Nghiên Cứu Hoạt Chất Sinh Học Có Khả Năng Kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 Từ Sâm Đại Hành

Chuyên khảo phân tích Phân lập và tinh chế hoạt chất sinh học có khả năng kháng staphylococcus aureus atcc 43300 mrsa từ, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên

• Tác giả: Hà Long
• Người hướng dẫn: ThS. Dương Nhật Linh
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Hoạt Chất Sinh Học Kháng MRSA Từ Sâm Đại Hành
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA)
• 1.2. Sơ lược về cây sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.)
• 1.2.1. Phân loại khoa học
• 1.2.2. Đặc điểm hình thái
• 1.2.3. Phân bố, thu hái và chế biến
• 1.2.4. Thành phần hóa học
• 1.2.5. Các bài thuốc chữa bệnh từ sâm đại hành
• 1.2.6. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước
• 1.2.7. Khái quát về phương pháp chiết cao dược liệu
• 1.2.7.1. Kỹ thuật chiết ngâm chiết (Maceration)
• 1.2.7.2. Phương pháp chiết lỏng - lỏng
• 1.2.7.3. Cô đặc và sấy khô
• 2. PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Môi trường – hóa chất
• 2.4. Thiết bị và dụng cụ
• 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
• 2.6. Xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết
• 2.7. Khảo sát hoạt tính kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 kháng methicillin (MRSA) các loại cao chiết
• 2.8. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA)
• 2.9. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC)
• 2.10. Phương pháp sắc ký cột
• 2.11. Phương pháp hiện hình sinh học
• 2.12. Phương pháp xác định cấu trúc
• 3. PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả giám định tên khoa học của cây
• 3.2. Thu nhận cao chiết ethyl acetate từ cây sâm đại hành
• 3.3. Đánh giá giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết
• 3.4. Khảo sát hoạt tính kháng MRSA của cao tổng
• 3.5. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn Staphyloccoccus aureus ATCC 43300 (MRSA)
• 3.6. Điều chế các phân đoạn từ cao ethyl acetate bằng phương pháp sắc ký cột
• 3.7. Kết quả khảo sát khả năng kháng MRSA
• 3.7.1. Phương pháp khuếch tán đĩa giấy
• 3.7.2. Phương pháp hiện hình sinh học
• 3.7.3. Sắc ký cột cao chiết
• 3.7.4. Khảo sát các phân đoạn cao ES-EA1
• 3.7.5. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất ES06
• 4. PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• PHỤ LỤC 1: XỬ LÝ SỐ LIỆU THỐNG KÊ
• PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ GIẢI PHỔ ES06
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu hoạt chất sinh học kháng MRSA

Nghiên cứu về hoạt chất sinh học kháng MRSA từ sâm đại hành đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. MRSA, hay Staphylococcus aureus kháng methicillin, là một trong những nguyên nhân chính gây nhiễm trùng trong bệnh viện và cộng đồng. Việc tìm kiếm các tác nhân kháng khuẩn mới từ thực vật, đặc biệt là từ sâm đại hành, có thể mở ra hướng đi mới trong điều trị nhiễm khuẩn. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về tính kháng thuốc mà còn cung cấp thông tin quý giá cho việc phát triển thuốc mới.

1.1. Tình hình kháng MRSA hiện nay

Tình hình kháng MRSA đang trở nên nghiêm trọng với tỷ lệ nhiễm khuẩn ngày càng tăng. Theo WHO, tỷ lệ MRSA ở Đông Nam Á có thể lên tới 25%. Việc kháng thuốc đang là thách thức lớn trong điều trị nhiễm khuẩn.

1.2. Vai trò của sâm đại hành trong y học

Sâm đại hành (Eleutherine subaphylla) được biết đến với nhiều tác dụng chữa bệnh. Các nghiên cứu cho thấy nó có khả năng kháng khuẩn và có thể là nguồn dược liệu quý giá trong việc điều trị nhiễm khuẩn do MRSA.

