Nghiên Cứu Chiết Xuất Hợp Chất Tự Nhiên Từ Hạt Cà Phê Robusta Có Hoạt Tính Sinh Học

Nghiên cứu chiết xuất hợp chất tự nhiên từ hạt cà phê Robusta (Coffea canephora) đang thu hút sự… 58 trang · Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh · 2019.

• Tác giả: Trịnh Thị Hoài Phương
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Minh Hoàng
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Y – Dược
• Đề tài: Nghiên Cứu Chiết Xuất Hợp Chất Tự Nhiên Từ Hạt Cà Phê Robusta
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC VIẾT TẮT
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY CÀ PHÊ ROBUSTA
• 1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
• 1.1.2. Tác dụng dược lý
• 1.1.3. Nghiên cứu về thành phần hóa học đối với hạt cà phê
• 1.2. TỔNG QUAN VỀ CAFFEINE
• 1.2.1. Phân loại
• 1.2.2. Hoạt tính sinh học
• 1.3. TỔNG QUAN VỀ CHLOROGENIC ACID
• 1.4. TỔNG QUAN VỀ CHOLESTEROL VÀ KHẢ NĂNG GIẢM CHOLESTEROL CỦA CHLOROGENIC ACID
• 1.5. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.5.1. Phương pháp thu mẫu
• 1.5.2. Nguyên tắc tách chiết
• 1.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết nguyên liệu
• 1.5.4. Phương pháp chiết đun khuấy từ hồi lưu
• 1.5.5. Phương pháp chiết lỏng – lỏng
• 1.5.6. Phương pháp chiết soxhlet
• 1.5.7. Phương pháp định tính
• 2. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Hóa chất và thiết bị thí nghiệm
• 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.4.1. Quy trình thực hiện chiết xuất caffeine trong hạt cà phê robusta
• 2.4.2. Định tính và xác định cấu trúc sản phẩm thu được
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT THỜI GIAN CHIẾT CAFFEINE BẰNG ĐUN KHUẤY TỪ TỐI ƯU
• 3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỈ LỆ NGUYÊN LIỆU/DUNG MÔI CHIẾT CAFFEINE BẰNG ĐUN KHUẤY TỪ
• 3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT CAFFEINE THU ĐƯỢC
• 3.4. KẾT QUẢ CHẠY PHỔ CỘNG TỪ HẠT NHÂN NMR CAFFEINE THU ĐƯỢC
• 3.5. KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CHLOROGENIC ACID TRONG HẠT CÀ PHÊ ROBUSTA
• 3.5.1. Kết quả hàm lượng béo có trong hạt cà phê
• 3.5.2. Kết quả sắc kí bản mỏng
• 4. CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• 4.1. Đề nghị
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Chiết Xuất Hợp Chất Tự Nhiên Từ Hạt Cà Phê Robusta

Nghiên cứu chiết xuất hợp chất tự nhiên từ hạt cà phê Robusta (Coffea canephora) đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Hạt cà phê không chỉ là nguồn cung cấp caffeine mà còn chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học khác. Việc chiết xuất và phân tích các hợp chất này có thể mở ra hướng đi mới trong y học và dinh dưỡng. Các hợp chất như chlorogenic acid và flavonoid đã được chứng minh có tác dụng tích cực đối với sức khỏe con người.

1.1. Ứng Dụng Của Hợp Chất Tự Nhiên Trong Y Học

Hợp chất tự nhiên từ hạt cà phê Robusta có nhiều ứng dụng trong y học. Chlorogenic acid, một trong những hợp chất chính, đã được nghiên cứu về khả năng kháng viêm và hạ đường huyết. Nghiên cứu cho thấy chlorogenic acid có thể giúp giảm cholesterol và cải thiện sức khỏe tim mạch.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Chiết Xuất

Nghiên cứu chiết xuất hợp chất tự nhiên từ hạt cà phê Robusta không chỉ giúp hiểu rõ hơn về thành phần hóa học mà còn mở ra cơ hội phát triển các sản phẩm chức năng. Việc chiết xuất thành công các hợp chất này có thể tạo ra những sản phẩm mới có giá trị dinh dưỡng cao.

II. Vấn Đề Và Thách Thức Trong Nghiên Cứu Chiết Xuất Hợp Chất Từ Hạt Cà Phê

Mặc dù nghiên cứu chiết xuất hợp chất tự nhiên từ hạt cà phê Robusta mang lại nhiều lợi ích, nhưng cũng gặp phải không ít thách thức. Các vấn đề như hiệu suất chiết xuất, độ tinh khiết của sản phẩm và khả năng ứng dụng trong thực tiễn là những yếu tố cần được xem xét kỹ lưỡng. Việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất là rất quan trọng để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

2.1. Hiệu Suất Chiết Xuất Hợp Chất

Hiệu suất chiết xuất hợp chất từ hạt cà phê Robusta phụ thuộc vào nhiều yếu tố như thời gian chiết, tỉ lệ nguyên liệu và dung môi. Nghiên cứu cho thấy rằng việc tối ưu hóa các yếu tố này có thể tăng cường hiệu suất chiết xuất đáng kể.

2.2. Độ Tinh Khiết Của Sản Phẩm Chiết Xuất

Độ tinh khiết của sản phẩm chiết xuất là một yếu tố quan trọng trong nghiên cứu. Các phương pháp như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thường được sử dụng để xác định độ tinh khiết và thành phần hóa học của các hợp chất chiết xuất.

III. Phương Pháp Chiết Xuất Hợp Chất Từ Hạt Cà Phê Robusta

Có nhiều phương pháp chiết xuất hợp chất tự nhiên từ hạt cà phê Robusta, mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm riêng. Các phương pháp phổ biến bao gồm chiết xuất lỏng-lỏng, chiết xuất Soxhlet và chiết xuất bằng siêu âm. Việc lựa chọn phương pháp phù hợp sẽ ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu suất của sản phẩm chiết xuất.

