Phân Lập và Tinh Chế Hoạt Chất Kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 Từ Sâm Đại Hành

Tài liệu nghiên cứu Phân lập và tinh chế hoạt chất kháng staphylococcus aureus atcc 43300 mrsa từ cao chiết sâm đại, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên sâu

• Tác giả: Nguyễn Xuân Sanh
• Người hướng dẫn: ThS. Dương Nhật Linh
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Y Dược
• Đề tài: Phân Lập Và Tinh Chế Hoạt Chất Kháng Staphylococcus Aureus Từ Sâm Đại Hành
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Bình Dương

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA)
• 1.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA)
• 1.3. Tình hình MRSA trên thế giới và Việt Nam
• 1.4. Sơ lược về cây sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.)
• 1.5. Phân loại khoa học
• 1.6. Đặc điểm hình thái
• 1.7. Phân bố, thu hái và chế biến
• 1.8. Thành phần hóa học
• 1.9. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước
• 1.10. Khái quát về phương pháp chiết cao dược liệu
• 1.11. Kỹ thuật chiết ngâm dầm (Maceration)
• 1.12. Phương pháp chiết lỏng - lỏng
• 1.13. Cô đặc và sấy khô
• 1.14. Phương pháp sắc ký cột
• 1.15. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất
• 2. PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết đến khối lượng cao chiết
• 2.4. Xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết
• 2.5. Khảo sát hoạt tính kháng Staphylocuccus aureus ATCC 43300 kháng methicillin (MRSA) của các loại cao chiết
• 2.6. Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch
• 2.7. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với Staphylocuccus aureus ATCC 43300 kháng methicillin (MRSA)
• 2.8. Điều chế các phân đoạn từ cao n-hexane bằng phương pháp sắc ký cột
• 2.9. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
• 3. PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả giám định tên khoa học của cây
• 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết đến khối lượng cao chiết
• 3.3. Kết quả thử giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết
• 3.4. Khảo sát hoạt tính kháng MRSA của các loại cao chiết
• 3.5. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn MRSA
• 3.6. Điều chế các phân đoạn từ cao n-hexane bằng phương pháp sắc ký cột
• 3.7. Xác định cấu trúc của hợp chất ES02
• 4. PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• appendix.1. Tài liệu tiếng Việt
• appendix.2. Tài liệu tiếng Anh
• appendix.3. Tài liệu Internet

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu hoạt chất kháng Staphylococcus aureus

Nghiên cứu về hoạt chất kháng Staphylococcus aureus từ sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) đang thu hút sự chú ý của giới khoa học. Vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) là một trong những nguyên nhân chính gây nhiễm trùng bệnh viện. Việc tìm kiếm các kháng sinh tự nhiên từ thực vật như sâm đại hành có thể là giải pháp hiệu quả để đối phó với tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng. Sâm đại hành không chỉ có giá trị dinh dưỡng mà còn chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, hứa hẹn mang lại những kết quả tích cực trong việc điều trị nhiễm trùng do MRSA.

1.1. Tình hình kháng thuốc của Staphylococcus aureus hiện nay

Tình trạng kháng thuốc của Staphylococcus aureus đang trở thành vấn đề nghiêm trọng trong y tế. Theo nghiên cứu, tỷ lệ nhiễm MRSA đã gia tăng đáng kể, đặc biệt trong môi trường bệnh viện. Việc phát hiện và điều trị kịp thời là rất quan trọng để ngăn chặn sự lây lan của vi khuẩn này.

1.2. Lợi ích của việc sử dụng sâm đại hành trong y học

Sâm đại hành được biết đến với nhiều tác dụng dược lý, bao gồm khả năng kháng viêm và kháng khuẩn. Nghiên cứu cho thấy các hợp chất chiết xuất từ sâm đại hành có thể ức chế sự phát triển của MRSA, mở ra hướng đi mới trong việc phát triển kháng sinh tự nhiên.