II. Vấn đề kháng thuốc và thách thức trong điều trị MRSA

Kháng thuốc đang là một trong những vấn đề lớn trong y học hiện đại. MRSA đã trở thành một 'siêu vi khuẩn' với khả năng kháng lại nhiều loại kháng sinh. Việc điều trị các nhiễm khuẩn do MRSA gây ra ngày càng khó khăn hơn, đòi hỏi các nhà nghiên cứu phải tìm kiếm các giải pháp mới. Sự gia tăng tỷ lệ kháng thuốc không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng mà còn gây áp lực lên hệ thống y tế.

2.1. Nguyên nhân gia tăng kháng thuốc

Nguyên nhân chính dẫn đến tình trạng kháng thuốc là việc lạm dụng kháng sinh trong điều trị. Việc sử dụng không đúng cách và không đủ liều lượng đã tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển khả năng kháng thuốc.

2.2. Hệ quả của kháng MRSA

Kháng MRSA dẫn đến việc tăng tỷ lệ tử vong và chi phí điều trị. Các bệnh viện phải đối mặt với tình trạng nhiễm khuẩn khó điều trị, làm gia tăng gánh nặng cho hệ thống y tế.

III. Phương pháp chiết xuất hoạt chất từ sâm đại hành

Phương pháp chiết xuất là bước quan trọng trong nghiên cứu hoạt chất sinh học từ sâm đại hành. Việc sử dụng dung môi ethyl acetate đã cho thấy hiệu quả cao trong việc thu nhận các hợp chất có khả năng kháng MRSA. Các phương pháp chiết xuất hiện đại giúp tối ưu hóa quy trình và nâng cao hiệu suất thu nhận hoạt chất.

3.1. Quy trình chiết xuất bằng dung môi

Quy trình chiết xuất bằng dung môi ethyl acetate giúp thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học. Phương pháp này được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu dược liệu.

3.2. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn

Sau khi chiết xuất, các mẫu sẽ được đánh giá khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa giấy. Kết quả cho thấy cao chiết từ sâm đại hành có khả năng kháng MRSA mạnh mẽ.

IV. Kết quả nghiên cứu hoạt chất kháng MRSA từ sâm đại hành

Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết từ sâm đại hành có khả năng kháng MRSA với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đáng kể. Các phân đoạn chiết xuất đã được phân lập và xác định cấu trúc, mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc kháng khuẩn từ thiên nhiên.

4.1. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng MRSA

Kết quả khảo sát cho thấy cao chiết ethyl acetate có khả năng kháng MRSA với đường kính vòng ức chế lên tới 25,67 ± 0,86 mm, cho thấy tiềm năng lớn trong điều trị nhiễm khuẩn.

4.2. Phân lập và xác định cấu trúc hoạt chất

Các hoạt chất được phân lập từ cao chiết đã được xác định cấu trúc bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký cột, giúp hiểu rõ hơn về cơ chế tác động của chúng.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu về hoạt chất sinh học từ sâm đại hành mở ra nhiều triển vọng trong việc phát triển các loại thuốc kháng khuẩn mới. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên sẽ giúp giải quyết vấn đề kháng thuốc hiện nay. Sự kết hợp giữa y học hiện đại và y học cổ truyền có thể mang lại những giải pháp hiệu quả cho sức khỏe cộng đồng.

5.1. Tương lai của nghiên cứu hoạt chất kháng MRSA

Nghiên cứu sẽ tiếp tục tập trung vào việc phát triển các sản phẩm từ sâm đại hành, nhằm tìm ra các hoạt chất mới có khả năng kháng khuẩn hiệu quả.

5.2. Khuyến nghị cho nghiên cứu tiếp theo

Cần có thêm nhiều nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của các hoạt chất từ sâm đại hành, cũng như khả năng ứng dụng trong điều trị lâm sàng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: Hà Long KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2 GVHD: ThS. Dương Nhật Linh TS. Nguyễn Tấn Phát Trong các thập kỷ qua, các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc bệnh, tỷ lệ tử vong do nhiễm vi khuẩn kháng kháng sinh tăng đáng kể và lan truyền rộng rãi trên toàn thế giới do việc lạm dụng kháng sinh ngày càng phổ biến. Khoảng 11,000 ca tử vong liên quan đến MRSA bao gồm viêm phổi hoại tử, viêm tủy xương và nhiễm trùng huyết đã được báo cáo hàng năm (Mohammad H và cs.

