Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền trên gen mã hóa yếu tố ix ở bệnh nhân hemophilia b

Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền trên gen mã hóa yếu tố IX ở bệnh nhân Hemophilia B, cung cấp hiểu biết sâu về cơ chế bệnh.

• Tác giả: Vũ Thị Bích Hường
• Người hướng dẫn: TS. Dương Quốc Chính, Phó trưởng bộ môn Huyết học – Truyền máu, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền gen yếu tố IX ở bệnh nhân Hemophilia B
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1.1. Tổng quan về bệnh hemophilia B
• 1.1.2. Một số dấu mốc về lịch sử phát hiện và nghiên cứu bệnh hemophilia B
• 1.2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 1.2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
• 1.2.2.2. Công thức tính cỡ mẫu trong nghiên cứu đa hình nucleotide
• 1.2.2.3. Các bước nghiên cứu
• 1.2.2.4. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu. Vật tư – Trang thiết bị
• 1.2.2.5. Thu thập mẫu nghiên cứu
• 1.2.2.6. Tách chiết ADN
• 1.2.2.7. Thiết kế các trình tự mồi để khuếch đại gen tổng hợp yếu tố IX
• 1.2.2.8. Khuếch đại các phân đoạn a1-a8 bằng kỹ thuật Longrange PCR
• 1.2.2.9. Tinh sạch sản phẩm Longrange PCR khuếch đại các vùng gen F9
• 1.2.2.10. Khẳng định kết quả giải trình tự gen F9 trên NGS
• 1.2.2.11. Khẳng định các mất đoạn/lặp đoạn gen F9 bằng kỹ thuật MLPA
• 1.2.2.12. Phân tích đột biến gen từ dữ liệu giải trình tự
• 1.2.2.13. Phân tích đa hình nucleotide trên gen F9 từ dữ liệu giải trình tự
• 1.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 1.3.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu
• 1.3.2. Chuẩn bị vật liệu nghiên cứu
• 1.3.3. Xây dựng quy trình giải trình tự gen mã hóa yếu tố IX
• 1.3.3.1. Thiết kế bộ mồi khuếch đại toàn bộ gen F9
• 1.3.3.2. Tối ưu quy trình LR-PCR khuếch đại 8 vùng gen F9
• 1.3.3.3. Chuẩn bị thư viện ADN
• 1.3.3.4. Giải trình tự với quy trình NGS đã tối ưu
• 1.3.3.5. Khẳng định kết quả giải trình tự NGS
• 1.3.4. Giải trình tự gen F9 ở các mẫu nghiên cứu. Phân tích đột biến gen ở 100 bệnh nhân nghiên cứu
• 1.3.4.1. Kiểu đột biến gen. Tác động của các đột biến đến cấu trúc, hoạt động gen
• 1.3.4.2. Đánh giá mức độ lặp lại của các đột biến ở các bệnh nhân nghiên cứu
• 1.3.4.3. Tương quan giữa kiểu đột biến gen và mức độ bệnh
• 1.3.4.4. Lập bản đồ đột biến gen F9 ở bệnh nhân hemophilia B Việt Nam. Phân bố đột biến trên gen F9
• 1.3.4.5. Phân bố của các đột biến trên các domain của phân tử FIX
• 1.3.5. Phân tích đa hình nucleotide trên gen F9. Khảo sát đa hình nucleotide trên gen mã hoá yếu tố IX. Tần suất alen đa hình trong quần thể người bình thường
• 1.3.6. Phân tích liên kết giữa các đa hình nucleotide. Lựa chọn bộ đa hình có giá trị thông tin cao. Xác nhận hiệu quả của bộ đa hình trên gia đình người bệnh
• 1.4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 1.4.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu
• 1.4.2. Xây dựng quy trình NGS giải trình tự gen mã hóa yếu tố IX
• 1.4.3. Thiết kế bộ mồi khuếch đại gen F9
• 1.4.4. Tối ưu quy trình LR-PCR khuếch đại 8 vùng gen F9
• 1.4.5. Chuẩn bị thư viện ADN
• 1.4.6. Giải trình tự gen F9 với quy trình đã tối ưu
• 1.4.7. Đánh giá kết quả giải trình tự NGS
• 1.4.8. Giải trình tự gen F9 của các mẫu nghiên cứu
• 1.4.9. Phân tích đột biến gen của 100 bệnh nhân nghiên cứu
• 1.4.10. Đặc điểm kiểu đột biến gen gặp trong nghiên cứu
• 1.4.11. Mối tương quan giữa kiểu đột biến gen và mức độ bệnh
• 1.4.12. Bản đồ đột biến gen F9 ở bệnh nhân hemophilia B Việt Nam
• 1.4.13. Phân bố đột biến trên gen F9
• 1.4.14. Phân bố đột biến trên phân tử protein yếu tố IX
• 1.4.15. Đa hình di truyền trên gen F9
• 1.4.16. Khảo sát đa hình nucleotide trên gen F9
• 1.4.17. Tần suất alen đa hình trong nghiên cứu
• 1.4.18. Phân tích mối liên kết di truyền giữa các đa hình nucleotide
• 1.4.19. Lựa chọn bộ đa hình có giá trị thông tin cao
• 1.4.20. Khẳng định hiệu quả của bộ đa hình
• 2. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ
• CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về bệnh hemophilia B

Bệnh hemophilia B là một rối loạn di truyền nghiêm trọng, chủ yếu do đột biến trên gen mã hóa yếu tố IX (gen F9). Bệnh này gây ra hiện tượng chảy máu kéo dài, ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân. Theo thống kê, hemophilia B chiếm khoảng 15-20% tổng số ca bệnh hemophilia, với tỷ lệ mắc bệnh là 1:30. Cơ chế bệnh lý chủ yếu liên quan đến sự thiếu hụt yếu tố IX, dẫn đến rối loạn quá trình đông máu. Đột biến gen F9 có thể gây ra các dạng bệnh khác nhau, từ nhẹ đến nặng, tùy thuộc vào mức độ thiếu hụt yếu tố IX. Việc hiểu rõ về bệnh lý này là rất quan trọng để phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị hiệu quả.

