Luận văn: Định lượng Omeprazole, Lansoprazole, Pantoprazole, Rabeprazole trong huyết tương bằng HPLC-DAD

Nghiên cứu xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời omeprazole, lansoprazole, pantoprazole và rabeprazole trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu

• Tác giả: Nguyễn Lê Vân Hà
• Người hướng dẫn: DS. Dương Đình Chung
• Trường học: Đại học Nguyễn Tất Thành
• Chuyên ngành: Quản lý và cung ứng thuốc
• Đề tài: Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời Omeprazole, Pantoprazole, Rabeprazole và Lansoprazole trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – DAD)
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Tổng quan về định lượng đồng thời bốn thuốc PPIs trong huyết tương

Omeprazole, lansoprazole, pantoprazole và rabeprazole thuộc nhóm thuốc ức chế bơm proton (PPIs). Nhóm này có vai trò quan trọng trong điều trị các bệnh lý liên quan đến acid dạ dày như loét dạ dày tá tràng, trào ngược dạ dày thực quản và hội chứng Zollinger-Ellison. Việc định lượng đồng thời bốn hoạt chất này trong huyết trở thành nhu cầu cấp thiết. Mục tiêu nhằm đánh giá sinh khả dụng và dược động học của thuốc một cách toàn diện. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp đầu dò mảng photodeode (HPLC-DAD) được lựa chọn. Phương pháp này cho phép tách và định lượng nhiều chất phân tích cùng lúc. Độ nhạy cao, độ chọn lọc tốt và khả năng tái lập là những ưu điểm nổi bật. Các nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh tính khả thi của kỹ thuật này. Tuy nhiên, việc áp dụng trên mẫu huyết tương đòi hỏi quy trình xử lý mẫu phức tạp. Cần tối ưu hóa nhiều thông số sắc ký để đạt kết quả chính xác và tin cậy.

1.1. Lịch sử phát triển và tính chất hóa học của nhóm PPIs

Nhóm thuốc ức chế bơm proton được phát minh từ thập niên 1980. Omeprazole là PPI đầu tiên được đưa vào sử dụng lâm sàng năm 1988. Sau đó, lansoprazole, pantoprazole và rabeprazole lần lượt ra đời. Cả bốn chất đều có cấu trúc nền benzimidazole và pyridine. Chúng là các bazơ yếu, không bền trong môi trường acid. Cơ chế tác dụng chung là ức chế enzyme H+/K+ ATPase ở tế bào viền. Mỗi PPI có thời gian bán hủy và sinh khả dụng khác nhau. Omeprazole có sinh khả dụng khoảng 30-40%. Pantoprazole bền hơn trong môi trường acid dịch vị. Rabeprazole có tác dụng nhanh nhất trong nhóm. Sự khác biệt về dược động học đòi hỏi phương pháp định lượng phải đủ nhạy để phân biệt.

1.2. Nhu cầu định lượng đồng thời PPIs trong nghiên cứu lâm sàng

Nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học đòi hỏi định lượng chính xác nồng độ thuốc trong huyết tương. Việc định lượng đồng thời bốn PPIs giúp tiết kiệm thời gian và chi phí phân tích. Trong thực hành lâm sàng, bệnh nhân có thể chuyển đổi giữa các PPIs khác nhau. Do đó, cần phương pháp phân tích đa mục tiêu để theo dõi nồng độ thuốc. Các thử nghiệm lâm sàng về tương tác thuốc cũng cần kỹ thuật định lượng đồng thời. Mẫu huyết tương chứa nhiều tạp chất nội sinh như protein, lipid và muối vô cơ. Nồng độ PPIs trong huyết tương thường ở mức nanogram trên mililít. Điều này đặt ra thách thức lớn về độ nhạy và độ chọn lọc của phương pháp phân tích.

II. Phân tích thách thức trong định lượng đồng thời omeprazole lansoprazole pantoprazole và rabeprazole

Định lượng đồng thời bốn PPIs trong huyết tương đối mặt nhiều thách thức kỹ thuật. Thứ nhất, cấu trúc hóa học tương đồng giữa các PPIs khiến việc tách sắc ký trở nên khó khăn. Thời gian lưu của các chất này có thể chồng lấp nếu điều kiện sắc ký chưa được tối ưu. Thứ hai, mẫu huyết tương là ma trận phức tạp chứa nhiều chất nội sinh gây nhiễu. Protein và các chất chuyển hóa có thể ảnh hưởng đến quá trình tách và phát hiện. Thứ ba, PPIs không bền trong môi trường acid và dễ bị phân hủy. Quá trình xử lý mẫu cần được thực hiện nhanh chóng và đúng quy trình. Thứ tư, nồng độ PPIs trong huyết tương sau khi uống thuốc thường rất thấp. Cần phương pháp có giới hạn phát hiện đủ nhỏ để đáp ứng yêu cầu phân tích. Cuối cùng, việc lựa chọn chất chuẩn nội phù hợp cũng là yếu tố then chốt. Chất chuẩn nội phải có tính chất tương tự và thời gian lưu gần với các PPIs.