Tỷ lệ MRSA ở Đông Nam Á dao động từ 7% ở Philippines, ở Malaysia đến 25% và 39% ở Singapore (Lestari và cs. Từ 293 chủng Staphylococcus aureus phân lập từ mẫu bệnh phẩm tại Khoa Sinh học Lâm sàng, Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh đã xác định được 49,7% chủng MRSA (Phan Nữ Đài Trang và cs. aureus kháng methicillin (MRSA) đã trở thành nguyên nhân phổ biến của kháng kháng sinh.

Tình trạng kháng methicillin gia tăng đáng kể ở các chủng S. aureus lâm sàng ở các nước châu Âu lên tới 20%. Vấn đề kháng thuốc đang gia tăng và việc khám phá ra các tác nhân mới có hiệu quả chống lại MRSA là hết sức cần thiết. Do đó việc tìm nguồn thuốc mới ngày càng cấp thiết, thực vật là nguồn quan tâm hàng đầu của các nhà nghiên cứu trong các năm gần đây.

Hiện nay, cùng với sự phát triển của y học, các bài thuốc từ thực vật cho mục đích chữa bệnh ngày càng nhiều. Việc sử dụng dược liệu đã tăng vượt bậc trong thập kỷ vừa qua. Thực vật được xem như là một trong những nguồn thay thế lý tưởng vì mức độ an toàn, không hoặc ít phản ứng phụ và có nhiều đích tác động khác nhau lên tế bào vi khuẩn nên ít có nguy cơ gây ra sự kháng thuốc (Raskin và cs. Dược liệu đóng một vai trò quan trọng trong chăm sóc sức khỏe với khoảng 80% dân số thế giới sử dụng thuốc y học cổ truyền chủ yếu dựa vào thực vật (Owolabi và cs.

Theo WHO, cây thuốc sẽ là nguồn tốt nhất để có được nhiều loại thuốc. Thuốc có nguồn gốc thực vật đã đóng góp lớn cho sức khỏe con người (El-Astal và cs. Sự phong phú của cây thuốc trong tự nhiên và kiến thức truyền thống làm tăng sự hiểu biết về tính chất, tính an toàn và hiệu quả của cây thuốc (Nascimento và cs. Mối quan tâm về tính chất, tính an toàn và hiệu quả của cây thuốc đã được thể hiện do sự kháng thuốc của các vi sinh vật gây bệnh trên lâm sàng đối với các kháng sinh đã được sản xuất trong những SVTH: Hà Long KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 3 GVHD: ThS.

Dương Nhật Linh TS. Nguyễn Tấn Phát thập kỷ qua (Cohen và cs., 1992; Nascimento và cs. Hiện nay, các bài báo nghiên cứu về chiết xuất hợp chất từ các loài thực vật có hoạt tính sinh học cho mục đích làm thuốc gia tăng nhanh chóng (Nascimento và cs., 2000; Rios và cs., 2005) Sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) là một loại thảo mộc trong họ La dơn, một họ thực vật bao gồm 90 chi và 1200 loài (Schultes và cs. Sâm đại hành có tác dụng điều trị một số bệnh như kinh nguyệt không đều (Hodge và cs., 1956), rối loạn đường ruột (Van den Berg, 1984; Lin và cs.

Thân rễ của sâm đại hành được sử dụng như một tác nhân cầm máu và kháng khuẩn (Dam và cs. Các loại thực vật thuộc chi này đã phân lập và xác định được một số hợp chất bao gồm elecanicin, eleutherol, isoeleutherol, eleutherin, isoeleutherin (Hara và cs., 1997), hongconin (Zhengxiong và cs., 1984) và anthraquinones (Komura và cs. Đồng thời, củ của Eleutherine americana từ lâu đã được sử dụng như một loại thuốc dân gian để điều trị bệnh tim, bệnh tiểu đường, ung thư vú, đột quỵ, tăng huyết áp và rối loạn tình dục đặc biệt là rối loạn mạch vành ở đảo Hải Nam, Trung Quốc (Ieyama và cs., 2011; Chen và cs., 1981; Mahabusarakam và cs., 2010; Han và cs. Theo nhiều báo cáo, củ của E.