II. Vấn đề kháng sinh và thách thức trong điều trị MRSA

Kháng sinh là một trong những phát minh vĩ đại của y học, nhưng việc lạm dụng và sử dụng không đúng cách đã dẫn đến sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn kháng thuốc. MRSA là một trong những thách thức lớn nhất trong điều trị nhiễm trùng. Việc phát hiện sớm và điều trị kịp thời là rất cần thiết để giảm thiểu nguy cơ tử vong.

2.1. Nguyên nhân dẫn đến tình trạng kháng thuốc

Sự lạm dụng kháng sinh trong điều trị và chăn nuôi là nguyên nhân chính dẫn đến tình trạng kháng thuốc. Việc sử dụng kháng sinh không đúng cách đã tạo áp lực chọn lọc, dẫn đến sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc.

2.2. Hệ quả của việc kháng thuốc đối với sức khỏe cộng đồng

Tình trạng kháng thuốc không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe cá nhân mà còn gây ra gánh nặng cho hệ thống y tế. Các ca nhiễm MRSA ngày càng gia tăng, dẫn đến chi phí điều trị cao và kéo dài thời gian nằm viện.

III. Phương pháp phân lập và tinh chế hoạt chất từ sâm đại hành

Phương pháp chiết xuất và phân lập hoạt chất từ sâm đại hành được thực hiện qua nhiều bước khác nhau. Các phương pháp như chiết ngâm dầm, chiết lỏng - lỏng và sắc ký cột được áp dụng để thu nhận các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn. Việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả và chất lượng của sản phẩm.

3.1. Quy trình chiết xuất hoạt chất từ sâm đại hành

Quy trình chiết xuất bao gồm các bước như chuẩn bị mẫu, chiết xuất bằng dung môi và cô đặc. Các dung môi khác nhau sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi hoạt chất, do đó cần lựa chọn dung môi phù hợp.

3.2. Phân tích và xác định cấu trúc hoạt chất

Sau khi thu nhận các phân đoạn, việc phân tích và xác định cấu trúc của các hợp chất là cần thiết. Các phương pháp như sắc ký lớp mỏng và phổ hồng ngoại được sử dụng để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất.

IV. Kết quả nghiên cứu hoạt chất kháng MRSA từ sâm đại hành

Kết quả nghiên cứu cho thấy các hợp chất chiết xuất từ sâm đại hành có khả năng ức chế sự phát triển của Staphylococcus aureus kháng methicillin. Các thử nghiệm cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các hợp chất này đạt hiệu quả cao, mở ra triển vọng cho việc phát triển các sản phẩm kháng sinh tự nhiên.

4.1. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn

Các phân đoạn chiết xuất từ sâm đại hành được thử nghiệm trên vi khuẩn MRSA cho thấy hoạt tính kháng khuẩn rõ rệt. Kết quả cho thấy khả năng ức chế của các phân đoạn này có thể so sánh với một số kháng sinh thông dụng.

4.2. Tác động của các hợp chất đến vi khuẩn

Nghiên cứu chỉ ra rằng các hợp chất từ sâm đại hành không chỉ ức chế sự phát triển của MRSA mà còn có tác dụng kháng viêm, giúp tăng cường hiệu quả điều trị.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu về hoạt chất kháng Staphylococcus aureus từ sâm đại hành đã chỉ ra tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm kháng sinh tự nhiên. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các sản phẩm này sẽ góp phần quan trọng trong việc chống lại tình trạng kháng thuốc hiện nay.

5.1. Tương lai của nghiên cứu kháng sinh tự nhiên

Nghiên cứu về kháng sinh tự nhiên từ thực vật như sâm đại hành sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả và an toàn hơn cho bệnh nhân.

5.2. Khuyến nghị cho các nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các hợp chất từ sâm đại hành, bao gồm việc xác định cơ chế tác động và khả năng kết hợp với các loại kháng sinh khác để nâng cao hiệu quả điều trị.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: NGUYỄN XUÂN SANH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH TS. NGUYỄN TẤN PHÁT Kháng sinh là chất do vi sinh vật tiết ra, tổng hợp hoặc bán tổng hợp mà ở nồng độ thấp nhất có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn (Nguyễn Văn Kính, 2010). Trên thế giới, vấn đề vi khuẩn kháng thuốc ngày càng phát triển và giới hạn sự lựa chọn trong việc sử dụng thuốc để chữa bệnh, đặc biệt đối với sự xâm nhiễm của vi khuẩn Gram (-) và vi khuẩn Gram (+).

Trong đó có các chủng kháng kháng sinh phổ biến như E. coli, MRSA là nguyên nhân chính trong sự bùng nổ nhiễm khuẩn ở bệnh viện và ở cộng đồng trên toàn thế giới. Vi khuẩn tụ cầu vàng S. aureus được xếp vào vi khuẩn kháng thuốc ở mức độ báo động cao.

Trong tổng số 110 chủng S. aureus phân lập từ bệnh phẩm máu, dịch vô trùng, dịch vết thương tại bệnh viện, có 70 vi khuẩn MRSA chiếm 64% và 40 chủng MSSA chiếm 36% (Phan Nữ Đài Trang và cs. Do đó, việc tìm nguồn thuốc mới thay thế cho các thuốc đang sử dụng ngày càng trở nên cấp thiết. Hiện nay, cùng với sự phát triển của y học, các bài thuốc từ thực vật được sử dụng để chữa bệnh ngày càng nhiều.

Thực vật được xem như là một trong những nguồn thay thế lý tưởng vì mức độ an toàn, không hoặc ít phản ứng phụ và có nhiều đích tác động khác nhau lên tế bào vi khuẩn nên ít có nguy cơ gây ra sự kháng thuốc (Raskin và cs. Các loài thực vật này có trong tự nhiên, dễ kiếm, lại ít có những tác dụng phụ cho con người, do đó đã thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu hóa sinh và y dược học trong nước cũng như trên thế giới (Đỗ Tất Lợi, 2006). Sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) là một loại cỏ sống lâu năm, cao từ 30 - 60 cm, dò (củ) hình trứng dài 4 - 5 cm, đường kính 2 - 3 cm giống như củ hành nhưng dài hơn, bên ngoài phủ vảy màu đỏ nâu, phía trong màu nâu hồng đến đỏ nâu. Sâm đại hành có tác dụng kháng sinh, chống viêm,… (Đỗ Tất Lợi, 2006) và đã được sử dụng phổ biến trong dân gian.

Năm 2011, Huỳnh Kim Diệu đã nghiên cứu về sự thuần chủng và tính kháng khuẩn của sâm đại hành. Kết quả cho thấy sâm đại hành không thuần chủng, được chia làm 11 dòng, tính kháng khuẩn của các dòng trên vi khuẩn được thử nghiệm có hoạt tính khác nhau, nhưng tất cả đều tác động rất tốt trên S. aureus (MIC = 256-512 SVTH: NGUYỄN XUÂN SANH 1 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH TS.

NGUYỄN TẤN PHÁT µg/ml), kế đến S. faecalis (MIC = 512-1024 µg/ml), yếu hơn trên P. hydrophila (MIC = 2048-4096 µg/ml), kháng khuẩn yếu nhất trên E. coli và Salmonella spp.

Năm 2018, Harlita và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của Eleutherine palmifolia L. (Merr) đối với vi khuẩn gây bệnh, kết quả từ thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn chỉ ra rằng các chất chiết xuất từ n - hexane, ethyl acetate và ethanol 96% có khả năng ức chế sự tăng trưởng của MRSA, B. cereus, Shigella spp. aeruginosa (Harlita và cs.

Năm 1951, lần đầu tiên cây sâm đại hành được nghiên cứu bởi Schmid và cộng sự, hai hợp chất là eleutherin và isoeleutherin đã được phân lập (Schmid và cs. Ở Việt Nam, chưa có nhiều các nghiên cứu về thành phần hoá học của loài sâm đại hành, ngoài công bố phân lập được 4 hợp chất là eleutherin C16H16O4 độ chảy 175o, izoeleutherin C16H16O4 độ chảy 177o, eleutherol C14H12O4 độ chảy 202-203o và một chất chưa xác định được đặt tên là Ex của Lê Văn Hồng và Nguyễn Văn Đàn. Cả 3 hoạt chất đều có tác dụng kháng sinh đối với chủng S. Như vậy, trên thế giới đã có các nghiên cứu về cây sâm đại hành từ rất sớm.

Các nghiên cứu cho thấy thành phần hoá học chủ yếu của sâm đại hành là các hợp chất quinone và dẫn xuất. Hiện nay, trên thế giới cũng như Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về các hợp chất và khả năng kháng khuẩn, kháng nấm từ cao chiết sâm đại hành. Tuy nhiên, hướng nghiên cứu về khả năng kháng vi khuẩn kháng thuốc của cao chiết sâm đại hành vẫn chưa được quan tâm nhiều, cũng như khả năng kháng khuẩn kháng thuốc của cao chiết dược liệu. Nhằm tìm ra giải pháp để giải quyết những vấn đề trên chúng tôi tiến hành thực nghiên cứu “Phân lập và tinh chế hoạt chất kháng Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) từ cao chiết sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.)” SVTH: NGUYỄN XUÂN SANH 2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS.

DƯƠNG NHẬT LINH TS. NGUYỄN TẤN PHÁT Mục tiêu: - Khảo sát khả năng kháng Staphylocuccus aureus ATCC 43300 (MRSA) của cao chiết từ sâm đại hành. - Chiết xuất và phân lập hợp chất kháng Staphylocuccus aureus ATCC 43300 (MRSA) của cao chiết từ sâm đại hành. Nội dung: − Khảo sát hệ dung môi ngâm chiết của sâm đại hành.

− Đánh giá giới hạn nhiễm khuẩn cao chiết của sâm đại hành theo tiêu chuẩn dược điển Việt Nam IV. − Khảo sát khả năng kháng MRSA của các cao chiết phân đoạn từ củ sâm đại hành. − Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết sâm đại hành đối với MRSA. − Điều chế các phân đoạn từ cao n-hexane bằng phương pháp sắc ký cột.

− Xác định cấu trúc các hợp chất thu được trong cao chiết sâm đại hành. SVTH: NGUYỄN XUÂN SANH 3 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH TS. NGUYỄN TẤN PHÁT PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH: NGUYỄN XUÂN SANH 4 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS.

DƯƠNG NHẬT LINH TS. NGUYỄN TẤN PHÁT 1. Tổng quan về vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) 1. Vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) Staphylococcus aureus kháng methicillin (methicillin resistant S.

aureus hay viết tắt MRSA) là các loại S. aureus đã trở nên có khả năng kháng một số thuốc kháng sinh được dùng để điều trị nhiễm trùng S. Các loại vi khuẩn được gọi là MRSA khi mà một số loại kháng sinh khi được dùng không có hiệu quả để chống lại chúng. Các vi khuẩn này có thể sống cộng sinh ở vùng da hoặc vùng tai - mũi - họng mà không hề gây ra bệnh.

Những người bị nhiễm MRSA được gọi là vật chủ. Chính vì vậy phát hiện kháng methicillin trên S. aureus có thể được xem như phát hiện một thông số chỉ điểm được vi khuẩn S. aureus kháng đa kháng sinh (CLSI, 2004).

MRSA là các chủng S. aureus biểu hiện cơ chế kháng qua mecA hoặc qua cơ chế kháng methicillin khác, ví dụ thay đổi ái lực của protein gắn penicillin với oxacillin (CLSI, 2011). Phân loại khoa học Giới: Eubacteria Ngành: Firmicutes Lớp : Bacilli Bộ : Bacillales Họ: Staphylococcaceae Hình 1. Hình vi thể của MRSA Chi: Staphylococcus Loài: Staphylococcus aureus MRSA là một vấn đề y tế toàn cầu và là một thách thức trong điều trị.

MRSA thường gây nhiễm trùng bệnh viện nặng. Sự lây nhiễm MRSA dẫn đến tử vong ở các bệnh viện tại Việt Nam cũng như các nước trên Thế giới như Singapore, Anh, Đức, Thụy Sĩ,. đang khiến giới y học đặc biệt quan tâm. Đây là một loại bệnh gây suy yếu hệ miễn dịch và làm cho bệnh nhân kháng lại các loại thuốc kháng sinh thông dụng.

Con đường lây truyền bao gồm: máu, phổi, da (khi phẫu thuật) và nước tiểu, vì vậy vi khuẩn này xuất hiện nhiều ở các bệnh viện, đặc biệt lây lan trong quá trình phẫu thuật hay lây qua các ống dẫn tiểu, ống truyền nước biển nếu các thiết bị này không được vô SVTH: NGUYỄN XUÂN SANH 5 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH TS. NGUYỄN TẤN PHÁT trùng hiệu quả. Một cuộc nghiên cứu ở Thụy Sĩ cho thấy con số các ca nhiễm MRSA trong nước đã tăng gấp đôi trong năm 2003 so với năm trước đó.Trong số các bệnh viện được khảo sát, MRSA được tìm thấy ở 176 bệnh nhân, chiếm tỷ lệ 45%, trong đó 7,7% bị lây khi đang nằm viện.

Tại Đức, các bệnh viện được yêu cầu phải theo dõi sát số ca nhiễm MRSA ( Hidron AI và cs, 2008) Trước mắt, các Hiệp hội y trên Thế giới đều kêu gọi các bệnh viện quản lý tốt hơn tình hình vệ sinh trong bệnh viện để ngăn chặn các tác nhân lây bệnh. MRSA thường kéo theo sự đề kháng các kháng sinh khác là vì cơ chế đề kháng của S. aureus đối với methicillin là biến đổi protein bám penicillin (PBP) chỉ do một gen quy định (mecA) và kháng thuốc kiểu này là kháng thuốc một cấp, nghĩa là một khi đã đề kháng được methicillin thì vi khuẩn đề kháng được tất cả các kháng sinh -lactam và có thể kháng các kháng sinh khác nữa (Phạm Hùng Vân và cs. Hầu hết các chủng tụ cầu ban đầu nhạy cảm với kháng sinh nhóm -lactam như penicillin, methicillin.

Tuy nhiên, song hành cùng với việc sử dụng kháng sinh là sự phát triển các chủng vi khuẩn đề kháng kháng sinh dưới áp lực chọn lọc tự nhiên. Việc sử dụng tràn lan và lạm dụng các loại thuốc kháng sinh, nhất là ở các nước đang phát triển như Việt Nam càng đẩy nhanh tốc độ chọn lọc và xuất hiện của các chủng kháng thuốc. Tình trạng kiểm soát nhiễm trùng chưa đạt tiêu chuẩn, điều kiện vệ sinh và các phương pháp xử lý thực phẩm không phù hợp càng tạo điều kiện phát tán các chủng vi khuẩn đề kháng này. Hiện nay, các chủng đề kháng methicillin một kháng sinh được coi là mạnh nhất trong nhóm -lactam đã phát triển một cách đáng lo ngại, nhất là trong các trường hợp nhiễm trùng tại bệnh viện.

Hầu hết các dòng S. aureus kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau. Một vài dòng kháng với tất cả các loại kháng sinh ngoại trừ vancomycin, và những dòng này ngày càng tăng. Những dòng MRSA rất phổ biến và hầu hết các dòng này cũng kháng với nhiều kháng sinh khác.

Trong phòng thí nghiệm, người ta đã tìm thấy plasmid kháng vancomycin ở E. faecalis có thể chuyển sang S. aureus và người ta nghĩ rằng việc chuyển này có thể xảy ra ngoài tự nhiên, trong đường tiêu hóa chẳng hạn. aureus còn kháng với chất khử trùng và chất tẩy uế (Todar K.

SVTH: NGUYỄN XUÂN SANH 6 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH TS. NGUYỄN TẤN PHÁT Ngày càng xuất hiện nhiều chủng đa kháng kháng sinh hơn. Điều này cho thấy tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn ngày càng diễn biến phức tạp và một hệ thống giám sát quốc gia về kháng sinh của vi khuẩn nói chung, của S.

aureus nói riêng là cần thiết, đặc biệt là đối với các chủng MRSA hay MSSA tại Việt Nam (Nguyễn Hữu An và cs.