Tổng quan nghiên cứu

Đại dịch Covid-19 do virus SARS-CoV-2 gây ra đã trở thành một thách thức y tế toàn cầu với hơn 759 triệu ca nhiễm và hơn 6,8 triệu ca tử vong được báo cáo tính đến tháng 3 năm 2023. Tại Việt Nam, hơn 11 triệu ca nhiễm và hơn 43 nghìn ca tử vong đã được ghi nhận, với Hà Nội là địa phương chịu ảnh hưởng nặng nề nhất. Virus SARS-CoV-2 có khả năng lây lan nhanh qua giọt bắn và tiếp xúc gần, gây ra hội chứng hô hấp cấp tính nghiêm trọng. Việc phát hiện nhanh và chính xác các ca nhiễm là yếu tố sống còn trong kiểm soát dịch bệnh.

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là tổng hợp protein Nucleocapsid (protein N) tái tổ hợp của virus SARS-CoV-2 và ứng dụng bước đầu trong phát triển kit thử nhanh phát hiện kháng nguyên virus. Protein N được lựa chọn do tính đặc hiệu cao và là kháng nguyên nổi bật trong dịch nuôi cấy virus, giúp chẩn đoán sớm bệnh nhân nhiễm Covid-19. Nghiên cứu tập trung vào tối ưu hóa trình tự gen mã hóa protein N phù hợp với chủng E. coli BL21(DE3), biểu hiện và tinh sạch protein, tạo kháng thể đa dòng trên thỏ và chuột lang, đồng thời phát triển que thử nhanh với độ nhạy 93,3%, độ đặc hiệu và độ lặp lại đạt 100%.

Phạm vi nghiên cứu thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội, trong giai đoạn 2021-2023. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc cung cấp phương pháp xét nghiệm nhanh, chi phí thấp, dễ thực hiện, góp phần nâng cao hiệu quả sàng lọc và kiểm soát dịch bệnh Covid-19 tại Việt Nam và trên thế giới.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu về virus SARS-CoV-2, đặc biệt tập trung vào cấu trúc và chức năng của protein Nucleocapsid (protein N). Protein N là một trong bốn protein cấu trúc chính của virus, có vai trò đóng gói bộ gen RNA và là kháng nguyên quan trọng trong chẩn đoán huyết thanh học. Các khái niệm chính bao gồm:

  • Protein Nucleocapsid (N protein): Chứa hai vùng liên kết RNA (NTD và CTD) và vùng giàu serine/arginine, có tính đặc hiệu cao trong phát hiện kháng thể.
  • Tối ưu hóa codon: Điều chỉnh trình tự gen để phù hợp với hệ thống biểu hiện của E. coli nhằm tăng hiệu suất biểu hiện protein.
  • Phương pháp sắc ký miễn dịch (Lateral Flow Assay - LFA): Nguyên lý phát hiện kháng nguyên dựa trên phản ứng kháng thể - kháng nguyên với sự hỗ trợ của hạt nano vàng.
  • Kháng thể đa dòng: Kháng thể được tạo ra từ nhiều dòng tế bào miễn dịch, có khả năng nhận diện nhiều epitope khác nhau trên protein N.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là mẫu gen mã hóa protein N của virus SARS-CoV-2, chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3) làm vật chủ biểu hiện protein, cùng các kháng thể và hóa chất phục vụ cho các phương pháp phân tích. Phương pháp nghiên cứu bao gồm:

  • Tối ưu hóa gen: Sử dụng công cụ OptimumGene Codon Optimization Analysis để tối ưu trình tự gen, nâng chỉ số CAI từ 0,33 lên 0,96, tăng tần số sử dụng codon tối ưu lên 85%.
  • Biểu hiện và tinh sạch protein: Biến nạp plasmid pET-22b(+) chứa gen N vào E. coli BL21(DE3), cảm ứng biểu hiện bằng IPTG, thu nhận protein qua sắc ký ái lực với đuôi His-tag.
  • Tạo kháng thể đa dòng: Gây miễn dịch trên thỏ và chuột lang bằng protein N tái tổ hợp, thu nhận huyết thanh, tinh sạch kháng thể bằng sắc ký ái lực protein A.
  • Phát triển kit thử nhanh: Tạo cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng, cố định kháng thể trên màng nitrocellulose, lắp ráp que thử và đánh giá đặc tính qua các chỉ số độ nhạy, độ đặc hiệu, độ lặp lại.
  • Phân tích và đánh giá: Sử dụng ELISA, Western Blot, SDS-PAGE để kiểm tra hoạt tính protein và hiệu quả kháng thể; đánh giá kit thử nhanh trên mẫu thực tế.