3.1. Phương Pháp Chiết Xuất Soxhlet

Phương pháp chiết xuất Soxhlet là một trong những kỹ thuật phổ biến nhất để chiết xuất hợp chất từ hạt cà phê. Phương pháp này cho phép thu hồi tối đa các hợp chất có trong hạt cà phê, đặc biệt là caffeine và chlorogenic acid.

3.2. Chiết Xuất Lỏng Lỏng

Chiết xuất lỏng-lỏng là một phương pháp hiệu quả khác để tách các hợp chất tự nhiên. Phương pháp này sử dụng hai pha lỏng không hòa tan để tách biệt các hợp chất dựa trên độ hòa tan của chúng trong từng pha.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Chiết Xuất Hợp Chất Từ Hạt Cà Phê Robusta

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng hạt cà phê Robusta chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng caffeine và chlorogenic acid có thể được chiết xuất với hiệu suất cao, mở ra cơ hội ứng dụng trong y học và dinh dưỡng. Việc xác định cấu trúc và hoạt tính của các hợp chất này là rất quan trọng để phát triển các sản phẩm mới.

4.1. Hiệu Suất Chiết Xuất Caffeine

Nghiên cứu cho thấy rằng hiệu suất chiết xuất caffeine từ hạt cà phê Robusta có thể đạt tới 90% khi sử dụng phương pháp Soxhlet. Điều này cho thấy tiềm năng lớn của hạt cà phê trong việc cung cấp caffeine cho các sản phẩm chức năng.

4.2. Phân Tích Chlorogenic Acid

Chlorogenic acid được chiết xuất với hiệu suất cao và có nhiều tác dụng sinh học. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chlorogenic acid có khả năng kháng viêm và hạ đường huyết, làm cho nó trở thành một hợp chất tiềm năng trong y học.

V. Kết Luận Về Nghiên Cứu Chiết Xuất Hợp Chất Từ Hạt Cà Phê Robusta

Nghiên cứu chiết xuất hợp chất tự nhiên từ hạt cà phê Robusta đã chỉ ra rằng đây là một nguồn tài nguyên quý giá cho y học và dinh dưỡng. Các hợp chất như caffeine và chlorogenic acid không chỉ có giá trị dinh dưỡng mà còn có nhiều ứng dụng trong điều trị bệnh. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều sản phẩm mới có lợi cho sức khỏe.

5.1. Tiềm Năng Phát Triển Sản Phẩm Mới

Với những lợi ích sức khỏe rõ ràng, việc phát triển các sản phẩm mới từ hạt cà phê Robusta là rất khả thi. Các sản phẩm chức năng có thể được phát triển dựa trên các hợp chất tự nhiên này.

5.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất và khám phá thêm nhiều hợp chất tự nhiên khác trong hạt cà phê Robusta. Điều này sẽ giúp mở rộng ứng dụng của hạt cà phê trong y học và dinh dưỡng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong lĩnh vực công nghệ sinh học y – dược, xu hướng nghiên cứu tách chiết và tinh sạch các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học từ nguồn thực vật ngày càng nhận được sự quan tâm lớn. Các thành phần tự nhiên trong thực phẩm và dược liệu đã được chứng minh có khả năng hỗ trợ sức khỏe, giảm kích hoạt tiểu cầu, ức chế hình thành huyết khối, chống oxy hóa, kháng khuẩn và hạ đường huyết. Trong đó, hạt cà phê không chỉ là thức uống thông dụng mà còn chứa nhiều hoạt chất sinh học giá trị, điển hình là caffeine và chlorogenic acid.

Caffeine được biết đến rộng rãi với tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương, trợ tim và giãn cơ trơn. Chlorogenic acid – một hợp chất polyphenol dồi dào trong hạt cà phê – sở hữu các hoạt tính sinh học như kháng virus viêm gan B (HBV), ức chế virus HIV, kháng khuẩn, kháng nấm (MIC từ 20–80 μg/ml), điều hòa lipid huyết tương và hỗ trợ giảm xơ vữa động mạch. Mặc dù đã có các công nghệ hiện đại như chiết CO2 siêu tới hạn hay chiết bằng dung môi hữu cơ clo hóa, các phương pháp này thường đòi hỏi trang thiết bị phức tạp hoặc tiềm ẩn độc tính từ dung môi. Vì vậy, việc thiết lập quy trình chiết xuất truyền thống sử dụng hệ dung môi an toàn, thân thiện với môi trường và tối ưu hóa điều kiện trích ly là vấn đề thực tiễn cần được giải quyết.

Đề tài "Nghiên cứu ly trích các hợp chất tự nhiên có trong hạt cà phê Robusta (Coffea canephora) có hoạt tính sinh học ứng dụng trong y học" được thực hiện nhằm giải quyết các mục tiêu cụ thể sau:

1. Khảo sát quy trình chiết tách và tinh chế caffeine từ hạt cà phê Robusta (Coffea canephora); xác định thời gian chiết tối ưu, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết thô tối ưu và thể tích dung môi chiết lỏng – lỏng; tinh chế và xác định cấu trúc của caffeine thu được.
2. Nghiên cứu xây dựng quy trình ly trích chlorogenic acid từ hạt cà phê Robusta (Coffea canephora), tạo tiền đề cho việc phát triển các sản phẩm ứng dụng trong y dược.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Hạt cà phê Robusta (tên khoa học: Coffea canephora, thuộc chi Coffea, họ Rubiaceae).
• Phạm vi thu mẫu: Hạt cà phê được thu hái trực tiếp tại rẫy ở xã Hòa Xuân, tỉnh Đắk Lắk (TP. Buôn Ma Thuột), lựa chọn quả hơi tròn, đường kính khoảng 1,2 cm, màu chín đỏ hoặc hơi ươm, sau đó phơi khô tự nhiên dưới ánh nắng mặt trời, tách vỏ lấy hạt thô và xay thành bột.
• Địa điểm thực nghiệm: Phòng thí nghiệm Hóa – Môi trường, Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh (Cơ sở: 68 Lê Thị Trung, phường Phú Lợi, TP. Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương).

