Nghiên cứu sinh tổng hợp protein nucleocapsid tái tổ hợp của virus sars cov 2 và bước đầu ứng dụng cho phát triển kit thử nhanh

Chuyên khảo phân tích Nghiên cứu sinh tổng hợp protein nucleocapsid tái tổ hợp của virus sars cov 2 và bước đầu ứng dụng, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên

• Tác giả: Nguyễn Thị Hiền
• Người hướng dẫn: PGS. Trương Quốc Phong
• Trường học: Đại học Bách Khoa Hà Nội
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu tổng hợp protein Nucleocapsid SARS-CoV-2 và phát triển kit thử nhanh
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TÌNH HÌNH DỊCH COVID-19 TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
• 1.1. Tình hình Covid-19 trên thế giới
• 1.2. Tình hình Covid-19 tại Việt Nam
• 1.3. Virus SARS-CoV-2
• 1.3.1. Đặc điểm cấu trúc và di truyền của virus SARS-CoV-2
• 1.3.2. Đặc điểm của protein Nucleocapsid
• 1.3.3. Cơ chế xâm nhập và lây nhiễm virus SARS-CoV-2
• 1.4. Các phương pháp chẩn đoán
• 1.4.1. Thành phần cấu tạo
• 1.4.2. Nguyên lý, đặc tính của que thử
• 1.4.3. Ưu, nhược điểm của que thử
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Chủng vi sinh vật
• 2.2. Vector biểu hiện pET-22b(+)
• 2.3. Các kháng thể và protein sử dụng cho ELISA và Western Blot
• 2.4. Môi trường – Hóa chất
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Phương pháp vi sinh
• 2.5.2. Phương pháp sinh học phân tử
• 2.5.3. Phương pháp hóa sinh
• 2.5.4. Phương pháp miễn dịch học
• 2.5.5. Đánh giá đặc tính que thử
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả tối ưu trình tự gen N bằng các thuật toán có sẵn
• 3.2. Nghiên cứu điều kiện sinh tổng hợp protein Nucleocapsid
• 3.2.1. Biến nạp và biểu hiện protein Nucleocapsid
• 3.2.2. Thu nhận và tinh sạch protein Nucleocapsid
• 3.2.3. Đánh giá hoạt tính của protein N tái tổ hợp sau tinh sạch
• 3.3. Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng protein N trên thỏ và chuột lang
• 3.3.1. Quy trình gây miễn dịch trên thỏ và chuột lang
• 3.3.2. Đánh giá hiệu quả quá trình gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ và chuột lang
• 3.3.3. Tinh chế kháng thể đa dòng kháng protein Nucleocapsid
• 3.4. Nghiên cứu chế tạo que thử nhanh phát hiện kháng nguyên protein N của virus Sars-CoV-2
• 3.4.1. Thiết lập điều kiện ban đầu của que thử
• 3.4.2. Nghiên cứu điều kiện tạo phức hợp kháng thể - hạt nano vàng
• 3.4.3. Nghiên cứu cố định kháng thể lên màng lai
• 3.4.4. Nghiên cứu vật liệu tạo que thử
• 3.4.5. Đánh giá que thử
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Protein Nucleocapsid SARS CoV 2

Đại dịch COVID-19, do virus SARS-CoV-2 gây ra, đã đặt ra thách thức lớn cho y học toàn cầu. Việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác là vô cùng quan trọng. Protein Nucleocapsid (N) của virus đóng vai trò then chốt trong quá trình nhân lên và lây nhiễm. Nghiên cứu về protein này mở ra cơ hội phát triển các kit thử nhanh SARS-CoV-2 hiệu quả. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng protein N là một kháng nguyên quan trọng, có thể có giá trị trong việc chẩn đoán sớm bệnh nhân nhiễm Covid-19. Do đó, việc nghiên cứu và ứng dụng protein N trong phát triển kit thử nhanh là một hướng đi đầy tiềm năng. Theo WHO, tính đến 7/3/2023, hơn 759 triệu ca nhiễm và 6.8 triệu ca tử vong đã được báo cáo trên toàn cầu.

1.1. Vai Trò Của Protein Nucleocapsid Trong Virus SARS CoV 2

Protein Nucleocapsid (N) là một thành phần cấu trúc quan trọng của virus SARS-CoV-2, tham gia vào quá trình đóng gói và bảo vệ bộ gen RNA của virus. Nó chứa các vùng liên kết RNA riêng biệt, đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của virus. Protein N cũng là một kháng nguyên mạnh, kích thích phản ứng miễn dịch của cơ thể, tạo ra các kháng thể đặc hiệu. Các kháng thể này có thể được sử dụng để phát triển các xét nghiệm chẩn đoán, giúp phát hiện sự hiện diện của virus trong mẫu bệnh phẩm. Nghiên cứu cho thấy kháng nguyên Nucleocapsid có độ nhạy cao hơn so với các protein cấu trúc khác.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Kit Thử Nhanh Trong Chẩn Đoán COVID 19

Kit thử nhanh SARS-CoV-2 đóng vai trò quan trọng trong việc sàng lọc và phát hiện sớm các trường hợp nhiễm bệnh, đặc biệt trong bối cảnh dịch bệnh lây lan nhanh chóng. So với các phương pháp xét nghiệm truyền thống như RT-PCR, kit thử nhanh có ưu điểm về thời gian thực hiện ngắn, dễ dàng sử dụng và không đòi hỏi trang thiết bị phức tạp. Điều này cho phép triển khai xét nghiệm trên diện rộng, giúp kiểm soát dịch bệnh hiệu quả hơn. Tuy nhiên, cần lưu ý về độ nhạy và độ đặc hiệu của kit thử nhanh để đảm bảo kết quả chính xác.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Protein Nucleocapsid SARS CoV 2

