Nghiên cứu sản xuất gam chuẩn cho RT-PCR ứng dụng trong chẩn đoán cúm và kiểm định vắc xin sởi

Tài liệu nghiên cứu Luận án nghiên cứu sản xuất các gam chuẩn cho rt pcr ứng dụng trong chẩn đoán cúm và kiểm định công, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên

• Tác giả: Nguyễn Thị Thường
• Người hướng dẫn: GS. Huỳnh Phương Liên
• Trường học: Trường Đại học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh Y học
• Đề tài: Nghiên cứu sản xuất gam chuẩn cho RT-PCR trong chẩn đoán cúm và kiểm định vắc xin sởi
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan một số vấn đề về cúm
• 1.2. Phép gọi tên
• 1.3. Hình thái, cấu trúc
• 1.4. Kháng nguyên và tính đa dạng chủng
• 1.5. Sự nhân lên của virus cúm
• 1.6. Dịch tễ học
• 1.7. Chẩn đoán phòng thí nghiệm
• 1.8. Tình hình nghiên cứu về cúm và tỷ lệ nhiễm cúm
• 1.9. Tổng quan một số vấn đề về sởi
• 1.10. Phép gọi tên
• 1.11. Hình thái, cấu trúc
• 1.12. Sự nhân lên của virus
• 1.13. Các triển vọng thanh toán sởi
• 1.14. Các nghiên cứu liên quan đến sởi
• 1.15. Sản xuất chứng dương ARN in vitro và kiểm định công hiệu vắc xin
• 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu. Cơ sở vật chất và trang thiết bị, máy móc. Sinh phẩm hóa chất
• 2.3. Mồi và đầu dò
• 2.4. Phần mềm phân tích và nguồn thông tin
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6. Sản xuất chứng dương ARN in vitro
• 2.7. Xác định tỷ lệ nhiễm cúm
• 2.8. Xây dựng phương pháp kiểm định vắc xin sởi
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Sản xuất chứng dương ARN
• 3.2. Tạo khuôn mẫu cho phương pháp phiên mã cổ điển
• 3.3. Tạo khuôn mẫu cho phương pháp phiên mã trực tiếp
• 3.4. Xác định tỷ lệ nhiễm cúm bằng RT-PCR
• 3.5. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu
• 3.6. Đặc điểm trường hợp tử vong do cúm
• 3.7. Ứng dụng chứng dương trong xác định tỷ lệ nhiễm cúm
• 3.8. Tỷ lệ đồng nhiễm cúm và các virus khác
• 3.9. Phân bố nhiễm cúm theo giới tính, nhóm tuổi và thời gian
• 3.10. Kiểm định công hiệu vắc xin sởi
• 3.11. Công hiệu vắc xin mẫu chuẩn bằng tạo đám hoại tử
• 3.12. Công hiệu vắc xin mẫu chuẩn bằng real-time RT-PCR
• 3.13. Sự ổn định của ARN tách chiết bằng TpLR
• 3.14. Công hiệu vắc xin sởi thành phẩm
• 3.15. Độ lặp lại của phản ứng
• 3.16. Kết quả sản xuất các gam chuẩn
• 3.17. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp và chuyển nạp. Kiểm tra chuyển nạp
• 3.18. Tạo mạch thẳng ADN plasmid bằng cắt enzyme giới hạn
• 3.19. Kết quả phiên mã in vitro
• 3.20. Tỷ lệ nhiễm cúm tại Hải Dương năm 2009-2011
• 3.21. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu
• 3.22. Tỷ lệ tử vong và nhiễm cúm của bệnh nhân SARI
• 3.23. Phân bố nhiễm cúm theo giới tính, nhóm tuổi và thời gian
• 3.24. Bước đầu xây dựng phương pháp xác định hiệu giá vắc xin sởi đơn bằng real-time RT-PCR
• 3.25. Thử nghiệm tối ưu hóa các điều kiện phản ứng
• 3.26. Công hiệu vắc xin sởi thành phẩm
• 3.27. Thẩm định phương pháp
• 3.28. Bàn luận về các ưu điểm của đề tài
• 3.29. Chất lượng của sinh phẩm
• 3.30. Trang thiết bị máy móc
• 3.31. Quy trình thực hiện thử nghiệm
• 3.32. Phân tích kết quả và sự phù hợp với mục tiêu nghiên cứu
• 3.33. Chứng của phòng thí nghiệm và chứng quốc tế
• 3.34. Hoạt động độc lập
• 3.35. Bàn luận về những hạn chế của đề tài
• 3.36. Hạn chế trong sản xuất chứng dương ARN in vitro
• 3.37. Hạn chế trong xác định tỷ lệ nhiễm cúm
• 3.38. Hạn chế trong nghiên cứu xác định công hiệu vắc xin sởi
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu

Nghiên cứu sản xuất gam chuẩn cho RT-PCR trong chẩn đoán cúm và kiểm định vắc xin sởi là một công trình quan trọng nhằm nâng cao hiệu quả chẩn đoán và kiểm định vắc xin. RT-PCR là phương pháp chính trong việc phát hiện virus cúm và sởi, giúp xác định nhanh chóng và chính xác tình trạng nhiễm bệnh. Việc sản xuất gam chuẩn cho RT-PCR không chỉ giúp cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm mà còn đảm bảo tính chính xác trong việc định lượng ARN virus. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), cúm và sởi là hai bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, gây ra nhiều ca tử vong hàng năm. Do đó, việc phát triển các phương pháp chẩn đoán hiệu quả là rất cần thiết.

1.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu

Nghiên cứu này không chỉ góp phần vào việc nâng cao chất lượng chẩn đoán mà còn hỗ trợ trong việc kiểm định công hiệu của vắc xin sởi. Việc sử dụng gam chuẩn trong RT-PCR giúp giảm thiểu sai sót trong quá trình xét nghiệm, từ đó nâng cao độ tin cậy của kết quả. Hơn nữa, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng việc sản xuất gam chuẩn có thể khắc phục những hạn chế của việc sử dụng mẫu bệnh phẩm tách chiết, vốn thường không đảm bảo tính tinh khiết và định lượng. Điều này đặc biệt quan trọng trong bối cảnh dịch bệnh gia tăng và nhu cầu kiểm soát dịch bệnh ngày càng cao.

II. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu được áp dụng trong đề tài này bao gồm sản xuất chứng dương ARN in vitro và xác định tỷ lệ nhiễm cúm bằng RT-PCR. Việc sản xuất gam chuẩn cho RT-PCR được thực hiện thông qua các bước như tạo khuôn mẫu cho phương pháp phiên mã cổ điển và trực tiếp. Các mẫu ARN được sản xuất sẽ được sử dụng để kiểm định công hiệu của vắc xin sởi. Phương pháp này không chỉ giúp xác định tỷ lệ nhiễm cúm mà còn cho phép đánh giá hiệu quả của các loại vắc xin hiện có. Sự kết hợp giữa các phương pháp hiện đại và truyền thống trong nghiên cứu này tạo ra một nền tảng vững chắc cho việc phát triển các phương pháp chẩn đoán và kiểm định mới.

2.1. Sản xuất chứng dương ARN

Quá trình sản xuất chứng dương ARN được thực hiện bằng cách sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến. Việc tạo ra các mẫu ARN chuẩn giúp đảm bảo tính chính xác trong việc định lượng virus trong các mẫu bệnh phẩm. Các mẫu ARN này sẽ được sử dụng làm chuẩn trong các xét nghiệm RT-PCR, từ đó nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp chẩn đoán. Sự phát triển của công nghệ sinh học đã mở ra nhiều cơ hội mới trong việc sản xuất các mẫu chuẩn, giúp cải thiện chất lượng xét nghiệm và giảm thiểu rủi ro trong quá trình chẩn đoán.

III. Kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc sản xuất gam chuẩn cho RT-PCR đã đạt được những thành công nhất định. Tỷ lệ nhiễm cúm được xác định bằng RT-PCR cho thấy sự phân bố nhiễm cúm theo giới tính, nhóm tuổi và thời gian. Đặc biệt, việc kiểm định công hiệu của vắc xin sởi bằng phương pháp real-time RT-PCR đã cho thấy tính hiệu quả cao. Các mẫu vắc xin được kiểm định cho thấy sự ổn định của ARN tách chiết, điều này cho phép đánh giá chính xác công hiệu của vắc xin trong việc phòng ngừa bệnh. Kết quả này không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn có ứng dụng thực tiễn trong việc kiểm soát dịch bệnh.