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên nền tảng lý thuyết về hóa học hợp chất tự nhiên, dược lý thực vật học và các kỹ thuật tách chiết, tinh chế, phân tích cấu trúc hữu cơ:

• Khung lý thuyết về thực vật và hoạt chất: Đặc điểm thực vật chi Coffea (đặc biệt là loài Coffea canephora); thành phần hóa học hạt cà phê (glucid 5–8%, lipid 10–15%, acid hữu cơ, acid phenol 5–10%, alkaloid caffeine 0,3–2,5%); cấu trúc hóa học và dược lý của caffeine (1,3,7-trimethylpurine-2,6-dione, công thức $C_8H_{10}N_4O_2$, cơ chế đối kháng thụ thể adenosine $A_1, A_{2A}, A_{2B}$, huy động canxi nội bào và ức chế phosphodiesterase); cấu trúc và tính chất của chlorogenic acid (acid 3-O-caffeoylquinic, công thức $C_{16}H_{18}O_9$, cơ chế giảm lipid máu, ức chế xơ vữa động mạch và tác động lên hệ vi sinh đường ruột).
• Phương pháp chiết xuất:
  • Chiết đun khuấy từ hồi lưu: Ứng dụng để chiết thô caffeine từ bột hạt cà phê với nước được kiềm hóa bằng $CaCO_3$, sử dụng ống sinh hàn để tránh thất thoát dung môi.
  • Chiết lỏng – lỏng (Liquid-Liquid Extraction - LLE): Sử dụng phễu chiết (bình lóng) để phân bố caffeine từ pha nước sang pha hữu cơ chloroform ($CHCl_3$), và phân bố chlorogenic acid từ pha nước sang ethyl acetate.
  • Chiết Soxhlet: Kỹ thuật chiết ngấm kiệt liên tục dùng để loại bỏ chất béo bằng petroleum ether trong 8–10 giờ và chiết kiệt polyphenol/chlorogenic acid bằng dung môi methanol trong 12 giờ.
  • Phương pháp thăng hoa: Gia nhiệt dịch cắn caffeine sau cô quay ở nhiệt độ khoảng 200°C để thu tinh thể caffeine tinh khiết.
• Phương pháp phân tích và định tính:
  • Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC): Sử dụng bản nhôm tráng sẵn silica gel $60\ F_{254}$ (Merck), hoạt hóa ở 105°C trong 30 phút, phát hiện vết chất dưới đèn UV bước sóng 254 nm.
  • Đo điểm nóng chảy: Sử dụng thiết bị đo điểm nóng chảy chuyên dụng với ống vi quản để kiểm tra nhiệt độ nóng chảy và độ tinh khiết của tinh thể caffeine.
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Ghi phổ $^1H\text{-NMR}$ và $^{13}C\text{-NMR}$ trên dung môi $CDCl_3$ để đối chiếu cấu trúc khung phân tử với dữ liệu chuẩn đã công bố.
  • Phương pháp xử lý thống kê: Số liệu thực nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần, phân tích phương sai và so sánh sai biệt trung bình bằng phép thử Duncan ở mức ý nghĩa $p < 0,05$.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Tổng quan

Chương I tổng hợp có hệ thống các tài liệu khoa học trong và ngoài nước liên quan đến đề tài. Tác giả trình bày đặc điểm phân loại thực vật của 3 loài cà phê chính: cà phê chè (Coffea arabica), cà phê vối (Coffea canephora) và cà phê mít (Coffea liberica). Phân tích chi tiết thành phần hóa thực vật trong hạt cà phê gồm glucid, lipid, các acid hữu cơ và acid phenol.

Chương này đi sâu vào tính chất lý hóa, hoạt tính sinh học và cơ chế tác động của caffeine đối với hệ thần kinh trung ương, hệ tim mạch, cơ trơn và cơ vân, kèm theo tổng hợp các dạng chế phẩm phối hợp caffeine trong y học (như thuốc giảm đau, hạ sốt phối hợp paracetamol và aspirin). Đồng thời, tổng quan phân tích cấu trúc của chlorogenic acid, vai trò điều hòa cholesterol máu, khả năng giảm nồng độ lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL), ức chế hình thành huyết khối và ngăn ngừa xơ vữa động mạch. Phần cuối chương trình bày nguyên tắc lý thuyết của các kỹ thuật tách chiết (Soxhlet, đun khuấy từ hồi lưu, chiết lỏng – lỏng) cùng các phương pháp phân tích định tính hợp chất tự nhiên (TLC, đo điểm nóng chảy, NMR).

