Luận án tiến sĩ sinh học: Nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền trên gen mã hóa yếu tố IX ở bệnh nhân Hemophilia B

• Tác giả: Vũ Thị Bích Hường
• Người hướng dẫn: TS. Dương Quốc Chính, Phó trưởng bộ môn Huyết học – Truyền máu, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền gen yếu tố IX ở bệnh nhân Hemophilia B
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1.1. Tổng quan về bệnh hemophilia B
• 1.1.2. Một số dấu mốc về lịch sử phát hiện và nghiên cứu bệnh hemophilia B
• 1.2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 1.2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
• 1.2.2.2. Công thức tính cỡ mẫu trong nghiên cứu đa hình nucleotide
• 1.2.2.3. Các bước nghiên cứu
• 1.2.2.4. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu. Vật tư – Trang thiết bị
• 1.2.2.5. Thu thập mẫu nghiên cứu
• 1.2.2.6. Tách chiết ADN
• 1.2.2.7. Thiết kế các trình tự mồi để khuếch đại gen tổng hợp yếu tố IX
• 1.2.2.8. Khuếch đại các phân đoạn a1-a8 bằng kỹ thuật Longrange PCR
• 1.2.2.9. Tinh sạch sản phẩm Longrange PCR khuếch đại các vùng gen F9
• 1.2.2.10. Khẳng định kết quả giải trình tự gen F9 trên NGS
• 1.2.2.11. Khẳng định các mất đoạn/lặp đoạn gen F9 bằng kỹ thuật MLPA
• 1.2.2.12. Phân tích đột biến gen từ dữ liệu giải trình tự
• 1.2.2.13. Phân tích đa hình nucleotide trên gen F9 từ dữ liệu giải trình tự
• 1.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 1.3.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu
• 1.3.2. Chuẩn bị vật liệu nghiên cứu
• 1.3.3. Xây dựng quy trình giải trình tự gen mã hóa yếu tố IX
• 1.3.3.1. Thiết kế bộ mồi khuếch đại toàn bộ gen F9
• 1.3.3.2. Tối ưu quy trình LR-PCR khuếch đại 8 vùng gen F9
• 1.3.3.3. Chuẩn bị thư viện ADN
• 1.3.3.4. Giải trình tự với quy trình NGS đã tối ưu
• 1.3.3.5. Khẳng định kết quả giải trình tự NGS
• 1.3.4. Giải trình tự gen F9 ở các mẫu nghiên cứu. Phân tích đột biến gen ở 100 bệnh nhân nghiên cứu
• 1.3.4.1. Kiểu đột biến gen. Tác động của các đột biến đến cấu trúc, hoạt động gen
• 1.3.4.2. Đánh giá mức độ lặp lại của các đột biến ở các bệnh nhân nghiên cứu
• 1.3.4.3. Tương quan giữa kiểu đột biến gen và mức độ bệnh
• 1.3.4.4. Lập bản đồ đột biến gen F9 ở bệnh nhân hemophilia B Việt Nam. Phân bố đột biến trên gen F9
• 1.3.4.5. Phân bố của các đột biến trên các domain của phân tử FIX
• 1.3.5. Phân tích đa hình nucleotide trên gen F9. Khảo sát đa hình nucleotide trên gen mã hoá yếu tố IX. Tần suất alen đa hình trong quần thể người bình thường
• 1.3.6. Phân tích liên kết giữa các đa hình nucleotide. Lựa chọn bộ đa hình có giá trị thông tin cao. Xác nhận hiệu quả của bộ đa hình trên gia đình người bệnh
• 1.4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 1.4.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu
• 1.4.2. Xây dựng quy trình NGS giải trình tự gen mã hóa yếu tố IX
• 1.4.3. Thiết kế bộ mồi khuếch đại gen F9
• 1.4.4. Tối ưu quy trình LR-PCR khuếch đại 8 vùng gen F9
• 1.4.5. Chuẩn bị thư viện ADN
• 1.4.6. Giải trình tự gen F9 với quy trình đã tối ưu
• 1.4.7. Đánh giá kết quả giải trình tự NGS
• 1.4.8. Giải trình tự gen F9 của các mẫu nghiên cứu
• 1.4.9. Phân tích đột biến gen của 100 bệnh nhân nghiên cứu
• 1.4.10. Đặc điểm kiểu đột biến gen gặp trong nghiên cứu
• 1.4.11. Mối tương quan giữa kiểu đột biến gen và mức độ bệnh
• 1.4.12. Bản đồ đột biến gen F9 ở bệnh nhân hemophilia B Việt Nam
• 1.4.13. Phân bố đột biến trên gen F9
• 1.4.14. Phân bố đột biến trên phân tử protein yếu tố IX
• 1.4.15. Đa hình di truyền trên gen F9
• 1.4.16. Khảo sát đa hình nucleotide trên gen F9
• 1.4.17. Tần suất alen đa hình trong nghiên cứu
• 1.4.18. Phân tích mối liên kết di truyền giữa các đa hình nucleotide
• 1.4.19. Lựa chọn bộ đa hình có giá trị thông tin cao
• 1.4.20. Khẳng định hiệu quả của bộ đa hình
• 2. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ
• CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng quan về bệnh hemophilia B