3.1. Ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm y tế và các cơ sở nghiên cứu. Việc sử dụng gam chuẩn trong RT-PCR sẽ giúp nâng cao chất lượng chẩn đoán và kiểm định vắc xin, từ đó góp phần vào công tác phòng chống dịch bệnh hiệu quả hơn. Hơn nữa, nghiên cứu cũng mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán và kiểm định vắc xin, giúp đáp ứng nhanh chóng và hiệu quả với các dịch bệnh mới nổi. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong bối cảnh dịch bệnh ngày càng phức tạp và khó lường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN Sởi và cúm là hai bệnh do virus gây ra, được đề cập trong Y văn từ trước Công nguyên, qua thời kỳ Trung cổ, các cuộc chiến tranh và cho đến ngày nay. Những nghiên cứu về mọi khía cạnh của cúm và sởi thực sự lớn, khi vào trang mạng http://www. (xem tháng 2 năm 2014), chỉ mất 0,25 giây là có tới 45.000 kết quả liên quan đến cúm và con số tương ứng cho sởi là 0,32 giây với 9. Tổng quan một số vấn đề về cúm Cúm là một bệnh nhiễm virus đường hô hấp cấp tính, thường để lại dấu ấn dịch qua từng thế kỷ [1].

Hàng năm, thế giới có 3-5 triệu người mắc cúm nặng với 250.000 trường hợp tử vong. Giữa các đại dịch, virus cúm A và B vẫn gây dịch hàng năm [39],[40]. Đôi khi, người ta phát hiện được các trường hợp cúm C ở người [41]. Cúm gia cầm A/H5N1 ở động vật vẫn chưa được kiểm soát trên phạm vi toàn cầu, lây truyền từ động vật sang người và gây tử vong [15],[16],[42],[43].

Phép gọi tên Các virus cúm thuộc trên họ Mononegavirale, họ Orthomyxoviridae, được phân thành các típ (sau năm 2002 đổi thành chi) A, B, và C dựa vào quyết định kháng nguyên nucleoprotein (NP). Họ Orthomyxoviridae còn có các chi Isavirus, Quaranjavirus, và Thogotovirus [1],[2],[38]. Virus cúm A gồm các phân típ dựa vào sự thay đổi hoàn toàn quyết định kháng nguyên haemagglutinin (HA) của thử nghiệm ức chế ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin Inhibition - HI), virus cúm B chỉ có duy nhất một phân típ [1],[2],[38]. Hình thái, cấu trúc Hạt virus cúm A và cúm B đa hình thái, những phân lập mới thường có dạng hình sợi nhưng lại có dạng hình cầu khi được cấy chuyển trên nuôi cấy tế bào hoặc trứng gà ấp dở.

Virus hình cầu có kích thước 80-120nm gồm 70- 75% protein, 20% lipid, và 1% ARN [1],[2],[38]. Cấu trúc hạt virus cúm. Munier - Viện Pasteur Paris, Cộng hòa Pháp [44]. Thành phần cấu trúc từ trong ra ngoài của hạt virus gồm bộ máy di truyền (genome), capsid và vỏ ngoài (envelop).

Genome virus cúm A và cúm B chứa vật liệu di truyền là một sợi ARN phân cực âm, có phân đoạn (Hình 1.1) với tên gọi hoặc là theo đoạn ARN, hoặc dựa vào chức năng tạo nên cấu trúc hạt virus. Đoạn 1 đến 8 tương ứng mã hóa các protein PB2, PB1/N40/PB1F2, PA/PA-X, HA, NP, NA, M1/M2/M42, NS1/NEP [1],[2],[38],[44],[45]. Đề tài nghiên cứu này khuếch đại các khu vực ổn định 5 của các đoạn gen 7 mã hóa protein M virus cúm mùa A (H3N2 và H1N1), virus cúm B, và các đoạn gen 7, 6, 4 mã hóa tương ứng protein M, HA và NA của virus cúm gia cầm A/H5N1 và đoạn gen 7 của virus cúm đại dịch A/H1N1pdm09. Kháng nguyên và tính đa dạng chủng Thích ứng Tổ hợp Tổ hợp trực tiếp lại lại Hình 1.

Nguồn gốc các chủng cúm đại dịch 1918-1977. Viện Pasteur Paris, Cộng hòa Pháp [44]. Chuyển đổi kháng nguyên đột ngột (shift) là thay đổi cấu trúc kháng nguyên bề mặt, chủ yếu là HA, do tổ hợp lại vật liệu di truyền của các phân típ khác nhau và thường gây hiện tượng thay thế một loại HA mới, nhìn chung không chịu tác dụng của miễn dịch tồn tại trước đó và đây chính là nguyên nhân của các vụ đại dịch cúm trong thế kỷ XX và XXI [1],[2],[11- 13],[38],[46]. Đây là điểm đáng lưu ý trong chẩn đoán cúm và xác định phân típ cúm A bằng RT-PCR vì khi một đoạn gen bị thay thế thì có thể phải thiết 6 kế lại cặp mồi và đầu dò (real-time) đặc hiệu, đồng thời phải sản xuất lại chứng dương ARN.