Mặc dù protein Nucleocapsid là một mục tiêu đầy hứa hẹn cho việc phát triển kit thử nhanh, nhưng vẫn còn nhiều thách thức cần vượt qua. Việc sản xuất protein N tái tổ hợp với độ tinh khiết cao và hoạt tính sinh học tốt đòi hỏi quy trình phức tạp. Bên cạnh đó, việc tạo ra các kháng thể đặc hiệu và có ái lực cao với protein N cũng là một yếu tố quan trọng. Ngoài ra, sự xuất hiện của các biến chủng SARS-CoV-2 mới với các đột biến trên protein N có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của kit thử nhanh. Do đó, cần liên tục cập nhật và cải tiến quy trình nghiên cứu để đối phó với những thách thức này.

2.1. Khó Khăn Trong Tổng Hợp Protein Nucleocapsid Tái Tổ Hợp

Việc tổng hợp protein Nucleocapsid tái tổ hợp trong các hệ thống biểu hiện như E. coli có thể gặp nhiều khó khăn. Protein N có xu hướng tạo thành các thể vùi (inclusion bodies), gây khó khăn cho quá trình thu hồi và tinh sạch. Ngoài ra, protein N có thể bị biến đổi sau dịch mã (post-translational modifications) khác với protein tự nhiên, ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học và khả năng nhận diện của kháng thể. Cần tối ưu hóa các điều kiện biểu hiện, như nhiệt độ, môi trường nuôi cấy và chủng vi sinh vật, để tăng hiệu quả sản xuất protein N tái tổ hợp.

2.2. Ảnh Hưởng Của Đột Biến Protein Nucleocapsid Đến Kit Thử

Sự xuất hiện của các biến chủng SARS-CoV-2 với các đột biến protein Nucleocapsid có thể ảnh hưởng đến độ nhạy và độ đặc hiệu của kit thử nhanh. Các đột biến có thể làm thay đổi cấu trúc không gian của protein N, làm giảm khả năng nhận diện của kháng thể sử dụng trong kit thử. Do đó, cần theo dõi sát sao sự xuất hiện của các biến chủng mới và đánh giá tác động của chúng đến hiệu quả của kit thử nhanh. Trong trường hợp cần thiết, cần điều chỉnh hoặc thay thế kháng thể để đảm bảo kit thử vẫn có thể phát hiện chính xác các biến chủng mới.

III. Phương Pháp Phát Hiện Protein Nucleocapsid SARS CoV 2

Có nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện protein Nucleocapsid SARS-CoV-2, bao gồm các xét nghiệm miễn dịch như ELISA, lateral flow assay (que thử nhanh) và miễn dịch huỳnh quang. Mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm riêng về độ nhạy, độ đặc hiệu, thời gian thực hiện và yêu cầu về trang thiết bị. Việc lựa chọn phương pháp phù hợp phụ thuộc vào mục đích sử dụng, điều kiện cơ sở vật chất và nguồn lực sẵn có. Các nghiên cứu gần đây tập trung vào việc cải tiến các phương pháp hiện có và phát triển các phương pháp mới với độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn.

3.1. Nguyên Lý Và Ứng Dụng Của Phương Pháp ELISA

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) là một xét nghiệm miễn dịch phổ biến được sử dụng để phát hiện và định lượng protein Nucleocapsid SARS-CoV-2. Nguyên lý của ELISA dựa trên sự gắn kết đặc hiệu giữa kháng thể và kháng nguyên (protein N). Sau đó, một enzyme liên kết với kháng thể thứ cấp sẽ tạo ra tín hiệu màu, cho phép định lượng lượng protein N có trong mẫu. ELISA có độ nhạy cao và có thể được sử dụng để phát hiện protein N trong nhiều loại mẫu khác nhau, như dịch ngoáy họng, dịch mũi và huyết thanh.

3.2. Ưu Điểm Của Xét Nghiệm Lateral Flow Assay Que Thử Nhanh

Lateral flow assay (que thử nhanh) là một phương pháp xét nghiệm đơn giản, nhanh chóng và dễ sử dụng để phát hiện protein Nucleocapsid SARS-CoV-2. Que thử nhanh hoạt động dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch, trong đó mẫu bệnh phẩm được nhỏ lên que thử và di chuyển dọc theo màng nitrocellulose. Nếu mẫu chứa protein N, nó sẽ gắn kết với kháng thể đặc hiệu gắn trên hạt nano vàng, tạo ra vạch màu trên que thử. Que thử nhanh có ưu điểm là cho kết quả nhanh chóng (trong vòng 15-30 phút), không đòi hỏi trang thiết bị phức tạp và có thể được sử dụng tại chỗ.

IV. Phát Triển Kit Thử Nhanh Protein Nucleocapsid SARS CoV 2

Việc phát triển kit thử nhanh dựa trên protein Nucleocapsid SARS-CoV-2 là một hướng đi đầy tiềm năng để đáp ứng nhu cầu chẩn đoán nhanh chóng và rộng rãi. Quá trình phát triển kit thử nhanh bao gồm nhiều giai đoạn, từ việc lựa chọn kháng thể phù hợp, tối ưu hóa quy trình sản xuất, đến đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác của kit thử. Các nghiên cứu gần đây tập trung vào việc cải tiến thiết kế kit thử, sử dụng các vật liệu mới và áp dụng các công nghệ tiên tiến để nâng cao hiệu quả của kit thử nhanh.

