MỞ ĐẦU Bệnh viêm gan virút C là một trong những nguyên nhân chính gây xơ gan và ung thư gan. Theo Tổ chức Y tế thế giới, năm 2015 có 71 triệu người trên toàn thế giới nhiễm HCV mạn tính. Trung bình hàng năm có 399.000 người chết do các bệnh có liên quan đến virút viêm gan C (xơ gan, ung thư biểu mô tế bào gan và suy gan). Khác với viêm gan virút B, hiện tại vẫn chưa có vắc-xin phòng ngừa HCV [26], [51], [60].
Việt Nam chưa có một điều tra hệ thống dịch tễ học nhiễm HCV. Kết quả nghiên cứu của các tác giả dựa trên các đối tượng không mang tính chất đại diện với số lượng hạn chế nên tỷ lệ nhiễm HCV rất khác biệt từ 0,08 đến 3,9% [7], [13], [14], [19]. Theo Hiệp hội nghiên cứu bệnh gan của Mỹ, tỷ lệ nhiễm HCV của vùng Đông Nam Á là 1,5-3,5% [69]. Tuy tỷ lệ nhiễm HCV ở Việt Nam không cao như HBV (10-20%) [4] nhưng xét về mức độ trầm trọng thì bệnh nhân nhiễm HCV phải gánh chịu những biến chứng nặng nề hơn.
Theo WHO, dưới 5% người lớn nhiễm HBV sẽ chuyển sang giai đoạn nhiễm mạn tính trong khi tỷ lệ này ở người nhiễm HCV là 60-80%. Trong số này, 15-30% bệnh nhân sẽ bị xơ gan trong vòng 20 năm. Bệnh nhân nhiễm HCV mạn tính sẽ là nguồn lây chủ yếu cho cộng đồng trong khi hiện tại vẫn chưa có sẳn một loại vắc-xin phòng ngừa viêm gan C [51]. Rất may, khác với viêm gan B, bệnh nhân viêm gan C có thể được chữa lành hoàn toàn.
Chẳng hạn, với phác đồ Interferon-Ribavirin tỷ lệ đạt đáp ứng virút bền vững là 40-76%. Ngoài việc dựa vào kiểu gen HCV, gần đây các nhà khoa học đã phát hiện kiểu gen IL28B có liên quan đến kết quả SVR ở bệnh nhân viêm gan C mạn tính khi sử dụng phác đồ này. Các bệnh nhân có kiểu gen tốt có SVR cao hơn hai lần bệnh nhân sở hữu kiểu gen hỗn hợp hay xấu [32], [41], [78], [86], [96]. Mặt khác, đột biến vùng core HCV 2 cũng đã được ghi nhận có ảnh hưởng đến kết quả điều trị và biến chứng ung thư biểu mô tế bào gan ở bệnh nhân viêm gan C mạn tính [23], [47], [57], [71].
Như vậy, hiện tại có ba chỉ dấu sinh học ảnh hưởng đến kết quả điều trị bệnh nhân viêm gan C với phác đồ Interferon-Ribavirin. Vấn đề đặt ra là các chỉ dấu sinh học này có liên hệ gì với nhau hay không ? Hơn nữa, tại khu vực tỉnh Trà Vinh chưa thấy công bố một đề tài nghiên cứu về tình hình nhiễm HCV nên việc thực hiện đề tài “Mối liên quan giữa IL28B với genotype và đột biến vùng core HCV” sẽ giúp xác định tỷ lệ kiểu gen và đột biến vùng core HCV; tỷ lệ kiểu gen SNP rs12979860 của IL28B ở những bệnh nhân viêm gan virút C mạn tính khu vực Trà Vinh, cũng như khảo sát mối liên hệ giữa ba chỉ dấu sinh học: kiểu gen SNP rs12979860, kiểu gen HCV và đột biến vùng core HCV. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1. Xác định tỷ lệ kiểu gen HCV, đột biến vùng core HCV và kiểu gen SNP rs12979860 của IL28B.
Xác định mối liên quan giữa đột biến vùng core HCV với kiểu gen HCV. Xác định mối liên quan giữa kiểu gen SNP rs12979860 của IL28B với kiểu gen HCV và đột biến vùng core HCV. 3 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CƠ BẢN CỦA HCV 1.