1.1. Đặc điểm di truyền của bệnh hemophilia B

Hemophilia B là bệnh di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể X. Nam giới có nguy cơ mắc bệnh cao hơn, trong khi phụ nữ thường là người mang gen bệnh. Tình trạng này dẫn đến việc các thế hệ sau có thể bị ảnh hưởng nếu không có biện pháp chẩn đoán và quản lý kịp thời. Việc phát hiện người mang gen bệnh là rất quan trọng để ngăn ngừa sự lây truyền trong gia đình. Các phương pháp chẩn đoán hiện nay bao gồm phân tích trực tiếp đột biến và phân tích gián tiếp thông qua các đa hình nucleotide liên kết với gen F9.

II. Đột biến và đa hình di truyền gen yếu tố IX

Nghiên cứu về đột biến và đa hình di truyền trên gen yếu tố IX là rất cần thiết để hiểu rõ hơn về bệnh hemophilia B. Các đột biến trên gen F9 có thể dẫn đến sự thiếu hụt yếu tố IX, gây ra các triệu chứng lâm sàng nghiêm trọng. Đến nay, đã có hơn 1000 đột biến được ghi nhận trên thế giới, trong đó có nhiều đột biến mới được phát hiện trong nghiên cứu này. Việc lập bản đồ đột biến gen F9 sẽ giúp xác định các kiểu đột biến phổ biến trong quần thể bệnh nhân hemophilia B tại Việt Nam, từ đó hỗ trợ cho việc chẩn đoán và điều trị.

2.1. Phân tích đột biến gen F9

Phân tích đột biến gen F9 được thực hiện thông qua các kỹ thuật hiện đại như giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) và phân tích MLPA. Các kết quả cho thấy sự phân bố đột biến không đồng đều trên các exon và intron của gen F9. Đặc biệt, một số đột biến có thể gây ra các biến đổi nghiêm trọng trong cấu trúc và chức năng của yếu tố IX, ảnh hưởng đến quá trình đông máu. Việc hiểu rõ về các đột biến này không chỉ giúp trong việc chẩn đoán mà còn trong việc phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả hơn cho bệnh nhân.

III. Giá trị và ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu

Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin quý giá về đột biến và đa hình di truyền trên gen yếu tố IX mà còn mở ra hướng đi mới trong việc chẩn đoán và quản lý bệnh hemophilia B tại Việt Nam. Việc lập bản đồ đột biến gen F9 sẽ giúp các bác sĩ và nhà nghiên cứu có cái nhìn tổng quan về tình hình bệnh lý trong quần thể, từ đó đưa ra các biện pháp can thiệp kịp thời. Hơn nữa, nghiên cứu cũng góp phần nâng cao nhận thức về bệnh hemophilia B trong cộng đồng, khuyến khích việc chẩn đoán sớm và tư vấn tiền hôn nhân cho các cặp đôi có nguy cơ.

3.1. Ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong việc phát triển các bộ xét nghiệm chẩn đoán nhanh và chính xác cho bệnh hemophilia B. Ngoài ra, việc xác định các đa hình nucleotide có tỷ lệ dị hợp tử cao sẽ hỗ trợ cho việc chẩn đoán người mang gen bệnh thông qua phương pháp phân tích liên kết. Điều này không chỉ giúp giảm thiểu tỷ lệ mắc bệnh mà còn nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân và gia đình họ.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Nghiên cứu "Nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền trên gen mã hóa yếu tố IX ở bệnh nhân hemophilia B" của NCS. Vũ Thị Bích Hường (chuyên ngành Di truyền học, Học viện Khoa học và Công nghệ, bảo vệ 2022, hướng dẫn bởi TS. Dương Quốc Chính và PGS. Đồng Văn Quyền) giải quyết một khoảng trống dữ liệu di truyền học người Việt Nam đã tồn tại suốt ba thập kỷ kể từ khi Yoshitake và cộng sự (1985) công bố toàn bộ trình tự gen F9 dài ~34 kb gồm 8 exon và 7 intron.

Research gap được xác lập với bằng chứng định lượng cụ thể: theo ghi nhận của Trung tâm hemophilia, Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương, ước tính có "~ 30.000 người mang gen bệnh trên cả nước nhưng chỉ 20% trong số đó được chẩn đoán và quản lý" — tức khoảng 24.000 phụ nữ mang gen chưa được nhận diện. Nguyên nhân cấu trúc của tình trạng này được luận án nêu rõ: "hiện chưa có một nghiên cứu nào được thực hiện để tìm hiểu về các đa hình nucleotide trên gen F9 ở người Việt Nam", trong khi các nghiên cứu đột biến trước đó "cỡ mẫu chưa nhiều do đó dữ liệu về đột biến gen ở bệnh nhân còn rất thiếu". Đối chiếu: cơ sở dữ liệu quốc tế đã ghi nhận trên 1.000 đột biến gen F9 (Rallapalli và cộng sự, 2013: 1.113 đột biến gây bệnh từ 3.721 bệnh nhân), còn Việt Nam gần như trống.

Hai mục tiêu được phát biểu tường minh: (1) Lập bản đồ đột biến gen mã hóa yếu tố IX của bệnh nhân hemophilia B Việt Nam; (2) Khảo sát xác định các đa hình nucleotide có tỷ lệ dị hợp tử cao làm cơ sở chẩn đoán người mang gen bằng phân tích liên kết. Các giả thuyết ngầm định tương ứng: H1 — phổ đột biến F9 ở người Việt đa dạng và chứa tỷ lệ đột biến mới đáng kể tương đồng với các quần thể châu Á khác; H2 — tần suất alen đa hình trên gen F9 của người Việt khác biệt có ý nghĩa so với người da trắng và người Mỹ gốc Phi, do đó bộ đa hình chẩn đoán phải được hiệu chỉnh theo quần thể.

Khung lý thuyết vận hành trên ba trụ: di truyền học Mendel về bệnh lặn liên kết nhiễm sắc thể X (Xq27.1–Xq27.2), lý thuyết mất cân bằng liên kết (linkage disequilibrium) của di truyền quần thể, và mô hình cấu trúc–chức năng năm domain của phân tử FIX (GLA, EGF1, EGF2, Activation Peptide, Serine Protease).