americana chứa anthraquinones, naphthoquinones, các dẫn xuất của naphtalene và các hoạt tính sinh học quan trọng, chẳng hạn như giãn mạch vành, giảm prothrombin, chống đông máu, chữa lành vết thương, ức chế topoisomerase II, ức chế HIV, kháng nấm và chống ung thư (Alves và cs., 2003; Shibuya và cs., 1997; Francesca và cs., 2010; Chen và cs., 1986; Qiu và cs., 2005; Xu và cs. Hiện nay các nghiên cứu, bài báo khoa học trong nước về khả năng chữa bệnh trong các bộ phận của cây sâm đại hành còn rất hạn chế cũng như còn khá ít các nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của cao chiết sâm đại hành. Kế thừa kết quả từ đề tài nghiên cứu trước “Phân lập và tinh chế hoạt chất kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) từ cao chiết sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.)” cho thấy kết quả cao ethyl acetate có khả năng kháng mạnh với MRSA (25,67 ± 0,86 mm). Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng kháng MRSA ở người từ các phân đoạn của cao SVTH: Hà Long KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 4 GVHD: ThS.

Dương Nhật Linh TS. Nguyễn Tấn Phát ethyl acetate đồng thời phân lập và tinh chế các hoạt chất khác có hoạt tính sinh học nói trên. Chính vì thế, chúng tôi thực hiện đề tài “Phân lập và tinh chế hoạt chất sinh học có khả năng kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) từ cao chiết ethyl acetate của sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.)” Mục tiêu: - Phân lập và tinh chế hoạt chất sinh học có khả năng kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) Nội dung: - Thu nhận cao chiết sâm đại hành bằng dung môi ethyl acetate. - Đánh giá giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết.

- Điều chế các phân đoạn của cao chiết từ dung môi ethyl acetate bằng phương pháp sắc kí cột. - Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết sâm đại hành: + Khảo sát khả năng kháng khuẩn của sâm đại hành bằng phương pháp khuếch tán đĩa giấy. + Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với MRSA - Xác định cấu trúc của hợp chất ES06. SVTH: Hà Long KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 5 GVHD: ThS.

Dương Nhật Linh TS. Nguyễn Tấn Phát PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH: Hà Long KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 6 GVHD: ThS. Dương Nhật Linh TS. Nguyễn Tấn Phát 1.

Tổng quan về vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) Staphylococcus aureus kháng methicillin (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, viết tắt là MRSA) là chủng tụ cầu vàng Gram dương có khả năng đề kháng với các loại kháng sinh methicillin, penicillin, amoxicillin, oxacillin và được xem là một loại “siêu vi khuẩn” vì hiện nay có thể nó có khả năng đề kháng với rất nhiều loại kháng sinh mà trước kia có thể sử dụng để tiêu diệt MRSA trong các bệnh viện, trung tâm y tế… MRSA đề kháng penicillin M chủ yếu qua trung gian gen mecA mã hóa cho protein 2A gắn penicillin (PBP 2A hoặc PBP 2’). Khi được tạo ra, PBP 2A nằm ở vách tế bào vi khuẩn và có ái lực thấp với kháng sinh β-lactam, nhờ vậy mà làm cho vi khuẩn kháng được không chỉ penicillin M mà còn với tất cả các kháng sinh β-lactam (Phạm Hùng Vân, 2013). Kể từ những năm 1960, MRSA trở nên phổ biến trên toàn cầu và là nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn ở bệnh viện và cộng đồng. Các chủng MRSA mang gen mã hóa protein làm cho vi khuẩn kháng với hầu hết các kháng sinh nhóm β-lactam (như methicillin) (Lee và cs.