LỊCH SỬ VIÊM GAN C Trong thập niên 70, người ta nhận thấy gần 90% các viêm gan virút xảy ra sau truyền máu không có liên quan đến virút A cũng như virút B nên các trường hợp này được gọi là viêm gan không A-không B (non A-non B). Từ năm 1978, qua mô hình thực nghiệm trên khỉ Chimpanzee, người ta đã chứng minh có một tác nhân lây truyền qua đường tiêm chích có thể gây ra bệnh cảnh viêm gan không A-không B. Mãi đến năm 1989, nhờ vào phương pháp tạo dòng vô tính (clonage) và phân tích trình tự (sequencing) của genom virút, Choo và cộng sự lần đầu tiên đã phát hiện ra tác nhân đó chính là virút viêm gan C. Tuy nhiên, các hạt tử của virút viêm gan C chỉ mới được quan sát và mô tả dưới kính hiển vi điện tử từ năm 1994.
HCV dưới kính hiển vi điện tử “Nguồn: Universitätsklinikum Heidelberg, 2012” [53] 4 1. CẤU TRÚC CỦA VIRÚT VIÊM GAN C HCV là virút đầu tiên được phát hiện bằng kỹ thuật sinh học phân tử, thuộc họ Flaviviridae, giống Hepacivirus. Virút có đường kính 55-65 nm, trọng lượng phân tử vào khoảng 4. Bộ gen gồm một sợi đơn RNA có cực tính dương nằm bên trong phần nucleocapsid hình đa diện.
Ngoài cùng là lớp màng bọc lipid chứa các protein E1 và E2 tạo thành phức hợp dimer. Protein E1 Vỏ virút HCV-RNA Protein E2 Vùng core HCV Hình 1. Sơ đồ cấu tạo HCV “Nguồn: Sharma SD, 2010” [83] Mật độ của các hạt tử HCV trong huyết thanh rất thay đổi, từ 1,03 đến 1,72g/ml. Sở dĩ mật độ của HCV thay đổi như vậy là do các virion lưu hành trong máu dưới nhiều dạng khác nhau: hoặc là ở dạng tự do có tính lây nhiễm rất cao nhưng chỉ hiện diện ở mật độ tương đối thấp (khoảng 1,03); hoặc là ở dạng kết hợp với các đại phân tử, đặc biệt là các lipoprotein hoặc hiện diện trong các phức hợp miễn dịch nhưng mật độ lại cao (khoảng 1,10).
Thực nghiệm trên khỉ Chimpanzee cho thấy tính lây nhiễm của các hạt tử HCV tự do cao hơn rõ rệt so với dạng kết hợp với các đại phân tử. Qua phương pháp khuyếch đại chuỗi di truyền (PCR) và phương pháp lai ghép tại chỗ người ta nhận thấy khuynh hướng của HCV không chỉ ở các tế bào gan mà các chuỗi HCV-RNA còn được tìm thấy trong các tế bào đơn 5 nhân ở máu ngoại vi. HCV có thể lây nhiễm ở các lymphô bào B và T cũng như ở các dòng đơn bào. Việc phát hiện này có nhiều ý nghĩa rất quan trọng: - Việc nuôi cấy HCV có thể thực hiện được ở các dòng lymphô bào.
- Các tế bào đơn nhân có thể là nguồn “dự trữ” virút và đặc biệt có thể là nguyên nhân gây tái nhiễm HCV sau khi ghép gan. - Sự lây nhiễm ở các tế bào đơn nhân có thể chọn lọc nên một vài “biến chủng” đặc biệt và tạo điều kiện cho bệnh tồn tại kéo dài [1]. CẤU TRÚC CỦA BỘ GEN HCV Bộ gen của HCV là một sợi đơn RNA có cực tính dương, gồm khoảng 9.600 nucleotide, được chia làm ba vùng: * Đầu 5’ không mã hóa dài khoảng 341 nucleotide, là vị trí gắn kết với ribosome, được gọi là IRES (internal ribosome entry site), để khởi phát quá trình giải mã cho việc tổng hợp chuổi polyprotein tiền chất của virút. * Đầu 3’ không mã hóa chứa một đoạn 30-60 nucleotide tương đối thay đổi, nằm phía sau codon kết thúc.
