Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền trên gen mã hóa yếu tố ix ở bệnh nhân hemophilia b

Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền trên gen mã hóa yếu tố IX ở bệnh nhân Hemophilia B, cung cấp hiểu biết sâu về cơ chế bệnh.

• Tác giả: Vũ Thị Bích Hường
• Người hướng dẫn: TS. Dương Quốc Chính, Phó trưởng bộ môn Huyết học – Truyền máu, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền gen yếu tố IX ở bệnh nhân Hemophilia B
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1.1. Tổng quan về bệnh hemophilia B
• 1.1.2. Một số dấu mốc về lịch sử phát hiện và nghiên cứu bệnh hemophilia B
• 1.2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 1.2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
• 1.2.2.2. Công thức tính cỡ mẫu trong nghiên cứu đa hình nucleotide
• 1.2.2.3. Các bước nghiên cứu
• 1.2.2.4. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu. Vật tư – Trang thiết bị
• 1.2.2.5. Thu thập mẫu nghiên cứu
• 1.2.2.6. Tách chiết ADN
• 1.2.2.7. Thiết kế các trình tự mồi để khuếch đại gen tổng hợp yếu tố IX
• 1.2.2.8. Khuếch đại các phân đoạn a1-a8 bằng kỹ thuật Longrange PCR
• 1.2.2.9. Tinh sạch sản phẩm Longrange PCR khuếch đại các vùng gen F9
• 1.2.2.10. Khẳng định kết quả giải trình tự gen F9 trên NGS
• 1.2.2.11. Khẳng định các mất đoạn/lặp đoạn gen F9 bằng kỹ thuật MLPA
• 1.2.2.12. Phân tích đột biến gen từ dữ liệu giải trình tự
• 1.2.2.13. Phân tích đa hình nucleotide trên gen F9 từ dữ liệu giải trình tự
• 1.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 1.3.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu
• 1.3.2. Chuẩn bị vật liệu nghiên cứu
• 1.3.3. Xây dựng quy trình giải trình tự gen mã hóa yếu tố IX
• 1.3.3.1. Thiết kế bộ mồi khuếch đại toàn bộ gen F9
• 1.3.3.2. Tối ưu quy trình LR-PCR khuếch đại 8 vùng gen F9
• 1.3.3.3. Chuẩn bị thư viện ADN
• 1.3.3.4. Giải trình tự với quy trình NGS đã tối ưu
• 1.3.3.5. Khẳng định kết quả giải trình tự NGS
• 1.3.4. Giải trình tự gen F9 ở các mẫu nghiên cứu. Phân tích đột biến gen ở 100 bệnh nhân nghiên cứu
• 1.3.4.1. Kiểu đột biến gen. Tác động của các đột biến đến cấu trúc, hoạt động gen
• 1.3.4.2. Đánh giá mức độ lặp lại của các đột biến ở các bệnh nhân nghiên cứu
• 1.3.4.3. Tương quan giữa kiểu đột biến gen và mức độ bệnh
• 1.3.4.4. Lập bản đồ đột biến gen F9 ở bệnh nhân hemophilia B Việt Nam. Phân bố đột biến trên gen F9
• 1.3.4.5. Phân bố của các đột biến trên các domain của phân tử FIX
• 1.3.5. Phân tích đa hình nucleotide trên gen F9. Khảo sát đa hình nucleotide trên gen mã hoá yếu tố IX. Tần suất alen đa hình trong quần thể người bình thường
• 1.3.6. Phân tích liên kết giữa các đa hình nucleotide. Lựa chọn bộ đa hình có giá trị thông tin cao. Xác nhận hiệu quả của bộ đa hình trên gia đình người bệnh
• 1.4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 1.4.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu
• 1.4.2. Xây dựng quy trình NGS giải trình tự gen mã hóa yếu tố IX
• 1.4.3. Thiết kế bộ mồi khuếch đại gen F9
• 1.4.4. Tối ưu quy trình LR-PCR khuếch đại 8 vùng gen F9
• 1.4.5. Chuẩn bị thư viện ADN
• 1.4.6. Giải trình tự gen F9 với quy trình đã tối ưu
• 1.4.7. Đánh giá kết quả giải trình tự NGS
• 1.4.8. Giải trình tự gen F9 của các mẫu nghiên cứu
• 1.4.9. Phân tích đột biến gen của 100 bệnh nhân nghiên cứu
• 1.4.10. Đặc điểm kiểu đột biến gen gặp trong nghiên cứu
• 1.4.11. Mối tương quan giữa kiểu đột biến gen và mức độ bệnh
• 1.4.12. Bản đồ đột biến gen F9 ở bệnh nhân hemophilia B Việt Nam
• 1.4.13. Phân bố đột biến trên gen F9
• 1.4.14. Phân bố đột biến trên phân tử protein yếu tố IX
• 1.4.15. Đa hình di truyền trên gen F9
• 1.4.16. Khảo sát đa hình nucleotide trên gen F9
• 1.4.17. Tần suất alen đa hình trong nghiên cứu
• 1.4.18. Phân tích mối liên kết di truyền giữa các đa hình nucleotide
• 1.4.19. Lựa chọn bộ đa hình có giá trị thông tin cao
• 1.4.20. Khẳng định hiệu quả của bộ đa hình
• 2. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ
• CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về bệnh hemophilia B

