Phân Lập và Tinh Chế Hợp Chất Kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 Từ Diệp Hạ Châu Đắng

Nghiên cứu phân lập và tinh chế hợp chất kháng Staphylococcus aureus kháng methicillin từ cao chiết diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus.

• Tác giả: Lê Thị Trúc Linh
• Người hướng dẫn: ThS. Dương Nhật Linh
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học - Y Dược
• Đề tài: Nghiên Cứu Hợp Chất Kháng Staphylococcus Aureus Từ Diệp Hạ Châu Đắng
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BIỂU ĐỒ
• ĐẶT VẤN ĐỀ. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA)
• 1.1.1. Phân loại Staphylococcus aureus
• 1.1.2. Tình hình nghiên cứu MRSA trên thế giới và Việt Nam
• 1.2. Tổng quan về cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus)
• 1.2.1. Phân loại khoa học
• 1.2.2. Đặc điểm hình thái và phân bố
• 1.2.3. Thành phần hóa học
• 1.2.4. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước
• 1.3. Khái quát về phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất
• 1.3.1. Kỹ thuật chiết (Maceration)
• 1.3.2. Phương pháp chiết lỏng - lỏng
• 1.3.3. Cô đặc và sấy khô
• 1.3.4. Phương pháp sắc ký bản mỏng
• 1.3.5. Phương pháp sắc ký cột
• 1.3.6. Khái quát về phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn
• 1.3.6.1. Phương pháp khuếch tán
• 1.3.6.2. Phương pháp pha loãng liên tiếp
• 1.3.7. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Đối tượng nghiên cứu
• 2.4. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Bố trí thí nghiệm
• 2.5.2. Quy trình thu nhận và xử lý mẫu
• 2.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết đến khối lượng cao chiết
• 2.5.4. Xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết
• 2.5.5. Khảo sát hoạt tính kháng Staphylocuccus aureus ATCC 43300 kháng methicillin (MRSA) của các loại cao chiết
• 2.5.5.1. Phương pháp sắc ký bản mỏng
• 2.5.5.2. Phương pháp sắc ký cột
• 2.5.5.3. Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp tự sinh đồ
• 2.5.6. Tinh sạch và xác định cấu trúc hợp chất thu được
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả giám định tên khoa học của cây
• 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết đến khối lượng cao chiết thu được từ cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus)
• 3.3. Kết quả thử giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết
• 3.4. Khảo sát hoạt tính kháng MRSA của các loại cao chiết
• 3.5. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn MRSA
• 3.6. Điều chế các phân đoạn từ cao ethyl acetate
• 3.7. Khảo sát hoạt tính kháng MRSA của các cao phân đoạn ethyl acetate
• 3.8. Khảo sát khả năng kháng MRSA bằng phương pháp tự sinh đồ
• 3.9. Khảo sát các phân đoạn của cao PA-E3
• 3.10. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất PA02
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu hợp chất kháng Staphylococcus aureus từ diệp hạ châu đắng

Nghiên cứu hợp chất kháng Staphylococcus aureus từ diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) đang thu hút sự chú ý trong lĩnh vực y học. Vi khuẩn Staphylococcus aureus, đặc biệt là các chủng kháng methicillin (MRSA), đã trở thành một thách thức lớn trong điều trị nhiễm khuẩn. Diệp hạ châu đắng được biết đến với nhiều tác dụng dược lý, bao gồm khả năng kháng khuẩn. Nghiên cứu này nhằm mục đích phân lập và tinh chế các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn từ cây này.

1.1. Tình hình nghiên cứu Staphylococcus aureus kháng methicillin

Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) là một trong những nguyên nhân chính gây nhiễm trùng trong bệnh viện. Tình hình kháng thuốc ngày càng nghiêm trọng, với nhiều chủng vi khuẩn kháng lại hầu hết các loại kháng sinh hiện có. Việc tìm kiếm các hợp chất kháng khuẩn mới từ thiên nhiên là rất cần thiết.

1.2. Đặc điểm và thành phần hóa học của diệp hạ châu đắng

Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) là một loại thảo dược có nhiều thành phần hóa học có lợi. Các nghiên cứu cho thấy cây này chứa lignans, flavonoids và tannins, có khả năng kháng khuẩn và chống viêm. Những hợp chất này có thể là nguồn tiềm năng cho việc phát triển thuốc kháng khuẩn.

II. Vấn đề kháng thuốc và thách thức trong điều trị nhiễm khuẩn

Kháng thuốc là một trong những vấn đề lớn trong y tế hiện đại. Việc sử dụng kháng sinh không hợp lý đã dẫn đến sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt là MRSA. Điều này gây khó khăn trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn thông thường. Cần có các biện pháp hiệu quả để kiểm soát tình trạng này.

2.1. Nguyên nhân dẫn đến kháng thuốc

Sự lạm dụng và sử dụng kháng sinh không đúng cách là nguyên nhân chính dẫn đến kháng thuốc. Việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi cũng góp phần làm gia tăng tình trạng kháng thuốc ở vi khuẩn.

2.2. Hệ quả của kháng thuốc đối với sức khỏe cộng đồng

Kháng thuốc dẫn đến việc điều trị nhiễm khuẩn trở nên khó khăn hơn, làm tăng tỷ lệ tử vong và chi phí điều trị. Các bệnh viện phải đối mặt với tình trạng gia tăng nhiễm trùng do vi khuẩn kháng thuốc, gây áp lực lên hệ thống y tế.

III. Phương pháp nghiên cứu hợp chất kháng khuẩn từ diệp hạ châu đắng

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất từ diệp hạ châu đắng. Các phương pháp như chiết lỏng-lỏng và sắc ký bản mỏng được áp dụng để tách biệt các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn. Mục tiêu là xác định các hợp chất có khả năng ức chế sự phát triển của Staphylococcus aureus.

