Nghiên cứu định lượng SARS-CoV-2 bằng phương pháp Realtime PCR sử dụng SYBR Green

Nghiên cứu định lượng SARS-CoV-2 bằng phương pháp realtime PCR với chất nhuộm SYBR Green, cung cấp thông tin chi tiết và ứng dụng trong y tế.

• Tác giả: Nguyễn Thị Mai Hương
• Người hướng dẫn: TS. Tạ Văn Thạo
• Trường học: Trường Đại Học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Kỹ Thuật Xét Nghiệm Y Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Định Lượng SARS-CoV-2 Bằng Phương Pháp Realtime PCR Với SYBR Green
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CÁM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: ĐẶC ĐIỂM VÀ CẤU TRÚC VIRUS SARS-CoV-2. CƠ CHẾ GÂY BỆNH CỦA VIRUS SARS-CoV-2. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NHIỄM SARS-CoV-2
• 1.1. XÉT NGHIỆM KHÁNG NGUYÊN NHANH
• 1.2. XÉT NGHIỆM NUÔI CẤY VIRUS
• 1.3. XÉT NGHIỆM KHUẾCH ĐẠI ACID NUCLEIC
• 1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SARS-CoV-2
• 1.4.1. PHƯƠNG PHÁP PCR
• 1.4.1.1. PHƯƠNG PHÁP REALTIME-PCR
• 1.4.1.1.1. PHƯƠNG PHÁP REALTIME-PCR SỬ DỤNG ĐẦU DÒ TAQMAN
• 1.4.1.1.2. PHƯƠNG PHÁP REALTIME-PCR SỬ DỤNG CHẤT NHUỘM HUỲNH QUANG SYBR GREEN
• 1.5. LỰA CHỌN MỒI
• 1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SARS-CoV-2 Ở VIỆT NAM
• 1.7. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP THEO HƯỚNG DẪN CỦA IVD
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.3. THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU
• 2.4. NỘI DUNG LIÊN HÀNH NGHIÊN CỨU
• 2.5. QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU
• 2.6. PHÂN LÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU
• 2.7. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU
• 2.8. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỒI
• 3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA MỒI KHUẾCH ĐẠI GEN E VÀ IP4
• 3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG HOẠT ĐỘNG CỦA MỒI E VÀ IP4
• 3.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ MỒI CHO PHẢN ỨNG REALTIME-PCR
• 3.5. KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN KHI SỬ DỤNG MỒI E
• 3.6. KẾT QUẢ ĐƯỜNG CHUẨN
• 3.7. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐỘ LẶP VÀ ĐỘ ĐÚNG
• 3.8. KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN KHI SỬ DỤNG MỒI IP4
• 3.9. KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN
• 3.10. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐỘ LẶP VÀ ĐỘ ĐÚNG ĐƯỜNG CHUẨN MỒI IP4
• 3.11. KẾT QUẢ ĐIỂM NÓNG CHẠY
• 3.12. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐIỂM NÓNG CHẠY LÝ THUYẾT CỦA SẢN PHẨM PCR CỦA MỒI E VÀ IP4
• 3.13. XÁC ĐỊNH ĐIỂM NÓNG CHẠY CỦA SẢN PHẨM PCR CỦA MỒI E VÀ IP4
• 3.14. KHẢO SÁT VỚI MẪU THỰC
• 3.15. KẾT QUẢ TÁCH RNA
• 3.16. PHẢN ỨNG REALTIME-PCR ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG SARS-CoV-2
• 3.17. KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN KHUẾCH ĐẠI GEN E VÀ RdRP CỦA VIRUS SARS-CoV BẰNG CẶP MỒI E VÀ IP4
• 3.18. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA MỒI E VÀ IP4
• 3.19. KẾT QUẢ KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ MÔI SỬ DỤNG CHO PHƯƠNG PHÁP REALTIME-PCR SỬ DỤNG CHẤT NHUỘM SYBR GREEN
• 3.20. KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN SỬ DỤNG CẶP MỒI E VÀ IP4
• 3.21. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐIỂM NÓNG CHẠY CỦA SẢN PHẨM PCR THU ĐƯỢC KHI SỬ DỤNG MỒI E VÀ IP4
• 3.22. ỨNG DỤNG TRONG ĐỊNH LƯỢNG VÀ ĐỊNH TÍNH SARS-CoV-2 Ở MẪU LÂM SÀNG
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu định lượng SARS CoV 2 bằng Realtime PCR

Nghiên cứu định lượng SARS-CoV-2 là một trong những lĩnh vực quan trọng trong y học hiện đại, đặc biệt trong bối cảnh đại dịch COVID-19. Phương pháp Realtime PCR với SYBR Green đã trở thành tiêu chuẩn vàng trong việc phát hiện và định lượng virus. Phương pháp này không chỉ giúp xác định sự hiện diện của virus mà còn cho phép đánh giá mức độ nhiễm trùng trong cơ thể bệnh nhân. Việc áp dụng phương pháp này mang lại nhiều lợi ích cho việc chẩn đoán và điều trị kịp thời.

1.1. Định nghĩa và vai trò của SARS CoV 2 trong y học

SARS-CoV-2 là virus gây ra đại dịch COVID-19, có khả năng lây lan nhanh chóng và gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng. Việc phát hiện sớm và chính xác virus này là rất cần thiết để kiểm soát dịch bệnh.

1.2. Phương pháp Realtime PCR và SYBR Green

Realtime PCR là phương pháp khuếch đại DNA trong thời gian thực, cho phép phát hiện virus một cách nhanh chóng và chính xác. SYBR Green là chất nhuộm giúp phát hiện DNA trong quá trình khuếch đại, mang lại độ nhạy cao cho phương pháp.

II. Thách thức trong việc định lượng SARS CoV 2 bằng phương pháp Realtime PCR

Mặc dù phương pháp Realtime PCR với SYBR Green mang lại nhiều lợi ích, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức trong quá trình thực hiện. Độ chính xác của kết quả phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chất lượng mẫu, quy trình lấy mẫu và điều kiện bảo quản. Ngoài ra, việc lựa chọn mồi phù hợp cũng ảnh hưởng đến độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp.

2.1. Vấn đề về chất lượng mẫu trong xét nghiệm

Chất lượng mẫu là yếu tố quyết định đến độ chính xác của kết quả xét nghiệm. Mẫu không đạt yêu cầu có thể dẫn đến kết quả sai lệch, ảnh hưởng đến việc chẩn đoán và điều trị.

2.2. Khó khăn trong việc lựa chọn mồi PCR

Việc lựa chọn mồi PCR phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp. Mồi không phù hợp có thể dẫn đến kết quả âm tính giả hoặc dương tính giả.