Phạm vi: 100 bệnh nhân hemophilia B và 100 phụ nữ khỏe mạnh (người hiến máu), giải trình tự toàn bộ gen F9 bằng NGS — bao gồm toàn bộ exon, intron, promoter và vùng 5'UTR/3'UTR.

Literature Review và Positioning

Dòng nghiên cứu thứ nhất — lập bản đồ đột biến theo quần thể — khởi nguồn từ cơ sở dữ liệu đầu tiên của Giannelli và cộng sự (1990) với 216 đột biến, và mở rộng qua các nghiên cứu quốc gia: Belvini và cộng sự (2005) phát hiện 137 đột biến trên 238 bệnh nhân Italia với tỷ lệ đột biến mới 36,5% (50/137); Tagariello và cộng sự (2007) mở rộng lên 306 bệnh nhân từ 29 trung tâm; Tengguo Li và cộng sự (2014) xác định 87 đột biến trên 226 bệnh nhân Mỹ với đột biến điểm chiếm 86%; V. Surin (2016) tìm 46 đột biến trên 56 bệnh nhân Nga, trong đó 11 đột biến mới và đột biến sai nghĩa chiếm 30/46; dự án My Life, Our Future (Johnsen và cộng sự, 2017) — quy mô lớn nhất — phân tích 599 bệnh nhân hemophilia B trong tổng số hơn 3.000 bệnh nhân hemophilia (≈15% toàn nước Mỹ), phát hiện 217 đột biến ở 595 bệnh nhân với 25,3% (55/217) là đột biến mới.

Dòng nghiên cứu thứ hai — đa hình liên kết — bắt đầu từ Graham JB và cộng sự (1985) với đa hình Malmo/MnlI (G>A tại exon 6, đổi threonin thành alanin ở vị trí 148), tiếp nối bởi Winship và cộng sự (1989, HhaI ở đầu 3'; 1993, MseI ở đầu 5').

Hai tranh luận đối lập nổi bật trong y văn. Thứ nhất, về giá trị của phân tích trực tiếp so với gián tiếp: các nước phát triển ưu tiên phân tích đột biến trực tiếp nhờ hạ tầng công nghệ, trong khi "phân tích gián tiếp sử dụng các đa hình liên kết với gen F9 được triển khai nhiều hơn ở các nước đang phát triển". Luận án bác bỏ thế lưỡng phân này, chọn lập trường phối hợp — đây chính là positioning cốt lõi. Thứ hai, về tính khả chuyển xuyên quần thể của bộ đa hình: dữ liệu cho thấy BamHI 5' có tần suất alen (+) chỉ 0,02 ở người da trắng, 0 ở người Nhật, nhưng 0,36–0,64 ở người Mỹ da đen; MnlI exon 6 đạt 0,33 ở người da trắng nhưng chỉ 0,03 ở người Trung Quốc. Bộ 6 đa hình (TaqI, XmnI, DdeI, MspI, BamHI, MnlI) đạt hiệu quả chẩn đoán 80% ở người da trắng và tổ hợp BamHI–DdeI–XmnI đạt 87% ở người Mỹ da đen — nhưng không có bằng chứng nào bảo đảm hiệu lực tương đương ở người Việt.

So sánh quốc tế trực tiếp: nghiên cứu này (100 bệnh nhân) vượt quy mô Pauline BalRaj và cộng sự (2012, Malaysia, 16 bệnh nhân, 8 đột biến, 1 đột biến mới 6660-6664delTTCTT), vượt Wang và cộng sự (2016, Trung Quốc, 23 bệnh nhân, 19 đột biến điểm, 1 đột biến mới) và Muhammad và cộng sự (2018, Pakistan, 34 bệnh nhân, 17 đột biến với 15 đột biến điểm chiếm 88,2%).

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng mô hình phân loại đột biến nhóm I (ảnh hưởng số lượng protein) và nhóm II (ảnh hưởng chất lượng/chức năng) — khung do y văn hemophilia thiết lập với ghi nhận nhóm II chiếm ~60% — bằng dữ liệu từ một quần thể Đông Nam Á chưa từng được lập bản đồ. Việc phát hiện 58 đột biến trên 100 bệnh nhân, trong đó 16 đột biến mới (tỷ lệ 27,6%), đặt quần thể Việt Nam vào khoảng dao động quốc tế 25,3%–36,5% (MLOF – Belvini), qua đó củng cố luận điểm rằng tính đa dạng đột biến F9 là đặc trưng phổ quát chứ không phải nhiễu chọn mẫu.

Khung cấu trúc–chức năng FIX được kiểm chứng ở cấp quần thể: mô hình domain của Astermark và Bajaj (xác định domain serine protease là vị trí liên kết FIXa–FVIIIa, minh chứng qua đột biến Glu-c80(245)→Val phá vỡ vị trí gắn Ca²⁺) và các thực nghiệm hoán đổi domain chứng minh EGF2 (43 axit amin, Asp-c85 đến Ala-c127, bảo tồn 80–85% giữa các loài) quyết định chức năng đặc hiệu của FIX. Bản đồ phân bố đột biến trên các domain FIX của bệnh nhân Việt Nam cung cấp bằng chứng dịch tễ phân tử độc lập cho mô hình này.

Mệnh đề lý thuyết được số hóa: P1 — phổ đột biến F9 người Việt tuân theo phân bố kiểu đột biến tương đồng các quần thể đã công bố (thay thế đơn nucleotide chiếm ưu thế, indel ~18%, bất thường lớn 3–5%); P2 — tương quan kiểu gen–kiểu hình tuân theo quy luật đột biến vô nghĩa và mất đoạn lớn liên kết mức độ nặng; P3 — tần suất alen đa hình người Việt gần nhóm Đông Á (Trung Quốc, Nhật Bản) hơn nhóm da trắng và Mỹ gốc Phi.

Khung phân tích độc đáo

Ba lý thuyết được tích hợp: (i) lý thuyết đột biến phân tử với cơ chế đảo CpG — DNA methyltransferase chuyển cytosine thành 5-methylcytosine, khử amin thành thymine, biến CGn (mã hóa arginine) thành TGn, giải thích hiện tượng "hotspot"; (ii) lý thuyết hiệu ứng sáng lập (founder effect), đã được kiểm chứng qua đột biến Ile443T ở quần thể Bắc Mỹ (Thomson và cộng sự, 1990), c.17781A>G ở Anh, g.-35G>A và Ala317Val ở Ireland; (iii) lý thuyết mất cân bằng liên kết, thao tác hóa qua chỉ số D' tính trên phần mềm Haploview 4.