Bệnh hemophilia B là một rối loạn di truyền nghiêm trọng, chủ yếu do đột biến trên gen mã hóa yếu tố IX (gen F9). Bệnh này gây ra hiện tượng chảy máu kéo dài, ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân. Theo thống kê, hemophilia B chiếm khoảng 15-20% tổng số ca bệnh hemophilia, với tỷ lệ mắc bệnh là 1:30. Cơ chế bệnh lý chủ yếu liên quan đến sự thiếu hụt yếu tố IX, dẫn đến rối loạn quá trình đông máu. Đột biến gen F9 có thể gây ra các dạng bệnh khác nhau, từ nhẹ đến nặng, tùy thuộc vào mức độ thiếu hụt yếu tố IX. Việc hiểu rõ về bệnh lý này là rất quan trọng để phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị hiệu quả.

1.1. Đặc điểm di truyền của bệnh hemophilia B

Hemophilia B là bệnh di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể X. Nam giới có nguy cơ mắc bệnh cao hơn, trong khi phụ nữ thường là người mang gen bệnh. Tình trạng này dẫn đến việc các thế hệ sau có thể bị ảnh hưởng nếu không có biện pháp chẩn đoán và quản lý kịp thời. Việc phát hiện người mang gen bệnh là rất quan trọng để ngăn ngừa sự lây truyền trong gia đình. Các phương pháp chẩn đoán hiện nay bao gồm phân tích trực tiếp đột biến và phân tích gián tiếp thông qua các đa hình nucleotide liên kết với gen F9.

II. Đột biến và đa hình di truyền gen yếu tố IX

Nghiên cứu về đột biến và đa hình di truyền trên gen yếu tố IX là rất cần thiết để hiểu rõ hơn về bệnh hemophilia B. Các đột biến trên gen F9 có thể dẫn đến sự thiếu hụt yếu tố IX, gây ra các triệu chứng lâm sàng nghiêm trọng. Đến nay, đã có hơn 1000 đột biến được ghi nhận trên thế giới, trong đó có nhiều đột biến mới được phát hiện trong nghiên cứu này. Việc lập bản đồ đột biến gen F9 sẽ giúp xác định các kiểu đột biến phổ biến trong quần thể bệnh nhân hemophilia B tại Việt Nam, từ đó hỗ trợ cho việc chẩn đoán và điều trị.

2.1. Phân tích đột biến gen F9

Phân tích đột biến gen F9 được thực hiện thông qua các kỹ thuật hiện đại như giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) và phân tích MLPA. Các kết quả cho thấy sự phân bố đột biến không đồng đều trên các exon và intron của gen F9. Đặc biệt, một số đột biến có thể gây ra các biến đổi nghiêm trọng trong cấu trúc và chức năng của yếu tố IX, ảnh hưởng đến quá trình đông máu. Việc hiểu rõ về các đột biến này không chỉ giúp trong việc chẩn đoán mà còn trong việc phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả hơn cho bệnh nhân.

