tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
• Đối tượng vi sinh vật: Chủng nấm men kiểm định Candida albicans do Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh cung cấp.
• Phạm vi thời gian: Nghiên cứu được triển khai từ tháng 10/2019 đến tháng 07/2020.
• Phạm vi không gian: Các thí nghiệm vi sinh và chiết xuất ban đầu được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh, Trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh; các nội dung sắc ký phân lập và tinh sạch hợp chất được thực hiện tại Phòng 19 và Phòng 44 thuộc Phòng các chất có hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên nền tảng hóa thực vật học về các nhóm hợp chất thứ cấp trong chi Eleutherine, các tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu theo Dược điển Việt Nam IV (2009) và các quy chuẩn thử nghiệm vi sinh vật in vitro. Về mặt hóa học, củ sâm đại hành được ghi nhận chứa các thành phần chủ yếu thuộc nhóm quinone (eleutherin, isoeleutherin, eleutherol, eleutherinone, hongconin) và dẫn xuất anthraquinone. Về mặt dược điển, chất lượng cao dược liệu phải đảm bảo các chỉ tiêu cảm quan, độ ẩm, độ tan và giới hạn nhiễm khuẩn (tổng vi khuẩn hiếu khí không quá 5×10⁴ CFU/g; tổng nấm men, nấm mốc không quá 500 CFU/g; không chứa vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli và Salmonella).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm đã được áp dụng đồng bộ qua các giai đoạn:

• Quy trình trích ly và phân đoạn: Áp dụng phương pháp chiết rắn – lỏng kết hợp chiết lỏng – lỏng. Củ sâm đại hành sau khi rửa sạch, thái mỏng, sấy khô ở 50°C trong 72 giờ và xay thành bột mịn được trích ly bằng phương pháp ngâm dầm (maceration) với ethanol 96° ở nhiệt độ phòng theo tỷ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:5 (w/v) trong thời gian 72 giờ. Dịch chiết ethanol được lọc, thu hồi dung môi bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ 50°C để tạo thành cao thô. Cao thô tiếp tục được phân tán vào nước cất theo tỷ lệ 1:10 (w/v) rồi tiến hành chiết phân bố lỏng – lỏng lần lượt với n-hexane và ethyl acetate để thu phân đoạn cao ethyl acetate.
• Kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn: Thực hiện theo Dược điển Việt Nam IV; mẫu cao ethyl acetate được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO) nồng độ 1 mg/mL, pha loãng bậc 10 bằng dung dịch NaCl 0,85%, cấy trang trên môi trường Nutrient Agar (NA) ủ ở 37°C trong 24–48 giờ để đếm tổng vi khuẩn hiếu khí, và trên môi trường Sabouraud Dextrose Agar (SDA) ủ ở 28–30°C trong 5 ngày để định lượng nấm men, nấm mốc.
• Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm:
  • Phương pháp khuếch tán giếng thạch (agar well diffusion): Môi trường thạch Sabouraud được trải đều huyền dịch C. albicans có mật độ tế bào đạt chuẩn 0,5 McFarland (tương đương 10⁶ CFU/mL, kiểm soát OD₆₀₀ từ 0,08 đến 0,1). Cao chiết pha trong DMSO (tỷ lệ 1:5) được nạp vào các giếng thạch đường kính 6 mm với thể tích 70 µL/giếng, DMSO nguyên chất dùng làm đối chứng âm. Đĩa thạch được khuếch tán ở 4°C trong 15 phút, sau đó nuôi ủ ở 27°C trong 3–5 ngày; hoạt tính được đánh giá qua đường kính vòng vô khuẩn (mm) với 3 lần lặp lại độc lập.
  • Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Pha loãng mẫu cao ethyl acetate theo cấp số nhân trong dung môi DMSO 10% để tạo thành dãy nồng độ giảm dần từ 1000 µg/mL xuống 500; 250; 125; 62,5; 31,25 và 15,63 µg/mL trong môi trường SDA. Chấm dịch vi nấm (10⁶ CFU/mL) lên bề mặt thạch, ủ ở 27°C trong 36–48 giờ, xác định MIC là nồng độ thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phát triển của khuẩn lạc hoặc chỉ cho phép dưới 3 khuẩn lạc xuất hiện.
  • Phương pháp tự sinh đồ (TLC bioautography): Tấm sắc ký lớp mỏng sau khi khai triển được sấy khô để bay hết dung môi, đặt vào đĩa petri vô trùng và phun đều dịch nấm C. albicans (nồng độ 10⁶ CFU/mL chuẩn bị từ huyền dịch có OD₅₃₀ từ 0,08 đến 0,12). Ủ tấm TLC ở 25°C trong 48 giờ, sau đó phun dung dịch muối tetrazolium và ủ tiếp ở 25°C trong 24 giờ (hoặc 37°C trong 3–4 giờ). Enzyme dehydrogenase của tế bào nấm sống khử muối tetrazolium thành phức màu tím (formazan), qua đó vùng xuất hiện vệt màu trắng sáng trên nền tím thể hiện vị trí của chất có hoạt tính ức chế vi nấm.
• Phương pháp sắc ký và xác định cấu trúc: Sắc ký cột (CC) sử dụng pha tĩnh là silica gel pha thường (Merck, cỡ hạt 0,040–0,063 mm, 240–430 mesh), rửa giải bằng các hệ dung môi gradient từ n-hexane : ethyl acetate đến ethyl acetate : methanol. Sắc ký lớp mỏng (TLC) thực hiện trên bản nhôm tráng sẵn silica gel DC-Alufolien 60F₂₅₄ (Merck). Cấu trúc hợp chất phân lập sạch được xác định bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (¹H-NMR ở tần số 500 MHz và ¹³C-NMR ở tần số 125 MHz) đo trên thiết bị Bruker Avance 500 tại Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), sử dụng dung môi DMSO-d₆.