2.1. Vấn đề tách sắc ký và ảnh hưởng của ma trận mẫu huyết tương

Bốn PPIs có cấu trúc benzimidazole giống nhau dẫn đến tính chất sắc ký tương tự. Sự khác biệt về nhóm thế trên vòng pyridine quyết định khả năng tách biệt. Hệ pha động phải được lựa chọn kỹ để tạo sự khác biệt về thời gian lưu. pH của pha động ảnh hưởng trực tiếp đến dạng ion hóa của PPIs. Ma trận huyết tương chứa albumin, globulin và nhiều protein khác. Các protein này có thể liên kết với PPIs và cản trở quá trình chiết xuất. Chất béo nội sinh cũng gây nhiễu tín hiệu phát hiện ở bước sóng UV. Nhiễu nền từ mẫu trắng cần được đánh giá cẩn thận để đảm bảo tính chọn lọc. Phương pháp xử lý mẫu phải loại bỏ hiệu quả các tạp chất này.

2.2. Thách thức về độ nhạy và tính ổn định của các chất PPIs

PPIs có nồng độ đỉnh trong huyết tương sau uống thường từ 0,2 đến 3 microgam trên mililít. Để đánh giá dược động học đầy đủ, cần đo nồng độ thuốc ở thời điểm muộn. Nồng độ này có thể xuống dưới 10 nanogram trên mililít. Phương pháp phải có giới hạn định lượng đủ thấp để đáp ứng yêu cầu. PPIs bị phân hủy nhanh trong môi trường acid và kiệu mạnh. Quá trình chiết xuất cần kiểm soát pH nghiêm ngặt. Mẫu huyết tương phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 độ C hoặc thấp hơn. Chuẩn bị dung dịch mẫu cần thực hiện trên đá lạnh. Thời gian từ lúc rã đông đến khi hoàn tất xử lý mẫu phải rút ngắn. Nếu không, PPIs có thể bị suy giảm đáng kể, ảnh hưởng đến kết quả định lượng.

III. Giải pháp xây dựng quy trình định lượng bằng phương pháp HPLC DAD

Phương pháp HPLC-DAD được xây dựng và tối ưu hóa qua nhiều bước. Bước đầu tiên là khảo sát bước sóng phát hiện phù hợp. Phổ UV của bốn PPIs được quét trong dải 200-400 nm. Bước sóng 285 nm được chọn làm bước sóng phát hiện chính. Đây là bước sóng có độ hấp thụ cao nhất của cả bốn chất. Tiếp theo, hệ pha động được khảo sát kỹ lưỡng. Pha động gồm methanol và nước đệm phosphate với tỷ lệ tối ưu. pH của pha động được điều chỉnh để đạt sự tách biệt tốt nhất. Cột sắc ký C18 với kích thước hạt 5 micromet được sử dụng. Tốc độ dòng chảy và nhiệt độ cột cũng được tối ưu. Về xử lý mẫu, phương pháp chiết lỏng-lỏng được áp dụng. Dung môi chiết là ethyl acetat kết hợp với hóa chất kiềm hóa. Chất chuẩn nội indomethacin được sử dụng để tăng độ chính xác. Quy trình thẩm định bao gồm tính đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác và độ thu hồi.

3.1. Tối ưu hóa điều kiện sắc ký và lựa chọn hệ pha động

Quá trình tối ưu hóa bắt đầu bằng khảo sát các hệ pha động khác nhau. Methanol và acetonitrile được đánh giá khả năng tách biệt. Kết quả cho thấy methanol cho sắc ký đồ sắc nét hơn. Tỷ lệ methanol và nước đệm phosphate được điều chỉnh từ 40:60 đến 60:40. pH pha động từ 7,0 đến 7,5 tạo điều kiện tách tốt nhất. Bốn PPIs và chất chuẩn nội được tách hoàn toàn với thời gian lưu khác biệt rõ ràng. Nhiệt độ cột ổn định ở 30 độ C đảm bảo tính tái lập. Tốc độ dòng chảy 1,0 ml/phút là tối ưu cho hệ thống phân tích. Thời gian phân tích mỗi mẫu khoảng 20 phút. Điều kiện này đáp ứng yêu cầu về hiệu quả tách và năng suất phân tích.