3.1. Quy trình chiết xuất hợp chất từ diệp hạ châu đắng

Quy trình chiết xuất bao gồm việc sử dụng dung môi phù hợp để thu nhận các hợp chất từ cây. Các dung môi như ethanol và methanol thường được sử dụng để tối ưu hóa hiệu suất chiết xuất.

3.2. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất được thử nghiệm bằng phương pháp khuếch tán và pha loãng liên tiếp. Các chỉ số như nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) sẽ được xác định để đánh giá hiệu quả của các hợp chất.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy diệp hạ châu đắng có khả năng kháng Staphylococcus aureus. Các hợp chất phân lập từ cây này đã thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đáng kể. Những phát hiện này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc kháng sinh từ thiên nhiên.

4.1. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn

Các mẫu chiết xuất từ diệp hạ châu đắng cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của MRSA. Đường kính vòng kháng khuẩn được ghi nhận cho thấy hiệu quả rõ rệt của các hợp chất.

4.2. Ứng dụng trong y học và phát triển thuốc

Các hợp chất kháng khuẩn từ diệp hạ châu đắng có thể được phát triển thành thuốc điều trị nhiễm khuẩn. Nghiên cứu này góp phần vào việc tìm kiếm các giải pháp thay thế cho kháng sinh hiện tại.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về hợp chất kháng Staphylococcus aureus từ diệp hạ châu đắng đã chỉ ra tiềm năng lớn trong việc phát triển thuốc kháng sinh mới. Cần tiếp tục nghiên cứu để xác định rõ hơn về cơ chế hoạt động và hiệu quả của các hợp chất này. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại những giải pháp mới cho vấn đề kháng thuốc.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu hợp chất tự nhiên

Nghiên cứu hợp chất tự nhiên không chỉ giúp phát hiện ra các loại thuốc mới mà còn góp phần bảo tồn và phát huy giá trị của các loại thảo dược truyền thống.

5.2. Hướng đi mới trong nghiên cứu và phát triển thuốc

Cần có sự hợp tác giữa các nhà khoa học, nhà nghiên cứu và ngành công nghiệp dược phẩm để phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên, đáp ứng nhu cầu điều trị trong bối cảnh kháng thuốc ngày càng gia tăng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Sự gia tăng nhanh chóng của các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh là một trong những thách thức y tế lớn trên phạm vi toàn cầu. Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã xếp Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) vào danh mục các siêu vi khuẩn nguy hiểm hàng đầu cần ưu tiên nghiên cứu các liệu pháp điều trị mới. MRSA không chỉ đề kháng với các kháng sinh nhóm $\beta$-lactam thông qua sự biểu hiện của gen mecA mã hóa protein liên kết penicillin biến đổi (PBP2a), mà còn có khả năng kháng chéo với nhiều nhóm kháng sinh quan trọng khác như macrolide, lincosamide, fluoroquinolone và aminoglycoside. Tình trạng này dẫn đến tỷ lệ tử vong cao do các bệnh lý nhiễm khuẩn nghiêm trọng như nhiễm trùng máu, viêm phổi hoại tử, viêm nội tâm mạc và nhiễm trùng vết mổ. Tại Việt Nam, tỷ lệ các chủng S. aureus phân lập lâm sàng kháng penicillin, ciprofloxacin và amoxicillin duy trì ở mức rất cao, đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc tìm kiếm các hoạt chất kháng sinh mới từ nguồn thảo dược thiên nhiên.

Cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) là loài thảo dược nhiệt đới thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị các bệnh về gan, tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa và viêm nhiễm. Dù các nghiên cứu trên thế giới đã ghi nhận diệp hạ châu đắng chứa nhiều nhóm hoạt chất sinh học giá trị (lignan, flavonoid, tannin, triterpene) và có phổ kháng khuẩn đối với một số vi sinh vật gây bệnh, các công trình nghiên cứu sâu về khả năng ức chế chủng MRSA cũng như quy trình phân lập, tinh chế hoạt chất kháng khuẩn đặc hiệu từ nguồn nguyên liệu thu hái tại Việt Nam vẫn còn rất hạn chế.

Mục tiêu nghiên cứu của khóa luận:

1. Khảo sát khả năng kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 kháng methicillin (MRSA) của các loại cao chiết từ cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus).
2. Phân lập, tinh chế và nhận danh cấu trúc hợp chất có hoạt tính kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 kháng methicillin (MRSA) từ phân đoạn cao chiết có hoạt tính cao nhất.

Nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Giám định tên khoa học của mẫu nguyên liệu diệp hạ châu đắng thu hái tại thực địa.
2. Khảo sát ảnh hưởng của hệ dung môi chiết đến khối lượng và hiệu suất thu hồi cao chiết từ bột dược liệu khô.
3. Đánh giá giới hạn nhiễm khuẩn của các mẫu cao chiết theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV (2009).
4. Khảo sát hoạt tính kháng chủng vi khuẩn MRSA của các phân đoạn cao chiết bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch.
5. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết có hoạt tính mạnh nhất đối với MRSA.
6. Sắc ký cột phân đoạn cao chiết chọn lọc, theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và kiểm tra hoạt tính bằng kỹ thuật tự sinh đồ (bioautography).
7. Tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học của hợp chất phân lập được bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng thực vật: Mẫu cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn.) nguyên cây được thu hái tại tỉnh Tây Ninh, sau đó được giám định khoa học tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
• Đối tượng vi sinh vật: Chủng vi khuẩn kiểm định Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) do Công ty Nam Khoa Biotek cung cấp.
• Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 10/2019 đến tháng 07/2020.
• Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh – Trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh (Cơ sở 3); Phòng 19 và Phòng 44 (Phòng Các chất có hoạt tính sinh học) – Viện Công nghệ Hóa học TP. Hồ Chí Minh; Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và phân loại khoa học