Timeline nghiên cứu kéo dài từ năm 2021 đến đầu năm 2023, với các giai đoạn tối ưu gen, biểu hiện protein, tạo kháng thể và phát triển kit thử nhanh được thực hiện tuần tự.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Tối ưu hóa gen Nucleocapsid: Chỉ số CAI tăng từ 0,33 lên 0,96, tần số sử dụng codon tối ưu đạt 85%, hàm lượng GC giảm từ 59,73% xuống 47,3%, phù hợp với hệ biểu hiện E. coli, giúp tăng hiệu suất biểu hiện protein.

  2. Biểu hiện và tinh sạch protein N: Protein N tái tổ hợp được biểu hiện thành công trong E. coli BL21(DE3), thu nhận tinh sạch với độ tinh khiết cao qua sắc ký ái lực His-tag, tương đương với protein N thương mại. SDS-PAGE và Western Blot xác nhận kích thước và đặc tính kháng nguyên của protein.

  3. Tạo kháng thể đa dòng: Kháng thể đa dòng trên thỏ và chuột lang được tạo thành với hiệu giá cao, đáp ứng miễn dịch tăng rõ rệt sau các lần tiêm. Kháng thể tinh sạch có độ đặc hiệu cao với protein N, được xác nhận qua ELISA.

  4. Phát triển kit thử nhanh: Que thử nhanh phát hiện kháng nguyên protein N có độ nhạy 93,3%, độ đặc hiệu và độ lặp lại đạt 100% trên mẫu thử. Kit thử cho kết quả nhanh trong 15-30 phút, phù hợp với sàng lọc diện rộng.

Thảo luận kết quả

Việc tối ưu hóa gen Nucleocapsid đã giải quyết được vấn đề không tương thích mã di truyền giữa virus và vật chủ E. coli, nâng cao hiệu quả biểu hiện protein tái tổ hợp. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho thấy tối ưu codon là yếu tố then chốt trong sản xuất protein tái tổ hợp.

Protein N tái tổ hợp thu được có đặc tính kháng nguyên tương đương protein thương mại, chứng tỏ quy trình biểu hiện và tinh sạch đạt hiệu quả cao. Kháng thể đa dòng tạo ra có độ đặc hiệu và hiệu giá cao, phù hợp cho ứng dụng trong kit thử nhanh.

Kit thử nhanh phát hiện kháng nguyên protein N cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu cao, vượt trội so với nhiều kit thử nhanh hiện có trên thị trường, đồng thời giảm thiểu thời gian và chi phí xét nghiệm so với RT-PCR. Kết quả này có thể được minh họa qua biểu đồ so sánh độ nhạy và độ đặc hiệu của kit thử với các phương pháp khác.

Những phát hiện này góp phần quan trọng trong việc phát triển phương pháp xét nghiệm nhanh, hỗ trợ kiểm soát dịch bệnh hiệu quả, đặc biệt trong bối cảnh dịch Covid-19 còn diễn biến phức tạp.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Mở rộng quy mô sản xuất protein N tái tổ hợp: Tăng cường đầu tư công nghệ lên quy mô công nghiệp nhằm đáp ứng nhu cầu kit thử nhanh trên thị trường, đảm bảo chất lượng và ổn định sản phẩm trong vòng 12 tháng tới.

  2. Phát triển và hoàn thiện kit thử nhanh: Tiếp tục tối ưu hóa các thành phần vật liệu que thử, nâng cao độ nhạy và giảm tỷ lệ dương tính giả, hướng tới đạt độ nhạy trên 95% trong 6-9 tháng, do các phòng thí nghiệm và doanh nghiệp công nghệ sinh học thực hiện.

  3. Đào tạo và chuyển giao công nghệ: Tổ chức các khóa đào tạo kỹ thuật cho nhân viên y tế và kỹ thuật viên xét nghiệm về sử dụng kit thử nhanh, đảm bảo triển khai rộng rãi và hiệu quả trong cộng đồng trong vòng 6 tháng.

  4. Nghiên cứu ứng dụng mở rộng: Khuyến khích nghiên cứu ứng dụng protein N và kháng thể đa dòng trong các phương pháp chẩn đoán khác như ELISA, xét nghiệm huyết thanh học, nhằm đa dạng hóa công cụ chẩn đoán Covid-19 trong 1-2 năm tới.

