CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về Dunaliella 1. Giới thiệu vi tảo Dunaliella Vi tảo là một cấu thành quan trọng của sinh vật phù du (plankton), đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì và phát triển hệ sinh thái dưới nước.
Vi tảo là thức ăn tươi sống đặc biệt quan trọng cho sự phát triển ấu trùng của hầu hết các loài tôm, cá, ốc và cho các động vật phù du; tính ưu việt của vi tảo là không gây ô nhiễm môi trường, cung cấp đầy đủ các vitamin, chất khoáng, vi lượng, đặc biệt là chúng chứa rất nhiều loại acid béo không no. Chúng có giá trị dinh dưỡng rất cao và phạm vi ứng dụng rộng rãi [2]. Dunaliella là nhóm vi tảo lục đơn bào thuộc Ngành Tảo lục - Họ Dunaliellaceae. Các loài Dunaliella hiện diện trong các môi trường nước biển, các hồ muối trên khắp thế giới và có khả năng chống chịu với các độ muối khác nhau.
Loài tảo này chẳng những xuất hiện ở Châu Phi, Đại Tây Dương và Địa Trung Hải, mà còn có mặt ở Biển Chết, các đại dương, biển, hồ khác - những nơi nước rất mặn, có ánh sáng mạnh và nhiệt độ cao. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng chúng có khả năng thay đổi hình dạng và thể tích để đáp ứng với sự thay đổi áp suất thẩm thấu ngoại bào. Đây là sinh vật hiếm hoi có thể sinh tồn trong môi trường nước rất mặn, nhờ chứa nồng độ cao carotenoid bảo vệ chúng khỏi ánh sáng và chứa lượng glycerol cao giúp chúng giữ độ ẩm. Ngoài ra, chúng cũng rất giàu vitamin C và E [2].
Hình dạng và cấu trúc tế bào Dunaliella Dunaliella là vi tảo lục đơn bào, có hình cầu, hình trứng, hình ellips, hình trụ hay hình quả lê tùy theo các giai đoạn tăng trưởng cũng như môi trường dinh dưỡng khác nhau trong nuôi cấy, có kích thước rộng 4-15 μm và dài 6-25 μm [16], [9]. Tế bào di động do có 2 roi, không có vách cellulose mà chỉ có lớp nhầy bên ngoài gọi là glycocalyx [14], chỉ có một lục lạp với tâm tạo bột ở giữa [22], [7]. Các tế bào 3 Luan van Dunaliella không có vách giúp tế bào có thể nhanh chóng thay đổi thể tích tế bào đế đáp ứng với những thay đổi áp suất thẩm thấu ngoại bào [3], [11] (hình 1. Tế bào Dunaliella có các bào quan điển hình của tảo lục: nhân bao bọc bởi màng nhân nằm ở phần đầu của tế bào [5], ty thể, không bào, bộ máy Golgi và một điểm mắt [3], [12].
Tế bào Dunaliella bardawil chụp dưới kính hiển vi điện tử [11] 1. Các chất có hoạt tính sinh học ở Dunaliella Vi tảo có thể sản xuất một lượng lớn các chất chống oxy hóa và các sắc tố (carotenoid gồm fucoxanthin, lutein, β-carotene, astaxanthin và phycobilliprotein), LC-PUFA, protein (các acid amin thiết yếu như methionin, threonin và tryptophan), hợp chất phenolic, hợp chất sulfate và vitamin với ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, nông nghiệp và các ngành công nghiệp dược phẩm [3], [40], [45]. Vi tảo đơn bào là một nguồn các chất chống oxy hóa đầy hứa hẹn gồm nhiều 4 Luan van loài khác nhau Botryococcus, Chlorella, Dunaliella, Nostoc, Phaeodactylum, Spirulina, Haematococcus và Chaetoceros. Nhóm hợp chất chống oxy hóa chính và được biết đến nhiều từ vi tảo là carotenoid.
Carotenoid đóng một vai trò quan trọng trong việc dập tắt các gốc tự do (ROS) tạo ra trong quá trình quang hợp, đặc biệt là oxy singlet. Ngoài ra, các hợp chất phenolic cũng là chất chống oxy hóa quan trọng ở vi tảo. Hàm lượng các hợp chất phenolic trong sinh khối tảo tăng khi tiếp xúc với các điều kiện ức chế khác nhau (như ánh sáng, nhiệt độ, độ muối, cạn kiệt dinh dưỡng.) cho thấy chúng thật sự đóng một vai trò quan trọng trong đáp ứng với các ức chế này [3], [23]. Dunaliella là một trong những loài tảo lục chịu mặn có thể sản xuất và tích lũy ba sản phẩm có giá trị cao về thương mại là glycerol, β-carotene và acid béo [8].salina được nuôi cấy trong điều kiện ức chế khác nhau tăng sản xuất carotene và dịch trích chứa carotene này có hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn và chống ung thư cao [60].