Đóng góp khái niệm: "bộ đa hình có giá trị thông tin đặc trưng quần thể" — tập hợp tối thiểu các SNP đồng thời thỏa mãn hai điều kiện tỷ lệ dị hợp tử cao và cân bằng liên kết tương đối với nhau, vì "nếu đa hình này là đồng hợp tử và không có thông tin thì đa hình còn lại cũng không có thông tin, việc sử dụng đồng thời hai đa hình này không làm tăng thêm hiệu quả".

Boundary conditions được nêu rõ: phân tích liên kết chỉ áp dụng khi trong gia đình xác định được người chắc chắn mang gen (obligate carrier) và người đó dị hợp tử với ít nhất một đa hình trên gen F9; đồng thời phải ưu tiên chỉ thị nội gen vì chỉ thị ngoại gen "có giá trị thông tin thấp do tỷ lệ xảy ra [trao đổi chéo]".

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Research philosophy: positivism thực nghiệm, với giả thuyết được kiểm định bằng dữ liệu trình tự khách quan và xác nhận chéo bằng phương pháp độc lập. Thiết kế mô tả cắt ngang kết hợp phát triển công nghệ (technology development), triển khai trên hai tầng đối tượng: tầng bệnh (100 bệnh nhân hemophilia B tại Trung tâm hemophilia) và tầng quần thể chứng (100 phụ nữ khỏe mạnh từ khoa Tiếp nhận máu). Cỡ mẫu 100 người nữ khỏe mạnh được xác lập theo công thức tính cỡ mẫu cho nghiên cứu đa hình nucleotide — không phải chọn tùy tiện.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Chuỗi kỹ thuật gồm sáu bước có kiểm soát: (1) tách chiết ADN tổng số từ máu ngoại vi với kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch (tỷ số A260/A280); (2) thiết kế bộ mồi gối đầu nhau phủ toàn bộ gen F9 ~34 kb, chia thành 8 phân đoạn a1–a8, có bước kiểm tra độ bao phủ gen bằng tin sinh học; (3) tối ưu Long-range PCR với ba chu trình nhiệt riêng biệt — một cho nhóm a1, a2, a5, a6, a7; một cho a3 và a4; một cho a8 (phân đoạn khó nhất, phải tối ưu qua nhiều vòng); (4) tinh sạch sản phẩm và chuẩn bị thư viện ADN, kiểm tra trên hệ thống điện di mao quản; (5) giải trình tự NGS theo nguyên lý sequencing-by-synthesis (library preparation → cluster generation qua khuếch đại bắc cầu → sequencing → data analysis); (6) phân tích biến thể.

Triangulation được thực thi ở ba tầng phương pháp: NGS làm phương pháp chính, Sanger làm phương pháp khẳng định độ tin cậy quy trình, và MLPA (9 probe, riêng exon 8 thiết kế 2 probe do kích thước 1.935 bp) để khẳng định mất đoạn/lặp đoạn — minh họa cụ thể trên ba mẫu H14, H94, H97, những mẫu mà Long-range PCR không khuếch đại được vùng gen tương ứng.

Validity: construct validity đảm bảo qua chuẩn đối chiếu HGVS trong danh pháp biến thể; internal validity qua đối chứng Sanger; external validity qua đối chiếu tần suất alen với các quần thể quốc tế đã công bố.

Data và phân tích

Công cụ dự đoán tác động chức năng: PolyPhen-2 (Polymorphism Phenotyping v2) và SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant) đánh giá ảnh hưởng của biến đổi axit amin lên cấu trúc và chức năng protein. Phân tích liên kết bằng Haploview 4 với chỉ số D'. Robustness check quan trọng nhất: các mẫu âm tính với NGS được đưa qua MLPA thay vì bị loại — tránh sai lệch chọn lọc theo hướng bỏ sót đột biến cấu trúc lớn (nhóm chiếm 3–5% y văn).

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

Thứ nhất, 58 đột biến được phát hiện trên 100 bệnh nhân, trong đó 16 đột biến mới (27,6%) chưa từng ghi nhận trong cơ sở dữ liệu quốc tế — tỷ lệ nằm giữa MLOF Mỹ (25,3%) và Italia (36,5%), cao hơn hẳn tỷ lệ đột biến mới ở Malaysia (1/8) và Trung Quốc (1/19), phản ánh lợi thế của chiến lược giải trình tự toàn gen so với giải trình tự exon-targeted.

Thứ hai, số đột biến (58) nhỏ hơn số bệnh nhân (100) cho thấy hiện tượng lặp lại đột biến giữa các bệnh nhân không cùng huyết thống — dấu hiệu gợi ý đồng thời hai cơ chế: hiệu ứng đảo CpG tại các vị trí arginine và khả năng hiệu ứng sáng lập trong quần thể Việt Nam, giả thuyết cần xác minh bằng phân tích haplotype nền.

Thứ ba, tương quan kiểu đột biến – mức độ bệnh được lượng hóa trên nhóm nghiên cứu, phù hợp với mô hình quốc tế: MLOF ghi nhận ở nhóm nặng tỷ lệ mất đoạn lớn >50 bp là 10,6%, đột biến vô nghĩa 23,9%, dịch khung 10,6%, sai nghĩa 47,2%.

Thứ tư, ba trường hợp mất đoạn/lặp đoạn (H14, H94, H97) chỉ được xác định nhờ MLPA — bằng chứng trực tiếp rằng quy trình chẩn đoán chỉ dựa vào giải trình tự sẽ bỏ sót nhóm bệnh nhân có nguy cơ tạo chất ức chế cao nhất. Điều này có ý nghĩa lâm sàng nghiêm trọng: Radic và cộng sự (2013) chỉ ra bệnh nhân mất toàn bộ gen F9 có nguy cơ tạo chất ức chế cao gấp 32 lần, đột biến vô nghĩa p.W240* cao gấp 11 lần; Rallapalli và cộng sự ghi nhận 59/3.713 bệnh nhân (1,6%) tạo chất ức chế, chủ yếu do mất đoạn lớn (27 ca) và vô nghĩa (20 ca).

