Nghiên cứu sản xuất gam chuẩn cho RT-PCR ứng dụng trong chẩn đoán cúm và kiểm định vắc xin sởi

Nghiên cứu sản xuất gam chuẩn cho RT-PCR trong chẩn đoán cúm và kiểm định vắc xin sởi là một công trình quan… 183 trang · Trường Đại học Y Hà Nội · 2014.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thường
• Người hướng dẫn: GS. Huỳnh Phương Liên
• Trường học: Trường Đại học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh Y học
• Đề tài: Nghiên cứu sản xuất gam chuẩn cho RT-PCR trong chẩn đoán cúm và kiểm định vắc xin sởi
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan một số vấn đề về cúm
• 1.2. Phép gọi tên
• 1.3. Hình thái, cấu trúc
• 1.4. Kháng nguyên và tính đa dạng chủng
• 1.5. Sự nhân lên của virus cúm
• 1.6. Dịch tễ học
• 1.7. Chẩn đoán phòng thí nghiệm
• 1.8. Tình hình nghiên cứu về cúm và tỷ lệ nhiễm cúm
• 1.9. Tổng quan một số vấn đề về sởi
• 1.10. Phép gọi tên
• 1.11. Hình thái, cấu trúc
• 1.12. Sự nhân lên của virus
• 1.13. Các triển vọng thanh toán sởi
• 1.14. Các nghiên cứu liên quan đến sởi
• 1.15. Sản xuất chứng dương ARN in vitro và kiểm định công hiệu vắc xin
• 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu. Cơ sở vật chất và trang thiết bị, máy móc. Sinh phẩm hóa chất
• 2.3. Mồi và đầu dò
• 2.4. Phần mềm phân tích và nguồn thông tin
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6. Sản xuất chứng dương ARN in vitro
• 2.7. Xác định tỷ lệ nhiễm cúm
• 2.8. Xây dựng phương pháp kiểm định vắc xin sởi
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Sản xuất chứng dương ARN
• 3.2. Tạo khuôn mẫu cho phương pháp phiên mã cổ điển
• 3.3. Tạo khuôn mẫu cho phương pháp phiên mã trực tiếp
• 3.4. Xác định tỷ lệ nhiễm cúm bằng RT-PCR
• 3.5. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu
• 3.6. Đặc điểm trường hợp tử vong do cúm
• 3.7. Ứng dụng chứng dương trong xác định tỷ lệ nhiễm cúm
• 3.8. Tỷ lệ đồng nhiễm cúm và các virus khác
• 3.9. Phân bố nhiễm cúm theo giới tính, nhóm tuổi và thời gian
• 3.10. Kiểm định công hiệu vắc xin sởi
• 3.11. Công hiệu vắc xin mẫu chuẩn bằng tạo đám hoại tử
• 3.12. Công hiệu vắc xin mẫu chuẩn bằng real-time RT-PCR
• 3.13. Sự ổn định của ARN tách chiết bằng TpLR
• 3.14. Công hiệu vắc xin sởi thành phẩm
• 3.15. Độ lặp lại của phản ứng
• 3.16. Kết quả sản xuất các gam chuẩn
• 3.17. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp và chuyển nạp. Kiểm tra chuyển nạp
• 3.18. Tạo mạch thẳng ADN plasmid bằng cắt enzyme giới hạn
• 3.19. Kết quả phiên mã in vitro
• 3.20. Tỷ lệ nhiễm cúm tại Hải Dương năm 2009-2011
• 3.21. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu
• 3.22. Tỷ lệ tử vong và nhiễm cúm của bệnh nhân SARI
• 3.23. Phân bố nhiễm cúm theo giới tính, nhóm tuổi và thời gian
• 3.24. Bước đầu xây dựng phương pháp xác định hiệu giá vắc xin sởi đơn bằng real-time RT-PCR
• 3.25. Thử nghiệm tối ưu hóa các điều kiện phản ứng
• 3.26. Công hiệu vắc xin sởi thành phẩm
• 3.27. Thẩm định phương pháp
• 3.28. Bàn luận về các ưu điểm của đề tài
• 3.29. Chất lượng của sinh phẩm
• 3.30. Trang thiết bị máy móc
• 3.31. Quy trình thực hiện thử nghiệm
• 3.32. Phân tích kết quả và sự phù hợp với mục tiêu nghiên cứu
• 3.33. Chứng của phòng thí nghiệm và chứng quốc tế
• 3.34. Hoạt động độc lập
• 3.35. Bàn luận về những hạn chế của đề tài
• 3.36. Hạn chế trong sản xuất chứng dương ARN in vitro
• 3.37. Hạn chế trong xác định tỷ lệ nhiễm cúm
• 3.38. Hạn chế trong nghiên cứu xác định công hiệu vắc xin sởi
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu

Nghiên cứu sản xuất gam chuẩn cho RT-PCR trong chẩn đoán cúm và kiểm định vắc xin sởi là một công trình quan trọng nhằm nâng cao hiệu quả chẩn đoán và kiểm định vắc xin. RT-PCR là phương pháp chính trong việc phát hiện virus cúm và sởi, giúp xác định nhanh chóng và chính xác tình trạng nhiễm bệnh. Việc sản xuất gam chuẩn cho RT-PCR không chỉ giúp cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm mà còn đảm bảo tính chính xác trong việc định lượng ARN virus. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), cúm và sởi là hai bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, gây ra nhiều ca tử vong hàng năm. Do đó, việc phát triển các phương pháp chẩn đoán hiệu quả là rất cần thiết.

1.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu

Nghiên cứu này không chỉ góp phần vào việc nâng cao chất lượng chẩn đoán mà còn hỗ trợ trong việc kiểm định công hiệu của vắc xin sởi. Việc sử dụng gam chuẩn trong RT-PCR giúp giảm thiểu sai sót trong quá trình xét nghiệm, từ đó nâng cao độ tin cậy của kết quả. Hơn nữa, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng việc sản xuất gam chuẩn có thể khắc phục những hạn chế của việc sử dụng mẫu bệnh phẩm tách chiết, vốn thường không đảm bảo tính tinh khiết và định lượng. Điều này đặc biệt quan trọng trong bối cảnh dịch bệnh gia tăng và nhu cầu kiểm soát dịch bệnh ngày càng cao.

II. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu được áp dụng trong đề tài này bao gồm sản xuất chứng dương ARN in vitro và xác định tỷ lệ nhiễm cúm bằng RT-PCR. Việc sản xuất gam chuẩn cho RT-PCR được thực hiện thông qua các bước như tạo khuôn mẫu cho phương pháp phiên mã cổ điển và trực tiếp. Các mẫu ARN được sản xuất sẽ được sử dụng để kiểm định công hiệu của vắc xin sởi. Phương pháp này không chỉ giúp xác định tỷ lệ nhiễm cúm mà còn cho phép đánh giá hiệu quả của các loại vắc xin hiện có. Sự kết hợp giữa các phương pháp hiện đại và truyền thống trong nghiên cứu này tạo ra một nền tảng vững chắc cho việc phát triển các phương pháp chẩn đoán và kiểm định mới.