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Tổng quan tài liệu

Chương này hệ thống hóa các tài liệu khoa học liên quan đến thực vật sâm đại hành, đặc điểm sinh học vi nấm C. albicans và các phương pháp nghiên cứu hóa học. Tác giả trình bày vị trí phân loại học của loài Eleutherine subaphylla Gagnep. (họ Iridaceae, bộ Asparagales, phân bố tại các tỉnh Hòa Bình, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Nam, Đà Nẵng, Đồng Tháp), kèm theo mô tả hình thái thân hành vỏ vảy đỏ nâu, lá hình mác có gân song song. Về thành phần hóa học, chương tổng hợp các mốc nghiên cứu tiêu biểu: Bianchi và cộng sự (1975) phân lập eleutherin và eleutherol; Weniger và cộng sự (1982) phân lập dẫn xuất anthraquinone; Lê Văn Hồng và Nguyễn Văn Đàn (1973) xác định 4 chất từ sâm đại hành Việt Nam có hoạt tính ức chế Staphylococcus aureus; nghiên cứu năm 2010 cô lập 4 hợp chất polyketit mới cùng 8 dẫn xuất quinone.

Về hoạt tính sinh học, chương dẫn chứng các công bố quốc tế: Alves và cộng sự (2003) chứng minh phân đoạn dichloromethane của E. bulbosa kháng nấm Cladosporium sphaerospermum; Ifesan và cộng sự (2009, 2010) ghi nhận dịch chiết E. americana kháng 6 chủng vi khuẩn Gram dương (vòng vô khuẩn 13–20 mm) và các nấm Aspergillus niger, C. albicans; Wahyuni và cộng sự (2016) chứng minh cao ethanol 70% và cao nước của E. palmifolia ức chế C. albicans lần lượt là 65,44% và 54,78%. Tại Việt Nam, các công trình của Trương Minh Lương và cộng sự (2010), Huỳnh Kim Diệu (2011), Nguyễn Thị Hồng Vân và cộng sự (2013) đã khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn và dẫn xuất từ sâm đại hành. Phần còn lại của chương trình bày chi tiết về bệnh học vi nấm C. albicans, tỷ lệ nhiễm nấm lâm sàng tại Việt Nam (nghiên cứu tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới TP.HCM ghi nhận tỷ lệ nhiễm Candida đường niệu chiếm 3,67%, trong đó C. albicans chiếm 47,8%; báo cáo tại Bệnh viện Đại học Y Dược Huế ghi nhận tổn thương nấm da, tóc, móng đạt 51,81%), cùng các nguyên lý chiết xuất ngâm dầm, chiết lỏng – lỏng, sắc ký cột, sắc ký bản mỏng và kỹ thuật giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân.