Phân loại khoa học Giới: Eubacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Staphylococcaceae Chi: Staphylococcus Hình 1. Hình vi thể MRSA Loài: Staphylococcus aureus (Gaafar và cs., 2014) Penicillin được đưa vào sử dụng cho các ca nhiễm khuẩn vào năm 1940 nhưng chỉ 2 năm sau, chủng tụ cầu vàng kháng penicillin đã được phát hiện. Năm 1960, SVTH: Hà Long KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 7 GVHD: ThS. Dương Nhật Linh TS.

Nguyễn Tấn Phát methicillin được đưa vào sử dụng rộng rãi nhưng chỉ 1 năm sau, chủng Staphylococcus aureus kháng methicillin được phân lập (Jevons và cs. Kể từ lần đầu tiên xuất hiện vào năm 1960 (Jevons và cs., 1961) tình trạng kháng methicillin ở các chủng S. aureus đã trở nên phổ biến trong các bệnh viện. Hệ thống giám sát nhiễm khuẩn bệnh viện quốc gia (NNISS) đã ghi nhận sự gia tăng MRSA tại các bệnh viện lớn ở Hoa Kỳ, từ 4% vào những năm 1980 lên 50% vào cuối những năm 1990.

Ở một số bệnh viện, đã ghi nhận được tỷ lệ kháng thuốc cao tới 80% (Wenzel và cs. Sự gia tăng các trường hợp nhiễm khuẩn MRSA khởi phát tại bệnh viện, với ước tính khoảng 18.900 trường hợp trong năm 2005 (Klevens và cs. Các bệnh nhiễm trùng hầu hết do S. aureus kháng methicillin (MRSA) gây ra: Đông Nam Á hơn 25%, Đông Địa Trung Hải hơn 50%, Châu Âu 60%, Châu Phi 80%, Tây Thái Bình Dương 80%, Châu Mỹ 90% (WHO, 2018).

MRSA là nguyên nhân chính gây nhiễm trùng da và mô mềm trong bệnh viện cộng đồng ở những người khỏe mạnh khác. Tần suất tử vong hàng năm từ MRSA đang gia tăng nhanh chóng và vượt qua những người gây ra bởi virus suy giảm miễn dịch ở người/hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (HIV/AIDS) (Bancroft và cs., 2007), từ năm 1999 đến 2005, số ca nhập viện liên quan đến nhiễm trùng MRSA tăng 119%, hay 14% mỗi năm (Klein và cs.650 trường hợp nhiễm dòng máu và 500 trường hợp tử vong hàng năm ở Úc (Turnidge và cs.000 người chết mỗi năm tại Hoa Kỳ (Dantes và cs., 2011) và một chi phí vượt quá hàng năm cho hệ thống chăm sóc sức khỏe của châu Âu là 380 triệu euro (Köck và cs. Đứng trước tình hình S. aureus kháng với penicillin do gần 100% có khả năng tiết được enzyme penicillinase phá huỷ được penicillin, các nhà lâm sàng phải chỉ định penicillin M để điều trị các nhiễm khuẩn do S.

Tuy nhiên hiện nay các bác sĩ điều trị phải đối phó với thách thức là tác nhân S. aureus kháng được penicillin M (MRSA) với tỷ lệ ngày càng gia tăng. Tại Việt Nam, một nghiên cứu đa trung tâm thực hiện năm 2005 trên 235 chủng S. aureus phân lập được từ các trường hợp lâm sàng SVTH: Hà Long KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 8 GVHD: ThS.

Dương Nhật Linh TS. Nguyễn Tấn Phát nhiễm khuẩn do S. aureus cho thấy tỷ lệ MRSA là 47%. Tổng kết tại Bệnh Viện Chợ Rẫy và Bạch mai cũng cho thấy tỷ lệ MRSA là 57% và 43%.

Tổng kết của GARP:VN cho thấy tỷ lệ MRSA ghi nhận từ 15 bệnh viện tại VN vào năm 2008 là từ 30% đến 64%. Bệnh viện Thống Nhất TP. HCM từ năm 2005 đến 2007 đã ghi nhận có đến 79% Staphylococcus saprophyticus và 40% S. aureus phân lập từ nhiễm khuẩn đường tiết niệu kháng methicillin.