III. Giá trị và ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu

Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin quý giá về đột biến và đa hình di truyền trên gen yếu tố IX mà còn mở ra hướng đi mới trong việc chẩn đoán và quản lý bệnh hemophilia B tại Việt Nam. Việc lập bản đồ đột biến gen F9 sẽ giúp các bác sĩ và nhà nghiên cứu có cái nhìn tổng quan về tình hình bệnh lý trong quần thể, từ đó đưa ra các biện pháp can thiệp kịp thời. Hơn nữa, nghiên cứu cũng góp phần nâng cao nhận thức về bệnh hemophilia B trong cộng đồng, khuyến khích việc chẩn đoán sớm và tư vấn tiền hôn nhân cho các cặp đôi có nguy cơ.

3.1. Ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong việc phát triển các bộ xét nghiệm chẩn đoán nhanh và chính xác cho bệnh hemophilia B. Ngoài ra, việc xác định các đa hình nucleotide có tỷ lệ dị hợp tử cao sẽ hỗ trợ cho việc chẩn đoán người mang gen bệnh thông qua phương pháp phân tích liên kết. Điều này không chỉ giúp giảm thiểu tỷ lệ mắc bệnh mà còn nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân và gia đình họ.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Tổng quan về bệnh hemophilia B. Một số dấu mốc về lịch sử phát hiện và nghiên cứu bệnh hemophilia B.

Khái quát về bệnh hemophilia B. Cấu trúc và chức năng của yếu tố IX trong quá trình đông máu. Các yếu tố đông máu. Vai trò của yếu tố IX trong quá trình đông máu.

Cấu trúc yếu tố IX và quá trình hoạt hóa yếu tố IX. Mối tương tác giữa yếu tố IX với các nhân tố hoạt hóa và đồng yếu tố. Phân tích di truyền bệnh hemophilia B. Vai trò của phân tích di truyền trong bệnh hemophilia B.

Đặc điểm đột biến trên gen F9. Đặc điểm các đa hình nucleotide liên kết với gen F9. Các kỹ thuật phân tích di truyền trong bệnh hemophilia B. Kỹ thuật phân tích đột biến.

Kỹ thuật phân tích liên kết. Tình hình nghiên cứu về các biến đổi di truyền trên gen F9. Tình hình nghiên cứu trên thế giới. Tình hình nghiên cứu trong nước.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tượng nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Thiết kế nghiên cứu.

Công thức tính cỡ mẫu trong nghiên cứu đa hình nucleotide. Các bước nghiên cứu. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu. Vật tư – Trang thiết bị.

Thu thập mẫu nghiên cứu. Tách chiết ADN. Thiết kế các trình tự mồi để khuếch đại gen tổng hợp yếu tố IX. Khuếch đại các phân đoạn a1-a8 bằng kỹ thuật Longrange PCR.

Tinh sạch sản phẩm Longrange PCR khuếch đại các vùng gen F9. Khẳng định kết quả giải trình tự gen F9 trên NGS. Khẳng định các mất đoạn/lặp đoạn gen F9 bằng kỹ thuật MLPA. Phân tích đột biến gen từ dữ liệu giải trình tự.

Phân tích đa hình nucleotide trên gen F9 từ dữ liệu giải trình tự. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu. Chuẩn bị vật liệu nghiên cứu.

Xây dựng quy trình giải trình tự gen mã hóa yếu tố IX. Thiết kế bộ mồi khuếch đại toàn bộ gen F9. Tối ưu quy trình LR- PCR khuếch đại 8 vùng gen F9. Chuẩn bị thư viện ADN.

Giải trình tự với quy trình NGS đã tối ưu. Khẳng định kết quả giải trình tự NGS. Giải trình tự gen F9 ở các mẫu nghiên cứu. Phân tích đột biến gen ở 100 bệnh nhân nghiên cứu.

Kiểu đột biến gen. Tác động của các đột biến đến cấu trúc, hoạt động gen. Đánh giá mức độ lặp lại của các đột biến ở các bệnh nhân nghiên cứu. Tương quan giữa kiểu đột biến gen và mức độ bệnh.

Lập bản đồ đột biến gen F9 ở bệnh nhân hemophilia B Việt Nam. Phân bố đột biến trên gen F9. Phân bố của các đột biến trên các domain của phân tử FIX .3 Bản đồ đột biến gen F9 của bệnh nhân hemophilia B Việt Nam. Phân tích đa hình nucleotide trên gen F9.

Khảo sát đa hình nucleotide trên gen mã hoá yếu tố IX. Tần suất alen đa hình trong quần thể người bình thường. Phân tích liên kết giữa các đa hình nucleotide. Lựa chọn bộ đa hình có giá trị thông tin cao.

Xác nhận hiệu quả của bộ đa hình trên gia đình người bệnh. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu. Xây dựng quy trình NGS giải trình tự gen mã hóa yếu tố IX.

Thiết kế bộ mồi khuếch đại gen F9. Tối ưu quy trình LR-PCR khuếch đại 8 vùng gen F9. Chuẩn bị thư viện ADN. Giải trình tự gen F9 với quy trình đã tối ưu.

Đánh giá kết quả giải trình tự NGS. Giải trình tự gen F9 của các mẫu nghiên cứu. Phân tích đột biến gen của 100 bệnh nhân nghiên cứu. Đặc điểm kiểu đột biến gen gặp trong nghiên cứu.

Mối tương quan giữa kiểu đột biến gen và mức độ bệnh. Bản đồ đột biến gen F9 ở bệnh nhân hemophilia B Việt Nam. Phân bố đột biến trên gen F9. Phân bố đột biến trên phân tử protein yếu tố IX.

Đa hình di truyền trên gen F9. Khảo sát đa hình nucleotide trên gen F9. Tần suất alen đa hình trong nghiên cứu. Phân tích mối liên kết di truyền giữa các đa hình nucleotide.

Lựa chọn bộ đa hình có giá trị thông tin cao. Khẳng định hiệu quả của bộ đa hình. 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 36 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ.

37 CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI. 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 38 viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ Chú thích FIX Factor IX Yếu tố IX Hemophilia Bệnh lý rối loạn đông máu do thiếu B hụt FIX F9 Gen mã hóa yếu tố IX DNA Deoxyribonucleic Acid Phân tử ADN PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng tổng hợp chuỗi LD-PCR Long Distance PCR Phản ứng tổng hợp chuỗi dài NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự thế hệ mới Restriction Fragment Length Đa hình chiều dài các đoạn cắt giới RFLP Polymorphism hạn MLPA Multiplex Ligation-dependent Phương pháp multiplex PCR phát Probe Amplification hiện số lượng bản sao bất thường Kb Kilo base Đơn vị đo chiều dài của ADN SNP Single nucleotide polymorphism Đa hình đơn nucleotide VNTR Variable Number Tandem Repeat Các trình tự ADN lặp lại ngắn 5’UTR 5′ Untranslated Region Vùng không mã hóa ở đầu 5’ 3’UTR 3′ Untranslated Region Vùng không mã hóa ở đầu 3’ WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới European Association for EAHDA Hiệp hội bệnh hemophilia và các rối Haemophilia and Allied loạn đông máu Châu Âu Disorders United Kingdom Haemophilia Tổ chức các bác sỹ thuộc Trung tâm UKHCDO Centre Doctors’ Organisation hemophilia Vương quốc Anh CDC The Centers for Disease Control Trung tâm kiểm soát và phòng chống and Prevention bệnh dịch HGVS Human Genome Variation Hiệp hội biến đổi bộ gen người Society PolyPhen-2 Polymorphism Phenotyping v2 Phần mềm dự đoán tác động các biến đổi axit amin đến cấu trúc và chức SIFT Sorting Intolerant From Tolerant năng của phân tử protein ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Kích thước các exon và intron trên gen F9 ở người.

Tần suất alen của một số đa hình trong các quần thể khác nhau .1: Trình tự mồi giải trình tự gen F9 bằng phương pháp Sanger. Đặc điểm của các bệnh nhân nghiên cứu. Kết quả nồng độ và độ tinh sạch của một số mẫu ADN. Phân đoạn ADN và các trình tự mồi thiết kế.