Milko (1963) đã đề cập đến khả năng tạo ra lượng lớn β-carotene ở Dunaliella sp. Sau đó, nhiều nhà khoa học như Ben-Amotz và Avron (1983), Borowitzka (1988) đã chứng minh Dunaliella sinh ra nhiều β-carotene để làm chất bảo vệ cho bộ máy quang hợp dưới các điều kiện môi trường bất lợi. Các yếu tố môi trường như cường độ ánh sáng cao, điều kiện dinh dưỡng giới hạn, nồng độ muối cao và nhiệt độ cao đều tác động đến các quang thụ quan cảm nhận ánh sáng hay kênh vận chuyển, làm giảm tính ổn định của chúng, qua đó làm tăng các stress oxy hóa và nồng độ oxy đơn bội. Các stress này có thể làm cho sự tăng trưởng của Dunaliella bị giảm nhưng lại tăng cường sự tích lũy carotenoid.
Từ đó, các nhà khoa học nhận thấy Dunaliella chính là nguồn nguyên liệu chứa β-carotene tự nhiên tốt nhất với các đồng phân 9-cis (chiếm 41%), all-trans (42%), 15-cis (10%) và đồng phân khác (7%). Chính vì vậy, từ đầu những năm 1960, người ta đã bắt đầu sản xuất Dunaliella để thu β-carotene tự nhiên và đến cuối những năm 1980, việc nuôi trồng D.salina trên quy mô công nghiệp cũng đã bắt đầu được triển khai tại Australia, Israel, Hoa Kỳ, Trung Quốc, Kuwait, Iran. 5 Luan van Việc sản xuất carotenoid từ nguồn có sẵn trong tự nhiên được cho là an toàn hơn vì ít tạo ra các dạng đồng phân cấu trúc có khả năng ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người so với từ con đường tổng hợp hóa học. Vi tảo biển, đặc biệt là loài D.salina, trong các điều kiện nhất định, có khả năng tổng hợp nguồn β-carotene rất hữu hiệu [9].
Trên thế giới, mô hình làm giàu β-carotene trong sinh khối của D.salina đã được nghiên cứu trên quy mô phòng thí nghiệm và sản xuất thương mại [28]. Để tích lũy β-carotene cần độ mặn cao, nhiệt độ cao và cường độ chiếu sáng mạnh, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng ở độ mặn trên 27% NaCl D.salina có thể tích lũy được lượng carotenoid lên tới trên 14% trọng lượng khô [2]. Nước ta có đường bờ biển dài, cường độ chiếu sáng mạnh quanh năm, vào mùa khô nhiệt độ luôn duy trì ở mức ổn định 25-35oC, hơn nữa có hệ thống các ruộng muối có độ mặn cao, vì vậy là điều kiện rất tốt để vừa xen canh làm muối, vừa nuôi trồng vi tảo biển sinh carotenoid như Dunaliella. Cơ chế sinh tổng hợp carotenoid ở Dunaliella Carotenoid là isoprenoid được tổng hợp bởi tất cả sinh vật quang hợp, một số nấm và vi khuẩn không quang hợp [18].
Hơn 750 carotenoids đã được xác định cấu trúc [65]. Ở các sinh vật quang hợp, carotenoid gắn với các protein màng thykaloid nơi mà chúng tham gia vào hấp thu ánh sáng và bảo vệ cho bộ máy quang hợp chống lại những tổn thương quang oxy hóa [18]. Quá trình sinh tổng hợp carotenoid trong các sinh vật quang hợp được thực hiện qua hai giai đoạn: + Sinh tổng hợp tiền chất isoprenoid (IPP). + Sinh tổng hợp carotenoids từ tiền chất IPP.
Carotenoid được tổng hợp đầu tiên là các tiền chất C5-terpenoid; isopentyl diphosphat (IPP), hợp chất này sau đó chuyển thành geranyl diphosphat (C20). Hai phân tử này kết hợp với nhau tạo thành phytoene sau đó tiếp tục khử hydro tạo thành phytofluene, zeta-carotene và neurosporence để cho ra lycopene. Tiếp theo 6 Luan van đó là sự tạo vòng, sự khử hydro và sự oxy hóa để tạo ra các carotenoid riêng biệt thường gặp trong tự nhiên, tuy nhiên có một số ít các hợp chất được biết có sự chuyển hóa cấu trúc cuối cùng dẫn đến hình thành hàng trăm các carotenoid khác nhau. Một lượng lớn các chất biến dưỡng thứ cấp như isoprenoid hay terpenoid gồm một vài hợp chất có giá trị sinh học và kinh tế như carotenoid.