Chương II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương II mô tả cụ thể các nguyên vật liệu, hóa chất tinh khiết (acid acetic, chloroform, methanol, n-butanol, amoniac, petroleum ether, acetone, ethyl acetate), danh mục trang thiết bị (bộ chiết Soxhlet, bộ đun khuấy từ hồi lưu Isolab, đèn UV Vilber Lourmat VL-6LC, máy khuấy từ gia nhiệt Velp ARE, tủ sấy ALM400, cân kỹ thuật OHAUS GS 3000g) và quy trình thực nghiệm:

• Quy trình chiết xuất và tinh chế caffeine: Cân chính xác 30 g bột cà phê, chiết đun khuấy từ hồi lưu với nước; dịch chiết sau khi lọc bã được cô cạn còn 200 ml, để nguội và chiết lỏng – lỏng với chloroform; thu hồi dung môi chloroform ở 61–63°C; cắn thu được đem thăng hoa ở ~200°C thu tinh thể caffeine. Bố trí thí nghiệm khảo sát 3 mốc thời gian chiết (3 giờ, 6 giờ, 9 giờ) và 4 mức tỉ lệ nguyên liệu/dung môi nước (1:5, 1:10, 1:15, 1:20 tương ứng 150 ml, 300 ml, 450 ml, 600 ml).
• Quy trình chiết xuất chlorogenic acid: Bột cà phê được loại béo bằng chiết Soxhlet với petroleum ether trong 8–10 giờ; bột sau khi loại béo tiếp tục chiết Soxhlet với methanol trong 12 giờ; dịch chiết methanol cô cạn, hòa tan lại trong nước rồi chiết lỏng – lỏng với chloroform để loại bỏ caffeine; dịch nước chứa chlorogenic acid tiếp tục được chiết lỏng – lỏng với ethyl acetate; dịch ethyl acetate được cô cạn để thu cao thô chứa chlorogenic acid.
• Quy trình kiểm tra: Bản mỏng sắc ký chạy quãng đường 8 cm với các hệ dung môi phân cực khác nhau; đo điểm nóng chảy với tốc độ nâng nhiệt kiểm soát; đo phổ $^1H\text{-NMR}$ và $^{13}C\text{-NMR}$.

Chương III: Kết quả và thảo luận

Chương III trình bày toàn bộ số liệu thu được từ các thực nghiệm và thảo luận khoa học:

• Khảo sát thời gian chiết thô caffeine: Thời gian chiết ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu suất trích ly. Khi tăng thời gian từ 3 giờ lên 6 giờ, hiệu suất tăng từ 0,25% lên 0,33%. Tăng tiếp lên 9 giờ thì hiệu suất đạt 0,34% (khối lượng trung bình 0,1017 g), không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê so với mức 6 giờ (0,0961 g). Do đó, thời gian 6 giờ được chọn là tối ưu.
• Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết caffeine: Ở tỉ lệ 1:5, dung môi không đủ để hòa tan và khuấy trộn nên hiệu suất chỉ đạt 0,30%. Tăng tỉ lệ lên 1:10 và 1:15, hiệu suất tăng lần lượt lên 0,32% và 0,37% (khối lượng caffeine trung bình 0,1112 g). Khi tăng lên tỉ lệ 1:20, hiệu suất không tăng thêm (thu được 0,1123 g). Tỉ lệ 1:15 (30 g bột trong 450 ml nước) được xác định là thông số tối ưu.
• Định tính caffeine và kiểm tra độ tinh khiết: Sắc ký lớp mỏng trên 3 hệ dung môi (Hệ 1: Chloroform : Acetone 95:5 cho $R_f = 0,43$; Hệ 2: Amoniac đậm đặc : Acetone : Chloroform : Butanol 1:3:3:4 cho $R_f = 0,85$; Hệ 3: Butanol : Acid acetic : Nước 14:3:4 cho $R_f = 0,88$) chỉ cho duy nhất một vết đơn sắc trùng khớp hoàn toàn với mẫu chuẩn caffeine, không phát hiện vết tạp chất. Điểm nóng chảy thực nghiệm ghi nhận bắt đầu chảy ở 235,5°C và chảy hoàn toàn ở 238°C, phù hợp với tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV (234–239°C).
• Xác định cấu trúc caffeine bằng phổ NMR: Phổ $^1H\text{-NMR}$ và $^{13}C\text{-NMR}$ của mẫu cô lập trong dung môi $CDCl_3$ cho các mũi tín hiệu cộng hưởng tương đồng chặt chẽ với số liệu công bố của Sitkowski (1994).
• Xây dựng quy trình chiết chlorogenic acid: Quá trình chiết Soxhlet với petroleum ether ghi nhận khối lượng bột giảm 6,9% (tương ứng hàm lượng chất béo và tạp tan trong dung môi kém phân cực là 6,9%). Kết quả kiểm tra TLC dịch chiết methanol và phân đoạn chiết lỏng – lỏng ethyl acetate với các hệ dung môi phân cực (như Acid acetic : Nước 14:3:4 hoặc Acetone : Nước : Methanol : Acid acetic 18:1:1:1) đã ghi nhận sự xuất hiện của vết chất có giá trị $R_f$ tương đương với chất chuẩn chlorogenic acid.

Chương IV: Kết luận và đề nghị

Chương IV tóm lược các kết quả định lượng và thông số công nghệ đã đạt được, đồng thời đưa ra các đề xuất nghiên cứu tiếp nối về việc đánh giá hoạt tính sinh học và ứng dụng y dược chuyên sâu của các hợp chất thu nhận.

---

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã cung cấp các số liệu thực nghiệm đầy đủ về quá trình chiết tách và định danh hai hợp chất sinh học chính từ hạt cà phê Robusta:

Bảng tổng hợp kết quả khảo sát chiết thô caffeine

Thông số khảo sát	Nghiệm thức	Khối lượng nguyên liệu (g)	Khối lượng caffeine TB (g)	Hiệu suất TB (%)	Mức ý nghĩa thống kê (Duncan, $p<0,05$)
Thời gian chiết	3 giờ	30	0,0739	0,25	$b$
	6 giờ	30	0,0961	0,33	$a$
	9 giờ	30	0,1017	0,34	$a$
Tỉ lệ NL/Dung môi	1:5 (150 ml)	30	0,0892	0,30	$b$
(ở thời gian 6 giờ)	1:10 (300 ml)	30	0,0957	0,32	$ab$
	1:15 (450 ml)	30	0,1112	0,37	$a$
	1:20 (600 ml)	30	0,1123	0,37	$a$