Thứ năm, khảo sát 12 SNP từ dữ liệu giải trình tự trên 100 phụ nữ khỏe mạnh cho phép phân nhóm SNP theo mức độ liên kết và chắt lọc ra bộ SNP có giá trị thông tin, sau đó được xác nhận hiệu quả trên gia đình người bệnh thực tế — vòng khép kín từ dữ liệu quần thể đến ứng dụng phả hệ.

Implications đa chiều

Về lý thuyết, kết quả đóng góp cho hai lý thuyết: lý thuyết đột biến phân tử (bổ sung 16 biến thể mới vào phổ CGn hotspot) và lý thuyết di truyền quần thể (bổ sung dữ liệu tần suất alen Việt Nam vào bản đồ đa hình toàn cầu vốn thiếu vắng Đông Nam Á).

Về phương pháp, quy trình LR-PCR 8 phân đoạn kết hợp NGS có thể chuyển giao trực tiếp sang các gen lớn khác nằm trên nhiễm sắc thể X — đặc biệt gen F8 trong hemophilia A, nơi đảo đoạn intron 22 chiếm ~50% ca bệnh.

Về thực hành, thuật toán chẩn đoán ba tầng được đề xuất: NGS toàn gen → nếu âm tính, MLPA → nếu vẫn không xác định được đột biến gia đình, chuyển sang phân tích liên kết bằng bộ đa hình đã chuẩn hóa cho người Việt.

Về chính sách, dữ liệu 30.000 người mang gen với chỉ 20% được quản lý cung cấp căn cứ định lượng cho một chương trình quốc gia về tư vấn tiền hôn nhân và tư vấn sinh sản, mô phỏng mô hình Canada (chương trình quốc gia phân tích đột biến cho 1.500 bệnh nhân hemophilia, trong đó 267 hemophilia B) và mô hình MLOF của Mỹ.

Điều kiện khái quát hóa: kết quả áp dụng cho quần thể người Kinh miền Bắc tiếp cận Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương; ngoại suy sang các dân tộc thiểu số cần kiểm chứng bổ sung.

Limitations và Future Research

Thứ nhất, cỡ mẫu 100 bệnh nhân — dù lớn nhất tại Việt Nam — vẫn nhỏ hơn nhiều so với MLOF (599 bệnh nhân hemophilia B) và Italia (306), do đó chưa đủ công suất thống kê để phát hiện các đột biến hiếm có tần suất dưới 1% hay xác lập chắc chắn hiệu ứng sáng lập.

Thứ hai, 100 phụ nữ khỏe mạnh được tuyển từ người hiến máu tại một cơ sở duy nhất ở Hà Nội, tạo khả năng sai lệch chọn mẫu về cấu trúc dân tộc và địa lý; tần suất alen thu được có thể không đại diện cho toàn quốc.

Thứ ba, tương quan kiểu gen–kiểu hình dựa trên nồng độ FIX hoạt tính mà thiếu định lượng kháng nguyên FIX:Ag song song — hạn chế này ngăn cản việc phân loại dứt khoát đột biến nhóm I và nhóm II, vốn chỉ có thể phân biệt qua sự bất tương xứng giữa FIX:Ag và FIX hoạt tính (như trường hợp Gly357Arg/Gly357Glu so với Gly357Ter).

Thứ tư, không thực hiện nghiên cứu chức năng in vitro để xác nhận tác động của 16 đột biến mới; kết luận về tác động dựa trên dự đoán in silico bằng PolyPhen-2 và SIFT, vốn có tỷ lệ dương tính giả không nhỏ.

Chương trình nghiên cứu tương lai gồm năm hướng: (1) mở rộng cỡ mẫu lên trên 300 bệnh nhân đa vùng miền để kiểm định giả thuyết hiệu ứng sáng lập bằng phân tích haplotype; (2) biểu hiện protein tái tổ hợp mang 16 đột biến mới để đo hoạt tính FIX in vitro; (3) theo dõi dọc mối liên hệ giữa kiểu đột biến và sự hình thành chất ức chế trên cohort bệnh nhân Việt Nam; (4) khảo sát phổ đột biến vùng promoter để xác định các ca hemophilia B Leyden (chiếm ~3% bệnh nhân, liên quan 21 đột biến đã biết tại vị trí bám HNF4α, C/EBPα, ONECUT1/2); (5) tích hợp panel đa gen F8–F9–VWF theo mô hình Bermejo và cộng sự (102 bệnh nhân) để tối ưu chi phí trên đơn vị chẩn đoán.

Tác động và ảnh hưởng

Tác động học thuật: công trình tạo cơ sở dữ liệu đột biến gen F9 đầu tiên của người Việt Nam, có thể đóng góp trực tiếp vào cơ sở dữ liệu quốc tế (CDC Hoa Kỳ, EAHDA, UKHCDO) — nơi dữ liệu Đông Nam Á còn thưa thớt; 16 biến thể mới có tiềm năng được trích dẫn trong mọi nghiên cứu chú giải biến thể F9 tiếp theo.

Tác động ngành: quy trình LR-PCR–NGS nội địa hóa làm giảm phụ thuộc vào dịch vụ giải trình tự nước ngoài; bộ đa hình chuẩn hóa cho phép các phòng xét nghiệm tuyến tỉnh triển khai phân tích liên kết bằng kỹ thuật PCR-RFLP chi phí thấp — phù hợp với thực tế nguồn lực Việt Nam, đúng như y văn nhận định rằng phân tích gián tiếp phổ biến hơn ở các nước đang phát triển.

Tác động chính sách: cung cấp bằng chứng cho Bộ Y tế xây dựng hướng dẫn quốc gia về chẩn đoán người mang gen hemophilia B, kết nối với mạng lưới 97 quốc gia thành viên của Liên đoàn Hemophilia Thế giới.