3.2. Xử lý mẫu huyết tương và lựa chọn chất chuẩn nội

Phương pháp chiết lỏng-lỏng được chọn sau khi đánh giá nhiều kỹ thuật. Mẫu huyết tương được pha loãng với dung dịch kiềm hóa KOH 0,1 M. Dung môi chiết là ethyl acetat có ưu điểm tách hiệu quả PPIs từ ma trận protein. Sau khi lắc và ly tâm, pha hữu cơ được tách ra và bốc hơi khô ở 40 độ C. Cặn thu được hòa tan trong pha động và lọc qua màng PTFE 0,45 micromet. Indomethacin được chọn làm chất chuẩn nội do có cấu trúc tương tự. Chất này có thời gian lưu tách biệt hoàn toàn với bốn PPIs. Indomethacin không phản ứng với bất kỳ thành phần nào trong mẫu. Quy trình xử lý mẫu cho độ thu hồi đạt trên 85% cho tất cả các chất phân tích.

IV. Kết luận và ứng dụng của quy trình định lượng đồng thời PPIs

Quy trình định lượng đồng thời omeprazole, lansoprazole, pantoprazole và rabeprazole trong huyết tương bằng HPLC-DAD đã được xây dựng thành công. Phương pháp đáp ứng đầy đủ các tiêu chí thẩm định theo hướng dẫn của FDA và EMA. Tính đặc hiệu được xác nhận khi mẫu huyết tương trắng không có nhiễu tại thời gian lưu của các chất phân tích. Độ tuyến tính đạt được trong khoảng nồng độ phù hợp với nghiên cứu dược động học. Hệ số tương quan lớn hơn 0,999 cho thấy mối quan hệ tuyến tính tốt. Độ chính xác trong ngày và giữa các ngày có độ lệch chuẩn tương đối nhỏ hơn 15%. Giới hạn định lượng đạt mức nanogram trên mililít. Quy trình này có thể áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh khả dụng. Ngoài ra, phương pháp hỗ trợ đánh giá tương tác thuốc và theo dõi nồng độ thuốc trong điều trị cá thể hóa.

4.1. Kết quả thẩm định phương pháp phân tích sinh học

Thẩm định phương pháp được thực hiện theo hướng dẫn của FDA và EMA. Tính chọn lọc được đánh giá bằng phân tích sáu nguồn huyết tương trắng khác nhau. Kết quả cho thấy không có nhiễu đáng kể tại thời gian lưu của các PPIs và chất chuẩn nội. Độ tuyến tính được xây dựng với tám mức nồng độ từ giới hạn định lượng đến nồng độ cao. Hệ số tương quan đạt trên 0,999 cho tất cả bốn chất. Độ chính xác trong ngày có RSD từ 2,1% đến 6,8%. Độ chính xác giữa các ngày có RSD từ 3,5% đến 9,2%. Độ thu hồi trung bình đạt từ 87% đến 95%. Tính ổn định mẫu được chứng minh qua các điều kiện bảo quản khác nhau. Kết quả thẩm định xác nhận phương pháp đáng tin cậy và phù hợp mục đích sử dụng.

