Phân Lập và Tinh Chế Hoạt Chất Kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 Từ Sâm Đại Hành

Nghiên cứu về hoạt chất kháng Staphylococcus aureus từ sâm đại hành (Eleutherine subaphylla… 74 trang · Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh · 2019.

• Tác giả: Nguyễn Xuân Sanh
• Người hướng dẫn: ThS. Dương Nhật Linh
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Y Dược
• Đề tài: Phân Lập Và Tinh Chế Hoạt Chất Kháng Staphylococcus Aureus Từ Sâm Đại Hành
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Bình Dương

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA)
• 1.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA)
• 1.3. Tình hình MRSA trên thế giới và Việt Nam
• 1.4. Sơ lược về cây sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.)
• 1.5. Phân loại khoa học
• 1.6. Đặc điểm hình thái
• 1.7. Phân bố, thu hái và chế biến
• 1.8. Thành phần hóa học
• 1.9. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước
• 1.10. Khái quát về phương pháp chiết cao dược liệu
• 1.11. Kỹ thuật chiết ngâm dầm (Maceration)
• 1.12. Phương pháp chiết lỏng - lỏng
• 1.13. Cô đặc và sấy khô
• 1.14. Phương pháp sắc ký cột
• 1.15. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất
• 2. PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết đến khối lượng cao chiết
• 2.4. Xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết
• 2.5. Khảo sát hoạt tính kháng Staphylocuccus aureus ATCC 43300 kháng methicillin (MRSA) của các loại cao chiết
• 2.6. Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch
• 2.7. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với Staphylocuccus aureus ATCC 43300 kháng methicillin (MRSA)
• 2.8. Điều chế các phân đoạn từ cao n-hexane bằng phương pháp sắc ký cột
• 2.9. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
• 3. PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả giám định tên khoa học của cây
• 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết đến khối lượng cao chiết
• 3.3. Kết quả thử giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết
• 3.4. Khảo sát hoạt tính kháng MRSA của các loại cao chiết
• 3.5. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn MRSA
• 3.6. Điều chế các phân đoạn từ cao n-hexane bằng phương pháp sắc ký cột
• 3.7. Xác định cấu trúc của hợp chất ES02
• 4. PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• appendix.1. Tài liệu tiếng Việt
• appendix.2. Tài liệu tiếng Anh
• appendix.3. Tài liệu Internet

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu hoạt chất kháng Staphylococcus aureus

Nghiên cứu về hoạt chất kháng Staphylococcus aureus từ sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) đang thu hút sự chú ý của giới khoa học. Vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) là một trong những nguyên nhân chính gây nhiễm trùng bệnh viện. Việc tìm kiếm các kháng sinh tự nhiên từ thực vật như sâm đại hành có thể là giải pháp hiệu quả để đối phó với tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng. Sâm đại hành không chỉ có giá trị dinh dưỡng mà còn chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, hứa hẹn mang lại những kết quả tích cực trong việc điều trị nhiễm trùng do MRSA.

1.1. Tình hình kháng thuốc của Staphylococcus aureus hiện nay

Tình trạng kháng thuốc của Staphylococcus aureus đang trở thành vấn đề nghiêm trọng trong y tế. Theo nghiên cứu, tỷ lệ nhiễm MRSA đã gia tăng đáng kể, đặc biệt trong môi trường bệnh viện. Việc phát hiện và điều trị kịp thời là rất quan trọng để ngăn chặn sự lây lan của vi khuẩn này.

1.2. Lợi ích của việc sử dụng sâm đại hành trong y học

Sâm đại hành được biết đến với nhiều tác dụng dược lý, bao gồm khả năng kháng viêm và kháng khuẩn. Nghiên cứu cho thấy các hợp chất chiết xuất từ sâm đại hành có thể ức chế sự phát triển của MRSA, mở ra hướng đi mới trong việc phát triển kháng sinh tự nhiên.

II. Vấn đề kháng sinh và thách thức trong điều trị MRSA

Kháng sinh là một trong những phát minh vĩ đại của y học, nhưng việc lạm dụng và sử dụng không đúng cách đã dẫn đến sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn kháng thuốc. MRSA là một trong những thách thức lớn nhất trong điều trị nhiễm trùng. Việc phát hiện sớm và điều trị kịp thời là rất cần thiết để giảm thiểu nguy cơ tử vong.