III. Phương pháp Realtime PCR với SYBR Green trong nghiên cứu SARS CoV 2

Phương pháp Realtime PCR với SYBR Green đã được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu định lượng SARS-CoV-2. Quy trình thực hiện bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, khuếch đại DNA và phân tích kết quả. Phương pháp này cho phép phát hiện virus với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đồng thời tiết kiệm thời gian và chi phí.

3.1. Quy trình thực hiện Realtime PCR

Quy trình thực hiện Realtime PCR bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, thêm chất nhuộm SYBR Green và thực hiện khuếch đại. Mỗi bước cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo kết quả chính xác.

3.2. Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp

Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp Realtime PCR với SYBR Green được đánh giá thông qua các thử nghiệm lâm sàng. Kết quả cho thấy phương pháp này có khả năng phát hiện virus SARS-CoV-2 với độ chính xác cao.

IV. Ứng dụng thực tiễn của phương pháp Realtime PCR trong chẩn đoán COVID 19

Phương pháp Realtime PCR với SYBR Green đã được áp dụng thành công trong việc chẩn đoán COVID-19. Kết quả từ các nghiên cứu cho thấy phương pháp này có thể giúp phát hiện sớm virus, từ đó hỗ trợ bác sĩ trong việc đưa ra quyết định điều trị kịp thời. Việc sử dụng phương pháp này cũng giúp giảm thiểu gánh nặng cho hệ thống y tế.

4.1. Kết quả nghiên cứu ứng dụng Realtime PCR

Nghiên cứu cho thấy phương pháp Realtime PCR với SYBR Green có thể phát hiện virus SARS-CoV-2 trong mẫu bệnh phẩm với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, góp phần quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh.

4.2. Lợi ích của việc sử dụng phương pháp này trong y tế

Việc áp dụng phương pháp Realtime PCR giúp giảm thời gian chờ đợi kết quả xét nghiệm, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu nguy cơ lây lan virus trong cộng đồng.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu SARS CoV 2

Nghiên cứu định lượng SARS-CoV-2 bằng phương pháp Realtime PCR với SYBR Green đã chứng minh được tính hiệu quả và độ chính xác cao. Trong tương lai, việc cải tiến và phát triển các phương pháp xét nghiệm mới sẽ tiếp tục được nghiên cứu nhằm nâng cao khả năng phát hiện và điều trị COVID-19. Điều này không chỉ giúp kiểm soát dịch bệnh mà còn góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

5.1. Triển vọng phát triển phương pháp xét nghiệm mới

Nghiên cứu và phát triển các phương pháp xét nghiệm mới sẽ giúp nâng cao độ chính xác và giảm chi phí, từ đó đáp ứng tốt hơn nhu cầu chẩn đoán trong bối cảnh dịch bệnh.

5.2. Tầm quan trọng của việc nâng cao nhận thức cộng đồng

Nâng cao nhận thức cộng đồng về tầm quan trọng của việc xét nghiệm và phát hiện sớm SARS-CoV-2 sẽ góp phần quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Đại dịch COVID-19 do chủng vi-rút SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) gây ra đã tạo nên một cuộc khủng hoảng y tế toàn cầu chưa từng có tiền lệ. Theo dữ liệu thống kê dịch tễ quốc tế từ Worldometers và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tính đến đầu năm 2023, thế giới đã ghi nhận hàng trăm triệu ca nhiễm với hàng triệu ca tử vong. Tại Việt Nam, hệ thống giám sát ghi nhận hơn 11,5 triệu ca mắc và hơn 43.100 trường hợp tử vong. Mặc dù tình trạng khẩn cấp y tế công cộng quốc tế đã được dỡ bỏ, SARS-CoV-2 vẫn là mối đe dọa thường trực đối với các nhóm bệnh nhân có nguy cơ cao như người cao tuổi, người có bệnh nền mạn tính (suy tim, suy thận, đái tháo đường, tăng huyết áp) hoặc suy giảm miễn dịch. Ở nhóm đối tượng này, nguy cơ diễn tiến nặng thành hội chứng suy hô hấp cấp tính (ARDS) và tử vong do cơn bão cytokine vẫn ở mức cao.

Trong thực hành lâm sàng, việc xác định chính xác tải lượng vi-rút (viral load) đóng vai trò then chốt giúp bác sĩ đánh giá mức độ nhân lên của vi-rút, tiên lượng diễn tiến bệnh, theo dõi đáp ứng điều trị và quyết định thời điểm xuất viện hoặc cách ly. Phương pháp "tiêu chuẩn vàng" hiện nay là xét nghiệm khuếch đại axit nucleic (NAAT) thông qua kỹ thuật Realtime Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (Realtime-PCR) sử dụng đầu dò huỳnh quang đặc hiệu TaqMan. Tuy nhiên, rào cản lớn nhất của phương pháp TaqMan là chi phí hóa chất rất cao do phải tổng hợp đầu dò huỳnh quang kép (reporter/quencher), đòi hỏi nguồn ngân sách lớn và phụ thuộc vào sinh phẩm nhập khẩu từ nước ngoài. Trong khi đó, các phương pháp xét nghiệm kháng nguyên nhanh lại có độ nhạy hạn chế và không thể định lượng tải lượng vi-rút; còn phương pháp PCR thông thường kết hợp điện di gel agarose thì tốn thời gian và không phản ánh động học phản ứng theo thời gian thực.

Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Kỹ thuật Xét nghiệm Y học (Mã ngành: 7720601) tại Trường Đại học Y Hà Nội, phối hợp cùng Trung tâm Xét nghiệm Chemedic Việt Nam, đã tiến hành đề tài: "Nghiên cứu định lượng SARS-CoV-2 bằng phương pháp Realtime-PCR sử dụng chất nhuộm SYBR Green" nhằm giải quyết bài toán cân bằng giữa độ chính xác phân tích và chi phí xét nghiệm.

Mục tiêu nghiên cứu cụ thể:
1. Khảo sát và tối ưu hóa nồng độ cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen E (Envelope) và gen RdRp (IP4) của SARS-CoV-2 trong phản ứng Realtime-PCR sử dụng chất nhuộm huỳnh quang SYBR Green I.
2. Xây dựng và thẩm định đường chuẩn định lượng SARS-CoV-2 theo tiêu chuẩn của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) về độ tuyến tính, hiệu suất khuếch đại (Efficiency), độ lặp (Precision) và độ đúng (Accuracy).
3. Đánh giá độ đặc hiệu và phân tích đường cong nóng chảy (Melting Curve Analysis - Tm) của sản phẩm khuếch đại lý thuyết và thực nghiệm nhằm loại trừ hiện tượng dương tính giả từ thể trùng hợp mồi (primer-dimer).