4.2. Ứng dụng trong nghiên cứu dược động học và thực hành lâm sàng

Phương pháp đã định lượng thành công PPIs trong mẫu huyết tương từ nghiên cứu lâm sàng. Các đường cong nồng độ-thời gian được xây dựng chính xác. Các thông số dược động học như Cmax, Tmax, AUC và thời gian bán hủy được tính toán. Kết quả cho phép đánh giá sinh khả dụng tương đối giữa các chế phẩm PPIs. Trong thực hành lâm sàng, phương pháp hỗ trợ theo dõi nồng độ thuốc therapeutic drug monitoring. Bệnh nhân có biến đổi dược động học do di truyền hoặc bệnh lý nền được quản lý tốt hơn. Phương pháp cũng áp dụng được cho nghiên cứu tương tác thuốc PPIs với các thuốc khác. Tiềm năng mở rộng bao gồm định lượng chất chuyển hóa của PPIs trong huyết tương. Quy trình này đóng góp vào nền tảng phân tích dược phẩm tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Loét dạ dày - tá tràng là bệnh đứng đầu về mức độ phổ biến trong số các bệnh lý đường tiêu hóa. Ước tính khoảng 10 % dân số thế giới mắc bệnh ở mọi lứa tuổi, không phân biệt giới tính và mỗi năm tăng thêm khoảng 0,2 % dân số mắc bệnh. Trước thực trạng đó, nhiều nhóm thuốc điều trị loét dạ dày - tá tràng như nhóm kháng acid, kháng histamin H2 hay ức chế bơm proton…được sử dụng trong điều trị. Trong đó, nhóm thuốc ức chế bơm proton (PPIs) thường được kê đơn nhiều vì ưu điểm cho tác dụng nhanh, hiệu quả làm lành vết loét có thể đạt đến 95% sau tám tuần điều trị; thuốc ít ảnh hưởng đến khối lượng dịch vị, sự bài tiết pepsin, yếu tố nội tại và sự co bóp dạ dày [5].

Omeprazole (OPZ), Lansoprazole (LPZ), Pantoprazole (PPZ) và Rabeprazole (RPZ) là các đại diện quan trọng và được kê đơn phổ biến nhất của nhóm ức chế bơm proton. Để có được sự điều chỉnh liều sử dụng hợp lý cho từng đối tượng bệnh nhân thì việc kiểm soát nồng độ các hoạt chất này trong huyết tương là rất cần thiết, từ đó, làm định hướng giúp bác sĩ thực hiện kê đơn thuốc an toàn và hiệu quả. Tuy nhiên, cho đến nay, nước ta vẫn chưa có một quy trình chuẩn, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm để định lượng đồng thời các hoạt chất này trong huyết tương. Do đó, xuất phát từ yêu cầu thực tế và với mong muốn xây dựng một quy trình chung, nhanh chóng, chính xác, đơn giản và tiện lợi để xác định đồng thời 4 hoạt chất trên trong huyết tương nhằm phục vụ công tác điều trị cũng như đánh giá sinh khả dụng (SKD) và tương đương sinh học (TĐSH), chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời Omeprazole, Lansoprazole, Pantoprazole và Rabeprazole trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - DAD)”.

Đề tài được thực hiện với mục tiêu: 1. Nghiên cứu điều kiện sắc ký định lượng đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong huyết tương. Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu. Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng và đề ra quy trình phân tích thường quy để định lượng đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong huyết tương theo hướng dẫn FDA.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN VỀ NHÓM PPIs 1. Lịch sử phát minh nhóm thuốc ức chế bơm proton Thuốc PPI đầu tiên ra đời vào năm 1989 là OPZ, tiếp theo đó là sự ra đời của các thuốc LPZ, PPZ và RPZ, esomeprazole và mới đây nhất là dexlansoprazole. Các thuốc ức chế bơm proton gồm OPZ, esomeprazole, LPZ, PPZ và RPZ.

Chúng ức chế bài tiết acid dịch vị do ức chế hệ thống enzym H+/K+ – ATPase (“bơm proton”) của tế bào thành dạ dày. Các thuốc ức chế bơm proton điều trị có hiệu quả trong loét dạ dày và tá tràng, phối hợp với kháng sinh để tiệt trừ Helicobacter pylori. Trong bệnh trào ngược dạ dày – thực quản, chỉ dùng thuốc nhóm này khi có triệu chứng nặng (lúc đầu ngắn ngày) và khi có các biến chứng như hẹp, loét, chảy máu đã được xác định bằng nội soi (phải điều trị duy trì đủ liều bằng một thuốc của nhóm này). Các thuốc ức chế bơm proton cũng được dùng để phòng ngừa và điều trị các trường hợp loét do dùng NSAID.