Ở các sinh vật quang hợp, isoprenoid được tổng hợp từ isopentyl diphosphate (IPP) và dimethylallyl diphosphate (DMAPP) từ con đường mevalonate trong tế bào chất (MVA) hoặc con đường 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate (MEP) trong lục lạp (con đường không MVA hoặc 1-desoxy-D-xylulose-5-phosphate [DXP]). Ở tảo lục chỉ có con đường MEP trong lục lạp cung cấp các tiền chất cho sinh tổng hợp tất cả isoprenoid [3], [54]. Ở tảo lục (Chlorophyta) (như D.bardawil DCCBC 15) dường như thiếu con đường MVA trong tế bào chất. Ngược với con đường MVA trong tế bào chất cần 3 phân tử acetyl-coenzyme A (acetyl-CoA) để tạo IPP, con đường MEP sử dụng pyruvate và glyceraldehyde-3-phosphate làm cơ chất và 8 enzyme nằm trong lục lạp sử dụng các cofactor và ion kim loại khác nhau (hình 1.
7 Luan van Hình 1. Sơ đồ sinh tổng hợp isoprenoid ở vi tảo Dunaliella salina [54] GA-3P, glyceraldehyde-3-phosphate; DXS, 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase; DXR, 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase; MCT, 2-C- methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferrase; CMK, 4-(cytidine 5’- diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol kinase; MDS, 2-C-methyl-D-erythritol 2,4- cyclodiphosphate synthase; HDS, 4-hydroxy 3-methylbut-2-enyl diphosphate synthase; HDR, 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase; IPP, isopentenyl diphosphate; DMAPP, dimethylallyl diphosphate; IPI1 & 2, isopentenyl pyrophosphate isomerase; GPP, geranyl diphosphate; GPS, GPP synthase; FPP, farnesyl diphosphate; FPS, FPP synthase; GGPP, geranyl geranyl diphosphate; 8 Luan van GGPS, GGPP synthase; PSY, phytoene synthase; PDS, phytoene desaturase; CrtISO, carotenoid isomerase; ZDS, ζ-carotene desaturase; ZISO, 15-cis-ζ- isomerase; LCY-b, lycopene β-cyclase; LCY-e, lycopene ε-cyclase; CHY1, carotene β-hydroxylase; CHY2, carotene ε-hydroxylase; VDE, violaxanthin deepoxidase; ZE, zeoxanthin epoxidase; NSY, neoxanthin synthase. Ở lục lạp, sau khi hình thành IPP từ con đường MEP, ba phản ứng kết hợp liên tiếp được xúc tác bởi prenyltransferase hình thành geranylgeranyl diphosphate (GGPP) là tiền chất của tất cả các catenoids. Bước đầu tiên của sinh tổng hợp carotenoid gồm sự kết hợp của hai phân tử GGPP (C20) nhờ enzym phytoene synthase (PSY) thành phytoene.
Các bước tiếp theo liên quan đến các enzyme gắn trên màng thực hiện một chuỗi phản ứng khử bão hóa (phytoene desaturase [PDS] và -carotene desaturase [ZDS] và sự đồng phân hóa (carotenoid isomerase [CrtISO] và 15-cis- -isomerase [ZISO] tạo thành lycopene. Sau đó hình thành vòng nhờ cyclase (lycopene -cyclase [LCY-e] hoặc lycopene -cyclase[LCY-b]) tổng hợp - carotene và − carotene và tiếp tục các phản ứng hydroxyl hóa tạo thành lutein hoặc violaxanthin mà từ đó các carotenoid - sản phẩm cuối có thể được hình thành (hình 1. 9 Luan van Hình 1. Các con đường tổng hợp carotenoid ở các sinh vật tự dưỡng tạo oxy [54] Tuy giữa hai con đường MVA và MEP có sự tách biệt về sinh lý trong các phần khác nhau của tế bào nhưng cũng có sự liên kết giữa chúng.
Với chỉ con đường MEP hoạt động trong D.salina để cung cấp các tiền chất IPP và DMAPP cho sinh tổng hợp isopren, sự liên kết này cần thiết để cân bằng nhu cầu biến dưỡng giữa các phần khác nhau của tế bào.