Phương pháp tiếp cận của nghiên cứu dựa trên việc thay thế đầu dò đặc hiệu TaqMan bằng chất nhuộm xen kẽ DNA mạch đôi SYBR Green I, kết hợp kỹ thuật phân tích vi phân đường cong nóng chảy ($-dF/dT$). Giải pháp này giúp duy trì độ nhạy và độ chính xác tương đương TaqMan nhưng cắt giảm từ 60% đến 70% chi phí hóa chất cho mỗi phản ứng.

Phạm vi nghiên cứu bao gồm việc tối ưu hóa và thẩm định phân tích in-vitro trên các mẫu chứng chuẩn $C(+)$ (từ ICopy và Chemedic) và thử nghiệm kiểm chứng trên mẫu bệnh phẩm đường hô hấp thực tế (dịch tỵ hầu, dịch họng) đã được xác nhận dương tính, thực hiện trên hệ thống máy Realtime-PCR DT-Prime (DNA-Technology) theo quy chuẩn an toàn sinh học cấp II.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Để định vị giải pháp nghiên cứu, hiện trạng các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán SARS-CoV-2 được tổng hợp và so sánh qua bảng dưới đây:

Tiêu chí phân tích	Test nhanh kháng nguyên	PCR thông thường + Điện di	Realtime-PCR TaqMan	Realtime-PCR SYBR Green I (Đề tài)
Bản chất phát hiện	Protein kháng nguyên (S/N)	Axit nucleic (DNA/cDNA)	Axit nucleic (Đầu dò đặc hiệu)	Axit nucleic (Nhuộm mạch kép)
Khả năng định lượng	Không (Bán định tính)	Không định lượng	Định lượng tuyệt đối chính xác	Định lượng tuyệt đối chính xác
Độ nhạy & Độ đặc hiệu	Trung bình (Dễ âm tính giả)	Cao	Rất cao (> 99%)	Rất cao (kết hợp phân tích $T_m$)
Thời gian thực hiện	15 - 30 phút	3 - 4 giờ	1,5 - 2 giờ	1,5 - 2 giờ
Chi phí mỗi test	Rất thấp (30.000 - 50.000 VNĐ)	Trung bình	Rất cao (250.000 - 450.000 VNĐ)	Thấp - Trung bình (80.000 - 120.000 VNĐ)
Kiểm soát ngoại nhiễm	Không áp dụng	Nguy cơ cao khi mở nắp gel	Kín hoàn toàn trong tube PCR	Kín hoàn toàn trong tube PCR

Theo mô hình phân loại yêu cầu MoSCoW:

• Must Have (Bắt buộc): Khả năng định lượng nồng độ vi-rút thông qua chu kỳ ngưỡng ($C_t$); đường chuẩn tuyến tính đạt hệ số tương quan $R^2 \ge 0,99$; hiệu suất PCR nằm trong dải FDA khuyến cáo ($90% - 110%$); độ lặp có hệ số biến thiên $CV \le 25%$; độ lệch so với giá trị thực $\le 25%$.
• Should Have (Nên có): Tối ưu hóa nồng độ mồi xuống mức thấp ($0,15\ \mu\text{M}$) để triệt tiêu hiện tượng primer-dimer ở các mẫu âm tính; tự động hóa tính toán nồng độ bản sao qua phần mềm phân tích.
• Could Have (Có thể có): Mở rộng phát triển kỹ thuật High-Resolution Melting (HRM) để phân biệt các biến thể đột biến điểm của SARS-CoV-2.
• Won't Have (Chưa thực hiện): Tích hợp kỹ thuật Multiplex đa mục tiêu trong cùng một giếng phản ứng do hạn chế về kênh màu huỳnh quang xen kẽ đơn của SYBR Green I.

Thiết kế hệ thống

Quy trình phân tích định lượng SARS-CoV-2 bằng SYBR Green I được thiết kế qua chuỗi phản ứng chuẩn hóa:

graph TD
    A["Mẫu bệnh phẩm đường hô hấp<br/>(Dịch tỵ hầu / họng)"] --> B["Tách chiết RNA tự do<br/>(PREP-NA Kit, Ly tâm 13.000 rpm)"]
    B --> C["Phiên mã ngược Reverse Transcription<br/>(Tổng hợp sợi đơn cDNA)"]
    C --> D["Phản ứng Realtime-PCR SYBR Green I<br/>(Cặp mồi E và IP4 RdRp, 0.15 µM)"]
    D --> E["Đo tín hiệu huỳnh quang thời gian thực<br/>(Kênh màu FAM/Green, Bước sóng phát xạ 520 nm)"]
    E --> F["Phân tích đường cong nóng chảy<br/>(72°C - 95°C, Bước nhảy 0.5°C/s)"]
    F --> G["Đối chiếu đường chuẩn & Xác thực Tm<br/>(Định lượng log10 copies/mL & Xác nhận tính đặc hiệu)"]

Ngăn xếp công nghệ và thiết bị phân tích

• Hệ thống thiết bị: Máy Realtime-PCR DT-Prime đa kênh (DNA-Technology); Máy quang phổ tử ngoại Nanodrop Nabi MicroDigital; Bể điện di MSCHOICE 7 (Cleaver Scientific); Tủ an toàn sinh học cấp II; Máy ly tâm lạnh tốc độ cao 13.000 vòng/phút.
• Hóa chất & Sinh phẩm: Bộ kit tách chiết PREP-NA DNA/RNA Extraction Kit (DNA-Technology); Dung dịch đệm Mastermix PCR $2\text{X}$ và $10\text{X}$ (Intron Biotechnology); SYBR Green I $10.000\text{X}$ ($1\text{X} = 1,96\ \mu\text{M}$, Intron Biotechnology); Nước không chứa Nuclease (DEPC water, Sigma-Aldrich); Thuốc nhuộm RedSafe $20.000\text{X}$; Thang chuẩn DNA Ladder 100 bp (Cleaver Scientific).
• Phần mềm tính toán & Tin sinh học: NCBI Primer-BLAST đối chiếu bộ gen SARS-CoV-2 chuẩn (GenBank: NC_045512); Công cụ uMelt Batch Tool dự đoán nhiệt độ nóng chảy lý thuyết ($T_m$); Microsoft Excel tích hợp hàm hồi quy tuyến tính và kiểm định phương sai ANOVA.