ở những người phải tiếp tục dùng NSAID sau khi vết loét đã liền, thông thường không nên giảm liều thuốc ức chế bơm proton vì tình trạng loét không triệu chứng có thể xảy ra. Thuốc ức chế bơm proton có hiệu quả trong điều trị hội chứng Zollinger – Ellison (kể cả các trường hợp kháng với các điều trị khác) [6]. Công thức hóa học và tính chất Bảng 1. Công thức hóa học và tính chất của các PPIs OPZ LPZ PPZ RPZ CTPT C17H19N3O3S C16H14F3N3O2S C16H15F2N3O4S C18H21N3O3S KLPT 345,4 369,36 383,4 358,4 5-methoxy-2-[(4-methoxy-3,5- 2-[[3-methyl-4-(2,2,2- 6-(Difluoromethoxy)-2-[[(3,4- 2-[[4-(3-methoxypropoxy)-3- Danh dimethylpyridin-2-yl)- trifluoroethoxy)pyridin-2-yl]- imethoxypyridin-2-yl) methylpyridin-2-yl]methyl- pháp methylsulfinyl]-1H- methylsulfinyl]-1H-benzimidazole methylsulfinyl]-1H- sulfinyl]-1H-benzimidazole benzimidazole benzimidazole CTCT Bột trắng hoặc gần như trắng.

Bột kết tinh màu trắng hay nâu nhạt, Bột kết tinh màu trắng hay gần Bột kết tinh màu trắng hoặc hơi Tan trong dicloromethan và nhiệt độ nóng chảy khoảng 166°C. Khó tan trong nước và vàng trắng. Khó tan trong nước và dung dịch kiềm loãng, hơi tan Rất dễ tan trong dimethylformamid, ethanol (96%), thực tế không tan ethanol, thực tế không tan trong Tính trong ethanol 96% và tan trong methanol, hơi tan trong trong hexan. Rất dễ bị phân hủy hexan.

Rất dễ bị phân hủy trong chất methanol, rất khó tan trong ethanol, khó tan trong ethyl acetat, trong môi trường acid, thường môi trường acid, thường thấy ở nước [1], [21]. dicloromethan, rất khó tan trong thấy ở dạng muối natri ngậm 1,5 dạng muối natri [21]. acetonitril, thực tế không tan trong phân tử nước [4], [11], [14], [21]. hexan và nước [1], [21], [22].

Cơ chế tác dụng Các thuốc thuộc nhóm ức chế bơm proton là dẫn xuất benzimidazole, chúng có cùng cơ chế là ức chế bơm H+/ K+ ATPase (còn gọi là bơm proton). Sau khi vào trong cơ thể, ở pH ≤ 5, thuốc được proton hóa thành 2 dạng: acid sulphenic và sulphenamic. Hai chất này gắn thuận nghịch với nhóm sulfhydryl của bơm H+/ K+ ATPase ở tế bào thành dạ dày nên ức chế bài tiết acid do bất kỳ nguyên nhân nào [3], [6]. Dược động học Khi dùng đường uống, các PPIs hấp thu nhanh qua đường tiêu hóa nhưng thay đổi tùy thuộc theo liều dùng và pH dạ dày.

Sinh khả dụng theo đường uống có thể đạt đến 70 % nếu dùng lặp lại. Các thuốc gắn mạnh vào protein huyết tương (> 95 %). Nhóm thuốc PPIs chuyển hóa chủ yếu qua gan, chất chuyển hóa được đào thải chủ yếu qua nước tiểu (80 %), phần còn lại qua mật vào phân. Thời gian bán thải khoảng 30 – 90 phút [3], [6].

Dược lực học Thuốc ức chế đặc hiệu và không hồi phục bơm proton do tác dụng chọn lọc trên tế bào thành dạ dày nên thuốc tác dụng nhanh và hiệu quả hơn các thuốc khác. Tỷ lệ làm lành vết loét có thể đạt 95 % sau 8 tuần điều trị. Rất ít ảnh hưởng đến khối lượng dịch vị, sự bài tiết pepsin, yếu tố nội dạ dày và sự co bóp dạ dày [2], [6]. Tác dụng không mong muốn Thuốc có thể gây các rối loạn tiêu hóa như buồn nôn, táo bón hay tiêu chảy, các rối loạn thần kinh trung ương như chóng mặt, nhức đầu, ngủ gà (ít gặp).

Ngoài ra, do thuốc gây ức chế tiết acid sẽ khiến pH dạ dày tăng lên, làm cho một số vi khuẩn phát triển gây ung thư (hiếm). PPIs ức chế cytochrome P450 nên có thể ảnh hưởng đến tác dụng của các thuốc khác khi dùng đồng thời [2], [6]. Chỉ định  Trào ngược dạ dày - thực quản.  Loét dạ dày, tá tràng.

 Dự phòng loét dạ dày, tá tràng do dùng thuốc chống viêm không steroid, do stress.  Hội chứng Zollinger – Ellison [6]. Chống chỉ định Quá mẫn với bất kỳ thành phần nào của thuốc [6]. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐỊNH LƯỢNG OPZ, LPZ, PPZ VÀ RPZ TRONG DỊCH SINH HỌC 1.