2.1. Sản xuất chứng dương ARN

Quá trình sản xuất chứng dương ARN được thực hiện bằng cách sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến. Việc tạo ra các mẫu ARN chuẩn giúp đảm bảo tính chính xác trong việc định lượng virus trong các mẫu bệnh phẩm. Các mẫu ARN này sẽ được sử dụng làm chuẩn trong các xét nghiệm RT-PCR, từ đó nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp chẩn đoán. Sự phát triển của công nghệ sinh học đã mở ra nhiều cơ hội mới trong việc sản xuất các mẫu chuẩn, giúp cải thiện chất lượng xét nghiệm và giảm thiểu rủi ro trong quá trình chẩn đoán.

III. Kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc sản xuất gam chuẩn cho RT-PCR đã đạt được những thành công nhất định. Tỷ lệ nhiễm cúm được xác định bằng RT-PCR cho thấy sự phân bố nhiễm cúm theo giới tính, nhóm tuổi và thời gian. Đặc biệt, việc kiểm định công hiệu của vắc xin sởi bằng phương pháp real-time RT-PCR đã cho thấy tính hiệu quả cao. Các mẫu vắc xin được kiểm định cho thấy sự ổn định của ARN tách chiết, điều này cho phép đánh giá chính xác công hiệu của vắc xin trong việc phòng ngừa bệnh. Kết quả này không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn có ứng dụng thực tiễn trong việc kiểm soát dịch bệnh.

3.1. Ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm y tế và các cơ sở nghiên cứu. Việc sử dụng gam chuẩn trong RT-PCR sẽ giúp nâng cao chất lượng chẩn đoán và kiểm định vắc xin, từ đó góp phần vào công tác phòng chống dịch bệnh hiệu quả hơn. Hơn nữa, nghiên cứu cũng mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán và kiểm định vắc xin, giúp đáp ứng nhanh chóng và hiệu quả với các dịch bệnh mới nổi. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong bối cảnh dịch bệnh ngày càng phức tạp và khó lường.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ y học của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thường, chuyên ngành Vi sinh Y học (khóa 27, Trường Đại học Y Hà Nội, thực hiện năm 2014 dưới sự hướng dẫn của GS. Huỳnh Phương Liên và GS. Nguyễn Trần Hiển) có tiêu đề: "Nghiên cứu sản xuất các gam chuẩn cho RT-PCR, ứng dụng trong chẩn đoán cúm và kiểm định công hiệu vắc xin sởi".

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Bệnh sởi và cúm là các bệnh truyền nhiễm cấp tính đường hô hấp do virus gây ra. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng năm toàn cầu ghi nhận khoảng 30 triệu ca mắc và 1 triệu ca tử vong do sởi, tập trung chủ yếu ở các nước đang phát triển. Giai đoạn 2000–2008, số ca tử vong do sởi trên thế giới giảm từ 733.000 ca, nhưng khu vực Tây Thái Bình Dương chỉ đạt 4% chỉ tiêu giảm tử vong. Vắc xin là yếu tố quyết định trong chiến lược khống chế và thanh toán sởi. Tại Việt Nam, Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (POLYVAC) đã tiếp nhận chuyển giao công nghệ từ Viện Kitasato (Nhật Bản) để sản xuất thành công vắc xin sởi đơn sống giảm độc lực chủng AIK-C. Việc kiểm định công hiệu vắc xin thành phẩm đóng vai trò bắt buộc. Tuy nhiên, các phương pháp kiểm định sinh học hiện hành như đếm đơn vị tạo đám hoại tử (Plaque Forming Unit - PFU) hoặc xác định liều gây nhiễm 50% nuôi cấy tế bào (Tissue Culture Infectivity Dose - TCID50) đòi hỏi thời gian kéo dài, tốn nhân lực và phụ thuộc vào tính chủ quan của người đọc.

Về bệnh cúm, các đại dịch lịch sử (1918, 1957, 1968, 1977) và các chủng virus mới tiếp tục đe dọa sức khỏe cộng đồng. Tại Việt Nam, từ tháng 12/2003, dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát qua 4 đợt tại 32 tỉnh/thành phố với trên 100 ca mắc và tỷ lệ tử vong 50%. Giai đoạn từ tháng 9/2009 đến tháng 3/2010, đại dịch cúm A/H1N1pdm09 ghi nhận 11.214 ca mắc và 58 trường hợp tử vong trên cả nước.

Để kiểm soát chất lượng xét nghiệm và định lượng acid nucleic trong kỹ thuật RT-PCR/real-time RT-PCR, việc sử dụng gam chuẩn ngoài (chứng dương đã biết nồng độ) là yêu cầu bắt buộc. Tuy nhiên, thực tế tại nhiều phòng thí nghiệm ở Việt Nam tồn tại các hạn chế:

• Tách chiết ARN từ mẫu bệnh phẩm cũ làm chứng dương: mẫu không tinh khiết, không định lượng được số bản sao, số lượng hạn chế và tiềm ẩn nguy cơ lây nhiễm sinh học cho kiểm nghiệm viên.
• Sử dụng plasmid ADN làm chứng dương cho RT-PCR: không kiểm soát được hiệu quả của bước phiên mã ngược (Reverse Transcription - RT) và 1 bản sao ADN không tương đương 1 bản sao ARN.
• Sử dụng chứng dương tính theo PFU: PFU chỉ đo lường các hạt virus có hoạt tính gây nhiễm, trong khi lượng ARN thực tế cao hơn ít nhất $10^3$ lần so với PFU, không kiểm soát được ngưỡng phát hiện ở các mẫu có tải lượng virus thấp.

Chưa có công trình trong nước công bố quy trình sản xuất hàng loạt chứng dương ARN in vitro tinh khiết, định lượng cụ thể số bản sao. Đồng thời, tại thời điểm năm 2009, chưa có nghiên cứu công bố về tỷ lệ nhiễm cúm và đồng nhiễm giữa virus cúm với 18 tác nhân virus đường hô hấp khác ở nhóm bệnh nhân viêm đường hô hấp cấp tính nặng (Severe Acute Respiratory Infection - SARI) tại Hải Dương.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định 3 mục tiêu cụ thể:

1. Sản xuất được các gam chuẩn cho RT-PCR phát hiện đồng thời ARN virus cúm A, B (đoạn gen M); cúm A/H5N1 (đoạn gen M, H5 và N1); và sởi (đoạn gen N);
2. Xác định tỷ lệ nhiễm cúm mùa và phân típ cúm gia cầm A/H5N1 (nếu có) tại Hải Dương năm 2009 bằng RT-PCR;
3. Xác định công hiệu vắc xin sởi đơn sản xuất tại Việt Nam bằng real-time RT-PCR một bước.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu:
  • Các đoạn gen đích của virus cúm mùa A, B (gen M), cúm A/H5N1 (gen M, H5, N1), cúm A/H1N1pdm09 (gen M) và virus sởi (gen N).
  • Bệnh phẩm đường hô hấp thu thập từ bệnh nhân SARI tại tỉnh Hải Dương.
  • Vắc xin sởi mẫu chuẩn M-0107 và 10 loạt vắc xin sởi đơn sống giảm độc lực thành phẩm sản xuất tại POLYVAC (chủng AIK-C).
• Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm Vi sinh Y học, hệ thống y tế tỉnh Hải Dương và các đơn vị phối hợp nghiên cứu vắc xin tại Việt Nam.
• Phạm vi thời gian: Thu thập và phân tích dữ liệu dịch tễ cúm từ năm 2009 đến 2011; đối chiếu chuỗi số liệu dịch tễ học giai đoạn 2003–2013; luận án hoàn thành năm 2014.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước đây