Tiếp theo là một đoạn poly U/UC, gồm 50- 100 nucleotide rất thay đổi. Sau cùng là một chuỗi 98 base bảo tồn cao (vùng “3’-X”). Đây là đoạn bảo tồn nhất của bộ gen HCV. Thử nghiệm cho thấy tương tác giữa vùng 3’-X, vùng mã hóa NS5B và vùng poly U/UC là tuyệt đối cần thiết cho sự nhân bản của virút [95].
* Vùng được mã hóa nằm giữa hai đầu 5’ và 3’. Vùng này chỉ có một khung đọc mở duy nhất (open reading frame) gồm 9.481 nucleotide, được giải mã để tổng hợp thành một polyprotein tiền chất của virút gồm khoảng 3. Sau đó polyprotein này sẽ được các enzym protease của virút và các enzym peptidase tín hiệu của tế bào (host signal peptidase) phân cắt thành các protein cấu trúc và protein không cấu trúc. Cấu trúc bộ gen HCV “Nguồn: Zahid Hussain, 2013” [97] Các protein cấu trúc đƣợc tạo ra từ các gen C, E1 và E2 - Protein lõi (21 kDa) tạo nên phần nucleocapsid bao bọc bên ngoài chuỗi RNA của virút.
Protein lõi có liên quan một số protein tế bào và các con đường có tác động trực tiếp đến vòng đời và sinh học của HCV, có vai trò trong việc tác động chống virus của Interferon thông qua việc tương tác với protein tế bào. Đột biến protein lõi làm thay đổi cấu trúc virút, gây ra kém đáp ứng với phác đồ Interferon-Ribavirin. Đặc biệt, hai dạng đột biến R70Q và L91M gây đáp ứng kém với phác đồ Interferon-Ribavirin [36]. - Protein E1 (37 kDa) và E2 (61 kDa) là hai glycoprotein của lớp vỏ, liên kết với nhau thành các phức hợp dimer.
Một đoạn khoảng 30 axít amin ở gần đầu tận E2 được gọi là vùng siêu biến HVR-1 (hypervariable region). Đây là đoạn biến đổi di truyền nhiều nhất của protein vỏ và được giả định tồn tại như một vòng polypeptide trên bề mặt của virion. Bệnh nhân thường có kháng thể phản ứng với các peptid, đại diện cho trình tự HVR-1 của virút mà họ đang nhiễm. Việc xuất hiện kháng thể tạo ra những biến thể chọn lọc có chuỗi HVR-1 ít phản ứng hơn với kháng thể.
Có bằng chứng cho thấy HVR-1 có một hoặc nhiều quyết định kháng nguyên trung hòa và đó là vị trí đột biến gây ra thoát lưới miễn dịch trong suốt giai đoạn nhiễm khuẩn cấp tính và mạn tính [91]. 7 - Protein p7 (7 kDa): là một chuỗi polypeptid gồm 63 axít amin, có chức năng như một kênh ion, cần thiết cho việc sản xuất những virion lây nhiễm. Do nó bị ức chế bởi bởi nhiều hợp chất khác nhau nên là một mục tiêu thích hợp cho việc phát triển các loại thuốc kháng HCV [81]. Các protein không cấu trúc - Protein NS2 (23 kDa) là một cystein protease, cắt polyprotein tiền chất tại chỗ nối NS2/NS3 [94].
Enzym serine protease sẽ cắt chuỗi polyprotein tiền chất tại các vị trí NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A, NS5A/NS5B. Enzym helicase tham gia vào quá trình nhân đôi của virút. - Protein NS4A (6 kDa) là một đồng yếu tố cần thiết cho hoạt tính của men protease NS3. - Protein NS5A (56-58 kDa) là một phosphoprotein, có chức năng trong việc sao chép RNA.
NS5A chứa vùng quyết định cho tính nhạy cảm của HCV đối với Interferon-alpha (ISDR – Interferon sensitivity determining region). Vùng này làm mất tác dụng của Interferon qua trung gian việc ức chế men protein kinase R (PKR). Một khi PKR bị ức chế bởi NS5A thì khả năng kháng virút và chống tăng sinh virút của Interferon bị giảm đi. Mặt khác, NS5A có thể gây biểu hiện IL-8, làm ức chế biểu hiện gene kích hoạt sản xuất Interferon.
Nếu có đột biến xảy ra ở vùng NS5A có thể tạo được đáp ứng tốt với Interferon. NS5B (65 kDa) là men RNA polymerase phụ thuộc RNA, giúp tổng hợp chuỗi RNA từ khuôn mẫu RNA.