Trên thế giới Bảng 1. Tóm tắt các nghiên cứu định lượng OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong dịch sinh học đã được công bố trên Thế giới Bước sóng Tốc độ Thể tích Đối tượng Chuẩn nội Pha động Cột sắc ký phát hiện dòng bơm định lượng (nm) (ml/phút) mẫu (µl) H. Dugger và ACN – đệm kali các cộng sự Megesterol C18, 250 mm x LPZ dihydrophosphat pH 4,5 (46 : 285 1,5 10 (2001) acetat 4,6 mm; 5µm 54) [12] Na2HPO4 0,05 M – acetonitril K. Yuen và các (ACN) (65 : 35), đã điều chỉnh C18, 150 mm x cộng sự (2001) OPZ Chloramphenicol 302 1,0 20 pH đến 6,5 bằng acid acetic 4,6 mm; 5 µm [24] băng Ramakrishna và Đệm phosphate 10 mM (pH C18, 250 mm x cộng sự (2005) PPZ Zonisamide 290 1,0 100 6,0) – ACN (6 1: 39) 4,6 mm; 5 µm [19] 5 Đệm amoni acetate 5 mM (đã Ramakrishna và PPZ điều chỉnh pH đến 7,4 bằng C18, 250 mm x các cộng sự RPZ 284 1,0 100 dung dịch natri hydroxit) – 4,6 mm; 5µm (2005) [20] ACN – MeOH (45 : 20 : 35) Đệm amoni bihydro phosphate 285 nm Zeng Xiaohui và 0,01 M – ACN C18, 150 mm x với LPZ các cộng sự LPZ OPZ 1,0 20 (66 : 34), được thêm 1 ‰ 4,6 mm; 5 µm và 305nm (2006) [23] Octylamine với OPZ Triethylamin (TEA) 0,1 % (pH D.

Bharathi và OPZ, = 6,0 được điều chỉnh bằng C18, 75 mm x cộng sự (2009) LPZ, PPZ Zonisamide 270 1,0 20 acid ortho phosphoric) – ACN 4,6 mm; 3,5 µm [10] và RPZ (72 : 28) Định lượng OPZ và LPZ thì PPZ 290 nm Maryam OPZ, được sử dụng Đệm phosphate 10 mM – đối với Noubarani và các C18, 150 mm x LPZ, PPZ làm chất chuẩn ACN (53 : 47), đã điều chỉnh PPZ và 1,0 50 cộng sự (2010) 4,6 mm; 5 µm và RPZ nội. Định lượng pH đến 7,3 bằng TEA 285 nm [18] PPZ và RPZ thì với LPZ LPZ được dùng 6 làm chất chuẩn nội R. Hussein và Đệm Na2HPO4 0,05 M –ACN Cột C18, 4,5 x cộng sự (2016) OPZ LPZ (60 : 40), đã điều chỉnh pH đến 302 1,0 100 150 mm; 5 µm [16] 7,0 bằng acid phosphoric Các PPIs cũng có thể được định lượng trong huyết tương bằng một số phương pháp khác như: phương pháp LC/MS, LC/MS/MS [15], [25], [27], [28], [31] hay phương pháp điện di mao quản [30]. Trong nước Năm 2010, Đào Văn Đôn và các cộng sự đã nghiên cứu định lượng PPZ trong huyết tương chó bằng phương pháp HPLC, sử dụng chất nội chuẩn là LPZ.

Với điều kiện sắc ký là cột Gemini C18, 250 mm x 4 mm; 5 µm. Pha động ACN – đệm K2HPO4 0,01 M, điều chỉnh pH đến 6,0 (39 : 61); tốc độ dòng là 1,0 ml/phút; thể tích tiêm mẫu là 100 µl. Đầu dò UV ở bước sóng 296 nm. Kết quả cho thấy khảo sát độ tuyến tính trong khoảng nồng độ 20 – 5000 ng/ml.

Phương pháp HPLC có độ chính xác trong ngày và khác ngày lần lượt là 1,4 – 5,2 % và 1,5 – 4 %. Độ đúng trong ngày và khác ngày tương ứng là 99,3 – 102,2 % và 100,7 – 103,5 % [7]. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1. Cơ sở lý thuyết Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng ở áp suất cao.

Pha tĩnh có thể là chất rắn được bao trên bề mặt một chất mang rắn, hoặc là chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ.