Nghiên cứu định lượng SARS-CoV-2 bằng phương pháp Realtime PCR sử dụng SYBR Green

Nghiên cứu định lượng SARS-CoV-2 bằng phương pháp realtime PCR với chất nhuộm SYBR Green, cung cấp thông tin chi tiết và ứng dụng trong y tế.

• Tác giả: Nguyễn Thị Mai Hương
• Người hướng dẫn: TS. Tạ Văn Thạo
• Trường học: Trường Đại Học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Kỹ Thuật Xét Nghiệm Y Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Định Lượng SARS-CoV-2 Bằng Phương Pháp Realtime PCR Với SYBR Green
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CÁM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: ĐẶC ĐIỂM VÀ CẤU TRÚC VIRUS SARS-CoV-2. CƠ CHẾ GÂY BỆNH CỦA VIRUS SARS-CoV-2. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NHIỄM SARS-CoV-2
• 1.1. XÉT NGHIỆM KHÁNG NGUYÊN NHANH
• 1.2. XÉT NGHIỆM NUÔI CẤY VIRUS
• 1.3. XÉT NGHIỆM KHUẾCH ĐẠI ACID NUCLEIC
• 1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SARS-CoV-2
• 1.4.1. PHƯƠNG PHÁP PCR
• 1.4.1.1. PHƯƠNG PHÁP REALTIME-PCR
• 1.4.1.1.1. PHƯƠNG PHÁP REALTIME-PCR SỬ DỤNG ĐẦU DÒ TAQMAN
• 1.4.1.1.2. PHƯƠNG PHÁP REALTIME-PCR SỬ DỤNG CHẤT NHUỘM HUỲNH QUANG SYBR GREEN
• 1.5. LỰA CHỌN MỒI
• 1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SARS-CoV-2 Ở VIỆT NAM
• 1.7. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP THEO HƯỚNG DẪN CỦA IVD
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.3. THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU
• 2.4. NỘI DUNG LIÊN HÀNH NGHIÊN CỨU
• 2.5. QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU
• 2.6. PHÂN LÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU
• 2.7. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU
• 2.8. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỒI
• 3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA MỒI KHUẾCH ĐẠI GEN E VÀ IP4
• 3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG HOẠT ĐỘNG CỦA MỒI E VÀ IP4
• 3.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ MỒI CHO PHẢN ỨNG REALTIME-PCR
• 3.5. KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN KHI SỬ DỤNG MỒI E
• 3.6. KẾT QUẢ ĐƯỜNG CHUẨN
• 3.7. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐỘ LẶP VÀ ĐỘ ĐÚNG
• 3.8. KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN KHI SỬ DỤNG MỒI IP4
• 3.9. KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN
• 3.10. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐỘ LẶP VÀ ĐỘ ĐÚNG ĐƯỜNG CHUẨN MỒI IP4
• 3.11. KẾT QUẢ ĐIỂM NÓNG CHẠY
• 3.12. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐIỂM NÓNG CHẠY LÝ THUYẾT CỦA SẢN PHẨM PCR CỦA MỒI E VÀ IP4
• 3.13. XÁC ĐỊNH ĐIỂM NÓNG CHẠY CỦA SẢN PHẨM PCR CỦA MỒI E VÀ IP4
• 3.14. KHẢO SÁT VỚI MẪU THỰC
• 3.15. KẾT QUẢ TÁCH RNA
• 3.16. PHẢN ỨNG REALTIME-PCR ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG SARS-CoV-2
• 3.17. KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN KHUẾCH ĐẠI GEN E VÀ RdRP CỦA VIRUS SARS-CoV BẰNG CẶP MỒI E VÀ IP4
• 3.18. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA MỒI E VÀ IP4
• 3.19. KẾT QUẢ KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ MÔI SỬ DỤNG CHO PHƯƠNG PHÁP REALTIME-PCR SỬ DỤNG CHẤT NHUỘM SYBR GREEN
• 3.20. KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN SỬ DỤNG CẶP MỒI E VÀ IP4
• 3.21. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐIỂM NÓNG CHẠY CỦA SẢN PHẨM PCR THU ĐƯỢC KHI SỬ DỤNG MỒI E VÀ IP4
• 3.22. ỨNG DỤNG TRONG ĐỊNH LƯỢNG VÀ ĐỊNH TÍNH SARS-CoV-2 Ở MẪU LÂM SÀNG
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu định lượng SARS CoV 2 bằng Realtime PCR

Nghiên cứu định lượng SARS-CoV-2 là một trong những lĩnh vực quan trọng trong y học hiện đại, đặc biệt trong bối cảnh đại dịch COVID-19. Phương pháp Realtime PCR với SYBR Green đã trở thành tiêu chuẩn vàng trong việc phát hiện và định lượng virus. Phương pháp này không chỉ giúp xác định sự hiện diện của virus mà còn cho phép đánh giá mức độ nhiễm trùng trong cơ thể bệnh nhân. Việc áp dụng phương pháp này mang lại nhiều lợi ích cho việc chẩn đoán và điều trị kịp thời.

1.1. Định nghĩa và vai trò của SARS CoV 2 trong y học

SARS-CoV-2 là virus gây ra đại dịch COVID-19, có khả năng lây lan nhanh chóng và gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng. Việc phát hiện sớm và chính xác virus này là rất cần thiết để kiểm soát dịch bệnh.

1.2. Phương pháp Realtime PCR và SYBR Green

Realtime PCR là phương pháp khuếch đại DNA trong thời gian thực, cho phép phát hiện virus một cách nhanh chóng và chính xác. SYBR Green là chất nhuộm giúp phát hiện DNA trong quá trình khuếch đại, mang lại độ nhạy cao cho phương pháp.

II. Thách thức trong việc định lượng SARS CoV 2 bằng phương pháp Realtime PCR

Mặc dù phương pháp Realtime PCR với SYBR Green mang lại nhiều lợi ích, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức trong quá trình thực hiện. Độ chính xác của kết quả phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chất lượng mẫu, quy trình lấy mẫu và điều kiện bảo quản. Ngoài ra, việc lựa chọn mồi phù hợp cũng ảnh hưởng đến độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp.

2.1. Vấn đề về chất lượng mẫu trong xét nghiệm

Chất lượng mẫu là yếu tố quyết định đến độ chính xác của kết quả xét nghiệm. Mẫu không đạt yêu cầu có thể dẫn đến kết quả sai lệch, ảnh hưởng đến việc chẩn đoán và điều trị.

2.2. Khó khăn trong việc lựa chọn mồi PCR

Việc lựa chọn mồi PCR phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp. Mồi không phù hợp có thể dẫn đến kết quả âm tính giả hoặc dương tính giả.

III. Phương pháp Realtime PCR với SYBR Green trong nghiên cứu SARS CoV 2

Phương pháp Realtime PCR với SYBR Green đã được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu định lượng SARS-CoV-2. Quy trình thực hiện bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, khuếch đại DNA và phân tích kết quả. Phương pháp này cho phép phát hiện virus với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đồng thời tiết kiệm thời gian và chi phí.

3.1. Quy trình thực hiện Realtime PCR

Quy trình thực hiện Realtime PCR bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, thêm chất nhuộm SYBR Green và thực hiện khuếch đại. Mỗi bước cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo kết quả chính xác.

3.2. Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp

Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp Realtime PCR với SYBR Green được đánh giá thông qua các thử nghiệm lâm sàng. Kết quả cho thấy phương pháp này có khả năng phát hiện virus SARS-CoV-2 với độ chính xác cao.

IV. Ứng dụng thực tiễn của phương pháp Realtime PCR trong chẩn đoán COVID 19

Phương pháp Realtime PCR với SYBR Green đã được áp dụng thành công trong việc chẩn đoán COVID-19. Kết quả từ các nghiên cứu cho thấy phương pháp này có thể giúp phát hiện sớm virus, từ đó hỗ trợ bác sĩ trong việc đưa ra quyết định điều trị kịp thời. Việc sử dụng phương pháp này cũng giúp giảm thiểu gánh nặng cho hệ thống y tế.

4.1. Kết quả nghiên cứu ứng dụng Realtime PCR

Nghiên cứu cho thấy phương pháp Realtime PCR với SYBR Green có thể phát hiện virus SARS-CoV-2 trong mẫu bệnh phẩm với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, góp phần quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh.

4.2. Lợi ích của việc sử dụng phương pháp này trong y tế

Việc áp dụng phương pháp Realtime PCR giúp giảm thời gian chờ đợi kết quả xét nghiệm, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu nguy cơ lây lan virus trong cộng đồng.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu SARS CoV 2

Nghiên cứu định lượng SARS-CoV-2 bằng phương pháp Realtime PCR với SYBR Green đã chứng minh được tính hiệu quả và độ chính xác cao. Trong tương lai, việc cải tiến và phát triển các phương pháp xét nghiệm mới sẽ tiếp tục được nghiên cứu nhằm nâng cao khả năng phát hiện và điều trị COVID-19. Điều này không chỉ giúp kiểm soát dịch bệnh mà còn góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

5.1. Triển vọng phát triển phương pháp xét nghiệm mới

Nghiên cứu và phát triển các phương pháp xét nghiệm mới sẽ giúp nâng cao độ chính xác và giảm chi phí, từ đó đáp ứng tốt hơn nhu cầu chẩn đoán trong bối cảnh dịch bệnh.

5.2. Tầm quan trọng của việc nâng cao nhận thức cộng đồng

Nâng cao nhận thức cộng đồng về tầm quan trọng của việc xét nghiệm và phát hiện sớm SARS-CoV-2 sẽ góp phần quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Đại dịch COVID-19 do virus SARS-CoV-2 khởi phát vào cuối tháng 12 năm 2019 tại thành phố Vũ Hán (Trung Quốc) và nhanh chóng lan rộng ra toàn cầu. Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã tuyên bố đây là đại dịch truyền nhiễm nguy hiểm. Đến thời điểm tháng 3 năm 2023, thế giới ghi nhận hàng trăm triệu ca nhiễm; riêng tại Việt Nam đã ghi nhận trên 11,8 triệu ca mắc với hơn 43.100 trường hợp tử vong. Dù ngày 05/05/2023, WHO chính thức tuyên bố COVID-19 không còn là tình trạng khẩn cấp y tế toàn cầu và nhiều quốc gia đã dỡ bỏ các biện pháp hạn chế, virus SARS-CoV-2 vẫn tiếp tục tồn tại, biến đổi và là nguy cơ đe dọa trực tiếp đến nhóm bệnh nhân cao tuổi, người có bệnh lý nền mạn tính (suy thận, tim mạch, tăng huyết áp).

Trong công tác lâm sàng, xét nghiệm định lượng tải lượng virus SARS-CoV-2 giữ vai trò chiến lược, hỗ trợ bác sĩ tiên lượng tiến triển bệnh, đánh giá hiệu quả đáp ứng điều trị và theo dõi nguy cơ lây nhiễm. Tuy nhiên, các kỹ thuật định lượng chuẩn hiện nay tại các cơ sở y tế chủ yếu dựa trên kỹ thuật Realtime-PCR sử dụng đầu dò mẫu dò TaqMan (TaqMan probe). Phương pháp này đòi hỏi chi phí hóa chất, sinh phẩm ngoại nhập rất cao, tạo gánh nặng kinh tế lớn cho bệnh nhân và hệ thống y tế công tại các quốc gia đang phát triển. Do đó, yêu cầu nghiên cứu phát triển một quy trình định lượng thay thế có chi phí thấp hơn nhưng vẫn bảo đảm độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác khoa học là vấn đề cấp thiết.

• Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng SARS-CoV-2 bằng phương pháp trùng hợp chuỗi thời gian thực (Realtime-PCR) sử dụng chất nhuộm huỳnh quang SYBR Green.
• Nhiệm vụ nghiên cứu:
  1. Khảo sát tính đặc hiệu và tối ưu hóa nồng độ mồi khuếch đại gen E và gen RdRp (IP4) của SARS-CoV-2.
  2. Thiết lập đường chuẩn định lượng và thẩm định các chỉ số phân tích (hiệu suất PCR, độ lặp, độ đúng, khoảng tuyến tính) theo hướng dẫn của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA).
  3. Phân tích đường cong nóng chảy (Melting curve) để nhận diện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu và loại trừ dương tính giả do hiện tượng trùng hợp mồi (primer-dimer).
  4. Thử nghiệm ứng dụng quy trình trên mẫu bệnh phẩm đường hô hấp thực tế nhằm khẳng định giá trị ứng dụng lâm sàng.
• Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
  • Đối tượng nghiên cứu: Mẫu chứng dương chuẩn SARS-CoV-2 (ICopy), mẫu chuẩn gen E và gen RdRp đã biết trước nồng độ ($log_{10}$ copies/mL) do Trung tâm Xét nghiệm Chemedic Việt Nam cung cấp; mẫu bệnh phẩm đường hô hấp (dịch tỵ hầu, dịch ngoáy họng) lấy từ bệnh nhân đã được xác định dương tính với SARS-CoV-2 bằng Realtime-PCR tham chiếu.
  • Phạm vi không gian: Thực hiện tại Trung tâm Xét nghiệm Chemedic Việt Nam phối hợp cùng Bộ môn Hóa sinh lâm sàng - Khoa Kỹ thuật Y học, Trường Đại học Y Hà Nội.
  • Phạm vi thời gian: Từ tháng 02/2023 đến tháng 05/2023.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và nguyên lý sinh học phân tử

SARS-CoV-2 là virus thuộc phân họ Coronavirinae, họ Coronaviridae, bộ Nidovirales, chi Betacoronavirus, phân chi Sarbecovirus. Bộ gen của virus là sợi đơn RNA dương (+ssRNA) có kích thước lớn từ 26 đến 32 kb, được bao bọc bởi cấu trúc nucleocapsid xoắn ốc đối xứng. Hệ gen gồm các vùng chức năng: 2/3 đầu 5' chứa các khung đọc mở ORF1a và ORF1b mã hóa cho các protein phi cấu trúc (bao gồm enzym RNA-dependent RNA polymerase - RdRp); 1/3 đầu 3' mã hóa 4 protein cấu trúc chính là protein gai (S), protein màng ngoài (E), protein màng (M) và protein nucleocapsid (N). Cơ chế xâm nhập tế bào ký chủ diễn ra khi vùng thụ thể RBD của protein S gắn kết với thụ thể ACE2 trên bề mặt biểu mô đường hô hấp, được hỗ trợ bởi enzym cắt protease bề mặt TMPRSS2 hoặc furin.

Về mặt chẩn đoán xét nghiệm, các kỹ thuật khuếch đại acid nucleic (NAAT) đóng vai trò chuẩn mực. Khác với phương pháp TaqMan sử dụng đoạn dò đặc hiệu gắn chất huỳnh quang phóng thích (reporter) và chất dập huỳnh quang (quencher) hoạt động theo cơ chế FRET, phương pháp Realtime-PCR trong đề tài sử dụng chất nhuộm liên kết rãnh nhỏ DNA mạch đôi là SYBR Green I.

Chất nhuộm SYBR Green I có công thức phân tử là $(C_{32}H_{37}N_4S)^+$, danh pháp IUPAC: $N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine$. SYBR Green I có bước sóng kích thích cực đại $\lambda_{max} = 497\text{ nm}$ và bước sóng phát xạ cực đại $\lambda_{max} = 520\text{ nm}$. Ở trạng thái tự do, thuốc nhuộm phát huỳnh quang rất yếu; khi xen vào các phân tử DNA mạch kép hình thành trong quá trình kéo dài chuỗi PCR, cường độ huỳnh quang tăng lên xấp xỉ 1000 lần. Do SYBR Green I bám không chọn lọc vào mọi phân tử DNA mạch đôi, phân tích đường cong nóng chảy (Melting curve) và xác định nhiệt độ nóng chảy ($T_m$) là bắt buộc nhằm phân biệt tín hiệu khuếch đại đặc hiệu của gen đích với các dimer mồi hoặc sản phẩm phụ không đặc hiệu.

Cặp mồi mục tiêu và tiêu chuẩn thẩm định

Khóa luận sử dụng 2 cặp mồi do Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) công bố vào tháng 01/2020:

• Cặp mồi E: Khuếch đại một đoạn đặc hiệu trên gen E (vị trí nucleotide 26269 - 26381, kích thước sản phẩm 113 bp).
• Cặp mồi IP4: Khuếch đại vùng gen RdRp thuộc khung đọc mở ORF1ab (vị trí nucleotide 14080 - 14186 trên bộ gen chuẩn NC_045512, kích thước sản phẩm 107 bp).

Tiêu chuẩn thẩm định phương pháp được tác giả áp dụng theo đúng văn bản hướng dẫn của FDA về thẩm định phương pháp Realtime-PCR:

• Đường chuẩn: Hệ số góc (slope) nằm trong khoảng từ -3,1 đến -3,6, tương ứng hiệu suất phản ứng PCR ($E$) đạt từ 90% đến 110%. Khoảng tuyến tính phải bao phủ tối thiểu 5 bậc nồng độ $log_{10}$ với ít nhất 3 lần chạy lặp lại cho mỗi mức nồng độ.
• Độ lặp (độ chụm): Đánh giá qua độ lệch chuẩn (SD) và hệ số biến thiên (CV), tiêu chuẩn chấp nhận là $\text{CV} \le 25%$.
• Độ đúng: Mức độ sai khác giữa nồng độ định lượng đo được so với nồng độ thực tế, yêu cầu độ sai lệch không vượt quá 25%.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu được thiết kế theo mô hình thực nghiệm phòng xét nghiệm, tiến hành tuần tự qua các kỹ thuật:

• Tách chiết RNA: Sử dụng bộ kít tách chiết PREP-NA DNA/RNA Extraction Kit (hãng DNA-Technology) từ $100\ \mu\text{L}$ mẫu bệnh phẩm đường hô hấp qua 16 bước biến tính, ly giải protein, kết tủa bằng cồn, rửa sạch qua 2 dung dịch đệm và hòa tan thu hồi RNA tinh sạch.
• Phiên mã ngược (Reverse Transcription): Chuyển đổi RNA khuôn thành cDNA sử dụng enzym phiên mã ngược và hệ đệm chuyên dụng ở điều kiện ủ tiêu chuẩn.
• Điện di kiểm tra sản phẩm PCR: Chạy điện di trên gel agarose 2% trong đệm TAE 1X với thuốc nhuộm huỳnh quang RedSafe 20.000X, hiệu điện thế 130V, cường độ 300 mA trong 30 phút, đối chiếu kích thước vạch bằng thang chuẩn DNA ladder 100 bp.
• Khảo sát nồng độ mồi và Realtime-PCR: Thực hiện trên hệ máy DT Prime (DNA Technology), khảo sát nồng độ mồi từ $0,03125\ \mu\text{M}$ đến $0,25\ \mu\text{M}$.
• Xác định nhiệt độ nóng chảy ($T_m$): So sánh giá trị $T_m$ lý thuyết mô phỏng qua phần mềm uMelt với giá trị $T_m$ thực nghiệm ghi nhận từ đồ thị vi phân huỳnh quang theo nhiệt độ (từ 72°C đến 95°C, bước tăng 0,5°C).
• Phân tích số liệu: Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để tính toán giá trị trung bình, SD, CV(%), phương trình hồi quy tuyến tính và hiệu suất phản ứng.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan

Chương này trình bày toàn diện cơ sở sinh học của virus SARS-CoV-2, từ nguồn gốc phân loại học, cấu tạo vỏ bọc lipid, gai glycoprotein S đến cơ chế xâm nhập và gây bệnh sinh học phân tử qua thụ thể ACE2 kết hợp enzym TMPRSS2. Tác giả phân tích phản ứng đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ, làm rõ hiện tượng giải phóng ồ ạt các cytokine tiền viêm (IL-6, TNF-$\alpha$) dẫn đến "cơn bão cytokine", tổn thương phế nang cấp tính, hội chứng suy hô hấp cấp (ARDS) và tử vong ở người bệnh nặng.

Tiếp đó, chương 1 đối chiếu ưu điểm và hạn chế của các phương pháp xét nghiệm SARS-CoV-2:

• Test nhanh kháng nguyên: Thời gian trả kết quả nhanh (< 30 phút), chi phí thấp nhưng độ nhạy và độ đặc hiệu hạn chế, nguy cơ dương tính giả và âm tính giả cao khi tải lượng virus thấp.
• Nuôi cấy phân lập virus: Giữ vai trò nghiên cứu bệnh sinh, thử nghiệm thuốc kháng virus và phát triển vắc xin nhưng đòi hỏi điều kiện phòng an toàn sinh học cấp III (BSL-3).
• Các kỹ thuật khuếch đại acid nucleic (NAAT): Khảo sát các kỹ thuật đẳng nhiệt (LAMP, NEAR, TMA, HDA, SDA, CRISPR-Cas) và kỹ thuật RT-PCR.

Tác giả phân tích chi tiết cơ chế phản ứng PCR cổ điển và Realtime-PCR, so sánh hai hệ thống phát hiện huỳnh quang: đầu dò TaqMan probe và chất nhuộm SYBR Green I. Khóa luận chỉ ra rằng dù TaqMan có độ đặc hiệu cao, giá thành của các kít thử thương mại dùng mẫu dò này rất đắt đỏ. Ngược lại, kỹ thuật SYBR Green I kết hợp phân tích đường cong phân giải nhiệt ($T_m$) cung cấp giải pháp định lượng có độ tin cậy tương đương với chi phí hóa chất rẻ hơn đáng kể. Cuối chương, tác giả tổng kết các hướng dẫn của FDA về tiêu chuẩn kỹ thuật khi thẩm định một xét nghiệm Realtime-PCR định lượng.

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết danh mục trang thiết bị, hóa chất và quy trình thao tác chuẩn (SOP). Các thiết bị cốt lõi gồm máy Realtime-PCR DT Prime (DNA Technology), máy quang phổ Nanodrop (Nabi Microdigital), bể điện di MSCHOICE 7 (Cleaver). Hóa chất gồm đệm PCR 2X, Taq DNA polymerase, dNTPs (Intron Biotechnology), SYBR Green I 10.000X, nước tinh khiết DEPC (Sigma-Aldrich) và cặp mồi tổng hợp từ Công ty TNHH Phù Sa.

Quy trình nghiên cứu được chuẩn hóa qua 6 giai đoạn:

1. Thu thập, bảo quản bệnh phẩm đường hô hấp theo Thông tư 40/2018/TT-BYT (đóng gói 3 lớp, bảo quản nhiệt độ 2-8°C trong 48 giờ hoặc -70°C).
2. Tách chiết RNA bằng PREP-NA Extraction Kit và phiên mã ngược tạo cDNA.
3. Kiểm tra tính đặc hiệu in-silico của mồi trên ngân hàng gen NCBI và chạy PCR kiểm tra kích thước đoạn khuếch đại bằng điện di gel agarose.
4. Tối ưu hóa nồng độ mồi qua thử nghiệm dải nồng độ ($0,03125 - 0,25\ \mu\text{M}$) nhằm triệt tiêu tín hiệu không đặc hiệu ở mẫu chứng âm ($C_-$).
5. Xây dựng đường chuẩn định lượng qua dải pha loãng nồng độ, đánh giá độ lặp và độ đúng ở hai mức nồng độ cao và thấp qua 5 lần chạy lặp lại.
6. Thử nghiệm trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng thực tế để xác nhận giá trị sử dụng.

Về đạo đức nghiên cứu, đề tài sử dụng mẫu bệnh phẩm đã thu thập phục vụ chẩn đoán, không làm thay đổi phác đồ điều trị và bảo mật tuyệt đối thông tin người bệnh.

Chương 3. Kết quả nghiên cứu

Chương này trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình tối ưu hóa và thẩm định:

• Khảo sát độ đặc hiệu và kích thước mồi: Kết quả gióng hàng in-silico cho thấy mồi E và IP4 khớp hoàn toàn với hệ gen SARS-CoV-2. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% cho thấy cả hai cặp mồi đều tạo vạch khuếch đại đơn, sắc nét, đúng kích thước thiết kế: đoạn gen E đạt xấp xỉ 115 bp (lý thuyết 113 bp) và đoạn gen IP4 đạt xấp xỉ 110 bp (lý thuyết 107 bp), không xuất hiện vạch phụ.
• Tối ưu hóa nồng độ mồi: Thử nghiệm với các nồng độ $0,25\ \mu\text{M}$; $0,15\ \mu\text{M}$; $0,125\ \mu\text{M}$; $0,0625\ \mu\text{M}$ và $0,03125\ \mu\text{M}$. Tại nồng độ mồi cao $0,25\ \mu\text{M}$, ống chứng âm ($C_-$) xuất hiện tín hiệu huỳnh quang do hiện tượng primer-dimer. Ở các nồng độ thấp hơn, mẫu $C_-$ hoàn toàn âm tính. Tác giả chọn nồng độ $0,15\ \mu\text{M}$ cho cả mồi E và IP4 vì nồng độ này cho chu kỳ ngưỡng ($C_t$) nhỏ nhất và cường độ huỳnh quang tối ưu mà không gây dương tính giả.
• Xây dựng đường chuẩn định lượng:
  • Mồi E: Thiết lập đường chuẩn với các mẫu chuẩn S1.1 đến S1.7. Phương trình hồi quy tuyến tính thu được có dạng $y = -3,226x + b$ với hệ số góc $-3,226$, tương ứng hiệu suất khuếch đại đạt $104,18%$ (nằm trong khoảng chuẩn 90 - 110%).
  • Mồi IP4: Thiết lập đường chuẩn với các mẫu chuẩn S2.0 đến S2.7. Phương trình hồi quy có dạng $y = -3,373x + b$ với hệ số góc $-3,373$, tương ứng hiệu suất khuếch đại đạt $97,91%$.
• Thẩm định độ lặp và độ đúng: Thử nghiệm lặp lại 5 lần trên 2 mức nồng độ chuẩn cao và thấp:
  • Mồi E: Mức nồng độ cao đạt độ biến thiên $\text{CV} = 14,9%$, độ sai khác giá trị đo là $12,17%$; mức nồng độ thấp đạt $\text{CV} = 12,1%$, độ sai khác là $11,21%$.
  • Mồi IP4: Mức nồng độ cao đạt $\text{CV} = 14,79%$, sai khác $11,53%$; mức nồng độ thấp đạt $\text{CV} = 12,09%$, sai khác $12,64%$. Toàn bộ chỉ số $\text{CV}$ và độ lệch đều $< 25%$, thỏa mãn tiêu chuẩn khắt khe của FDA.
• Khảo sát nhiệt độ nóng chảy ($T_m$): Giá trị $T_m$ lý thuyết mô phỏng trên phần mềm uMelt là 82°C đối với sản phẩm gen E và 79°C đối với gen IP4. Kết quả chạy vi phân đường cong nóng chảy thực nghiệm cho thấy đỉnh cực đại đơn duy nhất hoàn toàn trùng khớp với giá trị lý thuyết, khẳng định sản phẩm tạo thành là duy nhất và đặc hiệu.
• Thử nghiệm trên mẫu bệnh phẩm thực tế: Phân tích trên các mẫu bệnh phẩm hô hấp lâm sàng đã được khẳng định dương tính trước đó. Phản ứng Realtime-PCR SYBR Green với cả hai cặp mồi E và IP4 đều cho đường cong khuếch đại điển hình, xác định chính xác tải lượng virus qua phương trình đường chuẩn và cho đỉnh $T_m$ trùng khớp với mẫu chứng chuẩn.

---

Kết quả và đóng góp

Bảng tổng hợp các thông số kỹ thuật và chỉ số thẩm định

Thông số phân tích	Cặp mồi gen E	Cặp mồi gen RdRp (IP4)	Tiêu chuẩn tham chiếu FDA
Vị trí khuếch đại trên gen	Nucleotide 26269 - 26381	Nucleotide 14080 - 14186	Đặc hiệu hệ gen virus
Kích thước sản phẩm lý thuyết	113 bp	107 bp	100 - 200 bp
Kích thước sản phẩm điện di	$\approx 115\text{ bp}$	$\approx 110\text{ bp}$	Phù hợp thiết kế
Nồng độ mồi tối ưu	$0,15\ \mu\text{M}$	$0,15\ \mu\text{M}$	Triệt tiêu tín hiệu ở mẫu $C_-$
Hệ số góc đường chuẩn (Slope)	$-3,226$	$-3,373$	$-3,1 \text{ đến } -3,6$
Hiệu suất phản ứng PCR ($E$)	$104,18%$	$97,91%$	$90% - 110%$
Khoảng tuyến tính khảo sát	7 bậc nồng độ $log_{10}$	7 bậc nồng độ $log_{10}$	$\ge 5$ bậc nồng độ
Độ lặp ($\text{CV}%$) mức cao / thấp	$14,9% \ /\ 12,1%$	$14,79% \ /\ 12,09%$	$\le 25%$
Độ đúng (sai khác) mức cao / thấp	$12,17% \ /\ 11,21%$	$11,53% \ /\ 12,64%$	$\le 25%$
Nhiệt độ nóng chảy ($T_m$) thực nghiệm	$82^\circ\text{C}$	$79^\circ\text{C}$	Trùng khớp mô phỏng uMelt

Đóng góp khoa học và giải pháp ứng dụng

• Giải pháp kỹ thuật tiết kiệm chi phí: Đề tài đã xây dựng thành công quy trình Realtime-PCR định lượng sử dụng chất nhuộm SYBR Green I thay thế cho đầu dò TaqMan probe đắt tiền. Việc tối ưu hóa nồng độ mồi ở mức $0,15\ \mu\text{M}$ đã khắc phục được nhược điểm cốt tử của thuốc nhuộm huỳnh quang không đặc hiệu, ngăn chặn triệt để hiện tượng primer-dimer ở mẫu âm tính.
• Bộ dữ liệu thẩm định hoàn chỉnh: Nghiên cứu đã cung cấp đầy đủ các bằng chứng thực nghiệm theo chuẩn FDA, chứng minh phương pháp tự xây dựng đạt độ lặp cao ($\text{CV} < 15%$), độ chính xác tin cậy (sai số $< 13%$) và hiệu suất khuếch đại tối ưu trên cả hai vùng gen mục tiêu (gen E bảo tồn và gen RdRp đặc hiệu).
• Quy trình kết hợp phân tích phân giải nhiệt: Việc kết hợp phân tích chu kỳ ngưỡng $C_t$ với đỉnh vi phân nhiệt độ nóng chảy $T_m$ tạo nên công cụ chẩn đoán "kép", cho phép phòng xét nghiệm vừa định lượng chính xác số bản sao virus vừa kiểm soát chất lượng phản ứng tức thì mà không cần bước điện di tốn thời gian.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của nghiên cứu:
  • Bản chất của SYBR Green I là chất nhuộm xen rãnh liên kết với mọi phân tử DNA mạch đôi, do đó phản ứng rất nhạy cảm với sự biến động nồng độ mồi và nguy cơ tạo sản phẩm phụ nếu chất lượng enzyme hoặc điều kiện chu nhiệt không ổn định.
  • Nghiên cứu chỉ tập trung thẩm định kỹ thuật trên mẫu chứng chuẩn thương mại và kiểm tra trên một số lượng mẫu bệnh phẩm hô hấp thực tế nhất định tại phòng xét nghiệm của Công ty Chemedic trong khoảng thời gian từ tháng 02/2023 đến tháng 05/2023, chưa bao phủ đa dạng các loại bệnh phẩm phức tạp khác như dịch rửa phế quản hay sinh thiết mô phổi.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Mở rộng cỡ mẫu thử nghiệm lâm sàng trên nhiều nhóm đối tượng bệnh nhân khác nhau (bệnh nhân nhẹ, bệnh nhân điều trị hồi sức tích cực mang nhiều bệnh nền) để củng cố giá trị tiên lượng của phương pháp.
  • Thử nghiệm đánh giá giới hạn phát hiện dưới (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của quy trình trên các biến thể mới nổi của SARS-CoV-2.
  • Hoàn thiện quy trình thành bộ kít xét nghiệm hoàn chỉnh, sẵn sàng chuyển giao công nghệ cho các cơ sở y tế tuyến dưới nhằm giảm chi phí xét nghiệm định lượng.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng thụ hưởng:
  • Sinh viên, học viên chuyên ngành Kỹ thuật xét nghiệm y học, Hóa sinh lâm sàng, Vi sinh y học và Công nghệ sinh học: Khóa luận là tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình thẩm định phương pháp sinh học phân tử định lượng theo hướng dẫn quốc tế của FDA.
  • Kỹ thuật viên và chuyên viên phòng xét nghiệm sinh học phân tử: Cung cấp quy trình thao tác chuẩn (SOP) từ khâu tách chiết RNA thủ công, pha hỗn hợp phản ứng Realtime-PCR, thiết lập chu trình nhiệt đến kỹ thuật phân tích đồ thị đường cong nóng chảy.
  • Các nhà nghiên cứu phát triển sinh phẩm chẩn đoán (In Vitro Diagnostics - IVD): Cung cấp các thông số tối ưu hóa nồng độ mồi, thành phần đệm và chất nhuộm huỳnh quang phục vụ nghiên cứu hạ giá thành xét nghiệm NAAT.
• Các phần nội dung đáng tham khảo nhất:
  • Bảng thành phần hóa chất và chu trình nhiệt tối ưu tại Chương 2 (Bảng 2.1 đến Bảng 2.5).
  • Phương pháp xử lý số liệu đường chuẩn, cách tính độ lặp ($\text{CV}%$) và độ đúng tại Chương 3 (Bảng 3.2 đến Bảng 3.5).
  • Quy trình phân tích đường cong nóng chảy ($T_m$) để phân biệt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu với primer-dimer.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao tác giả chọn nồng độ mồi là $0,15\ \mu\text{M}$ cho phản ứng Realtime-PCR thay vì nồng độ cao hơn như $0,25\ \mu\text{M}$?
Trong quá trình khảo sát dải nồng độ mồi từ $0,03125\ \mu\text{M}$ đến $0,25\ \mu\text{M}$, ở nồng độ $0,25\ \mu\text{M}$ mẫu chứng âm ($C_-$) xuất hiện tín hiệu huỳnh quang do hiện tượng mồi bắt cặp bổ sung tạo thành dimer (primer-dimer), gây nguy cơ dương tính giả. Ở mức $0,15\ \mu\text{M}$, mẫu chứng âm hoàn toàn không phát tín hiệu huỳnh quang, đồng thời giá trị $C_t$ ở mẫu dương tính nhỏ hơn và hiệu suất khuếch đại cao hơn rõ rệt so với các nồng độ thấp hơn ($0,0625$ và $0,03125\ \mu\text{M}$). Do đó, $0,15\ \mu\text{M}$ là nồng độ tối ưu nhất.

2. Nhiệt độ nóng chảy ($T_m$) thực nghiệm của hai sản phẩm khuếch đại gen E và IP4 đạt bao nhiêu và có khớp với mô phỏng lý thuyết không?
Nhiệt độ nóng chảy thực nghiệm xác định qua đỉnh cực đại của đường vi phân huỳnh quang ghi nhận được là 82°C đối với sản phẩm gen E và 79°C đối với sản phẩm gen IP4. Các giá trị này hoàn toàn trùng khớp với nhiệt độ nóng chảy lý thuyết mô phỏng bằng phần mềm uMelt (82°C cho gen E và 79°C cho gen IP4), khẳng định tính đặc hiệu tuyệt đối của sản phẩm khuếch đại.

3. Hiệu suất khuếch đại PCR và các chỉ số độ lặp, độ đúng của hai cặp mồi có đạt chuẩn FDA không?
Cả hai cặp mồi đều đáp ứng xuất sắc các tiêu chuẩn của FDA:

• Đường chuẩn gen E có hệ số góc $-3,226$, hiệu suất đạt $104,18%$; độ lặp $\text{CV}$ dao động từ $12,1%$ đến $14,9%$; độ sai khác so với giá trị thực đạt từ $11,21%$ đến $12,17%$.
• Đường chuẩn gen IP4 có hệ số góc $-3,373$, hiệu suất đạt $97,91%$; độ lặp $\text{CV}$ dao động từ $12,09%$ đến $14,79%$; độ sai khác so với giá trị thực đạt từ $11,53%$ đến $12,64%$. Tất cả các giá trị hiệu suất đều nằm gọn trong khoảng 90 - 110% và các chỉ số sai số, biến thiên đều dưới ngưỡng cho phép 25%.

4. Khóa luận sử dụng cặp mồi nào để khuếch đại SARS-CoV-2 và kích thước sản phẩm khuếch đại là bao nhiêu base pair (bp)?
Khóa luận sử dụng hai cặp mồi theo công bố của WHO tháng 01/2020: cặp mồi E (khuếch đại đoạn gen mã hóa protein màng ngoài E, vị trí 26269 - 26381) cho sản phẩm lý thuyết dài 113 bp (điện di thực tế $\approx 115\text{ bp}$); cặp mồi IP4 (khuếch đại vùng gen RdRp thuộc ORF1ab, vị trí 14080 - 14186) cho sản phẩm lý thuyết dài 107 bp (điện di thực tế $\approx 110\text{ bp}$).

5. Cơ chế phân biệt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu và sản phẩm phụ trong phản ứng Realtime-PCR SYBR Green là gì?
Do SYBR Green I là thuốc nhuộm huỳnh quang gắn xen kẽ không đặc hiệu vào mọi sợi đôi DNA, phản ứng bắt buộc phải kết hợp bước phân tích đường cong phân giải nhiệt sau chu trình PCR. Khi tăng dần nhiệt độ từ 72°C lên 95°C, chuỗi xoắn kép DNA bị biến tính tách thành sợi đơn và giải phóng SYBR Green I, làm cường độ huỳnh quang tụt đột ngột. Nhiệt độ làm biến tính 50% cấu trúc DNA ($T_m$) phụ thuộc chặt chẽ vào chiều dài và tỷ lệ GC của phân tử. Sản phẩm đặc hiệu của gen E và IP4 tạo nên các đỉnh phân giải nhiệt đơn độc, sắc nét tại 82°C và 79°C; trong khi các primer-dimer thường có kích thước rất ngắn nên sẽ biến tính ở nhiệt độ thấp hơn nhiều (thường dưới 75°C), giúp người phân tích dễ dàng nhận diện và loại trừ kết quả dương tính giả.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Thị Mai Hương đã xây dựng và thẩm định thành công quy trình kỹ thuật định lượng virus SARS-CoV-2 bằng phương pháp Realtime-PCR sử dụng chất nhuộm huỳnh quang SYBR Green I cho hai vùng gen mục tiêu E và RdRp (IP4). Toàn bộ các thông số kỹ thuật bao gồm tính đặc hiệu mồi, hiệu suất khuếch đại đường chuẩn, độ lặp và độ đúng của phương pháp đều thỏa mãn đầy đủ các tiêu chí thẩm định phương pháp phân tích của FDA Hoa Kỳ. Nghiên cứu mang tính ứng dụng thực tiễn cao, cung cấp một giải pháp xét nghiệm định lượng tải lượng virus tin cậy với giá thành hóa chất thấp, mở ra tiềm năng ứng dụng rộng rãi tại các phòng xét nghiệm y học trong điều kiện nguồn lực kinh tế còn hạn chế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TÔNG QUAN 1. Virus SARS-CoV-2 /. Dục đứnt và cẩu trúc virus SÂRS-CoV-2 Coronavirus là cảc loài virus thuộc phân hụ Coronavirinae trong họ Coronaviridae. cua bộ Nidoviralcs.

Coronavirus có thê gây bẻnh ớ người vã nhiều loài dộng vật. Phân hụ Coronavirinae dược phân loại thành bốn chi Alpha. Gamma và Delta Coronavirus.4 Cho tới nay có 7 chung coronavirus gày bệnh ở người (HCoV). Bỗn trẽn bay chung Coronavirus lưu hành ơ người gây bệnh hô hấp thòng thường.

Hai chung IICoV-229E vã IỈCoV-NL63 lã a-coronavĩruscs trong khi hai chung HCoV-OC43 và HCoV- HKU1 thuộc nhỏm B-coronaviruscs. Ba chung côn lại lã MERS-CoV. SARS- CoV và SARS-CoV-2 là B-coronavi ruses gây viêm phôi và suy giám hô hấp nghiêm trụng và có thè dẫn tới lư vong.5 BÔ ~~T7 Hụ Dưởihụ r~———Ị CwMrtiw.rt«M Chi r T" , J 1 J___ Alpha B«u Garnru 0Ã1 Towru* wrwwirt eoronawv* oormnvM MCoV-MM MCcV-HKUI HCoV-MCW, HCoV-OCC '••••. ; SARS-CoVJ Hình Ỉ.

fiieu dồ phân toại cùa họ Coronaviridaf SARS-CoV-2 thuộc chi Bctacoronavirus. dưới chi lã Sabecovirus. SARS-CoV-2 cô bộ gen tương dồng 79% với SARS-CoV vã 50% tương dồng với MERS-CoV." SARS-CoV-2 có bộ gen lởn nhất được biết đến trong các loại RNA -•c .^H «4 ugc V Hl 4 virus, với chiều dài từ 26 đến 32 kb. là virus có hệ gen RNA dương sợi dơn kèm nucleocapsid đổi xứng xoắn ốc*.

Bộ gen bao gồm các vùng: vùng 5'UTR. vũng 3'UTR vã cuối cùng lã Đuôi-poly (A). Hai phần ba đầu ticn cua bợ gcn mã hóa cho các protein phi cấu trúc từ 2 khung mơ dọc ORFIa và ORFIb; 1/3 cuối cua bộ gcn mã hóa cho các protein cấu trúc. Có 4 protein cấu trúc dược bao tồn trên các CoV dó là protein (S).

protein vo (E) và nuclcocapsid (N) protein. Protein s chịu trách nhiệm liên kết với tể bão vật chu và là thụ the de virus xâm nhập vào tế bào vật chu. So sánh SARS-CoV-2 với các coronavirus khác cho thấy sự khác biệt lim nhất năm trong gen mã hóa protein s. Protein này hình thành các gai trên bề mạt cứa hạt virus và lãm trung gian liên kết cua virus dền tế bào đích và hợp nhất virus và mang tế bào trong quá trình virus xâm nhập.

Protein này cùng là mục tiêu cua kháng thề vó hiệu hóa sự lây nhiêm cua virus. Cẩu trúc bộ gen cua SARS-Col'-2'a 1. Cff chề gây bệnh cùa virus SARS-CoV-2 SARS-CoV-2 lây trực tiếp từ người sang người qua đường hô hấp (qua giọt bắn là chu yếu) và qua tiếp xúc với các vật dụng bị ô nhiêm. SARS-CoV-2 cùng có kha nàng lây truyền qua khi dung ơ trong những không gian kin.

dông người và -c .^H «4 ugc V Hl 5 (hóng gió hạn chề hoặc nơi có nhiều thao tác tạo khi dung như trong các cơ sờ diều trị. protein s trên bề mặt vi rút có vùng thụ the RBD bám dinh hiệu qua trẽn thụ the ACE2 cua tế bảo con người dẻ bât dầu sự xâm nhập cua virus vảo tế bão vật chú. Tuy nhiên, sự xâm nhập cua virus thành cõng đòi hoi sự phản cắt protein s bởi các men furin hay một số men khác như TMPRSS2. Sau quá trinh phân cắt protein s bằng TMPRSS2.

mien S2 hợp nhất với mang tề bao chú. cho phép RNA virus vảo tế bão chu. Với cơ chế xâm nhập như trên, sụ dồng biếu hiện cua ACE2 và TMPRSS2 dưực coi là cần thiết để lây nhièm SARS-CoV-2. Thụ thê ACE2 dược biểu hiện nhiều trong các te bào phế nang loại II ơ các tể bào biếu mỏ phối, mũi và phế quán, cùng như trong các te bào biêu mõ ớ dường tiêu hóa thận và các tề bào tinh hoàn TMPRSS2 dược biếu hiện trong các tế bào loại II như niêm mạc mùi, phe nang, ống tiêu hóa.

thận, máo tinh hoàn, tuyến tiền liệt, tuyền tụy và tuyến cận giáp.