Luận án đã điểm cứu và hệ thống hóa các nghiên cứu trong nước và quốc tế trên ba nhóm nội dung chính:

                               CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN
Kiểm định Vắc xin & Real-time        Dịch tễ học Cúm & SARI               Chuẩn hóa Sinh học Phân tử
- Stranska và cs (2004)              - Nguyễn Thu Yến và cs (2006-2012)   - Higuchi và cs (1993)
- Nguyễn Thị Thường, Henry Agut (2006) - Thẩm Chí Dũng và cs (2009-2010)  - Tiêu chuẩn ISO 15189 (QA/QC)
- Schalk và cs (2005), Ammour (2006) - Dự án SISEA (2009-2011)           - Mạng lưới EQA NAT (WHO, NIH Thái Lan,
- Hummel và cs (2006)                - Nguyễn Hải Tuấn và cs                CRIVIB Italia, Viện Pasteur Paris)

1. Nghiên cứu về ứng dụng kỹ thuật khuếch đại phân tử trong kiểm định vi sinh:

   • Stranska và cs (2004): Ứng dụng real-time PCR định lượng ADN của virus Herpes Simplex (HSV) trong dịch nổi nuôi cấy tế bào Vero để đánh giá tính nhạy cảm với aciclovir và foscarnet. Phương pháp này vẫn phải chờ xuất hiện hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) và ADN dịch nổi không tương quan chặt chẽ với PFU.
   • Nguyễn Thị Thường, Henry Agut và cs (2006): Cải tiến kỹ thuật của Stranska bằng cách định lượng số bản sao ADN bên trong tế bào gây nhiễm sau 24 giờ nuôi cấy thay vì dịch nổi, không cần chờ CPE, xác lập tương quan chặt chẽ giữa số bản sao ADN nội bào và hiệu giá PFU. Đây là mô hình định hướng cho nghiên cứu trên virus ARN.
   • Schalk và cs (2005), Ammour và cs (2006): Xây dựng phương pháp kiểm định công hiệu thành phần sởi trong vắc xin phối hợp Sởi - Quai bị - Rubella (MMR) bằng real-time RT-PCR định lượng số bản sao ARN trong dịch nổi nuôi cấy. Hạn chế của phương pháp này là quy trình gặt ARN dịch nổi mất ít nhất 48–72 giờ, virus quai bị cạnh tranh nhân lên và gam chuẩn ngoài sản xuất còn tồn dư 7% ADN plasmid gốc.
   • Hummel và cs (2006): Nghiên cứu thẩm định mồi và đầu dò đặc hiệu cho chẩn đoán sởi, xác định đoạn nucleoprotein (gen N) vị trí nucleotide 1131–1293 có độ nhạy và độ đặc hiệu tối ưu.

2. Nghiên cứu dịch tễ học và giám sát cúm tại Việt Nam:

   • Nguyễn Thu Yến và cs (Trung tâm Cúm Quốc gia - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, 2006–2012): Giám sát trọng điểm hội chứng cúm (ILI) trên 29.804 mẫu tại 15 cơ sở y tế (tỷ lệ dương tính cúm 22%); giám sát viêm phổi nặng do virus (SVP) trên 1.034 mẫu (cúm A/H1N1pdm09 chiếm 6,1%, cúm mùa 2,8%, cúm B 2,2%, A/H5N1 2,9%, hRSV 0,1%); giám sát bệnh nhân SARI giai đoạn 2011–2012 trên 1.578 mẫu tại 5 bệnh viện.
   • Thẩm Chí Dũng và cs (2009–2010): Nghiên cứu mô tả cắt ngang tại Cẩm Sơn, Cẩm Giàng, Hải Dương trên 54 mẫu bệnh phẩm, phát hiện 69,3% dương tính (cúm A/H1N1pdm09 chiếm 53,7%, cúm B chiếm 1,9%).
   • Dự án SISEA (Hợp tác với Cơ quan Phát triển Pháp - FDA và Viện Pasteur Paris, 2009–2011 tại Bến Tre): Tỷ lệ nhiễm cúm A/H1N1pdm09 là 1,4%, cúm mùa A là 2,7% và cúm B là 1,0%.
   • Nguyễn Hải Tuấn và cs: Nghiên cứu chi phí và gánh nặng kinh tế do bệnh cúm tại cơ sở y tế tuyến huyện ở Việt Nam.