4.1. Lựa Chọn Kháng Thể Đặc Hiệu Cho Kit Thử Nhanh

Việc lựa chọn kháng thể đặc hiệu là yếu tố then chốt để đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu của kit thử nhanh. Kháng thể cần có ái lực cao với protein Nucleocapsid SARS-CoV-2 và không có phản ứng chéo với các protein khác. Có thể sử dụng kháng thể đơn dòng hoặc kháng thể đa dòng, tùy thuộc vào yêu cầu về độ đặc hiệu và chi phí sản xuất. Kháng thể cần được kiểm tra và đánh giá kỹ lưỡng trước khi đưa vào sử dụng trong kit thử nhanh.

4.2. Tối Ưu Hóa Quy Trình Sản Xuất Kit Thử Nhanh

Quy trình sản xuất kit thử nhanh cần được tối ưu hóa để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của sản phẩm. Các yếu tố cần được xem xét bao gồm: nồng độ kháng thể, kích thước hạt nano vàng, loại màng nitrocellulose, và điều kiện bảo quản. Cần thực hiện các thử nghiệm để xác định các thông số tối ưu cho từng giai đoạn của quy trình sản xuất. Quy trình sản xuất cần được kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo tính ổn định và khả năng tái lặp của kit thử nhanh.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Và Kết Quả Nghiên Cứu Kit Thử Nhanh

Các kit thử nhanh phát hiện protein Nucleocapsid SARS-CoV-2 đã được ứng dụng rộng rãi trong thực tế, giúp sàng lọc và phát hiện sớm các trường hợp nhiễm bệnh. Các nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của kit thử nhanh trong việc kiểm soát dịch bệnh. Tuy nhiên, cần lưu ý về độ nhạy và độ đặc hiệu của kit thử nhanh để đảm bảo kết quả chính xác. Các kết quả nghiên cứu cho thấy kit thử nhanh có thể đạt độ nhạy cao khi nồng độ virus trong mẫu bệnh phẩm cao, nhưng có thể cho kết quả âm tính giả khi nồng độ virus thấp.

5.1. Đánh Giá Độ Nhạy Và Độ Đặc Hiệu Của Kit Thử Nhanh

Độ nhạy và độ đặc hiệu là hai thông số quan trọng để đánh giá hiệu quả của kit thử nhanh. Độ nhạy là khả năng của kit thử phát hiện chính xác các trường hợp dương tính, trong khi độ đặc hiệu là khả năng của kit thử loại trừ chính xác các trường hợp âm tính. Cần thực hiện các thử nghiệm trên một số lượng lớn mẫu bệnh phẩm đã được xác định bằng RT-PCR để đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của kit thử nhanh. Kết quả đánh giá cần được công bố công khai để người sử dụng có thể đưa ra quyết định lựa chọn kit thử phù hợp.

5.2. So Sánh Kit Thử Nhanh Với Các Phương Pháp Chẩn Đoán Khác

Cần so sánh kit thử nhanh với các phương pháp chẩn đoán khác, như RT-PCR và ELISA, để đánh giá ưu và nhược điểm của từng phương pháp. RT-PCR có độ nhạy cao hơn kit thử nhanh, nhưng đòi hỏi trang thiết bị phức tạp và thời gian thực hiện lâu hơn. ELISA có độ nhạy tương đương RT-PCR, nhưng cần thực hiện trong phòng thí nghiệm. Kit thử nhanh có ưu điểm là cho kết quả nhanh chóng và dễ sử dụng, nhưng độ nhạy có thể thấp hơn các phương pháp khác. Việc lựa chọn phương pháp phù hợp phụ thuộc vào mục đích sử dụng, điều kiện cơ sở vật chất và nguồn lực sẵn có.

VI. Kết Luận Và Hướng Phát Triển Kit Thử Nhanh Tương Lai

Nghiên cứu và phát triển kit thử nhanh dựa trên protein Nucleocapsid SARS-CoV-2 là một lĩnh vực đầy tiềm năng, góp phần quan trọng vào việc kiểm soát dịch bệnh COVID-19. Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc cải tiến độ nhạy và độ đặc hiệu của kit thử nhanh, phát triển các kit thử có thể phát hiện đồng thời nhiều biến chủng SARS-CoV-2, và đơn giản hóa quy trình sử dụng để kit thử nhanh có thể được sử dụng rộng rãi tại nhà.

6.1. Cải Tiến Độ Nhạy Và Độ Đặc Hiệu Của Kit Thử Nhanh

Việc cải tiến độ nhạy và độ đặc hiệu của kit thử nhanh là một mục tiêu quan trọng trong các nghiên cứu tương lai. Có thể sử dụng các kháng thể có ái lực cao hơn, áp dụng các công nghệ khuếch đại tín hiệu, và cải tiến thiết kế kit thử để nâng cao hiệu quả phát hiện protein Nucleocapsid SARS-CoV-2. Cần thực hiện các thử nghiệm lâm sàng trên một số lượng lớn mẫu bệnh phẩm để đánh giá hiệu quả của các cải tiến.