Nguồn gốc các đại dịch cúm có thể hoặc là do hiện tượng tổ hợp lại các đoạn gen, hoặc là do thích ứng trực tiếp từ loài khác [1],[13],[38],[46]. Chi tiết, cúm đại dịch A/H1N1 năm 1918 có thể do thích ứng trực tiếp từ A/H1N1 thủy cầm hoặc do tổ hợp từ một nguồn khác không rõ (không có số liệu di truyền trước 1918), sau đó đại dịch cúm năm 1957 là do tổ hợp của 5 đoạn gen chủng A/H1N1 năm 1918 và 3 đoạn gen HA, NA, PB1 của chủng A/H2N2 thủy cầm để tạo thành virus A/H2N2 đại dịch 1957. Đại dịch cúm 1968 là do tổ hợp của 6 đoạn gen chủng 1957 và 2 đoạn gen HA và PB1 của A/H3Nx thủy cầm để hình thành chủng A/H3N2 đại dịch 1968 Hong Kong và chủng này hiện lưu hành như một chủng cúm mùa đến tận ngày nay. Chủng cúm mùa A/H1N1 hiện tại là do chủng đại dịch 1977 tiếp tục lưu hành (Hình 1.

Biến đổi kháng nguyên từ từ (drift) là những thay đổi nhỏ và liên tục các acid amin hoặc đột biến điểm tại các khu vực kháng nguyên protein vỏ HA và NA do lỗi của ARN polymerase hoặc do hiện tượng áp lực chọn lọc miễn dịch của kháng thể. Những chủng này không chuyển đổi hoàn toàn kháng nguyên do vậy vẫn chịu một phần miễn dịch từ những lần nhiễm cúm trước và chủng mới nổi trội hơn chủng cũ [1],[38]. Đây cũng là một điểm quan trọng cần lưu ý trong thiết kế mồi. Mặc dù không có hiện tượng thay thế một đoạn gen hoàn toàn mới nhưng nhiều đột biến điểm có thể làm thiết kế mồi thông thường không phát hiện được hết các chủng, chính vì vậy nhiều tác giả đã áp dụng phương pháp thiết kế thoái hóa mồi để tăng độ nhạy phát hiện của cặp mồi và đầu dò.

Điều này đặc biệt quan trọng trong chẩn đoán cúm gia cầm A/H5N1 ở người [47]. Sự nhân lên của virus cúm Các hệ thống tế bào phân lập virus cúm là tế bào thận khỉ tiên phát và tế bào thường trực thận chó (Madin-Darby Canine Kidney - MDCK). Phân lập virus cúm trên nuôi cấy tế bào có thể có hoặc không tạo hủy hoại tế bào (Cytopathic Effects - CPE) [2],[19]. Virus được hấp phụ trên bề mặt tế bào vật chủ qua thụ thể tế bào là acid sialic (SA) và xâm nhập vào tế bào qua con đường endocytosis.

Acid sialic gắn với galactose qua cầu nối α2,3 hoặc α2,6. Đây chính là yếu tố quyết định độc lực của một số chủng virus và bệnh cảnh lâm sàng vì ở đường hô hấp trên thì α2,6 nhiều hơn hẳn α2,3 và ngược lại với đường hô hấp dưới [1],[44],[45]. Sau hấp phụ, nhờ pH thấp của khoang nội bào mà HA tạo ra hiện tượng tiền thay đổi phù hợp về hình thái để peptide hòa màng tiến gần tới màng của nội bào, chèn peptide hòa màng vào màng của nội bào. Sau đó, hiện tượng bán hòa màng xảy ra, màng của virus và màng của tế bào vật chủ được kéo lại gần nhau rồi hình thành nên một lỗ hòa màng, tiếp đó xuất hiện những thay đổi phù hợp để bộc lộ peptide hòa màng làm cho kênh ion M2 bơm các proton để giải phóng phức hợp ribonucleoprotein (RNP) của virus và màng virus hòa với màng của khoang nội bào.