• Cơ chế kháng thuốc của MRSA: Staphylococcus aureus là cầu khuẩn Gram dương, tế bào hình cầu đường kính 0,5–1,5 $\mu$m. Tính kháng methicillin được quy định bởi đoạn gen mecA nằm trên yếu tố di truyền Staphylococcal Chromosome Cassette mec (SCCmec). Gen này biểu hiện protein PBP2a (Penicillin-Binding Protein 2a) có ái lực rất thấp với các kháng sinh nhóm $\beta$-lactam, cho phép vi khuẩn tiếp tục tổng hợp vách tế bào peptidoglycan ngay cả khi có mặt kháng sinh.
• Đặc điểm hóa thực vật của Phyllanthus amarus: Cây chứa các nhóm hợp chất chính gồm lignan (phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin, phylteralin), flavonoid (quercetin, kaempferol, rutin, isoquercitrin, astragalin), tannin thủy phân (amariin, phyllanthusiin D, amarulone, acid ellagic, acid gallic) và triterpenoid (stigmasterol, $\beta$-sitosterol, lupeol). Các hợp chất nhóm polyphenol và flavonoid được chứng minh đóng vai trò then chốt trong hoạt tính kháng khuẩn và kháng oxy hóa.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Chiết xuất và phân bố lỏng - lỏng:
  • Kỹ thuật ngâm dầm (Maceration): Sử dụng 3 kg bột dược liệu khô ngâm với ethanol 96° (tỷ lệ 1:5 w/v) trong 72 giờ ở nhiệt độ phòng, lọc và cô quay chân không ở 50°C để thu hồi cao thô ethanol.
  • Phương pháp chiết lỏng - lỏng: Phân bố cao thô ethanol lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần gồm n-hexane, ethyl acetate và nước để thu các cao phân đoạn tương ứng.
• Kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn: Thực hiện theo quy chuẩn Dược điển Việt Nam IV (2009) để xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được trên môi trường Nutrient Agar (NA) ủ ở 37°C trong 24–48 giờ và tổng số nấm men - nấm mốc trên môi trường Sabouraud Dextrose Agar ủ ở 28–30°C trong 5 ngày.
• Phương pháp khuếch tán giếng thạch (Agar Well Diffusion): Đánh giá đường kính vòng vô khuẩn (vòng kháng khuẩn) trên môi trường Mueller-Hinton Agar (MHA) được cấy trải dịch vi khuẩn MRSA mật độ $10^8$ CFU/mL (tương đương chuẩn độ đục McFarland 0,5). Đục giếng đường kính 6 mm, nạp 70 $\mu$L dung dịch mẫu cao chiết hòa tan trong DMSO 10%, ủ ở 37°C trong 18–24 giờ và đo đường kính vòng ức chế (mm).
• Phương pháp pha loãng trong thạch xác định MIC: Thực hiện theo chuẩn của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm Hoa Kỳ (CLSI 2010). Pha loãng cao chiết ethyl acetate theo cấp số nhân từ nồng độ gốc 1000 $\mu$g/mL thành các dãy nồng độ liên tiếp (500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,63 $\mu$g/mL) trong môi trường thạch MHA, cấy điểm 2 $\mu$L dịch khuẩn ($10^6$ CFU/mL), ủ 37°C trong 18–24 giờ để tìm nồng độ thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi khuẩn.
• Phương pháp sắc ký và tinh chế:
  • Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sử dụng bản mỏng silica gel $60\text{ F}_{254}$ (Merck), phát hiện vết bằng đèn UV bước sóng 254 nm hoặc phun thuốc thử $\text{H}_2\text{SO}_4$ 10% trong ethanol và hơ nóng ở 105°C trong 1–2 phút.
  • Sắc ký cột (CC): Nhồi cột pha thường bằng silica gel cỡ hạt 0,040–0,063 mm (240–430 mesh, Merck), nạp mẫu theo tỷ lệ cao:silica gel là 5:50, rửa giải phân đoạn với hệ dung môi gradient n-hexane : ethyl acetate (75:25, 50:50, 25:75, 0:100 v/v) và ethyl acetate : methanol (90:10 v/v).
  • Tự sinh đồ (TLC-Bioautography): Bản mỏng sau khi giải ly được làm khô, nhúng hoặc phun dịch khuẩn MRSA ($10^6$ CFU/mL), ủ ẩm 37°C trong 3–4 giờ và phun dung dịch muối tetrazolium để làm hiện rõ các dải ức chế màu trắng trên nền màu tím formazan.
• Phương pháp xác định cấu trúc hóa học: Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D bao gồm phổ $^1\text{H}$-NMR (500 MHz) và $^{13}\text{C}$-NMR (125 MHz) trên máy Bruker AM500 FT-NMR với dung môi DMSO-$d_6$, sử dụng tetramethylsilane (TMS) làm chất nội chuẩn, kết hợp tra cứu dữ liệu phổ chuẩn.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương này hệ thống hóa các cơ sở lý luận và tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến hai đối tượng chính của đề tài:

• Vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA): Phân loại học, đặc điểm hình thái vi thể (cầu khuẩn Gram dương, tụ thành từng đám dạng chùm nho, không di động, không sinh nha bào, phản ứng coagulase dương tính), dịch tễ học và gánh nặng bệnh tật. Trình bày chi tiết cơ chế kháng sinh nhóm $\beta$-lactam thông qua gen mecA nằm trên nhiễm sắc thể SCCmec, mã hóa protein PBP2a không bị bất hoạt bởi methicillin, cephalosporin và carbapenem. Tổng quan sự xuất hiện của các chủng trung gian (VISA) và kháng hoàn toàn vancomycin (VRSA).
• Cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus): Vị trí phân loại (họ Euphorbiaceae, chi Phyllanthus), đặc điểm hình thái thực vật phân biệt với loài Phyllanthus urinaria (thân xanh nhẵn, quả nang nhẵn rủ dưới cành lá, khác với thân đỏ và quả gai của P. urinaria). Tổng hợp các nhóm hợp chất hóa học đã được cô lập (lignan, flavonoid, triterpenoid, tannin) và các tác dụng dược lý kinh điển như bảo vệ nhu mô gan, ức chế enzyme DNA polymerase của virus viêm gan B (HBV), hạ đường huyết, chống co thắt cơ trơn và kháng các vi khuẩn gây bệnh (E. coli, P. aeruginosa, Bacillus subtilis, Salmonella spp.).
• Nguyên lý các phương pháp chiết xuất, phân tích và thử nghiệm sinh học: Cơ chế chiết ngấm dầm, chiết lỏng - lỏng, tiêu chuẩn chất lượng cao dược liệu theo Dược điển Việt Nam IV, lý thuyết sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột pha thường, nguyên tắc thử nghiệm khuếch tán giếng thạch, phương pháp pha loãng xác định MIC theo chuẩn CLSI và kỹ thuật tự sinh đồ.

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết quy trình chuẩn bị mẫu, hóa chất, chủng vi sinh và thiết kế các bước thực nghiệm:

• Thu hái nguyên liệu tại Tây Ninh, xử lý rửa sạch, phơi sấy ở nhiệt độ 50°C trong 72 giờ và xay thành bột mịn.
• Quy trình chiết ngâm dầm 3 kg bột khô với ethanol 96° (tỷ lệ 1:5), thu hồi dung môi bằng máy cô quay chân không ở 50°C để thu cao thô. Tiếp đó phân bố lỏng - lỏng với n-hexane, ethyl acetate và nước.
• Quy trình thử nghiệm giới hạn vi sinh vật hiếu khí và nấm men/mốc theo Dược điển Việt Nam IV trên các môi trường NA và Sabouraud Dextrose Agar.
• Quy trình khảo sát hoạt tính kháng MRSA bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (giếng 6 mm, 70 $\mu$L dung dịch mẫu trong DMSO 10%) và phương pháp pha loãng trong thạch MHA xác định MIC (dãy nồng độ pha loãng liên tiếp bậc 2 từ 1000 $\mu$g/mL xuống 15,63 $\mu$g/mL).
• Quy trình sắc ký cột silica gel chia cao ethyl acetate thành 5 phân đoạn ký hiệu từ PA-E1 đến PA-E5. Quy trình thử tự sinh đồ (bioautography) với muối tetrazolium phát hiện dải kháng khuẩn trực tiếp trên bản TLC.
• Quy trình sắc ký cột tinh chế phân đoạn PA-E3 để cô lập hợp chất tinh khiết PA02 và quy trình đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$-NMR và $^{13}\text{C}$-NMR) tại Viện Hóa học.

Chương 3. Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được kèm theo các bảng số liệu, biểu đồ và biện luận học thuật:

• Kết quả giám định thực vật: Mẫu thu thập tại Tây Ninh được định danh chính xác là loài Phyllanthus amarus Schum. et Thonn., thuộc chi Phyllanthus, họ Euphorbiaceae.
• Khối lượng và hiệu suất thu hồi cao chiết:
  • Từ 3 kg bột dược liệu khô ban đầu, chiết ngâm dầm với ethanol 96° thu được 360 g cao thô ethanol, đạt hiệu suất 12,0%.
  • Tiến hành chiết lỏng - lỏng từ 360 g cao thô với các dung môi khác nhau thu được: cao n-hexane đạt 41,4 g (hiệu suất 11,5%); cao ethyl acetate đạt 54,0 g (hiệu suất 15,0%); phần cao nước còn lại đạt 63,0 g (hiệu suất 17,5%).
• Kết quả thử giới hạn nhiễm khuẩn: Các mẫu cao chiết đều không phát hiện thấy nấm men và nấm mốc ($< 10\text{ CFU/g}$). Mẫu cao n-hexane có tổng số vi khuẩn hiếu khí là $1,62 \times 10^3\text{ CFU/g}$, nằm hoàn toàn trong giới hạn cho phép của Dược điển Việt Nam IV ($< 5 \times 10^4\text{ CFU/g}$ đối với chế phẩm nguồn gốc thực vật).
• Hoạt tính kháng MRSA của các loại cao chiết:
  • Cao phân đoạn ethyl acetate thể hiện hoạt tính kháng chủng vi khuẩn S. aureus ATCC 43300 mạnh nhất với đường kính vòng vô khuẩn trung bình đạt $18,67 \pm 0,37\text{ mm}$.
  • Cao nước cho đường kính vòng kháng khuẩn đạt $14,33 \pm 0,37\text{ mm}$.
  • Cao n-hexane cho đường kính vòng kháng khuẩn thấp nhất đạt $12,00 \pm 0,37\text{ mm}$. Mẫu đối chứng âm (dung môi DMSO) không tạo vòng vô khuẩn ($0\text{ mm}$). Phân tích thống kê qua phép thử Duncan cho thấy sự khác biệt giữa các phân đoạn có ý nghĩa ở mức xác suất 5%.
• Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao ethyl acetate: Thử nghiệm pha loãng trên thạch xác định giá trị MIC của cao chiết ethyl acetate đối với chủng MRSA là $31,25\ \mu\text{g/mL}$. Ở nồng độ $15,63\ \mu\text{g/mL}$ vi khuẩn bắt đầu phát triển trở lại.
• Sắc ký cột và hoạt tính của các cao phân đoạn:
  • Cao ethyl acetate được sắc ký cột silica gel thu được 5 phân đoạn: PA-E1 (rửa giải bằng n-hexane : ethyl acetate 75:25), PA-E2 (50:50), PA-E3 (25:75), PA-E4 (0:100) và PA-E5 (ethyl acetate : methanol 90:10).
  • Khảo sát hoạt tính kháng MRSA và phân tích tự sinh đồ cho thấy phân đoạn PA-E3 thể hiện hoạt tính kháng khuẩn vượt trội nhất với sự xuất hiện của vùng ức chế màu trắng rõ nét trên nền tím formazan.
• Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hợp chất PA02:
  • Tinh chế phân đoạn PA-E3 qua sắc ký cột silica gel thu được hợp chất sạch ký hiệu PA02.
  • Phân tích dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$-NMR và $^{13}\text{C}$-NMR đo trong DMSO-$d_6$) và đối chiếu với tài liệu chuẩn xác nhận hợp chất PA02 chính là Quercetin (một hợp chất polyphenol thuộc nhóm Flavonoid).