Thông số thiết kế cặp mồi đặc hiệu

Các cặp mồi được thiết kế theo khuyến cáo chuẩn của WHO và Viện Pasteur Paris:

• Gen E (Vỏ Envelope):
  • Mồi xuôi: E_Sarbeco_F ($5' \rightarrow 3'$): ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT
  • Mồi ngược: E_Sarbeco_R ($5' \rightarrow 3'$): ATATTGCAGCAGTACGCACACA
  • Tọa độ bám: 26269 - 26381 trên bộ gen NC_045512; Kích thước đoạn khuếch đại: $113\text{ bp}$.
• Gen RdRp / Vùng ORF1ab (Mồi IP4):
  • Mồi xuôi: IP4_F ($5' \rightarrow 3'$): GGTAACTGGTATGATTTCG
  • Mồi ngược: IP4_R ($5' \rightarrow 3'$): CTGGTCAAGGTTAATATAGG
  • Tọa độ bám: 14080 - 14186 trên bộ gen NC_045512; Kích thước đoạn khuếch đại: $107\text{ bp}$.

Methodology

Nghiên cứu áp dụng phương pháp nghiên cứu thực nghiệm phân tích phòng thí nghiệm tuân thủ nghiêm ngặt Hướng dẫn Thẩm định Phương pháp Phân tích Sinh học của FDA (FDA Bioanalytical Method Validation Guidance).

Tiến độ và các mốc triển khai chính (Tháng 02/2023 - Tháng 05/2023):

---

Implementation và kết quả

Development process

Quá trình triển khai kỹ thuật được tiêu chuẩn hóa thành các quy trình thao tác chuẩn (SOP) chi tiết trong phòng thí nghiệm.

# Cấu hình thành phần 1 phản ứng Realtime-PCR SYBR Green I (Tổng thể tích = 20 µL)
reaction_mastermix = {
    "Buffer_Realtime_PCR_10X": "2.0 µL (Tris-HCl 300mM pH 9.0, KCl/NH4+ 300mM, Mg2+ 20mM)",
    "dNTPs_Mix_10mM": "0.5 µL (2.5 mM mỗi loại dATP, dCTP, dGTP, dTTP)",
    "Taq_DNA_Polymerase_5U_uL": "0.2 µL (Hoạt độ 1.0 Unit/phản ứng)",
    "SYBR_Green_I_10000X": "0.2 µL (Nồng độ cuối cùng đạt 1X)",
    "Primer_Forward_Reverse_Mix": "3.0 µL (Nồng độ tối ưu 0.15 µM trong phản ứng)",
    "Template_cDNA": "5.0 µL",
    "Nuclease_Free_Water": "9.1 µL"
}

# Chu trình luân nhiệt trên máy Realtime-PCR DT-Prime
thermal_profile = [
    {"Stage": "Biến tính ban đầu / Khởi hoạt Taq", "Temp_C": 95, "Time_Sec": 300, "Cycles": 1},
    {"Stage": "Biến tính mạch kép", "Temp_C": 95, "Time_Sec": 10, "Cycles": 40},
    {"Stage": "Bắt cặp mồi & Kéo dài mạch (Đo huỳnh quang)", "Temp_C": 60, "Time_Sec": 30, "Cycles": 40},
    {"Stage": "Kéo dài kết thúc", "Temp_C": 72, "Time_Sec": 30, "Cycles": 1},
    {"Stage": "Phân tích đường cong nóng chảy (Melting Curve)", "Temp_Range": "72 -> 95°C", "Ramp_Rate": "0.5°C/giây"}
]

Thử nghiệm khảo sát nồng độ mồi cho thấy: ở nồng độ mồi cao ($0,25\ \mu\text{M}$), ống chứng âm ($C-$) xuất hiện tín hiệu huỳnh quang dương tính giả do hiện tượng tạo cặp mồi tự do (primer-dimer). Khi hạ nồng độ mồi xuống $0,0625\ \mu\text{M}$ và $0,03125\ \mu\text{M}$, giá trị $C_t$ tăng cao làm giảm độ nhạy phát hiện. Nồng độ $0,15\ \mu\text{M}$ được xác định là điểm tối ưu tuyệt đối: $C_t$ đạt cực tiểu, mẫu chứng âm $C(-)$ hoàn toàn không có tín hiệu khuếch đại và không có primer-dimer.

Testing và validation

1. Kiểm tra độ đặc hiệu khuếch đại

Điện di sản phẩm PCR trên gel Agarose 2% nhuộm RedSafe $20.000\text{X}$ cho thấy:

• Mồi E tạo một vạch sáng đơn duy nhất, kích thước xấp xỉ $113\text{ bp}$ (khớp với tính toán lý thuyết $113\text{ bp}$).
• Mồi IP4 tạo một vạch sáng đơn sắc nét, kích thước xấp xỉ $107\text{ bp}$ (khớp với tính toán lý thuyết $107\text{ bp}$).
• Không xuất hiện bất kỳ vạch phụ hay vạch mờ nào ở vùng trọng lượng phân tử thấp.

2. Xây dựng đường chuẩn định lượng (Standard Curve)

Đường chuẩn được thiết lập qua 3 lần chạy lặp lại độc lập trên từng bậc nồng độ:

• Đường chuẩn gen E (7 bậc nồng độ: $10^3$ đến $10^9\ \text{copies/mL}$):

  • Phương trình hồi quy: $y = -3,226x + 39,12$
  • Hệ số tương quan: $R^2 = 0,998$
  • Hệ số góc (Slope): $-3,226$
  • Hiệu suất khuếch đại (Efficiency): $E = (10^{-1/\text{slope}} - 1) \times 100% = (10^{-1/-3,226} - 1) \times 100% = 104,1%$ (Nằm hoàn hảo trong khoảng chuẩn FDA $90% - 110%$).

• Đường chuẩn gen IP4 / RdRp (8 bậc nồng độ: $10^3$ đến $10^{10}\ \text{copies/mL}$):

  • Phương trình hồi quy: $y = -3,373x + 40,85$
  • Hệ số tương quan: $R^2 = 0,999$
  • Hệ số góc (Slope): $-3,373$
  • Hiệu suất khuếch đại (Efficiency): $E = (10^{-1/-3,373} - 1) \times 100% = 97,9%$ (Nằm chuẩn xác trong khoảng FDA $90% - 110%$).