ARN được vận chuyển vào nhân tế bào qua lỗ màng nhân nhờ RNP gắn với α và β karyopherin [1],[44],[45],[48]. Tại nhân tế bào, ARN virus đóng vai trò làm khuôn mẫu tổng hợp ARN bổ trợ chuỗi dương, sau đó đến lượt ARN chuỗi dương này làm khuôn mẫu để tổng hợp trở lại ARN virus chuỗi âm và ARN thông tin. Cụ thể, phức hợp RNP gắn với 3 polymerase có vai trò thiết yếu trong quá trình nhân lên của virus cúm. PA có khu vực endonuclease và vị trí gắn với PB1, PB1 có vị trí gắn với PA và vị trí gắn với PB2, PB2 có vị trí gắn với PB1 và vị trí gắn với cấu trúc “đội mũ” của tiền ARN thông tin (Hình 1.

8 ARN virus cúm có cấu trúc “đội mũ” m7GpppXm(N10-13) và nó được PB2 sử dụng như đoạn mồi để khởi đầu quá trình phiên mã và sau đó PA của virus sẽ cắt cấu trúc mũ của ARN thông tin. Quá trình tổng hợp chuỗi bổ trợ được xúc tác nhờ enzyme PB1, chính là ARN polymerase phụ thuộc ARN dựa trên khuôn mẫu là ARN virus. Sau cùng, quá trình tổng hợp chuỗi kết thúc khi xuất hiện tín hiệu poly A từ cấu trúc khuôn mẫu poly U (Hình 1. Cơ chế phiên mã của virus cúm A.

Munier, Viện Pasteur Paris, Cộng hòa Pháp [44]. PB2 gắn với cấu trúc mũ b. PA endonuclease cắt ARN thông tin c. PB1 sử dụng ARN virus làm khuôn mẫu kéo dài chuỗi d.

Tổng hợp poly A Quá trình dịch mã xảy ra tại bào tương, các protein M1, 3 polymerase, và NP được vận chuyển vào nhân tế bào. Tại nhân, sau khi phức hợp RNP được hình thành thì các protein NEP/NS2 gắn vào phức hợp này rồi từ nhân ra bào tương qua lỗ màng nhân. Ở bào tương, chúng theo khung tế bào để đến 9 bộ Golgi rồi đi từ khu vực Cis sang Trans của bộ Golgi để tới màng tế bào và lắp ráp thành hạt virus hoàn chỉnh với HA, NA, M2 - là những protein đã trưởng thành ở lưới nội bào có hạt. Quá trình lắp ráp thiên về giả thiết cơ chế lắp ráp lựa chọn hơn là ngẫu nhiên.

Hạt virus được giải phóng khỏi tế bào gây nhiễm theo cơ chế nảy chồi. Hiện tượng cắt mối liên kết giữa SA và galactose nhờ hoạt tính salidase tạo nên chức năng neuramidase. Điều này cho phép giải phóng hạt virus gây bệnh khỏi tế bào vật chủ nhiễm, làm cho các phần tử virus mới được tổng hợp không ngưng kết với nhau, và cho phép virus đi xuyên qua lớp màng nhày của đường hô hấp. Sau khi hạt virus mới được tổng hợp và giải phóng khỏi tế bào thì có hiện tượng cắt HA0 thành HA1 và HA2 nhờ protease ngoại bào nằm ở đường hô hấp.

Đây cũng chính là một trong số các yếu tố quyết định độc lực của cúm ở một số loài (không có độc lực cao nếu tổ chức không có nhiều protease tại chỗ). Dịch tễ học Virus cúm truyền bệnh từ người sang người qua đường không khí, điều này giải thích hình thái xuất hiện bệnh đột ngột và mức độ lan truyền dịch nhanh trong cộng đồng. Trong cùng vụ dịch, tỷ lệ tấn công trẻ em cao hơn người lớn. Ở giai đoạn trung bình, khoảng 25% dân số bị nhiễm và trong số này, một phần ba phải đi điều trị, tỷ lệ nhập viện cao hơn hẳn ở nhóm tuổi nhỏ và người có tuổi.

Các vụ dịch cúm đều tuân theo một hình thái tương tự nhau, nhiễm virus và mắc cúm thường bắt đầu xảy ra từ trẻ em trường học dẫn đến hiện tượng học sinh nghỉ học, số bệnh nhân phải đi khám bác sỹ và nhập viện vì các bệnh phổi tăng. Vào giai đoạn cuối của dịch, thường người lớn phải nghỉ làm, số người đi khám và tử vong vì bệnh phổi tăng lên.