Bảng kết quả định tính và phân tích cấu trúc caffeine

Phương pháp kiểm tra	Thông số / Vị trí phân tử	Kết quả thực nghiệm mẫu thu	Dữ liệu đối chiếu chuẩn / Tài liệu
Sắc ký bản mỏng (TLC)	Hệ 1 ($CHCl_3 : \text{Acetone} = 95:5$)	$R_f = 0,43$ (1 vết đơn)	Trùng với vết caffeine chuẩn
	Hệ 2 ($\text{NH}_3 : \text{Acetone} : CHCl_3 : \text{BuOH} = 1:3:3:4$)	$R_f = 0,85$ (1 vết đơn)	Trùng với vết caffeine chuẩn
	Hệ 3 ($\text{BuOH} : \text{AcOH} : H_2O = 14:3:4$)	$R_f = 0,88$ (1 vết đơn)	Trùng với vết caffeine chuẩn
Đo điểm nóng chảy	Nhiệt độ nóng chảy (°C)	235,5 – 238,0°C	234 – 239°C (Dược điển VN IV)
Phổ $^1H\text{-NMR}$	$H_1$	3,40 ppm ($s$, 3H)	3,37 ppm ($s$) (Sitkowski, 1994)
(dung môi $CDCl_3$)	$H_3$	3,58 ppm ($s$, 3H)	3,55 ppm ($s$) (Sitkowski, 1994)
	$H_7$	3,99 ppm ($s$, 3H)	4,01 ppm ($d$) (Sitkowski, 1994)
	$H_8$	7,51 ppm ($s$, 1H)	7,58 ppm ($q$) (Sitkowski, 1994)
Phổ $^{13}C\text{-NMR}$	$C_1; C_2; C_3; C_4$	27,94; 151,77; 29,76; 148,76 ppm	27,5; 151,3; 29,3; 148,3 ppm
(dung môi $CDCl_3$)	$C_5; C_6; C_7; C_8$	107,65; 155,47; 33,58; 141,42 ppm	107,1; 154,9; 33,2; 141,2 ppm

Đóng góp của đề tài

1. Thiết lập quy trình chiết xuất caffeine an toàn: Xác lập thành công quy trình chiết thô caffeine từ hạt cà phê Robusta bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu sử dụng nước kiềm hóa ($CaCO_3$), kết hợp chiết lỏng – lỏng với chloroform và tinh chế bằng thăng hoa ở ~200°C. Phương pháp này hạn chế tối đa việc sử dụng các dung môi clo hóa độc hại trong giai đoạn đun chiết nhiệt độ cao.
2. Xác định các thông số công nghệ tối ưu: Khảo sát có hệ thống và đưa ra các thông số tối ưu gồm thời gian chiết (6 giờ) và tỉ lệ nguyên liệu/dung môi nước (1:15), đạt hiệu suất thu hồi caffeine 0,37% với độ tinh khiết cao được chứng minh qua sắc ký bản mỏng, điểm nóng chảy và phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1H\text{-NMR}$, $^{13}C\text{-NMR}$).
3. Xây dựng sơ đồ quy trình chiết phân đoạn chlorogenic acid: Thiết lập quy trình liên hoàn gồm: loại béo bằng Soxhlet với petroleum ether (xác định hàm lượng béo là 6,9%), chiết Soxhlet methanol (12 giờ), loại caffeine bằng chiết lỏng – lỏng với chloroform, và thu hồi chlorogenic acid trong phân đoạn ethyl acetate.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Do giới hạn về mặt thời gian và điều kiện trang thiết bị phòng thí nghiệm, đề tài chưa tiến hành khảo sát tối ưu hóa toàn bộ các yếu tố công nghệ ảnh hưởng đến quy trình tách chlorogenic acid (như tỉ lệ dung môi methanol, thời gian chiết phân đoạn ethyl acetate); chưa tiến hành định lượng nồng độ tinh khiết tuyệt đối của chlorogenic acid trong cao thô bằng phương pháp HPLC.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Mở rộng nghiên cứu và khảo sát thực nghiệm về các hoạt tính sinh học ứng dụng trong y học của caffeine tinh chế.
  • Khảo sát chuyên sâu khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và hoạt tính sinh học của phân đoạn cao thô chứa chlorogenic acid thu được từ hạt cà phê Robusta.

---

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các ngành:

• Công nghệ Sinh học (chuyên ngành Y – Dược, Nông nghiệp, Môi trường): Tham khảo quy trình thiết kế thí nghiệm chiết xuất hợp chất tự nhiên, bố trí thực nghiệm khảo sát tối ưu hóa các yếu tố công nghệ (thời gian, dung môi) và xử lý thống kê sinh học bằng ANOVA/Duncan.
• Hóa học Hợp chất Tự nhiên và Dược học: Tham khảo các hệ dung môi sắc ký lớp mỏng (TLC) chuyên biệt cho alkaloid purine và dẫn xuất acid phenolic, kỹ thuật tinh chế hợp chất hữu cơ bằng phương pháp thăng hoa, cùng bảng dữ liệu quy chuẩn độ dịch chuyển hóa học phổ $^1H\text{-NMR}$ và $^{13}C\text{-NMR}$ của caffeine trong $CDCl_3$.
• Nghiên cứu chế biến phụ phẩm nông nghiệp: Làm tài liệu tham khảo cho các đề tài nghiên cứu khai thác hoạt chất sinh học từ hạt và phụ phẩm cà phê Việt Nam nhằm nâng cao giá trị gia tăng trong y dược và thực phẩm chức năng.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Điều kiện tối ưu để chiết thô caffeine bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu trong nghiên cứu này là gì?
Nghiên cứu xác định điều kiện tối ưu là đun khuấy từ hồi lưu trong thời gian 6 giờ với tỉ lệ nguyên liệu bột cà phê trên dung môi nước là 1:15 (tương ứng 30 g bột cà phê trong 450 ml nước), đạt hiệu suất trích ly caffeine trung bình là 0,37%.