3. Thẩm định độ lặp (Precision) và độ đúng (Accuracy)

Thực hiện chạy lặp lại 5 lần ($n = 5$) trên hai mức nồng độ chuẩn cao và thấp:

Cặp mồi	Mức nồng độ chuẩn	Giá trị $C_t$ trung bình ($\pm \text{SD}$)	Nồng độ suy ra (copies/mL)	Hệ số biến thiên ($CV%$)	Độ đúng trung bình ($%$)	Tiêu chuẩn FDA	Đánh giá
Gen E	Cao ($10^8\ \text{copies/mL}$)	$12,98 \pm 0,38$	$1,28 \times 10^8$	$14,9%$	$12,1%$	$CV \le 25%$; Lệch $\le 25%$	Đạt
Gen E	Thấp ($10^4\ \text{copies/mL}$)	$26,35 \pm 0,42$	$9,12 \times 10^3$	$12,1%$	$11,2%$	$CV \le 25%$; Lệch $\le 25%$	Đạt
Gen IP4	Cao ($10^8\ \text{copies/mL}$)	$14,02 \pm 0,35$	$9,08 \times 10^7$	$14,7%$	$11,5%$	$CV \le 25%$; Lệch $\le 25%$	Đạt
Gen IP4	Thấp ($10^5\ \text{copies/mL}$)	$23,78 \pm 0,39$	$1,14 \times 10^5$	$12,0%$	$12,6%$	$CV \le 25%$; Lệch $\le 25%$	Đạt

4. Phân tích đường cong nóng chảy (Melting Curve Analysis)

Nhiệt độ nóng chảy thực nghiệm thu được từ đỉnh vi phân đồ thị $-dF/dT$ hoàn toàn đồng nhất với giá trị tính toán lý thuyết từ phần mềm uMelt:

• Sản phẩm mồi E: $T_{m\text{ (lý thuyết)}} = 82,5^\circ\text{C}$; $T_{m\text{ (thực nghiệm)}} = 82,3^\circ\text{C} \pm 0,2^\circ\text{C}$.
• Sản phẩm mồi IP4: $T_{m\text{ (lý thuyết)}} = 79,0^\circ\text{C}$; $T_{m\text{ (thực nghiệm)}} = 79,2^\circ\text{C} \pm 0,2^\circ\text{C}$.
• Đồ thị vi phân hiển thị một đỉnh đơn duy nhất, đối xứng cao, không xuất hiện đỉnh phụ ở dải nhiệt độ thấp ($70^\circ\text{C} - 75^\circ\text{C}$), khẳng định phản ứng hoàn toàn không tạo thể trùng hợp mồi không đặc hiệu.

Kết quả đạt được

Nghiên cứu đã hoàn thành $100%$ các chỉ tiêu kỹ thuật đề ra so với kế hoạch ban đầu:

• Thiết lập thành công quy trình định lượng SARS-CoV-2 bằng SYBR Green I cho cả hai đích gen thiết yếu E và RdRp.
• Khoảng tuyến tính định lượng rộng đạt từ 6 đến 8 bậc logarit ($10^3$ đến $10^{10}\ \text{copies/mL}$).
• Kiểm chứng thành công trên 10 mẫu bệnh phẩm lâm sàng thực tế tại Trung tâm Chemedic: $100%$ mẫu dương tính được phát hiện chính xác, giá trị $T_m$ và tải lượng vi-rút tương thích hoàn toàn với kết quả đối chứng từ kit TaqMan thương mại.

---

Đổi mới và đóng góp

1. Đổi mới giải pháp kỹ thuật: Nghiên cứu đã ứng dụng thành công kỹ thuật phân tích vi phân đường cong nóng chảy kết hợp để vượt qua nhược điểm cố hữu của chất nhuộm SYBR Green I (bám không đặc hiệu vào DNA mạch kép). Bằng cách kiểm soát chặt chẽ đỉnh $T_m$ ($82,3^\circ\text{C}$ cho gen E và $79,2^\circ\text{C}$ cho gen IP4), kỹ thuật cho phép phân biệt tuyệt đối giữa tín hiệu khuếch đại vi-rút thực sự và primer-dimer mà không cần đầu dò huỳnh quang đắt tiền.
2. Hiệu quả kinh tế vượt trội: Giảm giá thành hóa chất xét nghiệm từ $65%$ đến $70%$ so với việc sử dụng kit thương mại dùng đầu dò TaqMan probe, tạo tiền đề triển khai xét nghiệm định lượng diện rộng tại các cơ sở y tế tuyến tỉnh và tuyến huyện.
3. Đóng góp học thuật và thực tiễn: Khóa luận xây dựng một tài liệu thẩm định hoàn chỉnh tuân thủ tiêu chuẩn FDA quốc tế cho kỹ thuật định lượng axit nucleic bằng SYBR Green I, đóng vai trò là quy trình tham chiếu chuẩn (SOP) cho các nghiên cứu định lượng các mầm bệnh RNA nguy hiểm khác như Sốt xuất huyết (Dengue), Cúm A/H5N1, Cúm A/H1N1 và RSV tại Việt Nam.

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

Tình huống ứng dụng thực tế

• Đánh giá tiên lượng bệnh nhân COVID-19 nặng: Định lượng tải lượng vi-rút định kỳ cho bệnh nhân tại khoa Hồi sức tích cực (ICU) nhằm dự báo sớm nguy cơ xảy ra cơn bão cytokine và suy đa tạng.
• Theo dõi hiệu quả điều trị thuốc kháng vi-rút: Đánh giá động học sụt giảm nồng độ RNA vi-rút sau khi sử dụng các phác đồ thuốc kháng vi-rút như Remdesivir, Molnupiravir hoặc Paxlovid.
• Nghiên cứu dịch tễ học phân tử: Giám sát động lực đào thải mầm bệnh trong cộng đồng tại các trung tâm kiểm soát bệnh tật (CDC).

Yêu cầu hệ thống triển khai tối thiểu:
- Phòng sạch xét nghiệm đạt an toàn sinh học cấp II (BSL-2).
- Máy Realtime-PCR quang học hỗ trợ kênh màu Green/FAM (bước sóng kích thích 497 nm, phát xạ 520 nm).
- Tủ ấm phá mẫu và máy ly tâm tốc độ 13.000 rpm.
- Bộ micropipette đơn kênh phân giải từ 0.5 µL đến 1000 µL có hiệu chuẩn định kỳ.

Phân tích hiệu quả đầu tư (Cost-Benefit Analysis)

Xét trên quy mô 1.000 mẫu xét nghiệm tại bệnh viện đa khoa:

• Chi phí hóa chất TaqMan: $1.000 \times 350.000\ \text{VNĐ} = 350.000.000\ \text{VNĐ}$.
• Chi phí hóa chất SYBR Green I in-house: $1.000 \times 110.000\ \text{VNĐ} = 110.000.000\ \text{VNĐ}$.
• Mức tiết kiệm ròng: $240.000.000\ \text{VNĐ}$ (Tương đương giảm $68,5%$ chi phí ngân sách y tế mà vẫn đảm bảo độ tin cậy kết quả).

---

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật

• Phương pháp sử dụng hệ phản ứng đơn kênh (Singleplex), đòi hỏi phải thực hiện hai giếng phản ứng riêng biệt để phát hiện song song gen E và gen RdRp, làm tăng thao tác pipet thủ công.
• SYBR Green I ở nồng độ cao có thể gây ức chế hoạt tính xúc tác của enzyme Taq DNA Polymerase, đòi hỏi thao tác pha loãng mastermix phải cực kỳ chính xác.
• Cỡ mẫu kiểm chứng lâm sàng trực tiếp trong khuôn khổ đồ án còn giới hạn ở 10 mẫu bệnh phẩm thực tế.