3. Hệ thống đảm bảo và kiểm soát chất lượng xét nghiệm (QA/QC):

   • Tiêu chuẩn ISO trong phòng xét nghiệm y học phân định 3 giai đoạn: Trước xét nghiệm, Xét nghiệm và Sau xét nghiệm. Giai đoạn xét nghiệm được kiểm soát bởi chương trình nội kiểm (IQC) và ngoại kiểm (EQA). Các trung tâm quốc tế cung cấp mẫu chuẩn EQA NAT bao gồm Viện Sức khỏe Quốc gia (NIH) Thái Lan, Viện Pasteur Paris, CRIVIB (Italia) và WHO.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Luận án giải quyết khoảng trống về việc tự chủ sản xuất gam chuẩn ARN in vitro có độ tinh sạch cao, loại bỏ hoàn toàn ADN khuôn mẫu gốc, định lượng chính xác số bản sao; ứng dụng chứng dương chuẩn hóa này để xác định tỷ lệ nhiễm cúm và đồng nhiễm 18 tác nhân virus đường hô hấp ở bệnh nhân SARI tại Hải Dương năm 2009; đồng thời tối ưu hóa kỹ thuật real-time RT-PCR một bước định lượng ARN nội bào sau 24 giờ để kiểm định công hiệu vắc xin sởi đơn AIK-C sản xuất tại Việt Nam.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Đặc điểm sinh học phân tử virus cúm: Thuộc họ Orthomyxoviridae, hạt virus hình cầu kích thước 80–120 nm (gồm 70–75% protein, 20% lipid, 1% ARN). Genome gồm 8 phân đoạn ARN sợi đơn phân cực âm mã hóa cho các protein cấu trúc và phi cấu trúc (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M1/M2, NS1/NEP). Cơ chế nhân lên tại nhân tế bào: phức hợp PB2 gắn cấu trúc mũ $m^7\text{GpppXm}$, PA endonuclease cắt ARN thông tin mồi, PB1 xúc tác kéo dài chuỗi và kết thúc bằng tín hiệu poly A. Cơ chế biến đổi kháng nguyên gồm "shift" (tái tổ hợp đoạn gen tạo phân típ mới gây đại dịch) và "drift" (đột biến điểm tích lũy trên HA và NA). Thuốc ức chế neuraminidase gồm oseltamivir (kháng thuốc do đột biến His274Tyr) và zanamivir (kháng thuốc do đột biến Gln136Lys/Q136K).
• Đặc điểm sinh học phân tử virus sởi: Thuộc họ Paramyxoviridae, chi Morbillivirus, hạt virus hình cầu kích thước 100–300 nm. Genome là ARN sợi đơn phân cực âm, không phân đoạn, dài khoảng 16.000 nucleotide với trật tự gen 3'-N-P/C/V-M-F-H-L-5'. Quá trình phiên mã tạo gradient giảm dần từ N đến L, khiến protein N và ARN gen N được biểu hiện với hàm lượng cao nhất. Thụ thể xâm nhập tế bào là CD46 và CDw150 (SLAM). Quá trình nhân lên xảy ra hoàn toàn trong bào tương.
• Khái niệm Yếu tố bảo vệ (Correlate of Protection - CoP): CoP là đáp ứng miễn dịch tương quan có ý nghĩa thống kê với mức độ bảo vệ. Gồm CoP cơ học (mCoP) và CoP không cơ học (nCoP/surrogate). Định lượng số bản sao ARN vắc xin bằng real-time RT-PCR là một nCoP thay thế cho các chỉ số PFU hoặc TCID50.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Quy trình	Vật liệu & Kỹ thuật	Mục tiêu kỹ thuật
1. Sản xuất chứng dương ARN in vitro	- Phương pháp phiên mã cổ điển: Véc-tơ plasmid $pCR^{\circledR}2.1\text{-TOPO}$ và $pGEM^{\circledR}\text{-T Easy}$, tế bào cảm biến E. coli (chọn lọc theo cơ chế bù $\alpha$), enzyme cắt giới hạn tạo plasmid mạch thẳng, enzyme T7/SP6 RNA polymerase, xử lý DNase. - Phương pháp phiên mã trực tiếp: Mồi cải biên gắn promoter T7 và poly T, khuếch đại sản phẩm PCR mạch thẳng và phiên mã trực tiếp.	Tạo ARN chuỗi dương tinh khiết, không còn ADN gốc, đạt dải nồng độ $10^{11} - 10^{19}$ bản sao/20 µl; kiểm tra độ tinh sạch bằng đo mật độ quang (OD) và giải trình tự gen đối chiếu Blast NCBI.
2. Xác định tỷ lệ nhiễm cúm	- Phản ứng RT-PCR đa mồi (multiplex RT-PCR) phát hiện đồng thời cúm A, cúm B, hRSV, hMPV. - Phản ứng PCR bán tổ (semi-nested PCR) khẳng định cúm mùa A và B. - RT-PCR đặc hiệu xác định phân típ cúm A/H1N1pdm09 và cúm gia cầm A/H5N1 (đoạn gen M, H5, N1). - Quy trình dự án SISEA sàng lọc 18 tác nhân virus hô hấp.	Xác định tỷ lệ dương tính cúm, phân típ virus, tỷ lệ tử vong và tỷ lệ đồng nhiễm virus ở bệnh nhân SARI tại Hải Dương (2009–2011).
3. Kiểm định công hiệu vắc xin sởi	- Nuôi cấy tế bào gây nhiễm (CEF/Vero) với vắc xin mẫu chuẩn M-0107 và 10 loạt vắc xin sởi POLYVAC (chủng AIK-C). - Tách chiết ARN nội bào tại các thời điểm 24h, 48h, 72h (so sánh 3 phương pháp tách chiết, gồm TpLR). - Real-time RT-PCR một bước với cặp mồi và đầu dò huỳnh quang đặc hiệu gen N (vị trí nucleotide 1131–1293 theo Hummel). - Đánh giá độ lặp lại qua hệ số biến thiên (CV) và biểu đồ Levey-Jennings.	Định lượng hiệu giá ARN nội bào sau 24 giờ, đối chiếu tương quan tuyến tính với hiệu giá PFU truyền thống.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 tổng hợp các cơ sở lý luận và y văn chuyên ngành về virus cúm, virus sởi và kỹ thuật kiểm định sinh học phân tử:

• Hệ thống hóa phân loại học, cấu trúc hình thái học, tổ chức bộ gen, chức năng của 8 đoạn gen virus cúm A/B và cơ chế nhân lên phụ thuộc phức hợp polymerase (PB1, PB2, PA, NP).
• Phân tích chi tiết cơ chế biến đổi kháng nguyên (shift và drift), nguồn gốc các chủng cúm đại dịch từ 1918 đến 2009, đặc tính dịch tễ học lây truyền qua đường không khí, mô hình lây lan từ trường học ra cộng đồng, cơ chế kháng thuốc của oseltamivir và zanamivir.
• Trình bày đặc điểm bộ gen của virus sởi (gradient phiên mã 3'-N-P/C/V-M-F-H-L-5'), thụ thể CD46 và CDw150, lịch sử phân lập và giảm độc lực các chủng vắc xin từ chủng Edmonston ban đầu (Edmonston B, Schwarz, Moraten, Zagreb, AIK-C, CAM, Leningrad-16, Shanghai-191).
• Đánh giá vai trò của hệ thống đảm bảo chất lượng (QA) và kiểm soát chất lượng (QC) theo tiêu chuẩn ISO 15189, phân tích hạn chế của các phương pháp chứng dương truyền thống và cơ sở khoa học của việc áp dụng gam chuẩn ARN in vitro trong chẩn đoán và kiểm định sinh học.

Chương 2: Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết các trang thiết bị, hóa chất, sinh phẩm và quy trình thực nghiệm:

• Vật liệu và sinh phẩm: Chủng virus chuẩn (cúm mùa A/H1N1, A/H3N2, cúm B, cúm A/H5N1, cúm A/H1N1pdm09, sởi chủng AIK-C), véc-tơ tạo dòng ($pCR^{\circledR}2.1\text{-TOPO}$ và $pGEM^{\circledR}\text{-T Easy}$), tế bào cảm biến E. coli, enzyme cắt giới hạn, enzyme phiên mã T7/SP6, bộ sinh phẩm tách chiết ARN TpLR, mồi và đầu dò đặc hiệu.
• Trình tự mồi và đầu dò: Thiết kế các cặp mồi khuếch đại đoạn gen 7 (protein M) cúm A, B, A/H1N1pdm09; đoạn gen 4 (HA), gen 6 (NA), gen 7 (M) của cúm A/H5N1; đoạn gen N (vị trí 1131–1293) của virus sởi; mồi cải biên gắn promoter T7 và đuôi poly T.
• Quy trình nghiên cứu:
  1. Quy trình sản xuất chứng dương ARN in vitro (phiên mã cổ điển từ plasmid mạch thẳng và phiên mã trực tiếp từ sản phẩm PCR).
  2. Quy trình RT-PCR đa mồi, PCR bán tổ và RT-PCR xác định phân típ cúm trên mẫu bệnh phẩm SARI.
  3. Quy trình nuôi cấy tế bào, gặt ARN nội bào tại 24h, 48h, 72h, tối ưu hóa các thông số phản ứng real-time RT-PCR một bước (nhiệt độ, nồng độ mồi/đầu dò, so sánh đĩa 24 giếng và 96 giếng), thẩm định độ lặp lại và xây dựng biểu đồ Levey-Jennings.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các số liệu và phát hiện thực nghiệm của luận án theo 3 nhóm nội dung:

1. Kết quả sản xuất các gam chuẩn ARN in vitro:

   • Khuếch đại thành công các đoạn gen đích; tạo dòng plasmid tái tổ hợp chứa gen M (cúm A, B), H5, N1 (A/H5N1) và N (sởi).
   • Kiểm tra chuyển nạp bằng PCR và giải trình tự gen khẳng định độ đồng nhất 100% với trình tự trên ngân hàng gen GenBank (NCBI).
   • Cắt plasmid thành mạch thẳng bằng enzyme giới hạn và tiến hành phiên mã in vitro; xử lý triệt để ADN khuôn mẫu bằng DNase. Sản phẩm ARN đạt độ tinh sạch cao, không còn tồn dư ADN gốc, sản lượng đạt từ $10^{11}$ đến $10^{19}$ bản sao ARN/20 µl.
   • Sản xuất thành công hỗn dịch chứng dương đa tác nhân ổn định phục vụ phản ứng RT-PCR đa mồi.

2. Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm cúm tại Hải Dương (2009–2011):

   • Xác định tỷ lệ dương tính với virus cúm ở bệnh nhân SARI bằng kỹ thuật RT-PCR sử dụng chứng dương chuẩn hóa.
   • Phân tích cơ cấu phân típ cúm: ghi nhận sự lưu hành của cúm đại dịch A/H1N1pdm09, cúm mùa A và cúm B; không phát hiện ca nhiễm cúm gia cầm A/H5N1 ở người tại địa bàn nghiên cứu trong thời gian này.
   • Phân tích dịch tễ học: tỷ lệ nhiễm cúm phân bố theo giới tính, nhóm tuổi (tập trung cao ở trẻ nhỏ và lứa tuổi học đường) và diễn biến theo các tháng trong năm.
   • Xác định tỷ lệ tử vong ở bệnh nhân SARI và tỷ lệ đồng nhiễm giữa virus cúm với 18 tác nhân virus đường hô hấp khác (như hRSV, hMPV, Adenovirus, Rhinovirus, Coronavirus...).

3. Kết quả xây dựng phương pháp kiểm định công hiệu vắc xin sởi bằng real-time RT-PCR:

   • Thiết lập đường chuẩn tuyến tính giữa giá trị chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold - Ct) và nồng độ ARN gam chuẩn với hệ số tương quan $R^2$ cao.
   • Xác định hiệu giá ARN vắc xin mẫu chuẩn M-0107 tại các mốc thời gian 24h, 48h và 72h sau nhiễm tế bào; chứng minh hiệu giá ARN nội bào tại thời điểm 24 giờ phản ánh chính xác sự nhân lên của virus và có tương quan tuyến tính thuận, chặt chẽ với hiệu giá PFU.
   • Đánh giá độ bền vững của ARN tách chiết bằng hệ thống TpLR ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian thực tế.
   • Kiểm định công hiệu ARN trên 10 loạt vắc xin sởi đơn thành phẩm sản xuất tại POLYVAC; kết quả thử nghiệm trên đĩa 24 giếng và 96 giếng cho thấy độ tương đồng cao.
   • Thẩm định phương pháp: Độ lặp lại trong cùng một lần làm phản ứng và độ lặp lại trung gian giữa 2 ngày thử nghiệm đạt yêu cầu kiểm nghiệm với hệ số biến thiên (CV) thấp; biểu đồ Levey-Jennings chứng minh tính ổn định của hệ thống xét nghiệm.

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 tập trung phân tích, so sánh các kết quả đạt được với y văn và các nghiên cứu tiền nhiệm:

• Ưu điểm của quy trình sản xuất chứng dương: Việc sản xuất ARN in vitro khắc phục triệt để các nhược điểm của việc dùng mẫu bệnh phẩm tự nhiên (không ổn định, nguy cơ lây nhiễm) và dùng plasmid ADN (không kiểm soát được bước RT). Phương pháp phiên mã trực tiếp bằng mồi cải biên giúp rút ngắn thời gian, không cần qua bước tạo dòng plasmid phức tạp.
• Ý nghĩa của dữ liệu dịch tễ cúm SARI: Dữ liệu tại Hải Dương giai đoạn 2009–2011 bổ sung bức tranh dịch tễ học cúm tại Việt Nam bên cạnh các hệ thống giám sát ILI và SVP của Trung tâm Cúm Quốc gia, đặc biệt là việc sàng lọc toàn diện tình trạng đồng nhiễm 18 tác nhân virus đường hô hấp.
• Tính ưu việt của phương pháp kiểm định vắc xin sởi 24 giờ: Rút ngắn thời gian kiểm định từ hàng tuần (đối với PFU/TCID50) hoặc 2–3 ngày (đối với phương pháp của Schalk/Ammour) xuống còn 24 giờ nhờ kỹ thuật định lượng ARN nội bào; loại bỏ được ảnh hưởng của 7% ADN plasmid tồn dư và sự cạnh tranh virus trong vắc xin phối hợp.
• Bàn luận về hạn chế: Phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền của ARN in vitro khi bảo quản, yêu cầu kiểm soát tạp nhiễm ADN khuôn mẫu và giới hạn phạm vi nghiên cứu dịch tễ tại một tỉnh.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt lý luận và khoa học

• Hoàn thiện cơ sở lý luận về việc sử dụng nCoP (chỉ số thay thế không cơ học) trong kiểm định vắc xin: Chứng minh số lượng bản sao ARN nội bào của virus sởi tại thời điểm 24 giờ sau nuôi cấy có mối tương quan tuyến tính chặt chẽ với hiệu giá sinh học PFU, cho phép thay thế các phương pháp sinh học cổ điển tốn thời gian.
• Xây dựng thành công cơ sở khoa học cho quy trình công nghệ 2 bước và 1 bước sản xuất gam chuẩn ARN in vitro (phiên mã cổ điển qua plasmid và phiên mã trực tiếp qua mồi cải biên), loại bỏ hoàn toàn ADN khuôn mẫu gốc để kiểm soát chất lượng kỹ thuật RT-PCR.