2. Nhiệt độ nóng chảy của tinh thể caffeine cô lập được trong nghiên cứu là bao nhiêu và có phù hợp với dược điển không?
Tinh thể caffeine sau khi thăng hoa ở khoảng 200°C bắt đầu nóng chảy ở 235,5°C và chảy hoàn toàn ở 238°C. Khoảng nhiệt độ này hoàn toàn nằm trong tiêu chuẩn quy định của Dược điển Việt Nam IV đối với caffeine tinh khiết (234–239°C).

3. Khóa luận sử dụng các hệ dung môi nào để chạy sắc ký bản mỏng (TLC) định tính caffeine?
Tác giả đã khảo sát 3 hệ dung môi:

• Hệ 1 (kém phân cực): Chloroform : Acetone (tỉ lệ 95:5), cho giá trị $R_f = 0,43$.
• Hệ 2 (phân cực trung bình): Amoniac đậm đặc : Acetone : Chloroform : Butanol (tỉ lệ 1:3:3:4), cho giá trị $R_f = 0,85$.
• Hệ 3 (phân cực mạnh): Butanol : Acid acetic : Nước (tỉ lệ 14:3:4), cho giá trị $R_f = 0,88$.
  Cả ba hệ dung môi đều cho một vết chất duy nhất trùng khớp với chất chuẩn caffeine dưới đèn UV 254 nm.

4. Hàm lượng chất béo và tạp chất tan trong petroleum ether của mẫu hạt cà phê Robusta nghiên cứu là bao nhiêu?
Sau khi chiết Soxhlet mẫu bột cà phê với dung môi petroleum ether từ 8–10 giờ, khối lượng mẫu giảm 6,9%, cho thấy hàm lượng chất béo và các tạp chất không phân cực trong hạt cà phê Robusta chiếm khoảng 6,9%.

5. Các bước chính trong quy trình ly trích chlorogenic acid được tác giả xây dựng gồm những gì?
Quy trình gồm 6 bước liên hoàn: (1) Chiết Soxhlet bột cà phê với petroleum ether trong 8–10 giờ để loại béo; (2) Chiết Soxhlet bột đã loại béo với methanol trong 12 giờ; (3) Cô cạn dịch methanol, hòa tan lại với nước rồi chiết lỏng – lỏng với chloroform để loại bỏ caffeine; (4) Kiểm tra dịch nước bằng TLC; (5) Chiết lỏng – lỏng dịch nước với ethyl acetate; (6) Cô cạn phân đoạn ethyl acetate để thu nhận cao thô chứa chlorogenic acid.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Trịnh Thị Hoài Phương đã hoàn thành việc xây dựng và tối ưu hóa quy trình trích ly caffeine từ hạt cà phê Robusta (Coffea canephora) bằng phương pháp đun khuấy từ hồi lưu thân thiện với môi trường, đạt hiệu suất 0,37% tại điều kiện tối ưu (6 giờ, tỉ lệ 1:15). Sản phẩm tinh thể caffeine sau thăng hoa được chứng minh có độ tinh khiết cao thông qua kiểm tra sắc ký bản mỏng, điểm nóng chảy (235,5–238°C) và dữ liệu phổ $^1H\text{-NMR}$, $^{13}C\text{-NMR}$. Đồng thời, công trình đã thiết lập thành công sơ đồ quy trình chiết tách phân đoạn chlorogenic acid qua hệ thống Soxhlet và chiết phân bố lỏng – lỏng, tạo cơ sở thực nghiệm vững chắc cho các nghiên cứu ứng dụng hoạt chất tự nhiên từ hạt cà phê trong lĩnh vực y – dược.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1. TỔNG QUAN VỀ CÂY CÀ PHÊ ROBUSTA 1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố Cà phê thuộc họ Rubiaceae, chi Coffea, hiện nay cà phê được trồng phân bố rải rác khắp các vùng nhiệt đới, đại diện có 3 loài chính sau: • Cà phê chè (Coffea arabica): có nguồn gốc từ cao nguyên phía tây nam Ethiopia, cây được du nhập sang vùng Nam Á là Ấn Độ. Sau đó, cà phê chè được trồng ở đảo Java năm 1710 ở vùng Caribê và Nam Mỹ. Hiện nay cà phê chè dược trồng nhiều ở vùng châu Mỹ la tinh, Trung Phi, Ấn Độ, Indonexia, Philippin, Thái Lan và Việt Nam.

• Cà phê vối (Coffea canephora): Có nguồn gốc ở vùng rừng xích đạo châu Phi, từ Guinca đến Uganda. Cà phê vối cũng sớm được thuần hóa và trồng nhiều ở châu Phi, Đến năm 1900 du nhập vào Java sau đó tiếp tục được đưa đến các nước khác. Hiện nay, cà phê vối được trồng nhiều nhất ở Indonexia sau đó đến Việt Nam. • Cà phê mít (Coffea liberica): Có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Trung và Tây Phi.

Năm 1792, được trồng đầu tiên ở Liberia, từ năm 1872 – 1875 du nhập dến Indonesia. Hiện nay cà phê mít được trồng ở nhiều nước trong đó có Việt Nam tuy nhiên với sản lượng không lớn (Đỗ Huy Bích, 2006). Cây cà phê robusta có tên khoa học: Coffea canephora hay Coffea robusta, thường được gọi là cà phê vối, thuộc họ thiên thảo. Đặc điểm thực vật được thể hiện ở bảng 1.1 Đặc điểm thực vật về cây caffeine Giới (Kingdom) Plantae (Thực vật) Ngành (Division) Magnoliophyta Lớp (Class) Magnoliopsida Bộ (Ordo) Gentianales Họ (Familia) Rubiaceae Trịnh Thị Hoài Phương 4 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS.