Hướng phát triển tương lai

• Phát triển kỹ thuật phân tích đường cong nóng chảy độ phân giải cao (High-Resolution Melting - HRM) với các chất nhuộm thế hệ mới (EvaGreen) để tích hợp chẩn đoán phân biệt các biến thể phụ (Omicron XBB, JN.1).
• Nghiên cứu đóng gói bộ sinh phẩm One-step RT-qPCR dạng đông khô (Lyophilized) nhằm rút ngắn thời gian thao tác và thuận tiện bảo quản ở nhiệt độ phòng ($25^\circ\text{C}$).

---

Đối tượng hưởng lợi

Ma trận phân bổ giá trị cho các đối tượng thụ hưởng:

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật phần cứng và kênh màu trên máy Realtime-PCR để chạy SYBR Green I là gì?

Máy Realtime-PCR cần trang bị khối luân nhiệt (Thermal Cycler Block) tương thích giếng $0,2\text{ mL}$ hoặc strip 8 giếng, có nguồn kích thích huỳnh quang dải bước sóng xanh lam ($\lambda_{\text{excitation}} \approx 470 - 500\text{ nm}$) và bộ lọc phát xạ kênh màu Green/FAM ($\lambda_{\text{emission}} \approx 520\text{ nm}$). Phần mềm máy bắt buộc phải có mô-đun phân tích vi phân đường cong nóng chảy (Melting Curve / Dissociation Curve).

2. Làm thế nào để phân biệt tín hiệu huỳnh quang giữa SARS-CoV-2 và primer-dimer?

Do SYBR Green I nhuộm mọi phân tử DNA mạch kép, sự phân biệt bắt buộc phải dựa vào nhiệt độ nóng chảy $T_m$:

• Sản phẩm khuếch đại đặc hiệu của SARS-CoV-2 có kích thước dài ($113\text{ bp}$ với gen E và $107\text{ bp}$ với IP4) nên có $T_m$ cao ($82,3^\circ\text{C}$ và $79,2^\circ\text{C}$).
• Thể trùng hợp mồi (primer-dimer) là các đoạn DNA ngắn ngẫu nhiên ($30 - 50\text{ bp}$) nên sẽ nóng chảy và mất huỳnh quang ở nhiệt độ rất thấp ($70^\circ\text{C} - 74^\circ\text{C}$). Bất kỳ mẫu nào chỉ có đỉnh ở $< 75^\circ\text{C}$ đều được kết luận là âm tính.

3. Giới hạn phát hiện (LOD) và khoảng tuyến tính của phương pháp đạt mức nào?

Phương pháp có khoảng tuyến tính động học trải dài từ $10^3$ đến $10^9\ \text{copies/mL}$ đối với gen E và từ $10^3$ đến $10^{10}\ \text{copies/mL}$ đối với gen IP4 (RdRp), với hệ số $R^2 \ge 0,998$. Giới hạn phát hiện dưới đạt mức $10^3\ \text{copies/mL}$, hoàn toàn đáp ứng ngưỡng phát hiện lâm sàng trong giai đoạn vi-rút nhân lên.

4. Nồng độ mồi tối ưu trong nghiên cứu được xác định là bao nhiêu và tại sao?

Nồng độ mồi tối ưu cho cả hai mồi E và IP4 là $0,15\ \mu\text{M}$ trong hỗn hợp phản ứng cuối. Tại nồng độ này, phản ứng đạt hiệu suất khuếch đại cao nhất ($97,9% - 104,1%$), giá trị $C_t$ xuất hiện sớm nhất mà hoàn toàn triệt tiêu được hiện tượng dương tính giả trong mẫu chứng âm $C(-)$ vốn thường gặp ở nồng độ $0,25\ \mu\text{M}$.

5. Chi phí và thời gian thực hiện của quy trình này so với phương pháp TaqMan thương mại?

Quy trình SYBR Green I in-house giảm chi phí hóa chất từ $\sim 350.000\ \text{VNĐ}$ xuống còn $\sim 110.000\ \text{VNĐ}$/test (tiết kiệm hơn $68%$). Tổng thời gian thực hiện bao gồm tách chiết RNA ($40\ \text{phút}$), phiên mã ngược ($20\ \text{phút}$), Realtime-PCR và phân tích nóng chảy ($75\ \text{phút}$) là khoảng $2,25\ \text{giờ}$, tương đương thời gian chạy của kit TaqMan thương mại.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp đã nghiên cứu, xây dựng và thẩm định thành công phương pháp Realtime-PCR sử dụng chất nhuộm huỳnh quang SYBR Green I để định lượng chính xác vi-rút SARS-CoV-2 thông qua hai vùng gen đích thiết yếu là gen E và gen RdRp (IP4). Toàn bộ các thông số kỹ thuật phân tích đều đáp ứng xuất sắc các tiêu chuẩn khắt khe của FDA Hoa Kỳ: hiệu suất khuếch đại đạt $97,9% - 104,1%$, hệ số tương quan tuyến tính $R^2 \ge 0,998$, độ lặp biến thiên $CV < 15%$ và độ đúng sai lệch $< 13%$.

Việc kết hợp đồng thời giá trị chu kỳ ngưỡng $C_t$ với phân tích vi phân đường cong nóng chảy $T_m$ ($82,3^\circ\text{C}$ cho gen E và $79,2^\circ\text{C}$ cho gen IP4) đã giải quyết triệt để bài toán dương tính giả do thể trùng hợp mồi, mang lại độ tin cậy phân tích tương đương kỹ thuật đầu dò TaqMan probe trong khi cắt giảm tới gần $70%$ chi phí hóa chất. Kết quả này mở ra tiềm năng ứng dụng thực tiễn to lớn trong việc phổ cập hóa xét nghiệm định lượng tải lượng vi-rút phục vụ điều trị và giám sát dịch tễ tại các cơ sở y tế với nguồn lực kinh tế tối ưu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TÔNG QUAN 1. Virus SARS-CoV-2 /. Dục đứnt và cẩu trúc virus SÂRS-CoV-2 Coronavirus là cảc loài virus thuộc phân hụ Coronavirinae trong họ Coronaviridae. cua bộ Nidoviralcs.

Coronavirus có thê gây bẻnh ớ người vã nhiều loài dộng vật. Phân hụ Coronavirinae dược phân loại thành bốn chi Alpha. Gamma và Delta Coronavirus.4 Cho tới nay có 7 chung coronavirus gày bệnh ở người (HCoV). Bỗn trẽn bay chung Coronavirus lưu hành ơ người gây bệnh hô hấp thòng thường.

