Chương 1 TỔNG QUAN 1. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TÍNH AN TOÀN CỦA THUỐC 1. Xác định độc tính cấp 1. Một vài định nghĩa hiện đang sử dụng Độc tính (toxicity) của thuốc là tính chất được biểu hiện bằng tác dụng không mong muốn, có hại cho cơ thể.
Độc tính của thuốc có thể nhẹ như thay đổi hành vi, thay đổi vận động, buồn nôn, mẩn ngứa, có thể rất nặng, thậm chí gây chết. Độc tính cấp (acute toxicity) của thuốc là độc tính xảy ra sau khi dùng thuốc một lần hoặc vài ba lần trong ngày. Nghiên cứu độc tính cấp của thuốc trên động vật thí nghiệm, mục đích chính là xác định liều chết trung bình (mean lethal dose) tức là liều làm chết 50% số động vật thí nghiệm trong những điều kiện nhất định và được ký hiệu là LD50 (lethal dose 50%) [12, 18]. Mục tiêu Thử độc tính cấp nhằm cung cấp thông tin cho việc xếp loại mức độ độc của thuốc, điều trị ngộ độc cấp, thiết lập mức liều cho những thử nghiệm độc tính tiếp theo [2, 4].
Động vật thực nghiệm và đường dùng Động vật nghiên cứu: thử ít nhất trên 2 loài động vật có vú, trong đó có một loài không gặm nhấm. Tùy điều kiện, có thể chấp nhận thử độc tính cấp trên một loài động vật. Loài gặm nhấm thường sử dụng là chuột nhắt, chuột cống, loài không gặm nhấm có thể dùng là chó hoặc khỉ. Trong nghiên cứu của chúng tôi sử dụng động vật thực nghiệm là chuột nhắt [12].
Đường dùng theo đường dự kiến dùng cho người (đường uống, tiêm, hô hấp). Một số mô hình Mô hình liều cố định: Thử với một số liều cố định, dùng 5 động vật cho mỗi nhóm, thử lần lượt từng mức liều một. Liều khởi đầu là một liều cố định đã gợi ý, tùy theo kết quả đáp ứng của liều khởi đầu mà tiến hành thử tiếp những mức liều cao hơn hoặc thấp hơn. Thử nghiệm tiếp tục cho đến khi xác định được một mức liều gây độc tính rõ ràng, hoặc liều gây chết không quá 1 con, hoặc liều cao nhất không gây ảnh hưởng gì [49, 68].
Mô hình phân loại độc: Thử theo quy trình bậc thang, mỗi bước dùng 3 con cùng giới. Tùy theo động vật có chết hay không ở một bước thử mà xác định cho bước thử tiếp theo, như không cần thử thêm nữa, hoặc thử thêm 3 con nữa với cùng mức liều đó hoặc thử thêm trên 3 con nữa ở mức liều cao hơn hoặc thấp hơn [45]. Mô hình thử Tăng - Giảm: Thử lần lượt các liều định trước, mỗi liều ở một thời điểm, cách nhau tối thiểu là 48 giờ. Động vật đầu tiên uống ở mức liều thấp hơn gần nhất với liều ước tính LD50 [45].
Nếu động vật đó sống thì liều cho con tiếp theo sẽ tăng 3,2 lần so với liều vừa thử trước đó, còn nếu bị chết thì giảm liều xuống 3,2 lần. Quan sát cẩn thận tình trạng từng động vật để quyết định cho thử liều tiếp [59]. Mô hình theo Litchfield - Wilcoxon: Động vật thường dùng là chuột nhắt trắng, cả 2 giống. Cho từng lô chuột uống thuốc thử với các liều khác nhau từ liều cao nhất không gây chết tới liều thấp nhất gây chết 100% chuột.
Chuột được nhịn ăn 12 giờ trước khi uống thuốc, vẫn uống nước đầy đủ [69]. Đây là mô hình được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu trong và ngoài nước. Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, chúng tôi đã sử dụng mô hình này [78]. Chỉ tiêu theo dõi Tình trạng chung của chuột gồm hoạt động tự nhiên, tư thế, màu sắc (mũi, tai, đuôi), lông, phân, nước tiểu… 5 Tỷ lệ chuột chết trong vòng 72 giờ; khi có chuột chết, mổ để quan sát đại thể các cơ quan phủ tạng.
Nếu cần, làm thêm vi thể để xác định nguyên nhân [55]. Xác định độc tính bán trường diễn 1. Mục tiêu Thử độc tính bán trường diễn chỉ tiến hành sau khi đã có thông tin về độc tính cấp trên một loài nào đó và mẫu thử được dự định dùng dài ngày trên người. Nghiên cứu độc tính bán trường diễn để xác định được mức liều tối đa không gây ra những thay đổi đáng kể tới một số chỉ tiêu của sự sống, mức liều tối đa có thể gây ra những thay đổi đáng kể một số chỉ tiêu cho sự sống khi dùng nhiều lần (nếu có), những độc tính có thể quan sát được trên động vật và khả năng phục hồi nếu có thể [46].
Động vật thí nghiệm và đường dùng Động vật nghiên cứu: Thử ít nhất trên 2 loài động vật có vú, trong đó có một loài không gặm nhấm. Tùy điều kiện, có thể chấp nhận thử độc tính bán trường diễn trên một loài động vật. Loài gặm nhấm thường sử dụng là chuột nhắt, chuột cống. Loài không gặm nhấm có thể dùng là chó hoặc khỉ.
Trong nghiên cứu của chúng tôi sử dụng động vật thực nghiệm là chuột cống. Dùng theo đường dự kiến dùng cho người. Mức liều thử Thử nghiệm nên được thực hiện với 3 mức liều. Liều thấp là liều không gây ảnh hưởng độc nào trên động vật thí nghiệm, liều trung bình là mức liều có thể không gây những độc tính quan sát được hoặc gây ảnh hưởng không đáng kể, liều cao là mức liều dự kiến sẽ quan sát được biểu hiện ngộ độc trên động vật thí nghiệm.
Thử nghiệm nên được tiến hành song song với một nhóm chứng [46, 58]. Thời gian thử nghiệm Thời gian thử thuốc trên động vật được tính dựa theo thời gian dự kiến dùng trên người, được tính bằng 3 – 4 lần thời gian dự kiến dùng trên người [60]. Có thể áp dụng các mô hình thời gian thử trên động vật như sau với 3 mức thời gian cố định là 14 ngày, 28 ngày và 90 ngày. Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, chúng tôi sử dụng mức thời gian là 28 ngày [76].
Chỉ tiêu theo dõi Theo dõi hàng ngày tình trạng của động vật thí nghiệm. Xác định các chỉ tiêu đánh giá như trọng lượng, các chỉ số sinh hóa, huyết học. Tiến hành mổ để quan sát đại thể các tổ chức, so sánh với nhóm chứng, nếu cần thiết có thể quan sát vi thể. Theo dõi khả năng phục hồi cần bổ sung số động vật thí nghiệm muốn giữ lại để theo dõi sau khi hết thời gian dùng thuốc [22, 46].
MỘT SỐ MÔ HÌNH GÂY TĂNG SẢN LÀNH TÍNH TUYẾN TIỀN LIỆT TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM 1. Mô hình in vitro Nuôi cấy tế bào biểu mô tuyến tiền liệt bình thường trong các điều kiện ảnh hưởng đến sự phát triển và biệt hóa của chúng. Các tế bào biểu mô nuôi cấy có thể là những tế bào lấy từ các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân, do tăng sản lành tính tuyến tiền liệt hoặc do bệnh lý khác như ung thư tuyến tiền liệt. Các dòng tế bào tuyến tiền liệt bình thường có thể được lấy từ tuyến tiền liệt của chuột.
Mô hình in vivo 1. Mô hình ghép dị loài (xenograft models) Tế bào tuyến tiền liệt người được cấy ghép lên chuột đã loại bỏ tuyến ức, có ưu điểm là đánh giá trực tiếp trên tế bào tuyến tiền liệt của người, tuy nhiên kỹ thuật khó, đòi hỏi đầu tư cơ sở vật chất lớn, chi phí nghiên cứu cao. Mô hình sử dụng chuột nhắt biến đổi gen Chuột nhắt biến đổi gen được sử dụng rộng rãi cho nhiều mô hình nghiên cứu về cơ chế bệnh sinh cũng như hiệu quả của các phương pháp điều trị. Tuy nhiên việc sử dụng chuột biến đổi gen hiện vẫn chưa phổ biến tại các cơ sở nghiên cứu trong nước, chi phí nghiên cứu cao do nguồn động vật phải nhập từ nước ngoài, cần điều kiện nuôi dưỡng, chăm sóc riêng biệt.
Mô hình gây tăng sản lành tính tuyến tiền liệt bằng hormone, hoá chất Scolnik và cộng sự (1994) gây tăng sản lành tính tuyến tiền liệt bằng citral [63]. Lee và cộng sự (1998) phát triển mô hình gây tắc nghẽn đường niệu bằng cách kích thích sự phát triển tuyến tiền liệt của chuột theo con đường hormone - thần kinh. Trong mô hình này, sự phát triển tuyến tiền liệt của chuột được gây ra bằng cách kết hợp Dihydrotestosteron liều 1,25mg/kg/ngày và prazosin (chất đối kháng alpha-1 adrenoreceptor) liều 30µg/kg/ngày tiêm dưới da trong 14 ngày [44]. Ngoài các mô hình động vật gặm nhấm, chó đã được sử dụng để nghiên cứu về bệnh tăng sản lành tính tuyến tiền liệt ở người.
Bệnh TSLTTTL ở người và chó có nhiều đặc điểm chung. Ở cả hai loài, sự phát triển của TSLTTTL xảy ra tự phát với tuổi cao và có thể được ngăn ngừa bằng cách thiến sớm/chuẩn bị trước. Tăng sản biểu mô tuyến tiền liệt ở cả người và chó đều nhạy cảm với androgen. Walsh và Wilson (1976) đã phát triển mô hình gây TSLTTTL ở chó bị thiến bằng cách cho dùng trong thời gian dài 5α-androstane-3α, 17β-diol (3α- diol) 75mg/tuần, kết hợp với 17β-estradiol 0,75mg/tuần [72].
Jian-Hui Wu và cộng sự (2011) [52] báo cáo sử dụng bisphenol A đường uống liều thấp (10µg/kg) làm tăng mức độ phì đại tuyến tiền liệt trên chuột cống trắng đực uống gây tăng sản lành tính tuyến tiền liệt bằng testosteron 8 (1mg/kg) tiêm dưới da chuột cống đực trong 4 tuần. Dựa trên kết quả này, một số tác giả trong nước đã sử dụng mô hình gây phì đại tuyến tiền liệt trên chuột cống trắng đực bằng cách kết hợp testosteron (1mg/kg) tiêm dưới da và bisphenol A đường uống liều thấp (10µg/kg) trong 4 tuần. Trong các công bố gần đây trên các tạp chí quốc tế uy tín, phần lớn các tác giả sử dụng mô hình gây TSLTTTL bằng sử dụng testosterone propionate trên chuột cống trắng, có thể thiến [77] hoặc không thiến [64] để đánh giá tác dụng của thuốc làm giảm kích thước tuyến tiền liệt. Trên mô hình thiến chuột, testosterone propionate được tiêm liều 0,5mg/kg/ngày trong 28 ngày liên tục để gây mô hình tăng sản tuyến tiền liệt đánh giá tác dụng làm giảm sự phì đại tuyến tiền liệt của chế phẩm [77].
Với liều tiêm testosterone propionate 25mg/kg/ngày liên tục trong 28 ngày sau cắt bỏ tinh hoàn 2 bên của chuột 1 tuần, sự phì đại nhiều của tuyến tiền liệt đã gây chèn ép làm cho các triệu chứng tắc nghẽn đường niệu dưới thể hiện rõ rệt [54]. Trên mô hình không thiến, testosterone propionate được tiêm liều 3mg/kg/ngày trong 28 ngày liên tục, đã gây được mô hình rõ rệt và phù hợp để đánh giá tác dụng làm giảm sự phì đại tuyến tiền liệt của chế phẩm [64]. Đặc biệt mô hình được mô tả bởi In Sik Shin được tiến hành trên chuột cống đực chủng Wistar, là chủng chuột đang được sử dụng phổ biến ở nước ta. Chính vì vậy, trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, chúng tôi sử dụng mô hình này.