6.2. Phát Triển Kit Thử Phát Hiện Đa Biến Chủng SARS CoV 2

Sự xuất hiện của các biến chủng SARS-CoV-2 mới đặt ra thách thức cho việc phát triển kit thử nhanh. Các nghiên cứu cần tập trung vào việc phát triển các kit thử có thể phát hiện đồng thời nhiều biến chủng, bằng cách sử dụng các kháng thể nhận diện các vùng bảo tồn trên protein Nucleocapsid hoặc kết hợp nhiều kháng thể khác nhau. Điều này sẽ giúp đảm bảo hiệu quả của kit thử nhanh trong bối cảnh dịch bệnh liên tục thay đổi.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Đại dịch Covid-19 do virus SARS-CoV-2 gây ra đã trở thành một thách thức y tế toàn cầu với hơn 759 triệu ca nhiễm và hơn 6,8 triệu ca tử vong được báo cáo tính đến tháng 3 năm 2023. Tại Việt Nam, hơn 11 triệu ca nhiễm và hơn 43 nghìn ca tử vong đã được ghi nhận, với Hà Nội là địa phương chịu ảnh hưởng nặng nề nhất. Virus SARS-CoV-2 có khả năng lây lan nhanh qua giọt bắn và tiếp xúc gần, gây ra hội chứng hô hấp cấp tính nghiêm trọng. Việc phát hiện nhanh và chính xác các ca nhiễm là yếu tố sống còn trong kiểm soát dịch bệnh.

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là tổng hợp protein Nucleocapsid (protein N) tái tổ hợp của virus SARS-CoV-2 và ứng dụng bước đầu trong phát triển kit thử nhanh phát hiện kháng nguyên virus. Protein N được lựa chọn do tính đặc hiệu cao và là kháng nguyên nổi bật trong dịch nuôi cấy virus, giúp chẩn đoán sớm bệnh nhân nhiễm Covid-19. Nghiên cứu tập trung vào tối ưu hóa trình tự gen mã hóa protein N phù hợp với chủng E. coli BL21(DE3), biểu hiện và tinh sạch protein, tạo kháng thể đa dòng trên thỏ và chuột lang, đồng thời phát triển que thử nhanh với độ nhạy 93,3%, độ đặc hiệu và độ lặp lại đạt 100%.

Phạm vi nghiên cứu thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội, trong giai đoạn 2021-2023. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc cung cấp phương pháp xét nghiệm nhanh, chi phí thấp, dễ thực hiện, góp phần nâng cao hiệu quả sàng lọc và kiểm soát dịch bệnh Covid-19 tại Việt Nam và trên thế giới.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu về virus SARS-CoV-2, đặc biệt tập trung vào cấu trúc và chức năng của protein Nucleocapsid (protein N). Protein N là một trong bốn protein cấu trúc chính của virus, có vai trò đóng gói bộ gen RNA và là kháng nguyên quan trọng trong chẩn đoán huyết thanh học. Các khái niệm chính bao gồm:

• Protein Nucleocapsid (N protein): Chứa hai vùng liên kết RNA (NTD và CTD) và vùng giàu serine/arginine, có tính đặc hiệu cao trong phát hiện kháng thể.
• Tối ưu hóa codon: Điều chỉnh trình tự gen để phù hợp với hệ thống biểu hiện của E. coli nhằm tăng hiệu suất biểu hiện protein.
• Phương pháp sắc ký miễn dịch (Lateral Flow Assay - LFA): Nguyên lý phát hiện kháng nguyên dựa trên phản ứng kháng thể - kháng nguyên với sự hỗ trợ của hạt nano vàng.
• Kháng thể đa dòng: Kháng thể được tạo ra từ nhiều dòng tế bào miễn dịch, có khả năng nhận diện nhiều epitope khác nhau trên protein N.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là mẫu gen mã hóa protein N của virus SARS-CoV-2, chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3) làm vật chủ biểu hiện protein, cùng các kháng thể và hóa chất phục vụ cho các phương pháp phân tích. Phương pháp nghiên cứu bao gồm:

• Tối ưu hóa gen: Sử dụng công cụ OptimumGene Codon Optimization Analysis để tối ưu trình tự gen, nâng chỉ số CAI từ 0,33 lên 0,96, tăng tần số sử dụng codon tối ưu lên 85%.
• Biểu hiện và tinh sạch protein: Biến nạp plasmid pET-22b(+) chứa gen N vào E. coli BL21(DE3), cảm ứng biểu hiện bằng IPTG, thu nhận protein qua sắc ký ái lực với đuôi His-tag.
• Tạo kháng thể đa dòng: Gây miễn dịch trên thỏ và chuột lang bằng protein N tái tổ hợp, thu nhận huyết thanh, tinh sạch kháng thể bằng sắc ký ái lực protein A.
• Phát triển kit thử nhanh: Tạo cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng, cố định kháng thể trên màng nitrocellulose, lắp ráp que thử và đánh giá đặc tính qua các chỉ số độ nhạy, độ đặc hiệu, độ lặp lại.
• Phân tích và đánh giá: Sử dụng ELISA, Western Blot, SDS-PAGE để kiểm tra hoạt tính protein và hiệu quả kháng thể; đánh giá kit thử nhanh trên mẫu thực tế.