Hai chung IICoV-229E vã IỈCoV-NL63 lã a-coronavĩruscs trong khi hai chung HCoV-OC43 và HCoV- HKU1 thuộc nhỏm B-coronaviruscs. Ba chung côn lại lã MERS-CoV. SARS- CoV và SARS-CoV-2 là B-coronavi ruses gây viêm phôi và suy giám hô hấp nghiêm trụng và có thè dẫn tới lư vong.5 BÔ ~~T7 Hụ Dưởihụ r~———Ị CwMrtiw.rt«M Chi r T" , J 1 J___ Alpha B«u Garnru 0Ã1 Towru* wrwwirt eoronawv* oormnvM MCoV-MM MCcV-HKUI HCoV-MCW, HCoV-OCC '••••. ; SARS-CoVJ Hình Ỉ.

fiieu dồ phân toại cùa họ Coronaviridaf SARS-CoV-2 thuộc chi Bctacoronavirus. dưới chi lã Sabecovirus. SARS-CoV-2 cô bộ gen tương dồng 79% với SARS-CoV vã 50% tương dồng với MERS-CoV." SARS-CoV-2 có bộ gen lởn nhất được biết đến trong các loại RNA -•c .^H «4 ugc V Hl 4 virus, với chiều dài từ 26 đến 32 kb. là virus có hệ gen RNA dương sợi dơn kèm nucleocapsid đổi xứng xoắn ốc*.

Bộ gen bao gồm các vùng: vùng 5'UTR. vũng 3'UTR vã cuối cùng lã Đuôi-poly (A). Hai phần ba đầu ticn cua bợ gcn mã hóa cho các protein phi cấu trúc từ 2 khung mơ dọc ORFIa và ORFIb; 1/3 cuối cua bộ gcn mã hóa cho các protein cấu trúc. Có 4 protein cấu trúc dược bao tồn trên các CoV dó là protein (S).

protein vo (E) và nuclcocapsid (N) protein. Protein s chịu trách nhiệm liên kết với tể bão vật chu và là thụ the de virus xâm nhập vào tế bào vật chu. So sánh SARS-CoV-2 với các coronavirus khác cho thấy sự khác biệt lim nhất năm trong gen mã hóa protein s. Protein này hình thành các gai trên bề mạt cứa hạt virus và lãm trung gian liên kết cua virus dền tế bào đích và hợp nhất virus và mang tế bào trong quá trình virus xâm nhập.

Protein này cùng là mục tiêu cua kháng thề vó hiệu hóa sự lây nhiêm cua virus. Cẩu trúc bộ gen cua SARS-Col'-2'a 1. Cff chề gây bệnh cùa virus SARS-CoV-2 SARS-CoV-2 lây trực tiếp từ người sang người qua đường hô hấp (qua giọt bắn là chu yếu) và qua tiếp xúc với các vật dụng bị ô nhiêm. SARS-CoV-2 cùng có kha nàng lây truyền qua khi dung ơ trong những không gian kin.

dông người và -c .^H «4 ugc V Hl 5 (hóng gió hạn chề hoặc nơi có nhiều thao tác tạo khi dung như trong các cơ sờ diều trị. protein s trên bề mặt vi rút có vùng thụ the RBD bám dinh hiệu qua trẽn thụ the ACE2 cua tế bảo con người dẻ bât dầu sự xâm nhập cua virus vảo tế bão vật chú. Tuy nhiên, sự xâm nhập cua virus thành cõng đòi hoi sự phản cắt protein s bởi các men furin hay một số men khác như TMPRSS2. Sau quá trinh phân cắt protein s bằng TMPRSS2.

mien S2 hợp nhất với mang tề bao chú. cho phép RNA virus vảo tế bão chu. Với cơ chế xâm nhập như trên, sụ dồng biếu hiện cua ACE2 và TMPRSS2 dưực coi là cần thiết để lây nhièm SARS-CoV-2. Thụ thê ACE2 dược biểu hiện nhiều trong các te bào phế nang loại II ơ các tể bào biếu mỏ phối, mũi và phế quán, cùng như trong các te bào biêu mõ ớ dường tiêu hóa thận và các tề bào tinh hoàn TMPRSS2 dược biếu hiện trong các tế bào loại II như niêm mạc mùi, phe nang, ống tiêu hóa.

thận, máo tinh hoàn, tuyến tiền liệt, tuyền tụy và tuyến cận giáp. Sự đồng biêu hiện cua ACE2 vã TMPRSS2 trong niêm mạc mũi và phối cung cắp một lời giái thích hợp lý cho sự tham gia chu yếu cua hệ thống hô hấp trong COVID-19. Khi dược phóng thich vảo tế bào chắt cua tẻ bào vật chu. dầu ticn virus tồng hợp ra sợi ARN (hông tin de tỏng hựp ra cãc protein cấu true vả phi cẩu trác dê dam báo các hoạt dộng tiếp cùa virus, tiếp dỏ chúng tạo ra một sợi ARN âm dóng vai trò khuôn mẫu dê tông hợp tiếp sợi ARN dương con.

RNA cùa virus mới dược tông hợp và các protein cấu trúc dược lắp rãp trong bộ máy Golgi cua lưới nội chất (ER) đề tạo thành cảc virion mới. Ilộ thống ER-Golgi cùng xư lý quả trinh dưa virion vận chuyên đến bề mặt tề bào trong các túi và tiếp theo là xuất cãc virus mới hình thành từ tế bao vật chu thông qua quá trinh xuất bào.^H «4 ugc V Hl 6 Hình 1. Quá trình xâm nhập vào tế hào chu cùa virus SARS-Col'-2': Sau khi tiếp cận các thụ the đich là ACE2 trên bề mặt màng tế bão nicm mạc dường hô hấp cùa vật chu virus nhãn lên và giai phóng, gây nhiễm trùng các le bão phôi vã tạo ra các triệu chứng hô hâp không đậc hiệu giông cúm. Virus cùng gây tôn thương cãc tề bão biêu mô khứu giác và làm mắt khứu giác tạm thời.

Phan ứng viêm thu hút các lympho T đặc hiệu virus. Các tế bào miền dịch nãy loại trừ các tể bão bị nhiễm, khổng che sự lan tràn cùa virus và dàn đến sự hồi phục ờ hầu hết mọi người.1' 0 những bệnh nhãn phát triến bệnh nặng SARS-CoV-2 gãy ra phan ửng mien dịch không binh thường cua vụt chú. liộ thống mien dịch rất quan trọng dồi với vật chu đẽ chổng lại nhiềm virus. Tuy nhiên, dãp ửng miẻn dịch quá mức có thê dàn den bệnh lỷ.