Phần 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả toàn bộ quy trình bố trí thí nghiệm, nguyên vật liệu, hóa chất và trang thiết bị phục vụ nghiên cứu. Tác giả cung cấp sơ đồ quy trình từ khâu xử lý dược liệu thô, chiết xuất thu cao ethyl acetate, đánh giá giới hạn vi sinh vật, thử nghiệm hoạt tính sinh học sơ bộ bằng giếng thạch, xác định MIC, chạy sắc ký cột thu các phân đoạn nhỏ, sàng lọc hoạt tính bằng tự sinh đồ, đến khâu tinh sạch và phân tích cấu trúc hóa học. Toàn bộ thông số vận hành như tỷ lệ dung môi, nhiệt độ sấy (50°C), nồng độ McFarland huyền dịch nấm (0,5 McFarland tương đương 10⁶ CFU/mL), kích thước giếng thạch (6 mm), thể tích mẫu nạp (70 µL), các công thức tính mật độ vi sinh vật (CFU/g) và tỷ lệ hiệu suất thu hồi cao (%) đều được quy chuẩn hóa chi tiết nhằm đảm bảo tính lặp lại của thực nghiệm.

Phần 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình nghiên cứu:

• Đánh giá giới hạn nhiễm khuẩn: Kết quả kiểm tra mẫu cao ethyl acetate sâm đại hành cho thấy tổng số vi khuẩn hiếu khí là 1,81×10⁴ CFU/g, hoàn toàn nằm trong giới hạn cho phép của Dược điển Việt Nam IV (tiêu chuẩn ≤ 5×10⁴ CFU/g). Chỉ tiêu tổng số nấm men và nấm mốc đạt kết quả âm tính (-) (dưới 10 CFU/g, đáp ứng yêu cầu ≤ 500 CFU/g), khẳng định cao chiết đạt độ vô trùng cần thiết để tiếp tục các thử nghiệm sinh học.
• Hoạt tính kháng C. albicans và giá trị MIC: Thử nghiệm khuếch tán giếng thạch của cao ethyl acetate cho đường kính vòng ức chế vi nấm ổn định qua 3 lần lặp lại lần lượt là 16 mm, 15 mm và 16 mm. Khi tiến hành xác định nồng độ ức chế tối thiểu, cao ethyl acetate ức chế hoàn toàn sự phát triển của C. albicans tại nồng độ MIC = 31,25 µg/mL (ở các nồng độ 500; 250; 125; 62,5 và 31,25 µg/mL nấm hoàn toàn không mọc; tại nồng độ 15,63 µg/mL vi nấm bắt đầu phát triển). Giá trị MIC này thể hiện hoạt tính mạnh hơn đáng kể khi đối chiếu với công bố của Scorzoni và cộng sự (2006) đối với một số cao chiết ethyl acetate khác (MIC đạt 250 µg/mL).
• Sắc ký cột phân đoạn cao ethyl acetate: Từ 58 g cao ethyl acetate ban đầu, tác giả thực hiện sắc ký cột silica gel pha thường với 5 hệ dung môi có độ phân cực tăng dần, thu được 5 phân đoạn ký hiệu từ ES-EA1 đến ES-EA5:

Ký hiệu phân đoạn	Hệ dung môi giải ly	Khối lượng thu được (g)	Tỷ lệ thu hồi (%)
ES-EA1	n-hexane : ethyl acetate (75 : 25)	3,2	5,5
ES-EA2	n-hexane : ethyl acetate (50 : 50)	3,7	6,4
ES-EA3	n-hexane : ethyl acetate (25 : 75)	7,6	13,1
ES-EA4	n-hexane : ethyl acetate (0 : 100)	16,9	29,1
ES-EA5	ethyl acetate : methanol (90 : 10)	18,5	31,9
Tổng cộng	—	49,9	86,0

Phân tích số liệu cho thấy các phân đoạn kém phân cực (ES-EA1, ES-EA2, ES-EA3) chiếm tỷ lệ khối lượng thấp (tổng cộng 25,0%), trong khi các phân đoạn phân cực trung bình và cao (ES-EA4, ES-EA5) chiếm tỷ trọng chủ yếu (chiếm 61,0% tổng khối lượng cao ban đầu).

• Khảo sát hoạt tính và phân lập hợp chất: Các phân đoạn tiếp tục được kiểm tra hoạt tính kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch và tự sinh đồ trực tiếp trên bản mỏng TLC kết hợp thuốc thử tetrazolium. Phân đoạn ES-EA1 thể hiện hoạt tính kháng nấm rõ rệt và được lựa chọn để tiếp tục triển khai sắc ký cột tinh chế. Quá trình chia nhỏ phân đoạn ES-EA1 và kết tinh phân đoạn đã phân lập thành công hợp chất sạch ký hiệu ES08.
• Nhận danh cấu trúc hóa học của ES08: Phân tích dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (¹H-NMR 500 MHz và ¹³C-NMR 125 MHz đo trong DMSO-d₆) của hợp chất ES08 cho thấy các tín hiệu dịch chuyển hóa học hoàn toàn trùng khớp với hợp chất đối chiếu là 1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone (tên thông thường là emodin, thuộc khung anthraquinone).

Kết luận và đề nghị

Phần kết luận tóm tắt các kết quả đạt được về việc điều chế cao chiết, kiểm soát giới hạn nhiễm khuẩn, chứng minh hoạt tính kháng nấm mạnh của cao ethyl acetate (MIC = 31,25 µg/mL), tách thành công 5 phân đoạn sắc ký cột và định danh hợp chất kháng nấm ES08 là 1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone. Phần kiến nghị đề xuất tiếp tục nghiên cứu các phân đoạn còn lại có hàm lượng lớn (ES-EA4, ES-EA5), mở rộng khảo sát hoạt tính trên các chủng vi nấm kháng thuốc khác và đánh giá độc tính tế bào.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu mang lại các kết quả thực nghiệm định lượng cụ thể:

• Đã xây dựng quy trình chiết xuất và thu nhận cao ethyl acetate từ bột củ sâm đại hành thông qua giai đoạn tạo cao thô ethanol 96° và chiết lỏng – lỏng phân đoạn; mẫu cao đạt chuẩn vi sinh theo Dược điển Việt Nam IV với tổng vi khuẩn hiếu khí đạt 1,81×10⁴ CFU/g (giới hạn cho phép ≤ 5×10⁴ CFU/g) và nấm mốc/nấm men dưới 10 CFU/g.
• Xác định hoạt tính kháng vi nấm Candida albicans của cao chiết ethyl acetate thông qua đường kính vòng ức chế đạt trung bình 15,67 mm và nồng độ ức chế tối thiểu MIC đạt 31,25 µg/mL.
• Phân đoạn thành công 58 g cao ethyl acetate bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển, thu hồi 49,9 g sản phẩm (hiệu suất thu hồi đạt 86,0%) chia thành 5 phân đoạn có độ phân cực tăng dần (ES-EA1: 3,2 g; ES-EA2: 3,7 g; ES-EA3: 7,6 g; ES-EA4: 16,9 g; ES-EA5: 18,5 g).
• Ứng dụng kỹ thuật tự sinh đồ kết hợp phản ứng màu tetrazolium để phát hiện trực tiếp hoạt chất kháng nấm trên bản mỏng TLC, từ đó dẫn hướng phân lập thành công hợp chất tinh khiết ES08 từ phân đoạn ES-EA1.
• Bằng phương pháp phổ ¹H-NMR và ¹³C-NMR (DMSO-d₆), đã xác định hợp chất ES08 có cấu trúc tương đồng với 1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone.