  5. Hợp tác quốc tế và cập nhật biến thể mới: Thiết lập mạng lưới hợp tác nghiên cứu để cập nhật các biến thể mới của virus SARS-CoV-2, đảm bảo kit thử nhanh luôn phù hợp và hiệu quả, thực hiện liên tục trong giai đoạn dịch bệnh.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học: Luận văn cung cấp kiến thức chuyên sâu về kỹ thuật biểu hiện protein tái tổ hợp, tạo kháng thể và phát triển kit thử nhanh, hỗ trợ nghiên cứu và học tập.

  2. Doanh nghiệp sản xuất kit xét nghiệm y tế: Thông tin về quy trình phát triển kit thử nhanh và đánh giá đặc tính sản phẩm giúp doanh nghiệp cải tiến và phát triển sản phẩm mới phù hợp thị trường.

  3. Cơ quan y tế và phòng xét nghiệm: Cung cấp cơ sở khoa học và kỹ thuật để lựa chọn và áp dụng các phương pháp xét nghiệm nhanh, nâng cao hiệu quả sàng lọc và kiểm soát dịch bệnh.

  4. Chính sách và quản lý y tế công cộng: Tham khảo để xây dựng chiến lược xét nghiệm, phân bổ nguồn lực và triển khai các biện pháp phòng chống dịch phù hợp với tình hình thực tế.

Câu hỏi thường gặp

  1. Tại sao chọn protein Nucleocapsid làm kháng nguyên trong kit thử nhanh?
    Protein N là kháng nguyên nổi bật nhất trong dịch nuôi cấy virus, có độ đặc hiệu cao và xuất hiện sớm trong quá trình nhiễm, giúp phát hiện nhanh và chính xác hơn so với các protein khác.

  2. Phương pháp tối ưu hóa gen có vai trò gì trong nghiên cứu?
    Tối ưu hóa gen giúp tăng hiệu suất biểu hiện protein trong vật chủ E. coli bằng cách điều chỉnh mã di truyền phù hợp, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng protein tái tổ hợp.

  3. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kit thử nhanh đạt được là bao nhiêu?
    Kit thử nhanh phát hiện protein N có độ nhạy 93,3%, độ đặc hiệu và độ lặp lại đều đạt 100%, đảm bảo kết quả chính xác và tin cậy trong sàng lọc.

  4. Ưu điểm của kit thử nhanh so với phương pháp RT-PCR là gì?
    Kit thử nhanh cho kết quả trong 15-30 phút, thao tác đơn giản, chi phí thấp và không cần thiết bị phức tạp, phù hợp với xét nghiệm tại chỗ và sàng lọc diện rộng.

  5. Có thể áp dụng kết quả nghiên cứu này cho các biến thể mới của SARS-CoV-2 không?
    Protein N có tính bảo tồn cao giữa các biến thể, do đó kit thử nhanh dựa trên protein N vẫn có khả năng phát hiện hiệu quả các biến thể mới, tuy nhiên cần cập nhật và kiểm tra định kỳ.

Kết luận

  • Thành công trong tối ưu hóa gen và biểu hiện protein Nucleocapsid tái tổ hợp với chỉ số CAI đạt 0,96, phù hợp hệ biểu hiện E. coli.
  • Thu nhận protein N tinh sạch có đặc tính kháng nguyên tương đương protein thương mại, được xác nhận qua SDS-PAGE và Western Blot.
  • Tạo được kháng thể đa dòng trên thỏ và chuột lang với hiệu giá cao, độ đặc hiệu tốt, phục vụ phát triển kit thử nhanh.
  • Phát triển que thử nhanh phát hiện kháng nguyên protein N với độ nhạy 93,3%, độ đặc hiệu và độ lặp lại 100%, cho kết quả nhanh và chính xác.
  • Đề xuất mở rộng sản xuất, hoàn thiện kit thử, đào tạo kỹ thuật và nghiên cứu ứng dụng mở rộng nhằm nâng cao hiệu quả kiểm soát dịch Covid-19.

Tiếp theo, cần triển khai sản xuất quy mô lớn và phối hợp với các cơ quan y tế để ứng dụng rộng rãi kit thử nhanh trong cộng đồng. Độc giả và các đơn vị quan tâm được khuyến khích liên hệ để nhận chuyển giao công nghệ và hợp tác nghiên cứu phát triển sản phẩm.