Bệnh hemophilia B là một rối loạn di truyền nghiêm trọng, chủ yếu do đột biến trên gen mã hóa yếu tố IX (gen F9). Bệnh này gây ra hiện tượng chảy máu kéo dài, ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân. Theo thống kê, hemophilia B chiếm khoảng 15-20% tổng số ca bệnh hemophilia, với tỷ lệ mắc bệnh là 1:30. Cơ chế bệnh lý chủ yếu liên quan đến sự thiếu hụt yếu tố IX, dẫn đến rối loạn quá trình đông máu. Đột biến gen F9 có thể gây ra các dạng bệnh khác nhau, từ nhẹ đến nặng, tùy thuộc vào mức độ thiếu hụt yếu tố IX. Việc hiểu rõ về bệnh lý này là rất quan trọng để phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị hiệu quả.

1.1. Đặc điểm di truyền của bệnh hemophilia B

Hemophilia B là bệnh di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể X. Nam giới có nguy cơ mắc bệnh cao hơn, trong khi phụ nữ thường là người mang gen bệnh. Tình trạng này dẫn đến việc các thế hệ sau có thể bị ảnh hưởng nếu không có biện pháp chẩn đoán và quản lý kịp thời. Việc phát hiện người mang gen bệnh là rất quan trọng để ngăn ngừa sự lây truyền trong gia đình. Các phương pháp chẩn đoán hiện nay bao gồm phân tích trực tiếp đột biến và phân tích gián tiếp thông qua các đa hình nucleotide liên kết với gen F9.

II. Đột biến và đa hình di truyền gen yếu tố IX

Nghiên cứu về đột biến và đa hình di truyền trên gen yếu tố IX là rất cần thiết để hiểu rõ hơn về bệnh hemophilia B. Các đột biến trên gen F9 có thể dẫn đến sự thiếu hụt yếu tố IX, gây ra các triệu chứng lâm sàng nghiêm trọng. Đến nay, đã có hơn 1000 đột biến được ghi nhận trên thế giới, trong đó có nhiều đột biến mới được phát hiện trong nghiên cứu này. Việc lập bản đồ đột biến gen F9 sẽ giúp xác định các kiểu đột biến phổ biến trong quần thể bệnh nhân hemophilia B tại Việt Nam, từ đó hỗ trợ cho việc chẩn đoán và điều trị.

2.1. Phân tích đột biến gen F9

Phân tích đột biến gen F9 được thực hiện thông qua các kỹ thuật hiện đại như giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) và phân tích MLPA. Các kết quả cho thấy sự phân bố đột biến không đồng đều trên các exon và intron của gen F9. Đặc biệt, một số đột biến có thể gây ra các biến đổi nghiêm trọng trong cấu trúc và chức năng của yếu tố IX, ảnh hưởng đến quá trình đông máu. Việc hiểu rõ về các đột biến này không chỉ giúp trong việc chẩn đoán mà còn trong việc phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả hơn cho bệnh nhân.

III. Giá trị và ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu

Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin quý giá về đột biến và đa hình di truyền trên gen yếu tố IX mà còn mở ra hướng đi mới trong việc chẩn đoán và quản lý bệnh hemophilia B tại Việt Nam. Việc lập bản đồ đột biến gen F9 sẽ giúp các bác sĩ và nhà nghiên cứu có cái nhìn tổng quan về tình hình bệnh lý trong quần thể, từ đó đưa ra các biện pháp can thiệp kịp thời. Hơn nữa, nghiên cứu cũng góp phần nâng cao nhận thức về bệnh hemophilia B trong cộng đồng, khuyến khích việc chẩn đoán sớm và tư vấn tiền hôn nhân cho các cặp đôi có nguy cơ.

3.1. Ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong việc phát triển các bộ xét nghiệm chẩn đoán nhanh và chính xác cho bệnh hemophilia B. Ngoài ra, việc xác định các đa hình nucleotide có tỷ lệ dị hợp tử cao sẽ hỗ trợ cho việc chẩn đoán người mang gen bệnh thông qua phương pháp phân tích liên kết. Điều này không chỉ giúp giảm thiểu tỷ lệ mắc bệnh mà còn nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân và gia đình họ.