Về mặt đóng góp khoa học, đề tài đã bổ sung dữ liệu thực nghiệm về hoạt tính kháng nấm C. albicans của sâm đại hành thu hái tại khu vực Đồng Tháp, chứng minh tiềm năng kháng nấm ở dải nồng độ thấp (31,25 µg/mL) của phân đoạn ethyl acetate. Đồng thời, nghiên cứu xác lập quy trình kết hợp sắc ký phân đoạn với tự sinh đồ nhằm rút ngắn thời gian định vị và cô lập hoạt chất anthraquinone tinh khiết từ nguồn thảo dược tự nhiên.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên nội dung văn bản khóa luận, các hạn chế và hướng mở nghiên cứu được ghi nhận như sau:

• Hạn chế: Mẫu nghiên cứu thực vật mới chỉ khảo sát trên nguồn sâm đại hành thu hái tại một địa phương (tỉnh Đồng Tháp); các thử nghiệm hoạt tính sinh học chỉ giới hạn ở mô hình in vitro trên một chủng đơn vị nấm men kiểm định Candida albicans, chưa mở rộng sang các chủng nấm da lâm sàng khác (Trichophyton, Epidermophyton, Microsporum) hoặc các chủng phân lập lâm sàng kháng azole. Việc phân lập hợp chất sạch mới chỉ tập trung xử lý phân đoạn ES-EA1 (chiếm 5,5% khối lượng), chưa tách chiết triệt để các phân đoạn có tỷ trọng lớn như ES-EA4 (29,1%) và ES-EA5 (31,9%).
• Hướng nghiên cứu tiếp: Tiếp tục chạy sắc ký cột tinh chế các hợp chất có hoạt tính sinh học từ các phân đoạn phân cực cao ES-EA4 và ES-EA5; mở rộng thử nghiệm phổ kháng khuẩn, kháng nấm trên nhiều chủng vi sinh vật gây bệnh khác nhau; tiến hành khảo sát độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và độc tính tế bào in vitro; nghiên cứu cơ chế phân tử tác động lên thành tế bào hoặc màng nguyên sinh chất của vi nấm C. albicans.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Công nghệ sinh học – Y dược, Dược học và Hóa học các hợp chất thiên nhiên.

Nội dung nghiên cứu có giá trị ứng dụng cao ở các phần:

• Quy trình trích ly phân đoạn lỏng – lỏng từ cao thô ethanol sang phân đoạn ethyl acetate đạt các tiêu chuẩn kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn theo Dược điển Việt Nam IV.
• Phương pháp luận kết hợp sắc ký lớp mỏng (TLC) với kỹ thuật tự sinh đồ (bioautography) sử dụng muối tetrazolium để sàng lọc nhanh hoạt tính kháng nấm trực tiếp trên bản mỏng, giúp định hướng phân lập mà không cần thử nghiệm mù tốn kém dung môi và mẫu thử.
• Bảng thông số kỹ thuật sắc ký cột phân đoạn và bộ dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (¹H-NMR, ¹³C-NMR) của khung cấu trúc 1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone dùng làm chất đối chiếu trong phân tích cấu trúc hóa thực vật.

Câu hỏi thường gặp

1. Tiêu chuẩn nhiễm khuẩn của cao ethyl acetate từ sâm đại hành trong nghiên cứu đạt kết quả cụ thể như thế nào?
Theo kết quả thử nghiệm dựa trên Dược điển Việt Nam IV năm 2009, mẫu cao ethyl acetate sâm đại hành đạt độ sạch vi sinh tốt: tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được là 1,81×10⁴ CFU/g (thấp hơn ngưỡng giới hạn tối đa cho phép là 5×10⁴ CFU/g); tổng số nấm men và nấm mốc đạt kết quả âm tính (-), tức là dưới 10 CFU/g (đáp ứng yêu cầu giới hạn không quá 500 CFU/g).

2. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao ethyl acetate đối với vi nấm Candida albicans là bao nhiêu?
Giá trị MIC của cao ethyl acetate đối với Candida albicans được xác định chính xác là 31,25 µg/mL. Thử nghiệm pha loãng theo cấp số nhân từ 1000 µg/mL cho thấy ở các nồng độ 500; 250; 125; 62,5 và 31,25 µg/mL vi nấm hoàn toàn bị ức chế, không mọc trên đĩa thạch; vi nấm chỉ bắt đầu phát triển trở lại ở nồng độ pha loãng 15,63 µg/mL.

3. Quá trình sắc ký cột từ cao ethyl acetate đã phân tách được bao nhiêu phân đoạn và tỷ lệ thu hồi ra sao?
Từ 58 g cao ethyl acetate ban đầu, hệ thống sắc ký cột silica gel pha thường với 5 hệ dung môi gradient đã tách thành 5 phân đoạn: ES-EA1 (n-hexane : ethyl acetate 75:25) thu được 3,2 g (5,5%); ES-EA2 (n-hexane : ethyl acetate 50:50) thu được 3,7 g (6,4%); ES-EA3 (n-hexane : ethyl acetate 25:75) thu được 7,6 g (13,1%); ES-EA4 (ethyl acetate 100%) thu được 16,9 g (29,1%); ES-EA5 (ethyl acetate : methanol 90:10) thu được 18,5 g (31,9%). Tổng khối lượng các phân đoạn thu hồi là 49,9 g, tương đương hiệu suất thu hồi đạt 86,0%.

4. Kỹ thuật tự sinh đồ (bioautography) trong đề tài hoạt động theo cơ chế nào để nhận diện hoạt chất kháng nấm?
Bản mỏng sắc ký sau khi khai triển được phun đều huyền dịch vi nấm C. albicans và nuôi ủ ở 25°C trong 48 giờ, sau đó được phun dung dịch muối tetrazolium. Ở các vùng có nấm sống phát triển bình thường, enzyme dehydrogenase của nấm sẽ khử muối tetrazolium thành hợp chất formazan có màu tím sẫm. Ngược lại, tại vị trí có hợp chất kháng nấm khuếch tán, vi nấm bị tiêu diệt hoặc ức chế sinh trưởng, dehydrogenase không hoạt động, tạo nên các vệt hoặc đốm màu trắng sáng nổi bật trên nền tím.

5. Hợp chất tinh khiết ES08 được phân lập từ phân đoạn nào và được xác định có cấu trúc hóa học là gì?
Hợp chất tinh khiết ký hiệu ES08 được phân lập và kết tinh từ phân đoạn ES-EA1 (hệ dung môi n-hexane : ethyl acetate 75:25). Dựa trên kết quả đo và đối chiếu dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ¹H-NMR (500 MHz) và ¹³C-NMR (125 MHz) đo trong dung môi DMSO-d₆, cấu trúc của hợp chất ES08 được xác định là 1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone (emodin).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Trúc Ly đã hoàn thành toàn diện quy trình chiết xuất, kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn và đánh giá hoạt tính kháng vi nấm Candida albicans của cao ethyl acetate từ củ sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.). Nghiên cứu ghi nhận hoạt tính ức chế vi nấm rõ rệt của cao chiết với giá trị MIC đạt 31,25 µg/mL và đường kính vòng kháng nấm đạt 15–16 mm. Bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển kết hợp kỹ thuật tự sinh đồ định hướng, tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc của hợp chất kháng nấm ES08 tương đồng với 1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone. Kết quả này cung cấp bằng chứng thực nghiệm quan trọng, khẳng định tiềm năng ứng dụng của nguồn dược liệu sâm đại hành trong việc phát triển các chế phẩm hỗ trợ điều trị nhiễm trùng vi nấm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: NGUYỄN THỊ TRÚC LY KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2 GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH TS. NGUYỄN TẤN PHÁT Trong những năm gần đây, vấn đề sức khỏe ngày càng được quan tâm đặc biệt là trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn, vi nấm gây ra. albicans là mầm bệnh đa kháng thuốc mới được tìm thấy ở các vị trí giải phẫu của người khỏe mạnh, gây nhiễm trùng toàn thân và bề mặt trong điều kiện môi trường tối ưu (Federico và cs.