Sự xâm nhập cùa virus cỡ thế gày ra một loạt cãc phan ứng mien dịch trong cơ thế vật chu dàn đến sự biêu hiện cùa các cytokine và chemokinc tiền viêm, chảng hạn như IL6. gây ra trạng thái viêm quá mức. thưởng dưực gọi là cơn bào cytokine vả cuối cùng cô thê dần den hội chứng suy hô hầp cắp tinh (ARDS) vã tư vong.^H «4 ugc V Hl 7 Binh Bfnhlj Tẽ báo btèumử ° phe quan Tc bâọbiẻu mò pl»ẻ nang X vital t>pc 1 khoang ° \ Tibtobii. rl,Ể“nS mõ phê nang KTV f Té bào t sjfìẵi u j XV? __________ W >i<awi»lur> 1(4 \ìJ' *9 Phiipbửi  Vital » Tc báo ngoai \ -» mạc 1 ThoM Dòng mâu s Hình 1.

Dáp ứng miền dịch cơ thè khi nhiễm trùng SARS-Coỉ'-2lf 1. Các phương pháp chan đoán nhiễm SARS-CoV-2 1. Xét nghiệm khủng nguyên nhanh Xét nghiệm khảng nguycn nhanh là xét nghiệm phát hiện sự cỏ mật cua các protein cua SARS-CoV-2. Mầu bệnh phâm xét nghiệm lã m.ìu bệnh phàm dường hõ hấp (dịch mùi.

dịch tỵ hầu.) nhầm giúp phát hiện nhicm SARS-CoV-2 hay không. Cùng giống như các xét nghiệm sàng lọc vá phát hiện các tác nhàn gây bệnh đưòng hô hầp. dộ nhạy và dộ dặc hiệu cua xét nghiệm này phụ thuộc vào vị tri lẩy mẫu. kỳ thuật cua người lấy mẫu.

ưu diêm: - Cho kết qua nhanh chóng, thường dưới 30 phút. - Dỗ dàng thực hiện, cỏ the dược sư dụng tại các điẽm lấy mẫu di dộng, chi phi rc. ít tồn kém nên cỏ thê sư dụng với mục đích khoanh vùng dịch trên diện rộng.^H «4 ugc V Hl 8 -•c «4 ugc V Hl 9 Nhược (item: - Tại những khu vực có lý lệ lây nhiễm thấp, nhùng xét nghiệm kháng nguyên không đáng tin cậy trừ khi chúng có độ đặc hiệu rất cao (>99%). - Độ nhạy và độ đặc hiệu không cao, dàn dền ti lệ dương tinh gia và ảm tinh gia cao.Xét nghiệm nuôi cay virus Xét nghiệm nuôi cấy virus được ứng dụng chu yếu đề nghiên cứu vả tim hicu VC SARS-CoV-2 với ycu cầu các phòng thi nghiệm phai đạt An toàn sinh học cẩp III.

Các phông thi nghiệm có the sứ dụng SARS-CoV-2 thu được từ việc nuôi cầy virus trong một số lình vực khác nhau bao gồm: - Nghiên cứu kháng virus: kiêm tra kha năng cua các loại thuồc kháng virus hiện có hoặc thư nghiệm trong việc diều trị hoặc ngán ngừa nhiêm SARS-CoV-2. - Phát triển vacxin - Nghiên cứu cơ che bệnh sinh: nghiên cứu đê xác định các cách khác nhau mà virus có thỏ dược truyền sang vật chu. mức dộ nghiêm trọng cua bệnh tật mã nó gày ra cho vụt chu. lượng virus dược tạo ra trong cơ thê và virus cỏ thê lây lan dền những cơ quan nào trong cơ thê.

- Nghiên cứu độ ôn định cua virus: nghiên cứu thời gian virus có thê tồn tại trong một số điều kiện nhất dịnh. Xét nghiệm khuếch (lại Acid Nucleic Xét nghiệm khuếch dại Acid Nucleic (Nucleic Acid Amplification Tcst-NAAT) cho SARS-CoV-2 phát hiện cụ the các trình tự RNA là vật liệu di truyền cua virus. Các màu bệnh phẩm xct nghiệm khuếch dại Acid Nucleic chân đoán SARS-CoV-2 được lấy từ dường hô hấp trên hoặc dưới. NAAT có thế sư dụng nhiều kỳ thuật phương pháp khác nhau dê khuếch dại acid nucleic và phát hiện virus, bao gồm các phương pháp dưới đây: - Phan ứng tồng hợp chuỗi polymerase sao chép ngược (Reverse transcription polymerase chain reaction RT-PCR) -c .^H «4 ugc V Hl 10 - Phán ứng khuềch dại dâng nhiệt bao gồm: • Phan ứng khuếch dại bang enzyme endonuclease cat DNA ờ các diêm giới hạn (Nicking endonuclease amplification rcaction-NEAR) + Khuếch đại thòng qua phiên mà (Transcription mediated amplification-TMA) ♦ Khuếch dại dẳng nhiệt thõng qua võng (Loop-mediated isothermal amplification - LAMP) + Khucch đại phụ thuộc enzyme Helicase (Helicase-dependent amplification-HAD) Hệ thống chinh sửa gen (Nhõm các đoạn ngần dối xứng lặp lại thường xuyên) (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats- CRISPR) - Khuếch dại boi DNA polymerase có hoạt tinh strand-displacement (Strand displacement amplification-SDA) 1.

Các phương pháp phân tích SARS-CoV-2 1. Phương phảp PCR PCR dược phát triển vào những nám 1980 bơi Kary Mullis, người dà nhận giai Nobcl năm 1993. Kê tir khi được mỏ ta, công nghệ này đã gây ra một cuộc cách mạng thực sự trong lỉnh vực sinh hục phân tư. PCR lã kỳ thuật khuếch đại một đoạn DNA quan tâm theo cấp số nhân làm lãng gấp dôi so lượng phân tứ mục tiêu sau mòi chu kỳ khuếch đại.

Thảnh phần cùa I phán ứng PCR - Enzyme DNA polymerase có vai trò trong việc kéo dãi mạch trong phan ứng. - Dung dịch dệm bao gồm Tris IICI 30 mM (pH 9. dung dịch muỗi K 30 mM vã NH Mg2 2 mM. dung dịch lãng cưởng: TMAC.

BSA cung cấp môi trưởng phan ứng. - dNTPs là các nucleotides: A. c cung cấp nuclcotits cho quá trinh tạo mạch mới. - DNA lã mẫu có chửa DNA can khuếch đại cung cấp mạch khuôn cho quá trình phan ứng.^H «4 ugc V Hl II - Mỗi lá I đoạn DNA sợi dim.

có trinh tự bổ sung vói DNA dich. bao gồm 2 loại là mồi xuôi và mồi ngược.