Kết luận và kiến nghị

• Khóa luận khẳng định diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) có khả năng kháng chủng vi khuẩn MRSA cao, trong đó phân đoạn dung môi ethyl acetate tập trung hoạt tính mạnh nhất.
• Hợp chất Quercetin được phân lập thành công từ phân đoạn hoạt tính PA-E3, chứng minh vai trò hóa thực vật của nhóm flavonoid trong việc ức chế vi khuẩn S. aureus kháng methicillin.

---

Kết quả và đóng góp

Bảng tổng hợp số liệu thực nghiệm chính

Bảng 1: Hiệu suất chiết xuất và phân bố phân đoạn từ cây diệp hạ châu đắng

Mẫu chiết xuất / Phân đoạn	Khối lượng nguyên liệu ban đầu	Khối lượng cao thu được (g)	Hiệu suất chiết xuất (%)
Cao thô Ethanol 96°	3,0 kg (bột khô)	360,0	12,0%
Cao phân đoạn n-Hexane	360,0 g (cao thô)	41,4	11,5%
Cao phân đoạn Ethyl acetate	360,0 g (cao thô)	54,0	15,0%
Cao phân đoạn Nước	360,0 g (cao thô)	63,0	17,5%

Bảng 2: Kết quả thử hoạt tính kháng vi khuẩn MRSA (S. aureus ATCC 43300)

Mẫu thử nghiệm	Nồng độ khảo sát	Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)	Nồng độ ức chế tối thiểu MIC ($\mu$g/mL)
Cao n-Hexane	1 mg / 5 mL DMSO	$12,00 \pm 0,37^c$	Chưa xác định
Cao Ethyl acetate	1 mg / 5 mL DMSO	$18,67 \pm 0,37^a$	31,25
Cao Nước	1 mg / 5 mL DMSO	$14,33 \pm 0,37^b$	Chưa xác định
Đối chứng âm (DMSO 10%)	70 $\mu$L	0	—

Ghi chú: Các chữ cái $a, b, c$ thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức $p < 0,05$ qua phép thử Duncan.

Đóng góp khoa học và thực tiễn

• Cung cấp bằng chứng thực nghiệm: Khóa luận chứng minh chiết xuất từ cây diệp hạ châu đắng sinh trưởng tại Tây Ninh (Việt Nam) có hoạt tính ức chế trực tiếp chủng vi khuẩn đa kháng thuốc Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA).
• Xác định phân đoạn hoạt tính ưu việt: Xác lập được quy trình chiết phân đoạn lỏng - lỏng định hướng hoạt tính, chỉ ra phân đoạn ethyl acetate có hiệu lực kháng MRSA cao nhất với giá trị $\text{MIC} = 31,25\ \mu\text{g/mL}$ (thấp hơn đáng kể so với kết quả công bố của Pathmavathi et al. năm 2016 với $\text{MIC} = 62,5\ \mu\text{g/mL}$ trên S. aureus).
• Phân lập và nhận diện hoạt chất mục tiêu: Ứng dụng thành công kỹ thuật tự sinh đồ kết hợp sắc ký cột pha thường để định vị và phân lập hợp chất sạch PA02 từ phân đoạn PA-E3; giải cấu trúc bằng phổ NMR ($^1\text{H}$ và $^{13}\text{C}$) chứng minh PA02 là Quercetin, làm rõ cơ sở hóa thực vật cho hoạt tính kháng khuẩn của loài dược liệu này.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

• Các thử nghiệm kháng khuẩn mới được tiến hành trên một chủng vi khuẩn chuẩn phòng thí nghiệm (Staphylococcus aureus ATCC 43300), chưa khảo sát trên tập hợp các chủng MRSA phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng thực tế tại các bệnh viện.
• Nghiên cứu chỉ dừng lại ở phạm vi khảo sát hoạt tính in vitro, chưa thực hiện các đánh giá về độc tính tế bào, dược động học và hiệu lực điều trị in vivo trên mô hình động vật thực nghiệm.
• Quá trình sắc ký cột mới chỉ tập trung phân lập và giải cấu trúc một hợp chất chính (Quercetin) từ phân đoạn PA-E3, chưa tiến hành tinh chế toàn diện các hợp chất khác hiện diện trong các phân đoạn còn lại.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Mở rộng thử nghiệm hoạt tính ức chế và xác định MIC của cao chiết ethyl acetate và hợp chất Quercetin trên các chủng MRSA lâm sàng đa kháng thuốc khác nhau.
• Nghiên cứu sâu cơ chế tác động ở mức độ phân tử của Quercetin lên vách tế bào vi khuẩn hoặc khả năng ức chế biểu hiện gen mecA / protein PBP2a.
• Khảo sát hiệu ứng hiệp đồng kháng khuẩn (synergistic effect) khi kết hợp phân đoạn cao ethyl acetate hoặc Quercetin với các kháng sinh thông dụng nhằm giảm liều dùng và hạn chế sự phát triển tính kháng thuốc.
• Tối ưu hóa các thông số kỹ thuật chiết xuất và phân lập nhằm nâng cao hiệu suất thu hồi hoạt chất ở quy mô pilot.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng thụ hưởng:
  • Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Công nghệ Sinh học - Y Dược, Hóa Dược, Dược học và Vi sinh học ứng dụng.
  • Các cán bộ nghiên cứu tại các viện, trung tâm nghiên cứu phát triển thuốc từ nguồn tài nguyên dược liệu thiên nhiên.
  • Các nhà vi sinh học lâm sàng quan tâm đến các giải pháp hỗ trợ điều trị nhiễm khuẩn kháng thuốc.
• Nội dung tham khảo giá trị:
  • Quy trình chiết ngâm dầm và phân bố lỏng - lỏng tách phân đoạn theo độ phân cực dung môi từ nguyên liệu thảo dược.
  • Phương pháp kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn cho cao chiết thảo dược theo đúng quy chuẩn Dược điển Việt Nam IV.
  • Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn bằng kỹ thuật tự sinh đồ (TLC-Bioautography) sử dụng muối tetrazolium để phát hiện trực tiếp hoạt chất kháng khuẩn trên bản mỏng.
  • Quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) theo hướng dẫn chuẩn hóa của CLSI và dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR) nhận danh hợp chất Quercetin.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu cây diệp hạ châu đắng trong nghiên cứu được thu hái ở đâu và định danh khoa học như thế nào?

Mẫu cây diệp hạ châu đắng được thu hái tại tỉnh Tây Ninh, lựa chọn những cây khỏe mạnh, không sâu bệnh. Mẫu sau đó được giám định khoa học tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, xác định chính xác là loài Phyllanthus amarus Schum. et Thonn., thuộc chi Phyllanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).

2. Hiệu suất thu hồi cao chiết từ 3 kg bột dược liệu khô ban đầu đạt bao nhiêu?

Quá trình ngâm chiết 3 kg bột khô với ethanol 96° thu được 360 g cao thô ethanol, đạt hiệu suất 12,0%. Sau khi phân bố lỏng - lỏng 360 g cao thô, khối lượng và hiệu suất thu hồi của các phân đoạn lần lượt là: cao n-hexane đạt 41,4 g (11,5%), cao ethyl acetate đạt 54,0 g (15,0%) và cao nước đạt 63,0 g (17,5%).

3. Phân đoạn cao chiết nào thể hiện hoạt tính kháng MRSA mạnh nhất và có giá trị MIC là bao nhiêu?

Phân đoạn cao ethyl acetate thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) mạnh nhất với đường kính vòng vô khuẩn trung bình đạt $18,67 \pm 0,37\text{ mm}$ (cao hơn phân đoạn nước $14,33 \pm 0,37\text{ mm}$ và n-hexane $12,00 \pm 0,37\text{ mm}$). Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao ethyl acetate đối với chủng MRSA được xác định bằng phương pháp pha loãng trong thạch là $31,25\ \mu\text{g/mL}$.

4. Kỹ thuật nào được sử dụng để phát hiện nhanh hoạt chất kháng khuẩn trên bản sắc ký?

Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật tự sinh đồ (TLC-Bioautography). Bản mỏng sắc ký sau khi giải ly phân đoạn PA-E3 được làm khô dung môi và tiếp xúc với dịch khuẩn MRSA ($10^6\text{ CFU/mL}$), ủ ở 37°C trong 3–4 giờ rồi phun thuốc thử muối tetrazolium. Dehydrogenase của tế bào vi khuẩn sống sẽ chuyển đổi muối tetrazolium thành màu tím formazan, làm lộ rõ các vị trí có hoạt chất kháng khuẩn dưới dạng các vùng màu trắng không đổi màu.

5. Hợp chất tinh khiết phân lập được từ phân đoạn PA-E3 là chất gì và được xác định bằng phương pháp nào?

Hợp chất tinh khiết ký hiệu PA02 được phân lập từ phân đoạn PA-E3 bằng phương pháp sắc ký cột silica gel pha thường. Cấu trúc hóa học của PA02 được xác định là Quercetin (thuộc nhóm flavonoid) thông qua phân tích dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân $^1\text{H}$-NMR (500 MHz) và $^{13}\text{C}$-NMR (125 MHz) đo trong dung môi DMSO-$d_6$ trên máy Bruker AM500 FT-NMR kết hợp so sánh với các dữ liệu phổ chuẩn.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lê Thị Trúc Linh đã thực hiện thành công quy trình chiết xuất, sàng lọc hoạt tính và phân lập hoạt chất kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 43300 kháng methicillin (MRSA) từ cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus). Kết quả thực nghiệm khẳng định cao phân đoạn ethyl acetate có hoạt tính kháng MRSA vượt trội với giá trị $\text{MIC} = 31,25\ \mu\text{g/mL}$ và đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn giới hạn nhiễm khuẩn theo Dược điển Việt Nam IV. Bằng kỹ thuật tự sinh đồ kết hợp sắc ký cột và phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), đề tài đã phân lập và xác định được hợp chất Quercetin từ phân đoạn có hoạt tính cao PA-E3. Công trình cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm có giá trị cho các nghiên cứu phát triển chế phẩm kháng khuẩn nguồn gốc tự nhiên nhằm đối phó với tình trạng vi khuẩn kháng thuốc.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH: LÊ THỊ TRÚC LINH Trang 4 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH GVHD 2: TS. NGUYỄN TẤN PHÁT 1.

Tổng quan về vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) 1. Phân loại Staphylococcus aureus. Theo Buchanan và Gibbons (1994), Staphylococcus aureus được phân loại như sau: Giới Eubacteria Ngành Fimicute Lớp Bacilli Bộ Bacillales Họ Staphylococcaceae Chi Staphylococcus Loài Staphylococcus aureus Hình 1. Hình vi thể của S.aureus (https://www.com/jesslyn08/micro/) 1.

Tình hình nghiên cứu MRSA trên thế giới và Việt Nam ❖ Tình hình thế giới Trong số các loài Staphylococcus thì Staphylococcus aureus là loài thường gặp nhất, chúng thuộc nhóm cho phản ứng coagulase dương tính. Staphylococcus là những tế bào hình cầu Gram (+), đường kính 0,5-1,5 µm, có thể đứng riêng rẽ, từng đôi, bốn con, chuỗi ngắn (3-4 tế bào) hoặc chùm không theo một trật tự nào cả. Sự SVTH: LÊ THỊ TRÚC LINH Trang 5 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH GVHD 2: TS.