albicans là một trong những vi nấm gây bệnh nguy hiểm nhất ở người, chiếm 6,8% các bệnh gây nhiễm trùng ở những bệnh nhân bị ức chế miễn dịch (Mohamed và cs. Ở hệ tiêu hóa và miệng, C. albicans chiếm khoảng 40-60% ở người lớn khỏe mạnh (Odds, 1988). albicans là tác nhân gây bệnh ở da, móng và niêm mạc.

Vi nấm có thể xâm nhập vào máu và các cơ quan gây nhiễm khuẩn huyết và bệnh nấm nội tạng rất nguy hiểm (Maheshwari và cs. Nấm gây bệnh ngày càng trở thành một vấn đề lớn và khó kiểm soát, làm phá vỡ hệ vi sinh vật, giảm khả năng miễn dịch (Sirirak và cs. Hiện nay, với sự phát triển của y học, thực vật được xem là nguồn thảo dược thay thế lý tưởng vì mức độ an toàn, ít tác dụng phụ và ít có nguy cơ gây ra sự kháng thuốc (Raskin và cs. Chiết xuất các thành phần có trong thực vật và chế phẩm thảo dược có đặc tính kháng khuẩn, kháng nấm có ý nghĩa lớn trong các phương pháp điều trị (Sasidharan và cs.

Các loài thực vật này dễ tìm trong tự nhiên do đó đã thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu hóa sinh và y dược học trong nước cũng như trên thế giới (Đỗ Tất Lợi, 2006). Sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) là một dược liệu phổ biến ở Việt Nam, có nhiều tác dụng dược lý trong đó có điều trị mụn nhọt, viêm da, lở ngứa, vảy nến. Nghiên cứu này đánh giá hoạt tính kháng vi nấm gây bệnh của cao chiết từ củ sâm đại hành (Insanua và cs. Một số nghiên cứu trước đây đã cho thấy rằng, sâm đại hành được sử dụng làm thuốc chống ung thư trong y học dân gian, tăng huyết áp, giảm cholesterol, điều trị các bệnh về da ở người (Padhi và cs.

SVTH: NGUYỄN THỊ TRÚC LY KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 3 GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH TS. NGUYỄN TẤN PHÁT Chiết xuất dichloromethane từ củ của Eleutherine bulbosa (Miller) cho thấy hoạt động kháng nấm Cladosporium sphaerospermum mạnh (Alves và cs. Cao chiết bằng ethanol của củ Eleutherine americana có khả năng kháng với tất cả 6 chủng Gram dương thử nghiệm (đường kính vòng kháng khuẩn từ 13-20 mm), kháng 1 trong 7 Gram âm thử nghiệm và các chủng nấm Aspergillus niger, Rhizopus spp., tuy nhiên không kháng lại các chủng nấm da (Ifesan và cs.

Keuk-Jun và cộng sự (2008), đã nghiên cứu tác dụng chống nấm của các hạt nano-bạc. Cho thấy các hạt nano-bạc có tác dụng chống nấm, làm tan máu chống lại hồng cầu của người. Sử dụng dòng chảy tế bào học để phân tích, lượng glucose được giải phóng và sự thay đổi của màng động lực học 1,6-diphenyl-1,3,5- hexatriene (DPH) như một đầu dò plasma, được thực hiện dựa trên vi nấm C. albicans (Keuk-Jun và cs.

Theo nghiên cứu của Wahyuni và cộng sự (2016), chiết xuất của Eleutherine palmifolia từ dung môi ethanol 70% và nước có tác dụng ức chế C. Hoạt tính kháng nấm được thực hiện bằng phương pháp giếng thạch và cho kết quả khả năng ức chế của mỗi chiết xuất là 65,44% và 54,78% (Wahyuni và cs.