Đóng góp về mặt thực tiễn và ứng dụng

• Sản xuất thành công bộ gam chuẩn ARN in vitro chuẩn hóa (đoạn gen M cúm A, B; gen M, H5, N1 cúm A/H5N1; gen M cúm A/H1N1pdm09; gen N virus sởi) đạt nồng độ cao ($10^{11} - 10^{19}$ bản sao/20 µl), phục vụ công tác nội kiểm (IQC) và ngoại kiểm (EQA) theo tiêu chuẩn ISO 15189 tại các phòng xét nghiệm y học.
• Cung cấp bộ dữ liệu dịch tễ học chuẩn xác về tỷ lệ nhiễm cúm mùa, cúm A/H1N1pdm09, tỷ lệ tử vong và mô hình đồng nhiễm với 18 loại virus đường hô hấp ở bệnh nhân SARI tại Hải Dương giai đoạn 2009–2011.
• Xây dựng và thẩm định hoàn chỉnh quy trình real-time RT-PCR một bước xác định công hiệu vắc xin sởi đơn chủng AIK-C sản xuất tại POLYVAC trong vòng 24 giờ, giúp đơn giản hóa quy trình, tăng tính khách quan, tự động hóa và rút ngắn chu kỳ kiểm định chất lượng xuất xưởng của vắc xin.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Ứng dụng rộng rãi quy trình sản xuất chứng dương ARN in vitro để cung cấp mẫu chuẩn cho mạng lưới phòng xét nghiệm sinh học phân tử trên toàn quốc.
• Đưa phương pháp real-time RT-PCR một bước xác định công hiệu ARN nội bào sau 24 giờ vào quy trình kiểm định thường quy tại cơ sở sản xuất vắc xin (POLYVAC) và Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế.
• Duy trì và mở rộng hệ thống giám sát phân tử các tác nhân virus hô hấp ở bệnh nhân SARI tại các cơ sở điều trị.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Trong sản xuất chứng dương ARN in vitro: Quy trình phiên mã in vitro đòi hỏi kiểm soát kỹ thuật nghiêm ngặt bằng enzyme DNase để loại bỏ hoàn toàn ADN khuôn mẫu; ARN in vitro có tính kém bền vững hơn ADN nên đòi hỏi điều kiện bảo quản nhiệt độ âm sâu nghiêm ngặt.
• Trong xác định tỷ lệ nhiễm cúm: Đối tượng nghiên cứu mới chỉ tập trung vào nhóm bệnh nhân SARI tại một địa bàn (Hải Dương) trong giai đoạn 2009–2011, chưa bao phủ toàn diện các thể lâm sàng nhẹ hơn (như ILI diện rộng tại cộng đồng) trong cùng khoảng thời gian.
• Trong kiểm định vắc xin sởi: Nghiên cứu mới hoàn thiện và thẩm định trên vắc xin sởi đơn sống giảm độc lực chủng AIK-C, chưa tiến hành thử nghiệm mở rộng trên các loại vắc xin phối hợp sởi - quai bị - rubella (MMR/MR) thương mại khác tại Việt Nam.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Nghiên cứu các giải pháp nâng cao tính ổn định và thời gian bảo quản của gam chuẩn ARN in vitro ở nhiệt độ phòng hoặc $4^\circ\text{C}$.
• Mở rộng ứng dụng phương pháp real-time RT-PCR một bước định lượng ARN nội bào 24 giờ sang kiểm định công hiệu các vắc xin virus ARN sống giảm độc lực khác (như quai bị, rubella, bại liệt, rotavirus).
• Thiết lập chương trình ngoại kiểm sinh học phân tử (EQA NAT) liên phòng thí nghiệm sử dụng các panel mẫu chuẩn ARN in vitro tự sản xuất trong nước.

---

Giá trị tham khảo

Đối tượng thụ hưởng

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học, bác sĩ nội trú và giảng viên: Chuyên ngành Vi sinh Y học, Sinh học phân tử, Truyền nhiễm, Y tế công cộng và Dược học.
• Cán bộ kiểm nghiệm và nghiên cứu phát triển (R&D): Tại các trung tâm, viện nghiên cứu và nhà máy sản xuất vắc xin (như POLYVAC, IVAC, VABIOTECH) và Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế.
• Chuyên viên quản lý chất lượng phòng xét nghiệm: Cán bộ phụ trách hệ thống QA/QC, chuẩn hóa phòng xét nghiệm theo tiêu chuẩn ISO 15189 tại các bệnh viện và viện sốt rét - ký sinh trùng - côn trùng, viện vệ sinh dịch tễ.

Các phần nội dung có giá trị tham khảo cao

• Quy trình thiết kế mồi cải biên gắn promoter T7 và poly T phục vụ kỹ thuật phiên mã in vitro trực tiếp không qua tạo dòng plasmid.
• Bảng trình tự mồi, đầu dò huỳnh quang và chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR đa mồi, PCR bán tổ phát hiện các virus đường hô hấp và phản ứng real-time RT-PCR một bước khuếch đại gen N virus sởi.
• Quy trình nuôi cấy, xử lý mẫu và gặt ARN nội bào 24 giờ cùng phương pháp phân tích thống kê thẩm định độ lặp lại, hệ số biến thiên (CV) và biểu đồ Levey-Jennings trong kiểm định chất lượng sinh phẩm.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao việc sử dụng ARN tách chiết từ bệnh phẩm hoặc plasmid ADN làm chứng dương trong RT-PCR lại không đạt yêu cầu chuẩn hóa?

ARN tách chiết từ bệnh phẩm cũ không đảm bảo độ tinh sạch, không xác định được chính xác số lượng bản sao, nồng độ không đồng nhất giữa các lần tách chiết, số lượng mẫu hạn chế và tiềm ẩn nguy cơ phơi nhiễm tác nhân gây bệnh cho kiểm nghiệm viên. Trong khi đó, việc sử dụng plasmid ADN làm chứng dương không thể kiểm soát và đánh giá được hiệu quả của bước phiên mã ngược (RT từ ARN thành cDNA), đồng thời một bản sao ADN không tương ứng trực tiếp với một bản sao ARN trong động học phản ứng.

2. Phương pháp phiên mã in vitro trực tiếp có cải tiến kỹ thuật gì so với phương pháp phiên mã cổ điển?

Phương pháp phiên mã trực tiếp sử dụng các cặp mồi đặc hiệu được cải biên bằng cách gắn thêm trình tự khởi động phiên mã (promoter) của T7 RNA polymerase và một đoạn poly T trực tiếp vào sản phẩm PCR. Kỹ thuật này cho phép tiến hành phiên mã in vitro tạo ARN chuỗi dương ngay từ sản phẩm PCR mạch thẳng mà không cần qua các bước tạo dòng (cloning) vào véc-tơ plasmid, chuyển nạp vào vi khuẩn E. coli, nuôi cấy chọn lọc và cắt mở vòng plasmid bằng enzyme giới hạn, giúp tiết kiệm thời gian và hạn chế nguy cơ lẫn ADN plasmid gốc.

3. Kỹ thuật xác định công hiệu vắc xin sởi bằng real-time RT-PCR trong luận án khắc phục được những hạn chế nào của các nghiên cứu trước đây?

Phương pháp của tác giả định lượng số bản sao ARN tích lũy bên trong tế bào nuôi cấy ở thời điểm 24 giờ sau nhiễm, thay vì gặt ARN trong dịch nổi tế bào (vốn đòi hỏi thời gian nuôi cấy kéo dài ít nhất 48–72 giờ như nghiên cứu của Schalk và Ammour). Đồng thời, phương pháp loại bỏ được ảnh hưởng của 7% ADN plasmid gốc tồn dư trong gam chuẩn ngoài và tránh được hiện tượng cạnh tranh nhân lên giữa các thành phần virus khi áp dụng trên vắc xin sởi đơn chủng AIK-C sản xuất tại Việt Nam.

4. Bệnh nhân viêm đường hô hấp cấp tính nặng (SARI) tại Hải Dương giai đoạn 2009–2011 có đặc điểm nhiễm cúm và đồng nhiễm virus như thế nào?

Nghiên cứu bằng kỹ thuật RT-PCR sử dụng chứng dương chuẩn hóa đã xác định được tỷ lệ dương tính với virus cúm ở bệnh nhân SARI tại Hải Dương, ghi nhận sự lưu hành của chủng cúm đại dịch A/H1N1pdm09, cúm mùa A và cúm B (không phát hiện ca cúm gia cầm A/H5N1). Nghiên cứu cũng làm rõ tỷ lệ tử vong liên quan đến cúm ở bệnh nhân SARI, cơ cấu phân bố theo nhóm tuổi/giới tính và xác định tỷ lệ đồng nhiễm giữa virus cúm với 18 tác nhân virus đường hô hấp khác theo quy trình giám sát SISEA.