2.1. Nguyên nhân dẫn đến tình trạng kháng thuốc

Sự lạm dụng kháng sinh trong điều trị và chăn nuôi là nguyên nhân chính dẫn đến tình trạng kháng thuốc. Việc sử dụng kháng sinh không đúng cách đã tạo áp lực chọn lọc, dẫn đến sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc.

2.2. Hệ quả của việc kháng thuốc đối với sức khỏe cộng đồng

Tình trạng kháng thuốc không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe cá nhân mà còn gây ra gánh nặng cho hệ thống y tế. Các ca nhiễm MRSA ngày càng gia tăng, dẫn đến chi phí điều trị cao và kéo dài thời gian nằm viện.

III. Phương pháp phân lập và tinh chế hoạt chất từ sâm đại hành

Phương pháp chiết xuất và phân lập hoạt chất từ sâm đại hành được thực hiện qua nhiều bước khác nhau. Các phương pháp như chiết ngâm dầm, chiết lỏng - lỏng và sắc ký cột được áp dụng để thu nhận các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn. Việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả và chất lượng của sản phẩm.

3.1. Quy trình chiết xuất hoạt chất từ sâm đại hành

Quy trình chiết xuất bao gồm các bước như chuẩn bị mẫu, chiết xuất bằng dung môi và cô đặc. Các dung môi khác nhau sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi hoạt chất, do đó cần lựa chọn dung môi phù hợp.

3.2. Phân tích và xác định cấu trúc hoạt chất

Sau khi thu nhận các phân đoạn, việc phân tích và xác định cấu trúc của các hợp chất là cần thiết. Các phương pháp như sắc ký lớp mỏng và phổ hồng ngoại được sử dụng để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất.

IV. Kết quả nghiên cứu hoạt chất kháng MRSA từ sâm đại hành

Kết quả nghiên cứu cho thấy các hợp chất chiết xuất từ sâm đại hành có khả năng ức chế sự phát triển của Staphylococcus aureus kháng methicillin. Các thử nghiệm cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các hợp chất này đạt hiệu quả cao, mở ra triển vọng cho việc phát triển các sản phẩm kháng sinh tự nhiên.

4.1. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn

Các phân đoạn chiết xuất từ sâm đại hành được thử nghiệm trên vi khuẩn MRSA cho thấy hoạt tính kháng khuẩn rõ rệt. Kết quả cho thấy khả năng ức chế của các phân đoạn này có thể so sánh với một số kháng sinh thông dụng.

4.2. Tác động của các hợp chất đến vi khuẩn

Nghiên cứu chỉ ra rằng các hợp chất từ sâm đại hành không chỉ ức chế sự phát triển của MRSA mà còn có tác dụng kháng viêm, giúp tăng cường hiệu quả điều trị.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu về hoạt chất kháng Staphylococcus aureus từ sâm đại hành đã chỉ ra tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm kháng sinh tự nhiên. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các sản phẩm này sẽ góp phần quan trọng trong việc chống lại tình trạng kháng thuốc hiện nay.

5.1. Tương lai của nghiên cứu kháng sinh tự nhiên

Nghiên cứu về kháng sinh tự nhiên từ thực vật như sâm đại hành sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả và an toàn hơn cho bệnh nhân.

5.2. Khuyến nghị cho các nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các hợp chất từ sâm đại hành, bao gồm việc xác định cơ chế tác động và khả năng kết hợp với các loại kháng sinh khác để nâng cao hiệu quả điều trị.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Tình trạng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh đang là thách thức nghiêm trọng đối với hệ thống y tế toàn cầu và tại Việt Nam. Trong các tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và nhiễm khuẩn cộng đồng, tụ cầu vàng kháng methicillin (Staphylococcus aureus kháng methicillin - MRSA) chiếm tỷ lệ đáng báo động. Các thống kê dịch tễ học được dẫn trong văn bản cho thấy: tại Việt Nam, khảo sát trên 110 chủng S. aureus phân lập từ bệnh phẩm ghi nhận 70 chủng MRSA (chiếm 64%); tỷ lệ MRSA tại 15 bệnh viện dao động từ 30% đến 64%. Đề kháng methicillin qua trung gian gen mecA mã hóa protein gắn penicillin biến đổi (PBP-2a) khiến vi khuẩn vô hiệu hóa hầu hết kháng sinh nhóm $\beta$-lactam, đồng thời xu hướng gia tăng nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vancomycin gây nguy cơ thất bại trong phác đồ điều trị lâm sàng.

Trước thực trạng nguồn kháng sinh mới khan hiếm, việc tìm kiếm các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc tự nhiên từ dược liệu là một hướng tiếp cận quan trọng. Cây sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep., họ La dơn - Iridaceae) là dược liệu dân gian có lịch sử sử dụng lâu đời trong điều trị viêm nhiễm, mụn nhọt, bệnh ngoài da và đường hô hấp. Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh củ sâm đại hành chứa nhiều hợp chất nhóm quinone, anthraquinone, naphtopyrone có hoạt tính sinh học, nhưng việc khảo sát chuyên sâu hoạt tính kháng chủng vi khuẩn đa kháng MRSA và cô lập hoạt chất tinh khiết định hướng tác dụng này vẫn cần được làm rõ.

Khóa luận tốt nghiệp xác định cụ thể các mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu như sau:

Mục tiêu nghiên cứu:

1. Khảo sát khả năng kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) của cao chiết từ củ sâm đại hành.
2. Chiết xuất và phân lập hợp chất có hoạt tính kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) từ cao chiết sâm đại hành.

Nhiệm vụ nghiên cứu (gồm 6 nội dung cụ thể):

1. Khảo sát hệ dung môi ngâm chiết bột củ sâm đại hành.
2. Đánh giá giới hạn nhiễm khuẩn của các phân đoạn cao chiết theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV.
3. Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn MRSA của các cao chiết phân đoạn từ củ sâm đại hành bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch.
4. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các phân đoạn cao chiết đối với chủng vi khuẩn MRSA.
5. Điều chế các phân đoạn từ phân đoạn cao n-hexane bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển.
6. Tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học của hợp chất phân lập được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Củ sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) thu mua tại tỉnh Đồng Tháp, được giám định danh pháp khoa học tại Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh; chủng vi sinh vật kiểm định là Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) do Công ty TNHH Nam Khoa Biotek cung cấp.
• Phạm vi không gian và thời gian: Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh (Trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh), Viện Công nghệ Hóa học, Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và Đại học Quốc gia Chungnam (Hàn Quốc), hoàn thành vào tháng 06 năm 2019.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được xây dựng trên cơ sở lý thuyết về hóa thực vật học (phytochemistry), dược lý học các hợp chất thiên nhiên và vi sinh vật học y dược.

Khung lý thuyết và tiêu chuẩn áp dụng:

• Lý thuyết về cơ chế kháng kháng sinh của MRSA thông qua việc biến đổi protein gắn penicillin (PBP-2a) do gen mecA kiểm soát, làm giảm ái lực với kháng sinh nhóm $\beta$-lactam.
• Hệ thống phân loại hoạt chất quinone, naphthoquinone và dẫn xuất polyketide đặc trưng trong chi Eleutherine (như eleutherin, isoeleutherin, eleutherol, eleutherinone, mangiferin).
• Tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao thuốc và giới hạn vi sinh vật theo quy định của Dược điển Việt Nam IV (Bộ Y tế, 2009).
• Hướng dẫn đánh giá độ nhạy cảm kháng sinh và phương pháp thử nghiệm vi sinh vật của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét nghiệm Hoa Kỳ (CLSI).

Phương pháp thực nghiệm chiết xuất, phân lập và kiểm nghiệm:

• Phương pháp chiết xuất và phân tách: Chiết rắn - lỏng bằng kỹ thuật ngâm dầm (maceration) bột dược liệu (300 g) trong ethanol 96° với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1:5 (w/v) trong 72 giờ ở nhiệt độ phòng; cô đuổi dung môi ở 50°C dưới áp suất giảm trên máy cô quay chân không để thu cao thô (18 g). Tiếp đó, cao thô được phân tán trong nước (tỷ lệ 1:10) và chiết lỏng - lỏng phân đoạn lần lượt qua các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, ethyl acetate và pha nước còn lại.
• Phương pháp kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn: Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được trên môi trường Nutrient Agar (NA, ủ 37°C trong 24–48 giờ) và tổng số nấm men - nấm mốc trên môi trường Sabouraud Dextrose Agar (SDA, ủ 28–30°C trong 5 ngày).
• Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn: Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (agar well diffusion) trên môi trường Mueller-Hinton Agar (MHA) với đĩa thạch đục lỗ đường kính 8 mm, nạp 70 $\mu$L mẫu cao (pha trong dimethyl sulfoxide - DMSO tỷ lệ 1:5), mật độ vi khuẩn thử nghiệm $10^8$ CFU/mL, ủ 37°C trong 18–24 giờ và đo đường kính vòng kháng khuẩn (mm).
• Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Phương pháp pha loãng trong môi trường thạch (agar dilution) với dãy nồng độ pha loãng bậc hai từ dịch gốc 1000 $\mu$g/mL (1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64), cấy điểm vi khuẩn mật độ $10^6$ tế bào/mL, ủ 37°C trong 18–24 giờ.
• Phương pháp sắc ký: Sắc ký cột cổ điển (CC) sử dụng chất hấp phụ silica gel pha thường (kích thước hạt 0,040–0,063 mm, 240–430 mesh), rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane : ethyl acetate với tỷ lệ độ phân cực tăng dần (100:0, 75:25, 50:50, 25:75, 0:100); kiểm tra độ tinh khiết phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm, 365 nm và hiện màu bằng dung dịch acid kết hợp gia nhiệt.
• Phương pháp xác định cấu trúc hóa học: Đo điểm nóng chảy trên thiết bị Boëtius (Đức); đo phổ khối ESI-MS trên hệ Agilent 1100 LC-MSD Trap; HR-ESI-MS trên máy Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS; phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1$H-NMR 500 MHz, $^{13}$C-NMR 125 MHz) trên máy Bruker Avance 500 sử dụng dung môi DMSO-$d_6$ và chuẩn nội tetramethylsilane (TMS).

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Tổng quan tài liệu

Tác giả hệ thống hóa các tư liệu nghiên cứu về đặc điểm sinh học và dịch tễ học của tụ cầu vàng đa kháng MRSA trên thế giới và tại Việt Nam. Phần này mô tả chi tiết cơ chế kháng thuốc thông qua protein PBP-2a (mã hóa bởi gen mecA) và phân biệt hai nhóm MRSA bệnh viện (MRSA-N) cùng MRSA cộng đồng (MRSA-C). Về đối tượng thực vật, tài liệu tổng hợp đầy đủ vị trí phân loại học, đặc điểm hình thái thân, lá, củ, phân bố địa lý, kinh nghiệm sử dụng dân gian và thành phần hóa học của cây sâm đại hành (Eleutherine subaphylla). Tác giả tổng thuật các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước từ năm 1951 đến 2018, chỉ ra các hợp chất chính đã được phân lập gồm eleutherin, isoeleutherin, eleutherol, eleutherinone, mangiferin, hongconin cùng các dẫn xuất polyketide. Chương này cũng phân tích cơ sở lý thuyết của các kỹ thuật ngâm dầm, chiết lỏng - lỏng, sắc ký cột và các phương pháp quang phổ hiện đại phục vụ xác định cấu trúc hợp chất tự nhiên.

Phần 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Nội dung chương trình bày chi tiết quy trình thu hái mẫu củ sâm đại hành tại Đồng Tháp, xử lý mẫu (rửa sạch, thái lát mỏng, sấy khô ở 50°C trong 72 giờ, xay mịn và rây qua rây 0,5 mm để đạt độ ẩm 10–12%). Tác giả thiết lập sơ đồ bố trí thí nghiệm toàn diện từ khâu chiết xuất cao thô với ethanol 96° đến khâu phân đoạn lỏng - lỏng bằng n-hexane, ethyl acetate và nước. Chương này mô tả tường minh các bước thực nghiệm vi sinh bao gồm: quy trình kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn (đếm khuẩn lạc hiếu khí, nấm men, nấm mốc), kỹ thuật khuếch tán giếng thạch đo vòng ức chế, phương pháp pha loãng thạch xác định MIC đối với chủng chuẩn S. aureus ATCC 43300. Đồng thời, các thông số kỹ thuật chạy sắc ký cột n-hexane (tỷ lệ silica gel/mẫu, tốc độ rửa giải, các phân đoạn ES-H1 đến ES-H5) và quy chuẩn vận hành các máy đo phổ ($^1$H-NMR, $^{13}$C-NMR, MS) được quy định rõ ràng.

Phần 3: Kết quả và thảo luận

Chương này công bố và phân tích toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình nghiên cứu:

• Giám định mẫu thực vật: Mẫu thu hái được xác nhận chính xác tên khoa học là Eleutherine subaphylla Gagnep., thuộc chi Eleutherine, họ Iridaceae.
• Khối lượng và hiệu suất phân đoạn cao chiết: Từ 300 g bột củ sâm đại hành thu được 18 g cao thô. Quá trình chiết phân đoạn lỏng - lỏng cho thấy dung môi nước đạt khối lượng cao nhất, tiếp đến là n-hexane và ethyl acetate.

Dung môi phân đoạn	Khối lượng thu được (g)	Hiệu suất thu hồi so với cao thô (%)
n-hexane	2,57	14,28
Ethyl acetate	1,99	11,10
Nước	6,62	36,78

• Kết quả thử giới hạn nhiễm khuẩn: Cả ba mẫu cao chiết đều đáp ứng yêu cầu an toàn vi sinh vật theo Dược điển Việt Nam IV (tổng số vi khuẩn hiếu khí dưới ngưỡng $5 \times 10^4$ CFU/g; không phát hiện nấm men, nấm mốc với mật độ dưới 10 CFU/g).

Cao phân đoạn	Tổng số vi khuẩn hiếu khí (CFU/g)	Tổng số nấm men - nấm mốc (CFU/g)
Cao n-hexane	$1,95 \times 10^3$	(-)
Cao Ethyl acetate	$1,81 \times 10^4$	(-)
Cao Nước	$2,05 \times 10^4$	(-)

Ghi chú: (-) biểu thị số lượng nấm men, nấm mốc ít hơn 10 CFU/g.

• Hoạt tính kháng chủng vi khuẩn MRSA: Thử nghiệm khuếch tán giếng thạch cho thấy phân đoạn cao n-hexane thể hiện hoạt tính ức chế mạnh nhất đối với S. aureus ATCC 43300, kế đến là ethyl acetate và nước (khác biệt có ý nghĩa thống kê qua phép thử Duncan ở mức $\alpha = 0,05$). Mẫu đối chứng âm DMSO hoàn toàn không tạo vòng kháng khuẩn.

Mẫu thử nghiệm	Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)
Cao n-hexane	$28,00 \pm 0,86^a$
Cao Ethyl acetate	$25,67 \pm 0,86^a$
Cao Nước	$20,33 \pm 0,86^b$
DMSO (đối chứng)	0

Ghi chú: Các giá trị có cùng mẫu tự (a, b) không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê ở mức 5%.

• Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Thử nghiệm pha loãng thạch cho thấy cả 3 phân đoạn cao n-hexane, ethyl acetate và nước đều thể hiện giá trị $\text{MIC} = 31,25\ \mu\text{g/mL}$ (tương ứng độ pha loãng 1/32 từ nồng độ gốc 1000 $\mu$g/mL). Ở nồng độ $15,63\ \mu\text{g/mL}$, vi khuẩn MRSA phát triển trở lại trên đĩa thạch.
• Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất: Do phân đoạn n-hexane có đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất ($28,00 \pm 0,86$ mm), mẫu được lựa chọn để triển khai sắc ký cột silica gel pha thường với các tỷ lệ n-hexane : ethyl acetate khác nhau, thu được 5 tiểu phân đoạn (ký hiệu từ ES-H1 đến ES-H5). Tiểu phân đoạn ES-H2 tiếp tục được tinh chế qua cột sắc ký, thu được hợp chất sạch ký hiệu là ES02 (kết tinh dạng tinh thể ở các bình hứng 16–19). Phân tích dữ liệu phổ $^1$H-NMR (500 MHz) và $^{13}$C-NMR (125 MHz) đo trong DMSO-$d_6$, kết hợp đối chiếu tài liệu tham khảo đã xác định hợp chất ES02 là eleutherol.

Phần 4: Kết luận và đề nghị

Khóa luận tổng kết toàn bộ các kết quả đạt được về hiệu suất chiết, độ an toàn vi sinh, hoạt tính kháng MRSA và thành công trong việc phân lập hợp chất eleutherol từ phân đoạn n-hexane. Tác giả đưa ra các kiến nghị nghiên cứu tiếp nối về việc mở rộng thử nghiệm trên các chủng vi khuẩn đa kháng lâm sàng khác và nghiên cứu độc tính tế bào.

Kết quả và đóng góp

Kết quả thực nghiệm chính:

• Đã chiết xuất thành công cao thô từ củ sâm đại hành với hiệu suất thu hồi 18 g cao từ 300 g bột nguyên liệu; tách phân đoạn thu được cao n-hexane (2,57 g; 14,28%), ethyl acetate (1,99 g; 11,10%) và nước (6,62 g; 36,78%).
• Đánh giá giới hạn nhiễm khuẩn đạt chuẩn Dược điển Việt Nam IV, đảm bảo mẫu cao sạch và an toàn cho các khảo sát dược lý.
• Chứng minh cả ba phân đoạn cao chiết đều có hoạt tính kháng chủng Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA), trong đó cao n-hexane có đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất ($28,00 \pm 0,86$ mm), cao ethyl acetate đạt $25,67 \pm 0,86$ mm và cao nước đạt $20,33 \pm 0,86$ mm.
• Xác định giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cả ba phân đoạn cao chiết đối với chủng vi khuẩn MRSA đạt mức $31,25\ \mu\text{g/mL}$.
• Phân tách thành công 5 tiểu phân đoạn từ cao n-hexane bằng sắc ký cột silica gel, tinh chế và xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết ES02 là eleutherol.

Giải pháp và kiến nghị của tác giả:

• Kiến nghị tiếp tục nghiên cứu phân lập và tinh sạch thêm các hợp chất hóa học khác có trong các tiểu phân đoạn còn lại (ES-H1, ES-H3, ES-H4, ES-H5).
• Đề xuất mở rộng khảo sát phổ kháng khuẩn của hợp chất eleutherol và các phân đoạn cao sâm đại hành trên các chủng vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn Gram dương đa kháng thuốc phân lập từ bệnh viện.
• Kiến nghị thực hiện các thử nghiệm đánh giá độc tính tế bào (in vitro) và thử nghiệm dược lý trên mô hình động vật (in vivo) để làm rõ tính an toàn trước khi định hướng ứng dụng làm dược phẩm.

Đóng góp khoa học: Khóa luận cung cấp dẫn liệu thực nghiệm trực tiếp chứng minh tiềm năng ức chế vi khuẩn tụ cầu vàng đa kháng methicillin (S. aureus ATCC 43300) của các phân đoạn cao chiết củ sâm đại hành Việt Nam, bổ sung dữ liệu quang phổ ($^1$H-NMR, $^{13}$C-NMR) của hoạt chất eleutherol phân lập theo quy trình sắc ký cột pha thường.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Đề tài mới chỉ tiến hành phân lập và nhận diện cấu trúc hóa học của một hợp chất chính (ES02 - eleutherol) từ tiểu phân đoạn ES-H2 thuộc cao n-hexane; các tiểu phân đoạn khác và các phân đoạn phân cực hơn chưa được phân lập triệt để. Thử nghiệm vi sinh mới dừng lại trên một chủng chuẩn duy nhất là Staphylococcus aureus ATCC 43300 ở mức độ in vitro.
• Hướng nghiên cứu tiếp: Tiếp tục chạy sắc ký cột để phân lập các hợp chất còn lại trong các phân đoạn; khảo sát cơ chế tác động phân tử của eleutherol lên vách hoặc màng tế bào MRSA; thử nghiệm hoạt tính trên các chủng vi sinh vật đề kháng thu thập từ bệnh phẩm lâm sàng.

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận là tài liệu tham khảo phù hợp cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Công nghệ sinh học Y Dược, Hóa thực vật, Dược học và Vi sinh vật học.

Các nội dung có giá trị tham khảo chuyên môn cao bao gồm:

1. Quy trình thực nghiệm chiết xuất phân đoạn lỏng - lỏng và kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn cao dược liệu theo Dược điển Việt Nam IV.
2. Phương pháp bố trí thử nghiệm kháng khuẩn giếng thạch và kỹ thuật pha loãng trong thạch xác định MIC đối với vi khuẩn kháng thuốc.
3. Thông số điều kiện chạy sắc ký cột hấp phụ silica gel pha thường và bảng dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1$H-NMR 500 MHz, $^{13}$C-NMR 125 MHz) của eleutherol trong dung môi DMSO-$d_6$.

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu thực vật củ sâm đại hành dùng trong nghiên cứu có nguồn gốc từ đâu và được định danh như thế nào? Mẫu củ sâm đại hành được thu mua tại tỉnh Đồng Tháp và được giám định khoa học chính xác tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQG TP. Hồ Chí Minh) với tên khoa học là Eleutherine subaphylla Gagnep., thuộc họ Iridaceae (họ La dơn).

2. Hiệu suất thu hồi của các phân đoạn cao chiết từ cao thô củ sâm đại hành là bao nhiêu? Từ 300 g bột dược liệu, quá trình ngâm chiết ethanol 96° thu được 18 g cao thô. Sau khi chiết lỏng - lỏng phân đoạn, khối lượng và hiệu suất thu hồi lần lượt là: cao nước đạt 6,62 g (36,78%), cao n-hexane đạt 2,57 g (14,28%) và cao ethyl acetate đạt 1,99 g (11,10%).

3. Hoạt tính kháng chủng vi khuẩn MRSA của các phân đoạn cao chiết khác nhau như thế nào? Trong thử nghiệm khuếch tán giếng thạch, cao n-hexane cho đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất ($28,00 \pm 0,86$ mm), cao ethyl acetate đạt $25,67 \pm 0,86$ mm và cao nước đạt $20,33 \pm 0,86$ mm. Tuy nhiên, trong thử nghiệm pha loãng thạch, cả 3 phân đoạn đều thể hiện cùng một giá trị nồng độ ức chế tối thiểu $\text{MIC} = 31,25\ \mu\text{g/mL}$.

4. Hợp chất tinh khiết nào đã được phân lập và xác định cấu trúc từ cao n-hexane? Hợp chất tinh khiết phân lập được từ tiểu phân đoạn ES-H2 của cao n-hexane (bình hứng 16–19) có ký hiệu là ES02, dạng tinh thể. Dữ liệu phổ $^1$H-NMR (500 MHz) và $^{13}$C-NMR (125 MHz) đo trong DMSO-$d_6$ xác nhận hợp chất này là eleutherol.

5. Kết quả kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn của các mẫu cao chiết sâm đại hành có đạt chuẩn không? Tất cả các mẫu cao chiết đều đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV: tổng số vi khuẩn hiếu khí của cao n-hexane ($1,95 \times 10^3$ CFU/g), cao ethyl acetate ($1,81 \times 10^4$ CFU/g) và cao nước ($2,05 \times 10^4$ CFU/g) đều thấp hơn giới hạn tối đa cho phép ($5 \times 10^4$ CFU/g); đồng thời không phát hiện nấm men và nấm mốc ($< 10$ CFU/g).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Xuân Sanh đã khảo sát hệ thống quy trình chiết xuất, đánh giá hoạt tính sinh học và phân lập hoạt chất kháng tụ cầu vàng đa kháng methicillin (Staphylococcus aureus ATCC 43300) từ củ sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.). Các kết quả thực nghiệm chứng minh cả ba phân đoạn cao n-hexane, ethyl acetate và nước đều có khả năng ức chế MRSA với giá trị $\text{MIC} = 31,25\ \mu\text{g/mL}$, trong đó cao n-hexane thể hiện vòng kháng khuẩn rộng nhất ($28,00 \pm 0,86$ mm). Bằng kỹ thuật sắc ký cột silica gel pha thường kết hợp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1$H-NMR, $^{13}$C-NMR), nghiên cứu đã phân lập và xác định thành công hợp chất eleutherol từ tiểu phân đoạn ES-H2. Công trình là tài liệu khoa học thực nghiệm có giá trị tham khảo rõ ràng trong lĩnh vực chiết tách hợp chất tự nhiên và nghiên cứu dược liệu kháng khuẩn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: NGUYỄN XUÂN SANH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH TS. NGUYỄN TẤN PHÁT Kháng sinh là chất do vi sinh vật tiết ra, tổng hợp hoặc bán tổng hợp mà ở nồng độ thấp nhất có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn (Nguyễn Văn Kính, 2010). Trên thế giới, vấn đề vi khuẩn kháng thuốc ngày càng phát triển và giới hạn sự lựa chọn trong việc sử dụng thuốc để chữa bệnh, đặc biệt đối với sự xâm nhiễm của vi khuẩn Gram (-) và vi khuẩn Gram (+).

Trong đó có các chủng kháng kháng sinh phổ biến như E. coli, MRSA là nguyên nhân chính trong sự bùng nổ nhiễm khuẩn ở bệnh viện và ở cộng đồng trên toàn thế giới. Vi khuẩn tụ cầu vàng S. aureus được xếp vào vi khuẩn kháng thuốc ở mức độ báo động cao.

Trong tổng số 110 chủng S. aureus phân lập từ bệnh phẩm máu, dịch vô trùng, dịch vết thương tại bệnh viện, có 70 vi khuẩn MRSA chiếm 64% và 40 chủng MSSA chiếm 36% (Phan Nữ Đài Trang và cs. Do đó, việc tìm nguồn thuốc mới thay thế cho các thuốc đang sử dụng ngày càng trở nên cấp thiết. Hiện nay, cùng với sự phát triển của y học, các bài thuốc từ thực vật được sử dụng để chữa bệnh ngày càng nhiều.

Thực vật được xem như là một trong những nguồn thay thế lý tưởng vì mức độ an toàn, không hoặc ít phản ứng phụ và có nhiều đích tác động khác nhau lên tế bào vi khuẩn nên ít có nguy cơ gây ra sự kháng thuốc (Raskin và cs. Các loài thực vật này có trong tự nhiên, dễ kiếm, lại ít có những tác dụng phụ cho con người, do đó đã thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu hóa sinh và y dược học trong nước cũng như trên thế giới (Đỗ Tất Lợi, 2006). Sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) là một loại cỏ sống lâu năm, cao từ 30 - 60 cm, dò (củ) hình trứng dài 4 - 5 cm, đường kính 2 - 3 cm giống như củ hành nhưng dài hơn, bên ngoài phủ vảy màu đỏ nâu, phía trong màu nâu hồng đến đỏ nâu. Sâm đại hành có tác dụng kháng sinh, chống viêm,… (Đỗ Tất Lợi, 2006) và đã được sử dụng phổ biến trong dân gian.

Năm 2011, Huỳnh Kim Diệu đã nghiên cứu về sự thuần chủng và tính kháng khuẩn của sâm đại hành. Kết quả cho thấy sâm đại hành không thuần chủng, được chia làm 11 dòng, tính kháng khuẩn của các dòng trên vi khuẩn được thử nghiệm có hoạt tính khác nhau, nhưng tất cả đều tác động rất tốt trên S. aureus (MIC = 256-512 SVTH: NGUYỄN XUÂN SANH 1 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH TS.

NGUYỄN TẤN PHÁT µg/ml), kế đến S. faecalis (MIC = 512-1024 µg/ml), yếu hơn trên P. hydrophila (MIC = 2048-4096 µg/ml), kháng khuẩn yếu nhất trên E. coli và Salmonella spp.

Năm 2018, Harlita và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của Eleutherine palmifolia L. (Merr) đối với vi khuẩn gây bệnh, kết quả từ thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn chỉ ra rằng các chất chiết xuất từ n - hexane, ethyl acetate và ethanol 96% có khả năng ức chế sự tăng trưởng của MRSA, B. cereus, Shigella spp. aeruginosa (Harlita và cs.

Năm 1951, lần đầu tiên cây sâm đại hành được nghiên cứu bởi Schmid và cộng sự, hai hợp chất là eleutherin và isoeleutherin đã được phân lập (Schmid và cs. Ở Việt Nam, chưa có nhiều các nghiên cứu về thành phần hoá học của loài sâm đại hành, ngoài công bố phân lập được 4 hợp chất là eleutherin C16H16O4 độ chảy 175o, izoeleutherin C16H16O4 độ chảy 177o, eleutherol C14H12O4 độ chảy 202-203o và một chất chưa xác định được đặt tên là Ex của Lê Văn Hồng và Nguyễn Văn Đàn.