Lợi ích xã hội có thể lượng hóa: mỗi phụ nữ mang gen được chẩn đoán sớm giảm 50% nguy cơ truyền nhiễm sắc thể X đột biến trong mỗi lần sinh thông qua tư vấn sinh sản và chẩn đoán trước sinh hoặc trước chuyển phôi; với hàng trăm ca bệnh mới mỗi năm được ghi nhận tại Trung tâm hemophilia, hiệu quả dự phòng tích lũy là đáng kể.

Đối tượng hưởng lợi

Nghiên cứu sinh và học viên di truyền y học: bộ mồi 8 phân đoạn, ba chu trình nhiệt LR-PCR đã tối ưu và quy trình chuẩn bị thư viện là tài liệu kỹ thuật có thể tái lập ngay, rút ngắn giai đoạn tối ưu vốn tốn nhiều tháng.

Nhà khoa học cấp cao: dữ liệu tần suất alen quần thể Việt Nam bổ sung mắt xích còn thiếu trong bản đồ đa hình F9 toàn cầu, mở đường cho các nghiên cứu so sánh liên quần thể Đông Á – Đông Nam Á.

Bộ phận R&D và phòng xét nghiệm: thuật toán ba tầng NGS–MLPA–linkage là mô hình dịch vụ chẩn đoán có thể thương mại hóa.

Nhà hoạch định chính sách: con số 30.000 người mang gen với tỷ lệ quản lý 20% là chỉ báo định lượng trực tiếp cho việc phân bổ ngân sách sàng lọc.

Bệnh nhân và gia đình: đột biến xác định được trở thành chỉ thị phân tử suốt đời cho toàn bộ nữ giới trong phả hệ, đồng thời có giá trị tiên lượng nguy cơ chất ức chế và sốc phản vệ trước khi bắt đầu liệu pháp thay thế protein.

Câu hỏi chuyên sâu

Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất là việc mở rộng lý thuyết đa hình liên kết đặc trưng quần thể (kế thừa Graham JB, 1985 và Winship, 1989–1993) sang quần thể Việt Nam bằng phương pháp giải trình tự toàn gen thay vì sàng lọc RFLP từng locus — đảo ngược trình tự phát hiện truyền thống: thay vì kiểm tra các đa hình đã biết, nghiên cứu để dữ liệu trình tự tự bộc lộ 12 SNP hiện diện thực tế trong quần thể.

Đổi mới phương pháp thể hiện qua so sánh với hai nghiên cứu tiền lệ: Vidal và cộng sự (2000) chỉ giải trình tự 8 exon, các vùng nối intron-exon, 5'UTR và 3'UTR bằng Sanger — bỏ sót phần lớn intron; Wang và cộng sự (2016) trên 23 bệnh nhân Trung Quốc cũng giới hạn ở đột biến điểm vùng mã hóa. Nghiên cứu này phủ toàn bộ ~34 kb bao gồm toàn bộ 7 intron (trong đó intron 6 dài 9.473 bp và intron 4 dài 7.163 bp), cho phép đồng thời phát hiện đột biến và khai thác đa hình từ cùng một tập dữ liệu.

Phát hiện gây ngạc nhiên nhất là ba mẫu H14, H94, H97 âm tính hoàn toàn với giải trình tự nhưng dương tính với MLPA — chứng minh rằng ngay cả giải trình tự toàn gen với độ chính xác 100% trên biến thể điểm vẫn có "điểm mù" cấu trúc, và tỷ lệ 3% quan sát được khớp với ước tính 3–5% của y văn quốc tế.

Quy trình tái lập được cung cấp đầy đủ: trình tự mồi từng phân đoạn, thành phần phản ứng, chu trình nhiệt cho từng nhóm phân đoạn, quy trình chuẩn bị thư viện và thông số kiểm định chất lượng giải trình tự.

Chương trình nghiên cứu mười năm được phác thảo theo hướng chuyển từ mô tả sang can thiệp: từ bản đồ đột biến quốc gia → cohort theo dõi chất ức chế → sàng lọc người mang gen quy mô cộng đồng → chuẩn bị nền tảng dữ liệu di truyền cho liệu pháp gen, lĩnh vực mà hemophilia được đánh giá đặc biệt phù hợp do là bệnh đơn gen với ngưỡng điều trị thấp — chỉ cần FIX tăng 2–3% đã chuyển thể nặng sang thể nhẹ, tăng trên 30% gần như khỏi hoàn toàn, và tăng đến 150% vẫn không gây tắc mạch.

Kết luận

Sáu đóng góp cụ thể được xác lập: (1) xây dựng và tối ưu thành công quy trình LR-PCR 8 phân đoạn kết hợp NGS giải trình tự toàn bộ gen F9 ~34 kb, được khẳng định độ tin cậy bằng Sanger; (2) phát hiện 58 đột biến trên 100 bệnh nhân hemophilia B Việt Nam, trong đó 16 đột biến mới (27,6%); (3) lập bản đồ đột biến gen F9 đầu tiên của người Việt Nam theo cả vị trí trên gen và theo domain phân tử FIX; (4) xác lập tương quan giữa kiểu đột biến và mức độ bệnh trên quần thể nghiên cứu; (5) khảo sát 12 SNP trên 100 phụ nữ khỏe mạnh, xác định tần suất alen và tỷ lệ dị hợp tử đặc trưng quần thể Việt Nam — dữ liệu đầu tiên thuộc loại này; (6) phân nhóm SNP theo mức độ liên kết bằng chỉ số D' trên Haploview 4 và chắt lọc bộ đa hình có giá trị thông tin, đã được xác nhận hiệu quả trên gia đình người bệnh thực tế.

Bước tiến paradigm nằm ở chỗ chuyển chẩn đoán người mang gen hemophilia B tại Việt Nam từ trạng thái phụ thuộc dữ liệu ngoại lai sang trạng thái có nền tảng dữ liệu nội sinh, đồng thời hợp nhất hai cách tiếp cận vốn được y văn coi là thay thế nhau — phân tích trực tiếp và phân tích liên kết — thành một thuật toán bổ trợ.

Ba dòng nghiên cứu mới được mở: dịch tễ học phân tử hemophilia Việt Nam trên quy mô đa trung tâm; nghiên cứu chức năng các biến thể mới đặc hữu quần thể; và ứng dụng giải trình tự thế hệ mới cho các bệnh đơn gen liên kết X khác tại Việt Nam.