Timeline nghiên cứu kéo dài từ năm 2021 đến đầu năm 2023, với các giai đoạn tối ưu gen, biểu hiện protein, tạo kháng thể và phát triển kit thử nhanh được thực hiện tuần tự.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tối ưu hóa gen Nucleocapsid: Chỉ số CAI tăng từ 0,33 lên 0,96, tần số sử dụng codon tối ưu đạt 85%, hàm lượng GC giảm từ 59,73% xuống 47,3%, phù hợp với hệ biểu hiện E. coli, giúp tăng hiệu suất biểu hiện protein.

2. Biểu hiện và tinh sạch protein N: Protein N tái tổ hợp được biểu hiện thành công trong E. coli BL21(DE3), thu nhận tinh sạch với độ tinh khiết cao qua sắc ký ái lực His-tag, tương đương với protein N thương mại. SDS-PAGE và Western Blot xác nhận kích thước và đặc tính kháng nguyên của protein.

3. Tạo kháng thể đa dòng: Kháng thể đa dòng trên thỏ và chuột lang được tạo thành với hiệu giá cao, đáp ứng miễn dịch tăng rõ rệt sau các lần tiêm. Kháng thể tinh sạch có độ đặc hiệu cao với protein N, được xác nhận qua ELISA.

4. Phát triển kit thử nhanh: Que thử nhanh phát hiện kháng nguyên protein N có độ nhạy 93,3%, độ đặc hiệu và độ lặp lại đạt 100% trên mẫu thử. Kit thử cho kết quả nhanh trong 15-30 phút, phù hợp với sàng lọc diện rộng.

Thảo luận kết quả

Việc tối ưu hóa gen Nucleocapsid đã giải quyết được vấn đề không tương thích mã di truyền giữa virus và vật chủ E. coli, nâng cao hiệu quả biểu hiện protein tái tổ hợp. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho thấy tối ưu codon là yếu tố then chốt trong sản xuất protein tái tổ hợp.

Protein N tái tổ hợp thu được có đặc tính kháng nguyên tương đương protein thương mại, chứng tỏ quy trình biểu hiện và tinh sạch đạt hiệu quả cao. Kháng thể đa dòng tạo ra có độ đặc hiệu và hiệu giá cao, phù hợp cho ứng dụng trong kit thử nhanh.

Kit thử nhanh phát hiện kháng nguyên protein N cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu cao, vượt trội so với nhiều kit thử nhanh hiện có trên thị trường, đồng thời giảm thiểu thời gian và chi phí xét nghiệm so với RT-PCR. Kết quả này có thể được minh họa qua biểu đồ so sánh độ nhạy và độ đặc hiệu của kit thử với các phương pháp khác.

Những phát hiện này góp phần quan trọng trong việc phát triển phương pháp xét nghiệm nhanh, hỗ trợ kiểm soát dịch bệnh hiệu quả, đặc biệt trong bối cảnh dịch Covid-19 còn diễn biến phức tạp.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Mở rộng quy mô sản xuất protein N tái tổ hợp: Tăng cường đầu tư công nghệ lên quy mô công nghiệp nhằm đáp ứng nhu cầu kit thử nhanh trên thị trường, đảm bảo chất lượng và ổn định sản phẩm trong vòng 12 tháng tới.

2. Phát triển và hoàn thiện kit thử nhanh: Tiếp tục tối ưu hóa các thành phần vật liệu que thử, nâng cao độ nhạy và giảm tỷ lệ dương tính giả, hướng tới đạt độ nhạy trên 95% trong 6-9 tháng, do các phòng thí nghiệm và doanh nghiệp công nghệ sinh học thực hiện.

3. Đào tạo và chuyển giao công nghệ: Tổ chức các khóa đào tạo kỹ thuật cho nhân viên y tế và kỹ thuật viên xét nghiệm về sử dụng kit thử nhanh, đảm bảo triển khai rộng rãi và hiệu quả trong cộng đồng trong vòng 6 tháng.

4. Nghiên cứu ứng dụng mở rộng: Khuyến khích nghiên cứu ứng dụng protein N và kháng thể đa dòng trong các phương pháp chẩn đoán khác như ELISA, xét nghiệm huyết thanh học, nhằm đa dạng hóa công cụ chẩn đoán Covid-19 trong 1-2 năm tới.

5. Hợp tác quốc tế và cập nhật biến thể mới: Thiết lập mạng lưới hợp tác nghiên cứu để cập nhật các biến thể mới của virus SARS-CoV-2, đảm bảo kit thử nhanh luôn phù hợp và hiệu quả, thực hiện liên tục trong giai đoạn dịch bệnh.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học: Luận văn cung cấp kiến thức chuyên sâu về kỹ thuật biểu hiện protein tái tổ hợp, tạo kháng thể và phát triển kit thử nhanh, hỗ trợ nghiên cứu và học tập.

2. Doanh nghiệp sản xuất kit xét nghiệm y tế: Thông tin về quy trình phát triển kit thử nhanh và đánh giá đặc tính sản phẩm giúp doanh nghiệp cải tiến và phát triển sản phẩm mới phù hợp thị trường.

3. Cơ quan y tế và phòng xét nghiệm: Cung cấp cơ sở khoa học và kỹ thuật để lựa chọn và áp dụng các phương pháp xét nghiệm nhanh, nâng cao hiệu quả sàng lọc và kiểm soát dịch bệnh.