5. Chủng virus sởi nào được sử dụng để sản xuất vắc xin sởi đơn tại Việt Nam và mẫu chuẩn có hiệu giá bao nhiêu?

Vắc xin sởi đơn sống giảm độc lực tại Việt Nam được sản xuất bởi Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (POLYVAC) dựa trên công nghệ chuyển giao từ Viện Kitasato (Nhật Bản), sử dụng chủng virus sởi AIK-C thích nghi trên nguyên bào sợi phôi gà (CEF). Vắc xin mẫu chuẩn M-0107 có hiệu giá ổn định đạt 4,2–4,7 $\log_{10}$/liều 0,5 ml theo tiêu chuẩn quy định của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO).

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Thường đã nghiên cứu thành công quy trình sản xuất các gam chuẩn ARN in vitro có độ tinh sạch cao, định lượng chính xác số bản sao cho các phân típ virus cúm (cúm mùa A, B, A/H5N1, A/H1N1pdm09) và virus sởi. Kết quả nghiên cứu đã ứng dụng hiệu quả bộ chứng dương chuẩn hóa vào việc chẩn đoán, xác định tỷ lệ nhiễm cúm, phân típ và tình trạng đồng nhiễm các tác nhân virus hô hấp ở bệnh nhân SARI tại Hải Dương giai đoạn 2009–2011. Đồng thời, công trình đã xây dựng, tối ưu hóa và thẩm định hoàn chỉnh phương pháp real-time RT-PCR một bước định lượng ARN nội bào sau 24 giờ để kiểm định công hiệu vắc xin sởi đơn chủng AIK-C sản xuất tại Việt Nam, mang lại một quy trình kiểm nghiệm có độ lặp lại cao, khách quan và rút ngắn đáng kể thời gian so với các phương pháp sinh học truyền thống.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN Sởi và cúm là hai bệnh do virus gây ra, được đề cập trong Y văn từ trước Công nguyên, qua thời kỳ Trung cổ, các cuộc chiến tranh và cho đến ngày nay. Những nghiên cứu về mọi khía cạnh của cúm và sởi thực sự lớn, khi vào trang mạng http://www. (xem tháng 2 năm 2014), chỉ mất 0,25 giây là có tới 45.000 kết quả liên quan đến cúm và con số tương ứng cho sởi là 0,32 giây với 9. Tổng quan một số vấn đề về cúm Cúm là một bệnh nhiễm virus đường hô hấp cấp tính, thường để lại dấu ấn dịch qua từng thế kỷ [1].

Hàng năm, thế giới có 3-5 triệu người mắc cúm nặng với 250.000 trường hợp tử vong. Giữa các đại dịch, virus cúm A và B vẫn gây dịch hàng năm [39],[40]. Đôi khi, người ta phát hiện được các trường hợp cúm C ở người [41]. Cúm gia cầm A/H5N1 ở động vật vẫn chưa được kiểm soát trên phạm vi toàn cầu, lây truyền từ động vật sang người và gây tử vong [15],[16],[42],[43].

Phép gọi tên Các virus cúm thuộc trên họ Mononegavirale, họ Orthomyxoviridae, được phân thành các típ (sau năm 2002 đổi thành chi) A, B, và C dựa vào quyết định kháng nguyên nucleoprotein (NP). Họ Orthomyxoviridae còn có các chi Isavirus, Quaranjavirus, và Thogotovirus [1],[2],[38]. Virus cúm A gồm các phân típ dựa vào sự thay đổi hoàn toàn quyết định kháng nguyên haemagglutinin (HA) của thử nghiệm ức chế ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin Inhibition - HI), virus cúm B chỉ có duy nhất một phân típ [1],[2],[38]. Hình thái, cấu trúc Hạt virus cúm A và cúm B đa hình thái, những phân lập mới thường có dạng hình sợi nhưng lại có dạng hình cầu khi được cấy chuyển trên nuôi cấy tế bào hoặc trứng gà ấp dở.

Virus hình cầu có kích thước 80-120nm gồm 70- 75% protein, 20% lipid, và 1% ARN [1],[2],[38]. Cấu trúc hạt virus cúm. Munier - Viện Pasteur Paris, Cộng hòa Pháp [44]. Thành phần cấu trúc từ trong ra ngoài của hạt virus gồm bộ máy di truyền (genome), capsid và vỏ ngoài (envelop).

Genome virus cúm A và cúm B chứa vật liệu di truyền là một sợi ARN phân cực âm, có phân đoạn (Hình 1.1) với tên gọi hoặc là theo đoạn ARN, hoặc dựa vào chức năng tạo nên cấu trúc hạt virus. Đoạn 1 đến 8 tương ứng mã hóa các protein PB2, PB1/N40/PB1F2, PA/PA-X, HA, NP, NA, M1/M2/M42, NS1/NEP [1],[2],[38],[44],[45]. Đề tài nghiên cứu này khuếch đại các khu vực ổn định 5 của các đoạn gen 7 mã hóa protein M virus cúm mùa A (H3N2 và H1N1), virus cúm B, và các đoạn gen 7, 6, 4 mã hóa tương ứng protein M, HA và NA của virus cúm gia cầm A/H5N1 và đoạn gen 7 của virus cúm đại dịch A/H1N1pdm09. Kháng nguyên và tính đa dạng chủng Thích ứng Tổ hợp Tổ hợp trực tiếp lại lại Hình 1.

Nguồn gốc các chủng cúm đại dịch 1918-1977. Viện Pasteur Paris, Cộng hòa Pháp [44]. Chuyển đổi kháng nguyên đột ngột (shift) là thay đổi cấu trúc kháng nguyên bề mặt, chủ yếu là HA, do tổ hợp lại vật liệu di truyền của các phân típ khác nhau và thường gây hiện tượng thay thế một loại HA mới, nhìn chung không chịu tác dụng của miễn dịch tồn tại trước đó và đây chính là nguyên nhân của các vụ đại dịch cúm trong thế kỷ XX và XXI [1],[2],[11- 13],[38],[46]. Đây là điểm đáng lưu ý trong chẩn đoán cúm và xác định phân típ cúm A bằng RT-PCR vì khi một đoạn gen bị thay thế thì có thể phải thiết 6 kế lại cặp mồi và đầu dò (real-time) đặc hiệu, đồng thời phải sản xuất lại chứng dương ARN.

Nguồn gốc các đại dịch cúm có thể hoặc là do hiện tượng tổ hợp lại các đoạn gen, hoặc là do thích ứng trực tiếp từ loài khác [1],[13],[38],[46]. Chi tiết, cúm đại dịch A/H1N1 năm 1918 có thể do thích ứng trực tiếp từ A/H1N1 thủy cầm hoặc do tổ hợp từ một nguồn khác không rõ (không có số liệu di truyền trước 1918), sau đó đại dịch cúm năm 1957 là do tổ hợp của 5 đoạn gen chủng A/H1N1 năm 1918 và 3 đoạn gen HA, NA, PB1 của chủng A/H2N2 thủy cầm để tạo thành virus A/H2N2 đại dịch 1957. Đại dịch cúm 1968 là do tổ hợp của 6 đoạn gen chủng 1957 và 2 đoạn gen HA và PB1 của A/H3Nx thủy cầm để hình thành chủng A/H3N2 đại dịch 1968 Hong Kong và chủng này hiện lưu hành như một chủng cúm mùa đến tận ngày nay. Chủng cúm mùa A/H1N1 hiện tại là do chủng đại dịch 1977 tiếp tục lưu hành (Hình 1.