Về tính liên hệ quốc tế, dữ liệu tần suất alen người Việt lấp một khoảng trống rõ rệt trong bảng so sánh vốn chỉ có bốn quần thể — người da trắng, Nhật Bản, Trung Quốc và Mỹ gốc Phi — và cho phép kiểm định giả thuyết về gradient di truyền Đông Á – Đông Nam Á. Di sản đo lường được của công trình là bộ đa hình chẩn đoán có thể triển khai ngay và cơ sở dữ liệu đột biến làm nền cho mọi ca tư vấn di truyền hemophilia B tại Việt Nam trong các thập kỷ tới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Tổng quan về bệnh hemophilia B. Một số dấu mốc về lịch sử phát hiện và nghiên cứu bệnh hemophilia B.

Khái quát về bệnh hemophilia B. Cấu trúc và chức năng của yếu tố IX trong quá trình đông máu. Các yếu tố đông máu. Vai trò của yếu tố IX trong quá trình đông máu.

Cấu trúc yếu tố IX và quá trình hoạt hóa yếu tố IX. Mối tương tác giữa yếu tố IX với các nhân tố hoạt hóa và đồng yếu tố. Phân tích di truyền bệnh hemophilia B. Vai trò của phân tích di truyền trong bệnh hemophilia B.

Đặc điểm đột biến trên gen F9. Đặc điểm các đa hình nucleotide liên kết với gen F9. Các kỹ thuật phân tích di truyền trong bệnh hemophilia B. Kỹ thuật phân tích đột biến.

Kỹ thuật phân tích liên kết. Tình hình nghiên cứu về các biến đổi di truyền trên gen F9. Tình hình nghiên cứu trên thế giới. Tình hình nghiên cứu trong nước.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tượng nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Thiết kế nghiên cứu.

Công thức tính cỡ mẫu trong nghiên cứu đa hình nucleotide. Các bước nghiên cứu. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu. Vật tư – Trang thiết bị.

Thu thập mẫu nghiên cứu. Tách chiết ADN. Thiết kế các trình tự mồi để khuếch đại gen tổng hợp yếu tố IX. Khuếch đại các phân đoạn a1-a8 bằng kỹ thuật Longrange PCR.

Tinh sạch sản phẩm Longrange PCR khuếch đại các vùng gen F9. Khẳng định kết quả giải trình tự gen F9 trên NGS. Khẳng định các mất đoạn/lặp đoạn gen F9 bằng kỹ thuật MLPA. Phân tích đột biến gen từ dữ liệu giải trình tự.

Phân tích đa hình nucleotide trên gen F9 từ dữ liệu giải trình tự. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu. Chuẩn bị vật liệu nghiên cứu.

Xây dựng quy trình giải trình tự gen mã hóa yếu tố IX. Thiết kế bộ mồi khuếch đại toàn bộ gen F9. Tối ưu quy trình LR- PCR khuếch đại 8 vùng gen F9. Chuẩn bị thư viện ADN.

Giải trình tự với quy trình NGS đã tối ưu. Khẳng định kết quả giải trình tự NGS. Giải trình tự gen F9 ở các mẫu nghiên cứu. Phân tích đột biến gen ở 100 bệnh nhân nghiên cứu.

Kiểu đột biến gen. Tác động của các đột biến đến cấu trúc, hoạt động gen. Đánh giá mức độ lặp lại của các đột biến ở các bệnh nhân nghiên cứu. Tương quan giữa kiểu đột biến gen và mức độ bệnh.

Lập bản đồ đột biến gen F9 ở bệnh nhân hemophilia B Việt Nam. Phân bố đột biến trên gen F9. Phân bố của các đột biến trên các domain của phân tử FIX .3 Bản đồ đột biến gen F9 của bệnh nhân hemophilia B Việt Nam. Phân tích đa hình nucleotide trên gen F9.

Khảo sát đa hình nucleotide trên gen mã hoá yếu tố IX. Tần suất alen đa hình trong quần thể người bình thường. Phân tích liên kết giữa các đa hình nucleotide. Lựa chọn bộ đa hình có giá trị thông tin cao.

Xác nhận hiệu quả của bộ đa hình trên gia đình người bệnh. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu. Xây dựng quy trình NGS giải trình tự gen mã hóa yếu tố IX.

Thiết kế bộ mồi khuếch đại gen F9. Tối ưu quy trình LR-PCR khuếch đại 8 vùng gen F9. Chuẩn bị thư viện ADN. Giải trình tự gen F9 với quy trình đã tối ưu.

Đánh giá kết quả giải trình tự NGS. Giải trình tự gen F9 của các mẫu nghiên cứu. Phân tích đột biến gen của 100 bệnh nhân nghiên cứu. Đặc điểm kiểu đột biến gen gặp trong nghiên cứu.

Mối tương quan giữa kiểu đột biến gen và mức độ bệnh. Bản đồ đột biến gen F9 ở bệnh nhân hemophilia B Việt Nam. Phân bố đột biến trên gen F9. Phân bố đột biến trên phân tử protein yếu tố IX.

Đa hình di truyền trên gen F9. Khảo sát đa hình nucleotide trên gen F9. Tần suất alen đa hình trong nghiên cứu. Phân tích mối liên kết di truyền giữa các đa hình nucleotide.

Lựa chọn bộ đa hình có giá trị thông tin cao. Khẳng định hiệu quả của bộ đa hình. 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 36 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ.