Nguyễn Minh Hoàng Chi (Genus) Coffea Loài (Species) Coffea canephora Cà phê là cây nhiệt đới, ưa sáng thích hợp với vùng khí hậu nóng ẩm. Chiều cao cây 5 – 6 m, thân cành hình trụ phân nhánh nhiều, tán rộng. Lá mọc đối đầu hình bầu dục hoặc hình trứng, dài 10 – 15 cm, rộng 5 – 6 cm, mặt trên xanh sẫm bóng, mặt dưới rất nhạt, gân nổi rõ, mép uống lượn, cuốn lá dài 0,7 – 1 cm. Cà phê thuộc loại cây công nghiệp, sinh trưởng sau 3 năm bắt đầu có hoa.

Hoa mọc thành chùm tụ tập ở kẽ lá, màu trắng, hoa có 5 cánh đều, hoa cà phê robusta không bao giờ ra lại vào mùa sau tại vị trí cũ. Quả hạch, hình bầu dục hoặc tròn hơi dẹt đường kính 10 – 13 mm, bên trong chứa hai nhân nhưng đôi khi có một nhân nhân dẹt hơi cong màu xám vàng, quả non màu xanh, quả chín màu vàng đến đỏ sẫm (Đỗ Huy Bích, 2006).1: Cà phê Robusta (Coffea canephora) 1.2 Tác dụng dược lý Trịnh Thị Hoài Phương 5 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. Nguyễn Minh Hoàng Theo tài liệu nước ngoài, quả cà phê tươi có tác dụng hạ sốt, lợi tiểu. Hạt cà phê rang hiện đang là thức uống có tác dụng kích thích thần kinh.

Caffeine là chất chính trong hạt cà phê có tác dụng kích thích thần kinh trung ương, lợi tiểu và làm giản cơ trơn (Đỗ Huy Bích, 2006).3 Nghiên cứu về thành phần hóa học đối với hạt cà phê Hạt cà phê chứa một số chất điển hình: ⬩ Glucid: có 5 – 8% đường khử và saccharose, ít mantol, polysaccharid,… Không có tinh bột. ⬩ Lipid: chiếm 10- 15% ⬩ Acid hữu cơ: oxalic acid, citric acid, malic acid. ⬩ Acid phenol: 5 – 10% chlorogenic acid. ❖ Các nghiên cứu trong nước.

Trong nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Phương Quyên năm 2015 đã cho biết các hợp chất điển hình có trong hạt cà phê gồm caffeine và các flavonoid, gallic acid, catechin, caffeic acid, vanillin, chlorogenic acid,… là những hợp chất có thể ứng dụng trong y học. Nhóm tác giả đã tiến hành trích ly và phân tích hàm lượng caffeine của 15 mẫu cà phê bằng phương pháp Soxhlet và sử dụng máy HPLC để định lượng caffein có trong hạt cà phê và định danh một số hợp chất hóa học trong thành phần của hương cà phê bằng phương pháp GC- MS. (Nguyễn Phương Quyên và cs. ❖ Các nghiên cứu ngoài nước.

Năm 2014 tác giả Nuhu AA đã nghiên cứu cô lập từ hạt cà phê bằng kỹ thuật chiết pha rắn Solid-Phase Extraction (SPE) cùng với sử dụng các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC- MS) đã định danh xác đinh một số hợp chất tiêu biểu trong hạt cà phê có ứng ụng trong y học gồm caffeine, chlorogenic acid, diterpen và trigonelline Năm 2012 Abdul Munahb A G Nasser đã cô lập thành công chlorogenic acid từ hạt cà phê bằng phương pháp sắt ý cột C18. TỔNG QUAN VỀ CAFFEINE Trịnh Thị Hoài Phương 6 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. Nguyễn Minh Hoàng 2.1 Phân loại Caffeine danh pháp quốc tế: 1,3,7-Trimethylpurine-2,6-dione, có công thức hóa học là C8H10N4O2, thuộc nhóm các chất methylxanthine, ở dạng tinh thể, không màu, không mùi, vị đắng, tan được trong nước và các dung môi hữu cơ như methanol, chloroform,… là chất kích thích tự nhiên có nhiều trong lá chè, hạt cà phê, hạt coca và các loài thực vật khác (Najafi và cs. Caffeine là chất kích thích hệ thần kinh trung ương, làm cho tinh thần minh mẫn, tăng cường sự nhận biết của não bộ, kích thích hoạt động tim, thận, phổi (Spiller, 2000; Lynge, 1997) đã và đang có ứng dụng nhiều trong dược phẩm.2: Công thức cấu tạo của caffeine Tính chất hóa lý: Caffeine tinh khiết dạng tinh thể, không màu, không mùi, vị đắng, nhiệt độ nóng chảy 235oC, trong nước ở nhiệt độ bình thường tan một ít, tan nhiều trong nước nóng hoặc tan nhiều trong chloroform.2 Hoạt tính sinh học Đối với hệ thần kinh trung ương caffeine có tác dụng mạnh nhất trong các methylxanthine.

Tạo cho người dùng cảm giác ít mệt mỏi và tỉnh táo, đôi khi với liều lượng lớn có thể khiến người dùng rơi vào trạng thái bồn chồn lo lắng, mất ngủ. Đối với tim mạch, caffeine có tác dụng kích thích tim làm nhịp tim nhanh hơn, huyết áp tăng nhẹ. Đối với co cơ trơn, caffeine có tác dụng làm giản cơ trơn, tác dụng này ứng dụng trong y học giúp điều trị cho các bệnh nhân co thắt. Đối với cơ vân, caffeine có tác dụng tăng cường khả năng làm việc của cơ bắp ở người.