Biến đổi kháng nguyên từ từ (drift) là những thay đổi nhỏ và liên tục các acid amin hoặc đột biến điểm tại các khu vực kháng nguyên protein vỏ HA và NA do lỗi của ARN polymerase hoặc do hiện tượng áp lực chọn lọc miễn dịch của kháng thể. Những chủng này không chuyển đổi hoàn toàn kháng nguyên do vậy vẫn chịu một phần miễn dịch từ những lần nhiễm cúm trước và chủng mới nổi trội hơn chủng cũ [1],[38]. Đây cũng là một điểm quan trọng cần lưu ý trong thiết kế mồi. Mặc dù không có hiện tượng thay thế một đoạn gen hoàn toàn mới nhưng nhiều đột biến điểm có thể làm thiết kế mồi thông thường không phát hiện được hết các chủng, chính vì vậy nhiều tác giả đã áp dụng phương pháp thiết kế thoái hóa mồi để tăng độ nhạy phát hiện của cặp mồi và đầu dò.

Điều này đặc biệt quan trọng trong chẩn đoán cúm gia cầm A/H5N1 ở người [47]. Sự nhân lên của virus cúm Các hệ thống tế bào phân lập virus cúm là tế bào thận khỉ tiên phát và tế bào thường trực thận chó (Madin-Darby Canine Kidney - MDCK). Phân lập virus cúm trên nuôi cấy tế bào có thể có hoặc không tạo hủy hoại tế bào (Cytopathic Effects - CPE) [2],[19]. Virus được hấp phụ trên bề mặt tế bào vật chủ qua thụ thể tế bào là acid sialic (SA) và xâm nhập vào tế bào qua con đường endocytosis.

Acid sialic gắn với galactose qua cầu nối α2,3 hoặc α2,6. Đây chính là yếu tố quyết định độc lực của một số chủng virus và bệnh cảnh lâm sàng vì ở đường hô hấp trên thì α2,6 nhiều hơn hẳn α2,3 và ngược lại với đường hô hấp dưới [1],[44],[45]. Sau hấp phụ, nhờ pH thấp của khoang nội bào mà HA tạo ra hiện tượng tiền thay đổi phù hợp về hình thái để peptide hòa màng tiến gần tới màng của nội bào, chèn peptide hòa màng vào màng của nội bào. Sau đó, hiện tượng bán hòa màng xảy ra, màng của virus và màng của tế bào vật chủ được kéo lại gần nhau rồi hình thành nên một lỗ hòa màng, tiếp đó xuất hiện những thay đổi phù hợp để bộc lộ peptide hòa màng làm cho kênh ion M2 bơm các proton để giải phóng phức hợp ribonucleoprotein (RNP) của virus và màng virus hòa với màng của khoang nội bào.

ARN được vận chuyển vào nhân tế bào qua lỗ màng nhân nhờ RNP gắn với α và β karyopherin [1],[44],[45],[48]. Tại nhân tế bào, ARN virus đóng vai trò làm khuôn mẫu tổng hợp ARN bổ trợ chuỗi dương, sau đó đến lượt ARN chuỗi dương này làm khuôn mẫu để tổng hợp trở lại ARN virus chuỗi âm và ARN thông tin. Cụ thể, phức hợp RNP gắn với 3 polymerase có vai trò thiết yếu trong quá trình nhân lên của virus cúm. PA có khu vực endonuclease và vị trí gắn với PB1, PB1 có vị trí gắn với PA và vị trí gắn với PB2, PB2 có vị trí gắn với PB1 và vị trí gắn với cấu trúc “đội mũ” của tiền ARN thông tin (Hình 1.

8 ARN virus cúm có cấu trúc “đội mũ” m7GpppXm(N10-13) và nó được PB2 sử dụng như đoạn mồi để khởi đầu quá trình phiên mã và sau đó PA của virus sẽ cắt cấu trúc mũ của ARN thông tin. Quá trình tổng hợp chuỗi bổ trợ được xúc tác nhờ enzyme PB1, chính là ARN polymerase phụ thuộc ARN dựa trên khuôn mẫu là ARN virus. Sau cùng, quá trình tổng hợp chuỗi kết thúc khi xuất hiện tín hiệu poly A từ cấu trúc khuôn mẫu poly U (Hình 1. Cơ chế phiên mã của virus cúm A.

Munier, Viện Pasteur Paris, Cộng hòa Pháp [44]. PB2 gắn với cấu trúc mũ b. PA endonuclease cắt ARN thông tin c. PB1 sử dụng ARN virus làm khuôn mẫu kéo dài chuỗi d.

Tổng hợp poly A Quá trình dịch mã xảy ra tại bào tương, các protein M1, 3 polymerase, và NP được vận chuyển vào nhân tế bào. Tại nhân, sau khi phức hợp RNP được hình thành thì các protein NEP/NS2 gắn vào phức hợp này rồi từ nhân ra bào tương qua lỗ màng nhân. Ở bào tương, chúng theo khung tế bào để đến 9 bộ Golgi rồi đi từ khu vực Cis sang Trans của bộ Golgi để tới màng tế bào và lắp ráp thành hạt virus hoàn chỉnh với HA, NA, M2 - là những protein đã trưởng thành ở lưới nội bào có hạt. Quá trình lắp ráp thiên về giả thiết cơ chế lắp ráp lựa chọn hơn là ngẫu nhiên.

Hạt virus được giải phóng khỏi tế bào gây nhiễm theo cơ chế nảy chồi. Hiện tượng cắt mối liên kết giữa SA và galactose nhờ hoạt tính salidase tạo nên chức năng neuramidase. Điều này cho phép giải phóng hạt virus gây bệnh khỏi tế bào vật chủ nhiễm, làm cho các phần tử virus mới được tổng hợp không ngưng kết với nhau, và cho phép virus đi xuyên qua lớp màng nhày của đường hô hấp. Sau khi hạt virus mới được tổng hợp và giải phóng khỏi tế bào thì có hiện tượng cắt HA0 thành HA1 và HA2 nhờ protease ngoại bào nằm ở đường hô hấp.

Đây cũng chính là một trong số các yếu tố quyết định độc lực của cúm ở một số loài (không có độc lực cao nếu tổ chức không có nhiều protease tại chỗ). Dịch tễ học Virus cúm truyền bệnh từ người sang người qua đường không khí, điều này giải thích hình thái xuất hiện bệnh đột ngột và mức độ lan truyền dịch nhanh trong cộng đồng. Trong cùng vụ dịch, tỷ lệ tấn công trẻ em cao hơn người lớn. Ở giai đoạn trung bình, khoảng 25% dân số bị nhiễm và trong số này, một phần ba phải đi điều trị, tỷ lệ nhập viện cao hơn hẳn ở nhóm tuổi nhỏ và người có tuổi.

Các vụ dịch cúm đều tuân theo một hình thái tương tự nhau, nhiễm virus và mắc cúm thường bắt đầu xảy ra từ trẻ em trường học dẫn đến hiện tượng học sinh nghỉ học, số bệnh nhân phải đi khám bác sỹ và nhập viện vì các bệnh phổi tăng. Vào giai đoạn cuối của dịch, thường người lớn phải nghỉ làm, số người đi khám và tử vong vì bệnh phổi tăng lên.