NGUYỄN TẤN PHÁT hình thành chùm thường xảy ra trong quá trình vi khuẩn phát triển trên môi trường đặc, do kết quả của sự phân chia tế bào quá nhiều. Staphylococci không di động, không sinh nha bào, nang thì có mặt trong những tế bào còn non, nhưng biến mất khi tế bào ở giai đoạn pha ổn định. aureus kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau. Một vài loài kháng với tất cả các loại kháng sinh ngoại trừ vancomycin, và những loài này ngày càng tăng.

Methicilin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) rất phổ biến và hầu hết các dòng này cũng kháng với nhiều kháng sinh khác. Trong phòng thí nghiệm, người ta đã tìm thấy plasmid kháng vancomycin ở Enterococcus faecalis có thể chuyển sang S. aureus, và người ta nghĩ rằng việc chuyển này có thể xảy ra ngoài tự nhiên, trong đường tiêu hóa chẳng hạn. aureus còn kháng với chất khử trùng và chất tẩy uế (Kenneth Todar.

Các chủng MRSA mang gen mã hóa protein làm cho vi khuẩn kháng với hầu hết các kháng sinh nhóm β-lactam (như methicillin) ( Lee và cs. Tại Hà Lan, một quốc gia áp dụng chính sách 'tìm kiếm và tiêu diệt', một nghiên cứu gần đây cho thấy chỉ 0,03% bệnh nhân là người mang MRSA. Hơn nữa, kiểu gen tiết lộ rằng hầu hết các chủng MRSA ở Hà Lan không liên quan đến nhau, và do đó việc nhiễm bệnh có lẽ không phải là kết quả của lây nhiễm (Wertheim và cs. MRSA là nguyên nhân chính gây nhiễm trùng da và mô mềm trong bệnh viện và cộng động ở những người khỏe mạnh khác.

Tần xuất tử vong hàng năm từ MRSA đang gia tăng nhanh chóng và vượt qua những bệnh nhây gây ra bởi virus suy giảm miễn dịch ở người/ hội chứng suy giảm miễn dịch mẵ phải (HIV/AIDS) (Bancroft và cs., 2007), từ năm 1995 đến 2005, số ca nhập viện liên quan đến nhiễm trùng MRSA tăng 119% hay 14% mỗi năm (Klein và cs., 2007), khoảng 1650 trường hợp nhiễm trùng dòng máu và 500 trường hợp tử vong hàng năm ở Úc (Turnidge và cs.000 người chết mỗi năm tại Hoa Kỳ (Dantes và cs., 2013) và một chi phí vượt quá hàng năm cho hệ thống chăm sóc sức khỏe của châu Âu là 380 triệu euro (Köck và cs. Các tình trạng liên quan đến việc nhiễm SVTH: LÊ THỊ TRÚC LINH Trang 6 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH GVHD 2: TS. NGUYỄN TẤN PHÁT MRSA thường được báo cáo bao gồm: sốc nhiễm trùng (56%), viêm phổi (32%), viêm nội tâm mạc (19%), nhiễm khuẩn huyết (10%) và viêm mô tế bào (6%) (Carrol và cs.

Tỷ lệ nhiễm MRSA đã tăng lên trong 10 năm qua, với số lần xuất viện của bệnh nhân nhiễm trùng da và mô mềm do MRSA gây ra tăng gấp ba lần kể từ năm 2004 (Mera và cs. Methicillin, giống như tất cả các penicillin. Cơ chế đề kháng của S. aureus đối với methicillin là biến đổi protein bám penicillin (PBP), chịu trách nhiệm duy trì và hình thành vách tế bào vi khuẩn.

Các chủng MRSA đã thu được một loại protein mới, được gọi là PBP2a, không bị ảnh hưởng bởi methicillin và có thể thay thế các PBP khác, do đó cho phép S. aureus sống sót với sự hiện diện của methicillin. PBP2a được mã hóa bởi gen mec A, đây là dấu hiệu đặc trưng của MRSA. Trái ngược với gen penicillinase, mecA không cư trú trên một plasmid mà trên nhiễm sắc thể, được nhúng vào một yếu tố di truyền lớn có tên là Staphylococcal Chromosome Cassette mec hoặc SCC mec.

Sự hiện diện của PBP2a có nghĩa là MRSA không chỉ kháng với methicillin mà còn với tất cả các loại kháng sinh β-Lactam, bao gồm cả penicillin tổng hợp, cephalosporin và carbapenem (Katayama và cs. Hơn 50% các chủng MRSA kháng với các loại thuốc như macrolide, lincosamide, fluoroquinolones và aminoglycoside; và 30% kháng với trimethoprim-sulfamethoxazole (Archer, 1998). Harbarth và cộng sự (2001) đã nghiên cứu sự khác biệt trong dịch tễ học của vi khuẩn đa kháng tại Hoa Kỳ và Đức. Tỷ lệ kháng kháng sinh nói chung ở Đức thấp hơn ở Mỹ, nhưng không thấp hơn một số quốc gia châu Âu khác như Hà Lan.

Lý do cho sự khác biệt giữa Hoa Kỳ và Đức không rõ ràng, nhưng có thể liên quan đến sự khác biệt trong việc sử dụng phòng thí nghiệm để chẩn đoán nhiễm trùng và các quy trình thí nghiệm chính xác được sử dụng, cũng như sự khác biệt về dòng vô tính giữa các vi khuẩn lưu hành, thực hành kê đơn kháng sinh, sự khác biệt trong dân số bệnh nhân và các yếu tố văn hóa. Để nhấn mạnh về mối đe dọa tiềm tàng của MRSA gây ra cho hệ thống chăm sóc sức khỏe ở Châu Phi, một báo cáo toàn cầu đầu tiên của SVTH: LÊ THỊ TRÚC LINH Trang 7 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH GVHD 2: TS. NGUYỄN TẤN PHÁT WHO về kháng kháng sinh được công bố năm 2014 đã ghi nhận rằng, ở một số vùng của Châu Phi có đến 80% trường hợp nhiếm MRSA khiến việc điều trị bằng kháng sinh tiêu chuẩn không còn hiệu quả.