Trịnh Thị Hoài Phương 7 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. Nguyễn Minh Hoàng Cơ chế hoạt động của caffeine đối với cơ thể: Tác dụng tiềm tàng của caffeine ở cấp độ tế bào có thể được giải thích bằng ba cơ chế hoạt động: sự đối kháng của các thụ thể adenosine, đặc biệt là trong hệ thống thần kinh trung ương; việc huy động lưu trữ canxi nội bào; sự ức chế phosphodiesterase. ▪ Sự đối kháng của Adenosine: Caffeine ngăn chặn các thụ thể adenosine, chủ yếu là các phân nhóm A1 và A2A, góp phần kích thích giải phóng dopamine, noradrenalin và glutamate. Caffeine có thể làm giảm lưu lượng máu não và lưu lượng máu cơ tim, bằng cách ức chế thụ thể adenosine A1, A2A và A2B trong các mạch máu và hạn chế sự giãn mạch qua trung gian adenosine, là thụ thể có thể được tìm thấy trong hầu hết các khu vực vùng não.

Nồng độ cao nhất là ở vỏ não. ▪ Huy động Canxi nội bào: Caffeine làm giải phóng canxi từ mạng lưới sarcoplasmic và ức chế sự tái hấp thu. Thông qua các cơ chế này, caffeine có thể làm tăng khả năng co bóp trong các cơn co thắt dưới mức tối đa ở những người sử dụng caffeine theo chỉ định hay ngẫu nhiên. Canxi nội bào xác định sự kích hoạt của nitric oxide synthase nội mô (eNOS), với việc sản xuất một lượng nitrogen oxit cao hơn.

Do đó, một số tác động gây ra bởi caffeine sẽ được điều hòa bởi chức năng thần kinh cơ và tăng lực co bóp trong cơ xương. Một tác dụng đối kháng tiềm năng của caffeine được thể hiện là kích thích lợi tiểu, chịu trách nhiệm về tác dụng ergolytic ở các vận động viên sức bền trong quá trình tập luyện và thi đấu kéo dài. ▪ Tác dụng lên hệ thần kinh trung ương: Caffeine làm tăng nhận thức về sự tỉnh táo và đôi khi gây ra lo lắng, đặc biệt là ở liều cao. Hơn nữa, sự đối kháng của thụ thể A1 và A2 có thể gây co giật và co mạch máu não.

Sản phẩm có chứa caffein ▪ Caffein được dùng trong thành phần các loại thuốc cảm cúm (cold and flu medication), antipyretics (hạ sốt) và analgesics (giảm đau) vì làm tăng khả năng hấp thụ trong ruột (intestinal absorption) và chống lại tình trạng buồn ngủ (counteract drowsiness). Trịnh Thị Hoài Phương 8 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. Nguyễn Minh Hoàng Ví dụ: thuốc Extra-strength Excedrin có chứa 250 mg acetaminophen tức hoạt chất paracetamol, 250 mg aspirin, and 65 mg caffeine ▪ Caffeine phổ biến nhất trong chế độ ăn uống là cà phê, bên cạnh đó đồ uống ca cao, nước ngọt, nước tăng lực, thuốc, và các loại thực phẩm và chất bổ sung thể thao chuyên dụng cũng chứa caffeine. Hiện tại có vô số nhãn hiệu có thể tìm thấy hàm lượng caffeine dao động từ mức khiêm tốn 50 mg đến mức đáng báo động 500 mg mỗi lon hoặc chai.

Trong những năm gần đây, để hạn chế hiện tượng này, các giới hạn đã được đặt ra cho những đồ uống chứa caffeine. TỔNG QUAN VỀ CHLOROGENIC ACID Công thức phân tử: C16H18O9. Trọng lượng phân tử: 354,31 g/mol. Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: acid 3R-[[3-(3,4-dihydroxyphenyl)-1-oxo- 2-propenyl]oxy]-1S,4R,5R-trihydroxy-cyclohexanecarboxylic.

Tên khác: acid 3-0-Caffeoylquinic. Nhiệt độ nóng chảy: 210oC.3: Công thức cấu tạo của Chlorogenic acid Chlorogenic acid có dạng bột màu trắng hoặc hơi ngà vàng tan được trong nước và các dung môi hữu cơ như ethanol, methanol,… Chlorogenic acid có khả năng kháng virus B trong mô hình vịt và có khả năng kháng virus cúm H1N1, hoạt động chống HIV và kháng khuẩn và kháng nấm. Phương pháp thu nhận các hợp chất chlorogenic acid trong hạt cà phê chủ yếu được Trịnh Thị Hoài Phương 9 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. Nguyễn Minh Hoàng sử dụng là chiết lỏng lỏng với dung môi chloroform và chiết pha rắn, tuy nhiên trong một số nghiên cứu sử dụng hỗn hợp dung môi của ethanol và nước với tỉ lệ 1:1 (Nuhu, 2014).

Xơ vữa động mạch là nguyên nhân chính gây tử vong và là nguyên nhân quan trọng nhất trong các bệnh về tim mạch. Rối loạn mỡ máu là một yếu tố nguy cơ cao dẫn tới chứng xơ vữa động mạch. Hiện nay, phương pháp phổ biến để điều trị xơ vữa động mạch là giảm nồng độ lipid huyết tương bằng cách sử dụng statin. Tuy nhiên, việc sử dụng statin chỉ ngăn ngừa khoảng 50% đến 60% các rủi ro về tim mạch.

Do đó để điều trị triệt để xơ vữa động mạch cần mở rộng ứng dụng các phương pháp khác nhau.