4. Chính sách và quản lý y tế công cộng: Tham khảo để xây dựng chiến lược xét nghiệm, phân bổ nguồn lực và triển khai các biện pháp phòng chống dịch phù hợp với tình hình thực tế.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chọn protein Nucleocapsid làm kháng nguyên trong kit thử nhanh?
   Protein N là kháng nguyên nổi bật nhất trong dịch nuôi cấy virus, có độ đặc hiệu cao và xuất hiện sớm trong quá trình nhiễm, giúp phát hiện nhanh và chính xác hơn so với các protein khác.

2. Phương pháp tối ưu hóa gen có vai trò gì trong nghiên cứu?
   Tối ưu hóa gen giúp tăng hiệu suất biểu hiện protein trong vật chủ E. coli bằng cách điều chỉnh mã di truyền phù hợp, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng protein tái tổ hợp.

3. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kit thử nhanh đạt được là bao nhiêu?
   Kit thử nhanh phát hiện protein N có độ nhạy 93,3%, độ đặc hiệu và độ lặp lại đều đạt 100%, đảm bảo kết quả chính xác và tin cậy trong sàng lọc.

4. Ưu điểm của kit thử nhanh so với phương pháp RT-PCR là gì?
   Kit thử nhanh cho kết quả trong 15-30 phút, thao tác đơn giản, chi phí thấp và không cần thiết bị phức tạp, phù hợp với xét nghiệm tại chỗ và sàng lọc diện rộng.

5. Có thể áp dụng kết quả nghiên cứu này cho các biến thể mới của SARS-CoV-2 không?
   Protein N có tính bảo tồn cao giữa các biến thể, do đó kit thử nhanh dựa trên protein N vẫn có khả năng phát hiện hiệu quả các biến thể mới, tuy nhiên cần cập nhật và kiểm tra định kỳ.

Kết luận

• Thành công trong tối ưu hóa gen và biểu hiện protein Nucleocapsid tái tổ hợp với chỉ số CAI đạt 0,96, phù hợp hệ biểu hiện E. coli.
• Thu nhận protein N tinh sạch có đặc tính kháng nguyên tương đương protein thương mại, được xác nhận qua SDS-PAGE và Western Blot.
• Tạo được kháng thể đa dòng trên thỏ và chuột lang với hiệu giá cao, độ đặc hiệu tốt, phục vụ phát triển kit thử nhanh.
• Phát triển que thử nhanh phát hiện kháng nguyên protein N với độ nhạy 93,3%, độ đặc hiệu và độ lặp lại 100%, cho kết quả nhanh và chính xác.
• Đề xuất mở rộng sản xuất, hoàn thiện kit thử, đào tạo kỹ thuật và nghiên cứu ứng dụng mở rộng nhằm nâng cao hiệu quả kiểm soát dịch Covid-19.

Tiếp theo, cần triển khai sản xuất quy mô lớn và phối hợp với các cơ quan y tế để ứng dụng rộng rãi kit thử nhanh trong cộng đồng. Độc giả và các đơn vị quan tâm được khuyến khích liên hệ để nhận chuyển giao công nghệ và hợp tác nghiên cứu phát triển sản phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1.1 Tình hình dịch Covid-19 trên thế giới và Việt Nam 1.1 Tình hình Covid-19 trên thế giới Đại dịch Covid-19 là một đại dịch bệnh truyền nhiễm với tác nhân là virus SARS-CoV-2 và các biến thể của nó đang diễn ra trên phạm vi toàn cầu [1]. Khởi nguồn vào cuối tháng 12 năm 2019, với tâm dịch đầu tiên tại thành phố Vũ Hán, Trung Quốc, bắt nguồn từ một nhóm người mắc viêm phổi không rõ nguyên nhân. Ca nghi nhiễm đầu tiên ở Vũ Hán được báo cáo vào ngày 31 tháng 12 năm 2019. Trường hợp tử vong đầu tiên do SARS-CoV-2 xảy ra ở Vũ Hán vào ngày 9 tháng 1 năm 2020.

Các ca nhiễm virus bên ngoài Trung Quốc đầu tiên được xác định ở Thái Lan và Nhật Bản [2]. Sự lây nhiễm virus từ người sang người đã được xác nhận cùng với tỷ lệ bùng phát dịch tăng vào giữa tháng 1 năm 2020. Ngày 11 tháng 3 năm 2020, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ra tuyên bố gọi COVID-19 là “Đại dịch toàn cầu”, trước bối cảnh số ca nhiễm trên toàn cầu đã vượt mốc 126.000 và dịch đã lan ra 123 quốc gia và vùng lãnh thổ [3]. Sau 2 năm xuất hiện, đai dịch đã lan ra khắp 225 quốc gia và vùng lãnh thổ.

Theo số liệu thống kê của WHO, cập nhật đến ngày 7 tháng 3 năm 2023, hơn 759 triệu trường hợp được xác nhận và hơn 6,8 triệu trường hợp tử vong đã được báo cáo trên toàn cầu. Hầu hết những người bị nhiễm vi rút sẽ bị bệnh đường hô hấp nhẹ đến trung bình và tự khỏi mà không cần điều trị đặc biệt. Tuy nhiên, một số sẽ bị bệnh nặng và cần được chăm sóc y tế. Những người lớn tuổi và những người có bệnh lý tiềm ẩn như bệnh tim mạch, tiểu đường, bệnh hô hấp mãn tính hoặc ung thư có nhiều khả năng phát triển bệnh nghiêm trọng hơn [4].

Bất kỳ ai cũng có thể bị bệnh với COVID-19 và trở thành bệnh nặng hoặc chết ở mọi lứa tuổi [5] [6]. Tính đến ngày 6 tháng 3 năm 2023, tổng số hơn 13 tỷ liều vaccine đã được tiêm (theo WHO) [3]. Hiện nay, hầu hết các quốc gia tiếp tục tiến trình mở của đất nước. Tuy nhiên, nhiều nước châu Âu chứng kiến xu thế ca mắc tăng trở lại, đi kèm đó là nỗi lo một đợt sóng dịch mới bùng phát.

Tình hình dịch bệnh ở Đông Nam Á tiếp tục thuyên giảm, song có sự khác biệt lớn giữa các nước.2 Tình hình Covid-19 tại Việt Nam Đại dịch Covid-19 do virus SARS-CoV-2 có trường hợp xác nhận đầu tiên ở Việt Nam vào ngày 23 tháng 1 năm 2020 tại thành phố Hồ Chí Minh. Năm 2020, Việt Nam đã kiểm soát khá tốt dịch bệnh với tổng số ca tử vong cả năm được xác nhận là 35 người. Tuy nhiên vào cuối tháng 7 năm 2021, tình hình dịch bệnh trở nên tồi tệ hơn khi số ca mắc Covid-19 và số ca tử vong tăng đột biến. Đại dịch Covid-19 đã lan ra khắp 63 tỉnh thành tại Việt Nam.

Tác động của nó gây ra rất rộng, ảnh hưởng xấu đến xã hội nói chung, kinh tế, văn hoá, chính trị và nhiều lĩnh vực khác đều bị ảnh hưởng nặng nề.1: Biểu đồ tổng số ca xác nhận, đang điều trị, phục hồi và tử vong do Covid-19 tại Việt Nam từ đầu dịch [1] Tính đến ngày 7 tháng 3 năm 2023, Việt Nam có khoảng hơn 11 triệu ca nhiễm, đứng thứ 12/227 quốc gia và vùng lãnh thổ, trong khi với tỷ lệ số ca nhiễm trên 1 triệu dân, Việt Nam đứng thứ 12/227 quốc gia và vùng lãnh thổ (bình quân cứ 1 triệu người có 114.562 ca nhiễm), trong đó hơn 43 nghìn ca tử vong được công bố chính thức. Nơi có dịch nặng nhất là Hà Nội với tổng số 1,6 triệu ca nhiễm và hơn 1 nghìn. Nơi nhẹ nhất là Ninh Thuận với hơn 8 nghìn ca nhiễm và khoảng 60 ca tử vong [1] 2 Bảng 1.1: Các đợt bùng phát của đại dịch Covid-19 tại Việt Nam theo Bộ Y tế [1] Số ca Giai Thời gian Mô tả đoạn Ca nhiễm Tử vong Ca bệnh đầu tiên xuất hiện tại Thành 1 23/1–24/7/2020 415 0 phố Hồ Chí Minh là ca nhập cảnh từ Vũ Hán. Đợt dịch có sự xuất hiện cao điểm nhất trong 36 ngày tại Đà 2 25/7/2020–27/1/2021 1.136 554 Nẵng; ca bệnh chỉ điểm là 1 bệnh nhân của Bệnh viện C Đà Nẵng.

Bùng phát tại Hải Dương từ 1 người xuất khẩu lao động bị phát hiện dương tính khi nhập cảnh Nhật 3 28/1–26/4/2021 1. Đợt dịch chủ yếu tại ổ dịch Hải Dương (726 ca, chiếm gần 80% tổng số ca bệnh). Đợt dịch có sự xuất hiện của biến thể 4 27/4/2021–nay 11.000+ Delta và Omicron, bùng phát và lây lan mạnh khắp cả nước; 3 Số ca Giai Thời gian Mô tả đoạn Ca nhiễm Tử vong cao điểm nhất trong các ngày tại Thành phố Hồ Chí Minh; ca bệnh chỉ điểm là 1 bệnh nhân của Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh.2 Virus SARS-CoV-2 1.1 Đặc điểm cấu trúc và di truyền của virus SARS-CoV-2 Virus corona gây hội chứng hô hấp cấp tính nặng 2, viết tắt là SARS-CoV- 2 (tiếng Anh: Severe acute respiratory syndrome corona virus 2), trước đây có tên là virus corona mới 2019 (2019-nCoV), là một chủng coronavirus gây ra bệnh viêm đường hô hấp cấp do virus corona 2019 (COVID-19), xuất hiện lần đầu tiên vào tháng 12 năm 2019, trong đợt bùng phát đại dịch COVID-19 ở thành phố Vũ Hán, Trung Quốc và bắt đầu lây lan nhanh chóng, sau đó trở thành một đại dịch toàn cầu. Vào ngày 12 tháng 01 năm 2020, nó được Tổ chức Y tế Thế giới gọi tên là 2019-nCoV, dựa trên một phương thức đặt tên cho virus corona mới.

Đến ngày 11 tháng 2 năm 2020, Ủy ban Quốc tế về Phân loại Virus (ICTV) quyết định đặt tên chính thức cho chủng virus corona mới này là SARS-CoV-2 khi họ phân tích rằng nó cùng loài với virus SARS từng gây ra đại dịch năm 2003 nhưng là một chủng khác của loài. Virus này là một loại virus corona RNA đơn dương [7, 8]. Trong khoảng thời gian đầu của đại dịch Covid-19, các nhân viên nghiên cứu đã phát hiện chủng virus này sau khi họ tiến hành đo lường kiểm tra axit nucleic và dò tra trinh tự bộ gen ở mẫu vật lấy từ người bệnh. Các thành viên thuộc họ virus corona có dạng hình cầu với đường kính xấp xỉ 125 nm, với cấu trúc theo thứ tự từ trong ra ngoài như sau: 4 • Lõi acid nucleic: Bộ gen của virus, cụ thể là sợi RNA đơn, dương sẽ giúp virus có thể tổng hợp các thành phần cấu tạo khi đã xâm nhập vào tế bào vật chủ, nhằm phục vụ cho việc nhân bản.

Kích thước bộ gen của họ virus corona được xem là lớn nhất trong số các loại virus RNA: 26-32 kilobase. • Vỏ protein (vỏ capsit): Lớp vỏ bọc bên ngoài bộ gen được cấu tạo từ các capsome đóng vai trò bảo vệ. • Lớp vỏ ngoài: Cấu tạo từ lớp kép lipit và protein, bên trên có lớp gai protein. Lớp gai này sẽ thực hiện các nhiệm vụ của kháng nguyên, điển hình như giúp virus thâm nhập vào bên trong tế bào vật chủ.

Các hạt virus Coronavirus chứa bốn protein cấu trúc chính. Đây là các protein spike (S), màng (M), vỏ E và nucleocapsid (N) protein, tất cả đều được mã hóa trong đầu 3′ của bộ gen virus [7, 9]. Protein S có khối lượng khoảng 150 kDa, đa số gồm hai tiểu phần S1 hình cầu ở đầu và tiểu phần S2 là phần cuống, tạo nên cấu trúc gai đặc biệt trên bề mặt của virus và có vai trò trung gian gắn vào thụ thể của tế bào vật chủ [9, 10, 11, 12]. Protein M là protein cấu trúc chính của màng virus khiến hạt virus có hình cầu.

Protein E (8 -12 kDa) nằm trên vỏ virus và có vai trò chính trong việc lắp ráp và giải phóng virus. Protein N tồn tại trong nucleocapsid và có vai trò liên kết bộ gen virus thành cấu trúc kiểu chuỗi hạt để đóng gói bộ gen thành các hạt virus [13]. Ngoài bốn protein chính trên, còn có protein phi cấu trúc hemagglutinin- esterase (HE), có vai trò tăng cường sự xâm nhập của virus qua trung gian protein S và giúp virus xâm nhập vào tế bào niêm mạc. Các protein phi cấu trúc khác có vai trò trong đảm bảo các hoạt động của virus.2 Đặc điểm của protein Nucleocapsid Protein Nucleocapsid (N) là một kháng nguyên quan trọng đối với virus SARS- CoV-2, chúng tham gia vào việc đóng gói và giải phóng hạt virus.

Protein N chứa 2 vùng liên kết RNA riêng biệt là vùng NTD và CTD, được liên kết với vùng liên kết có cấu trúc kém (LKR) chứa vùng giàu serine/arginine (SRD) [15]. Chẩn đoán huyết thanh học phát hiện ra rằng các kháng thể đặc hiệu chống lại protein N trong huyết thanh của bệnh nhân SARS có độ nhạy cao hơn và tồn tại lâu hơn so với các kháng thể kháng lại các protein cấu trúc khác của virus SARS-CoV-2 [16]. Hơn nữa, các kháng thể kháng protein N được cho là có độ đặc hiệu cao trong giai đoạn đầu của nhiễm bệnh.3 Cấu trúc của protein Nucleocapsid 6 1.3 Cơ chế xâm nhập và lây nhiễm virus SARS-CoV-2 Hình 1.4: Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus SARS-CoV-2 [17] Khi xâm nhập vào vật chủ, protein S gắn vào thụ thể ứng với nó trên bề mặt màng tế bào niêm mạc đường hô hấp của vật chủ. Đa số các coronavirus sử dụng peptidase làm thụ thể tế bào của chúng.

SARS-CoV và HcoV-NL63 sử dụng enzyme chuyển angiotensin 2 (ACE2) làm thụ thể của chúng, còn MERS-CoV dùng peptidase 4 (DPP4) để làm thụ thể xâm nhập vào tế bào người [9]. Sự thay đổi di truyền virus làm thay đổi khả năng gắn kết thụ cảm thể và thay đổi vật chủ của chúng. Bước tiếp theo sau khi xâm nhập tế bào vật chủ là dịch mã gen sao chép từ RNA gen của virion. Đầu tiên chúng tổng hợp ra sợi RNA thông tin để tổng hợp ra các protein cấu trúc và phi cấu trúc để đảm bảo các hoạt động tiếp của virus, tiếp đó chúng tạo ra một sợi RNA âm đóng vai trò khuôn mẫu để tổng hợp tiếp cái sợi RNA dương con.

Sau quá trình sao chép và tổng hợp RNA thế hệ con, các protein cấu trúc S, E và M được chuyển vào lưới nội bào (ER) và di chuyển vào khoang trung gian reticulum-Golgi (ERGIC). Ở đó, bộ gen của virus được bao bọc bởi protein N thành các Nucleocapsid. Protein M phối hợp với protein E tích hợp vào màng của ERGIC thành lớp vỏ virus gắn bọc lấy Nucleocapsid tạo ra các hạt giống virus (VLP). Sau đó protein S gắn vào lớp màng của VLP thành các hạt virion trưởng thành.