37 CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI. 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 38 viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ Chú thích FIX Factor IX Yếu tố IX Hemophilia Bệnh lý rối loạn đông máu do thiếu B hụt FIX F9 Gen mã hóa yếu tố IX DNA Deoxyribonucleic Acid Phân tử ADN PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng tổng hợp chuỗi LD-PCR Long Distance PCR Phản ứng tổng hợp chuỗi dài NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự thế hệ mới Restriction Fragment Length Đa hình chiều dài các đoạn cắt giới RFLP Polymorphism hạn MLPA Multiplex Ligation-dependent Phương pháp multiplex PCR phát Probe Amplification hiện số lượng bản sao bất thường Kb Kilo base Đơn vị đo chiều dài của ADN SNP Single nucleotide polymorphism Đa hình đơn nucleotide VNTR Variable Number Tandem Repeat Các trình tự ADN lặp lại ngắn 5’UTR 5′ Untranslated Region Vùng không mã hóa ở đầu 5’ 3’UTR 3′ Untranslated Region Vùng không mã hóa ở đầu 3’ WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới European Association for EAHDA Hiệp hội bệnh hemophilia và các rối Haemophilia and Allied loạn đông máu Châu Âu Disorders United Kingdom Haemophilia Tổ chức các bác sỹ thuộc Trung tâm UKHCDO Centre Doctors’ Organisation hemophilia Vương quốc Anh CDC The Centers for Disease Control Trung tâm kiểm soát và phòng chống and Prevention bệnh dịch HGVS Human Genome Variation Hiệp hội biến đổi bộ gen người Society PolyPhen-2 Polymorphism Phenotyping v2 Phần mềm dự đoán tác động các biến đổi axit amin đến cấu trúc và chức SIFT Sorting Intolerant From Tolerant năng của phân tử protein ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Kích thước các exon và intron trên gen F9 ở người.

Tần suất alen của một số đa hình trong các quần thể khác nhau .1: Trình tự mồi giải trình tự gen F9 bằng phương pháp Sanger. Đặc điểm của các bệnh nhân nghiên cứu. Kết quả nồng độ và độ tinh sạch của một số mẫu ADN. Phân đoạn ADN và các trình tự mồi thiết kế.

Thành phần phản ứng LR-PCR khuếch đại các đoạn a1-a8. Chu trình nhiệt của phản ứng LR-PCR cho đoạn a1, a2, a5, a6, a7. Chu trình nhiệt của phản ứng LR-PCR cho đoạn a3 và a4. Chu trình nhiệt độ của phản ứng LR-PCR cho đoạn a8.

Danh sách 16 đột biến mới. Danh sách 58 đột biến phát hiện trong nghiên cứu. Đặc điểm kiểu đột biến gen gặp trong nghiên cứu. Tác động của các đột biến đến cấu trúc, hoạt động gen.

Mức độ lặp lại của các đột biến ở các bệnh nhân nghiên cứu. Tương quan giữa kiểu đột biến gen và mức độ bệnh. Danh sách 12 SNP phát hiện từ dữ liệu giải trình tự. Tần suất alen đa hình gặp trong nghiên cứu .16 : Thống kê sự đồng biểu hiện của các đa hình nucleotide.

Phân nhóm SNP theo mức độ liên kết. Bộ SNP có giá trị thông tin. Tỷ lệ đột biến mới trong một số nghiên cứu trên thế giới. Tần suất alen đa hình ở một số quần thể khác nhau.

Tần suất alen của đa hình MseI ở các quần thể trên thế giới. Tần suất dị hợp tử của một số đa hình liên kết với gen F9 ở các quần thể. 119 x DANH MỤC HÌNH Hình 1. Sơ đồ di truyền trong bệnh hemophilia B.

Sơ đồ con đường đông máu. Cấu trúc phân tử yếu tố IX. Tương tác của yếu tố FIXa với phức hợp TF/FVIIa. Tương tác của FIXa với FVIIIa.

Các vị trí đột biến trên trình tự phân tử FIX. Kiểu đột biến và tỷ lệ đột biến trong gen F9 .8: Sơ đồ các đột biến điểm trong vùng promoter của gen F9. Số đột biến mới được công bố hàng năm. Vị trí đa hình trên gen F9 .2: Xác định giá trị D’ trên phần mềm Haploview.

Kết quả tách chiết ADN tổng số. Kết quả kiểm tra độ bao phủ gen F9 của các trình tự mồi. Kết quả phản ứng LR-PCR tối ưu đoạn a1 và a2. Kết quả phản ứng LR-PCR tối ưu đoạn a3 và a4.

Kết quả phản ứng LR-PCR tối ưu đoạn a5 và a6. Kết quả phản ứng LR-PCR tối ưu đoạn a7 và a8. Kết quả phản ứng LR-PCR tối ưu đoạn a8. Kết quả phản ứng LR-PCR tối ưu đoạn a8.

Hình ảnh khuếch đại các phân đoạn a1-a8 ở điều kiện Tm tối ưu. Kết quả kiểm tra thư viện ADN trên hệ thống điện di mao quản. Các chỉ số chất lượng và hình ảnh kết quả giải trình tự. Kết quả phân tích đột biến với quy trình NGS và Sanger.

Kết quả Longrange PCR của các mẫu H14, H94, H97. Kết quả giải trình tự gen NGS của các mẫu H14, H94, H97. Kết quả phân tích MLPA của các mẫu H14, H94, H97. Phân bố đột biến trên gen F9.

Phân bố đột biến trên domain của phân tử FIX. Bản đồ đột biến gen F9 của bệnh nhân hemophilia B ở Việt Nam. Kết quả phân tích mối liên kết giữa các trên phần mềm Haploview 4. Kết quả khảo sát hiệu quả của bộ đa hình nucleotide.

93 1 MỞ ĐẦU Hemophilia B là hội chứng rối loạn chảy máu nghiêm trọng. Biểu hiện chính của bệnh là hiện tượng chảy máu lâu cầm sau nhổ răng, vết rách, sau chấn thương, sau phẫu thuật hoặc chảy máu sinh lý khác. Ở bệnh mức độ nặng hiện tượng chảy máu trong có thể gây tổn thương các cơ quan và mô, dẫn đến tàn phế và đe dọa tính mạng của người bệnh [1] [2]. Đây là bệnh lý dai dẳng, khó điều trị và ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống của người bệnh.

Hemophilia B chiếm tỷ lệ từ 15-20% trong nhóm bệnh hemophilia với tỷ lệ mắc bệnh là 1:30. Cơ chế sinh bệnh xuất phát từ các đột biến trên gen mã hóa yếu tố IX (gen F9). Các đột biến tác động làm suy giảm hoặc làm ngừng quá trình tổng hợp yếu tố IX của gen, gây thiếu hụt yếu tố IX và dẫn đến hiện tượng chảy máu kéo dài. Gen F9 là gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể X (Xq27.