Điều này cho thấy tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn ngày càng diễn biến phức tạp. Để đối phó với tình hình kháng kháng sinh, nhiều nhà nghiên cứu đã nghiên cứu các sản phẩm tự nhiên có nguồn gốc từ thực vật cho các loại thuốc kháng sinh và phương pháp điều trị thay thế (Wang và cs.Vancomycin là kháng sinh được lựa chọn để điều trị nhiễm trùng MRSA. Tuy nhiên sự xuất hiện của S. aureus kháng vancomycin (VRSA) và vancomycin-trung gian S.aureus (VISA) đã khiến việc điều trị kháng khuẩn trở nên khó khăn.

Do đó, các hợp chất mới được điều chế để điều trị và kiểm soát nhiễm trùng bởi các vi sinh vật này đã được phát triển và nghiên cứu rộng rãi (Lora-Tamayo và cs. ❖ Tình hình ở Việt Nam Sự lây nhiễm MRSA dẫn đến nhiều ca tử vong ở các bệnh viện tại Việt Nam. MRSA là nguyên nhân chính gây ra nhiễm trùng da và mô mềm trong bệnh viện và cộng động ở những người khỏe mạnh khác. Các vi khuẩn này có thể sống ký sinh ở vùng da hoặc vùng tai - mũi - họng mà không gây ra bệnh.

Những người nhiễm MRSA được gọi là vật chủ. MRSA thường kéo theo sự đề kháng các kháng sinh khác là vì cơ chế đề kháng của S. aureus đối với methicillin là biến đổi protein bám penicillin (PBP) chỉ do một gen quy định (mecA) và kháng thuốc kiểu này là kháng thuốc một cấp, nghĩa là một khi đã đề kháng được methicillin thì vi khuẩn đề kháng được tất cả các kháng sinh - lactam và có thể kháng các kháng sinh khác nữa (Phạm Hùng Vân, 2005). Khảo sát tính chất chống đối kháng sinh tại Thành phố Hồ Chí Minh năm 2005 cho thấy các chủng S.aureus phân lập từ bệnh phẩm cho thấy có đến 94,1% chủng kháng Penicillin, 52,9% kháng Ciprofloxacin, 52% kháng Amoxillin và 12,5% kháng Getamicin (Nguyễn Thị Kê và cs.

Điều này cho thấy tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn ngày càng diễn biến phức tạp. SVTH: LÊ THỊ TRÚC LINH Trang 8 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH GVHD 2: TS. NGUYỄN TẤN PHÁT 1.

Tổng quan về cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) 1. Phân loại khoa học Theo Đỗ Huy Bích và cộng sự (2004), Phyllanthus thuộc họ thầu dầu. Tên khoa học: Phyllanthus amarus. Tên thường gọi: cây chó đẻ, diệp hạ châu, rút đất, cam kiềm, trân châu thảo, diệp hòe thái, lào nha châu.

Theo Hemant Dhongade (1999), diệp hạ châu đắng được phân loại như sau Giới Plantae Ngành Angiospermae Lớp Dicotyledoneae Bộ Tubiflorae Họ Euphorbiaceae Chi Phyllanthus Loài Amarus Schum.et Thom Hình 1. Cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) (http://tropical.php?id=Phyllanthus+amarus) 1. Đặc điểm hình thái và phân bố Diệp hạ châu đắng là một loại cây thảo, sống quanh năm, cao 20-30 cm, có thể lên đến 60-70 cm, thân nhẵn, có màu xanh. Lá đơn, mọc so le, xếp thành 2 dãy, mỗi cành giống như một lá kép lông chim gồm nhiều lá.

Phiến lá hình bầu dục đầu tròn có mũi nhọn, màu xanh lục, đậm ở mặt trên, nhạt ở mặt dưới. Hoa mọc ở kẽ lá, SVTH: LÊ THỊ TRÚC LINH Trang 9 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH GVHD 2: TS. NGUYỄN TẤN PHÁT quả nang, hình cầu, hơi dẹt, mọc rủ xuống ở dưới lá, mùa hoa: tháng 4-6, mùa quả: tháng 7-9.

có nhiều loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, chi này có khoảng 40 loài, trong đó đáng chú ý là hai loài P.amarus có hình dáng gần giống nhau nhưng P.amarus thân có màu xanh, quả nang nhẵn, có tên gọi là diệp hạ châu đắng, còn P. urinaria thân có màu đỏ, quả nang có gai, có tên gọi là diệp hạ châu ngọt hay cây chó đẻ răng cưa. Cả hai loài này mọc rải rác ở khắp nơi,phân bố khắp các vùng nhiệt đới.

Ở Việt Nam, cây mọc hoang trên đất ẩm, ở khắp các địa phương trừ vùng núi cao, lạnh. Diệp hạ châu đắng là cây ưa ẩm, ưa sáng và hơi chịu bóng, thường mọc lẫn trong các bầu cỏ, ruộng cao, nương rẫy và vườn nhà,.Cây non mọc từ hạt vào cuối mùa xuân, sinh trưởng nhanh vào mùa hè và tàn lụi vào giữa mùa thu nêncây thường được thu hái vào cuối mùa hè vì trong thời gian này cây đã sinh trưởng, phát triển đầy đủ và chứa lượng hoạt chất cao nhất (Đỗ Huy Bích và cs. Lá và hoa diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) 1. Thành phần hóa học Theo Đỗ Huy Bích và cộng sự (2004), Phyllanthus chứa nhiều chất thuộc các nhóm hóa học: - Triterpen (stigmasterol, stigmasterol-3-0-β glucosid, β-sitosterol, β- sitosterol glucosid, lup-20-en-3 β-ol), flavonoid (kaempferol, quercetin, SVTH: LÊ THỊ TRÚC LINH Trang 10 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD 1: ThS.

DƯƠNG NHẬT LINH GVHD 2: TS.