Thành phần phản ứng LR-PCR khuếch đại các đoạn a1-a8. Chu trình nhiệt của phản ứng LR-PCR cho đoạn a1, a2, a5, a6, a7. Chu trình nhiệt của phản ứng LR-PCR cho đoạn a3 và a4. Chu trình nhiệt độ của phản ứng LR-PCR cho đoạn a8.

Danh sách 16 đột biến mới. Danh sách 58 đột biến phát hiện trong nghiên cứu. Đặc điểm kiểu đột biến gen gặp trong nghiên cứu. Tác động của các đột biến đến cấu trúc, hoạt động gen.

Mức độ lặp lại của các đột biến ở các bệnh nhân nghiên cứu. Tương quan giữa kiểu đột biến gen và mức độ bệnh. Danh sách 12 SNP phát hiện từ dữ liệu giải trình tự. Tần suất alen đa hình gặp trong nghiên cứu .16 : Thống kê sự đồng biểu hiện của các đa hình nucleotide.

Phân nhóm SNP theo mức độ liên kết. Bộ SNP có giá trị thông tin. Tỷ lệ đột biến mới trong một số nghiên cứu trên thế giới. Tần suất alen đa hình ở một số quần thể khác nhau.

Tần suất alen của đa hình MseI ở các quần thể trên thế giới. Tần suất dị hợp tử của một số đa hình liên kết với gen F9 ở các quần thể. 119 x DANH MỤC HÌNH Hình 1. Sơ đồ di truyền trong bệnh hemophilia B.

Sơ đồ con đường đông máu. Cấu trúc phân tử yếu tố IX. Tương tác của yếu tố FIXa với phức hợp TF/FVIIa. Tương tác của FIXa với FVIIIa.

Các vị trí đột biến trên trình tự phân tử FIX. Kiểu đột biến và tỷ lệ đột biến trong gen F9 .8: Sơ đồ các đột biến điểm trong vùng promoter của gen F9. Số đột biến mới được công bố hàng năm. Vị trí đa hình trên gen F9 .2: Xác định giá trị D’ trên phần mềm Haploview.

Kết quả tách chiết ADN tổng số. Kết quả kiểm tra độ bao phủ gen F9 của các trình tự mồi. Kết quả phản ứng LR-PCR tối ưu đoạn a1 và a2. Kết quả phản ứng LR-PCR tối ưu đoạn a3 và a4.

Kết quả phản ứng LR-PCR tối ưu đoạn a5 và a6. Kết quả phản ứng LR-PCR tối ưu đoạn a7 và a8. Kết quả phản ứng LR-PCR tối ưu đoạn a8. Kết quả phản ứng LR-PCR tối ưu đoạn a8.

Hình ảnh khuếch đại các phân đoạn a1-a8 ở điều kiện Tm tối ưu. Kết quả kiểm tra thư viện ADN trên hệ thống điện di mao quản. Các chỉ số chất lượng và hình ảnh kết quả giải trình tự. Kết quả phân tích đột biến với quy trình NGS và Sanger.

Kết quả Longrange PCR của các mẫu H14, H94, H97. Kết quả giải trình tự gen NGS của các mẫu H14, H94, H97. Kết quả phân tích MLPA của các mẫu H14, H94, H97. Phân bố đột biến trên gen F9.

Phân bố đột biến trên domain của phân tử FIX. Bản đồ đột biến gen F9 của bệnh nhân hemophilia B ở Việt Nam. Kết quả phân tích mối liên kết giữa các trên phần mềm Haploview 4. Kết quả khảo sát hiệu quả của bộ đa hình nucleotide.

93 1 MỞ ĐẦU Hemophilia B là hội chứng rối loạn chảy máu nghiêm trọng. Biểu hiện chính của bệnh là hiện tượng chảy máu lâu cầm sau nhổ răng, vết rách, sau chấn thương, sau phẫu thuật hoặc chảy máu sinh lý khác. Ở bệnh mức độ nặng hiện tượng chảy máu trong có thể gây tổn thương các cơ quan và mô, dẫn đến tàn phế và đe dọa tính mạng của người bệnh [1] [2]. Đây là bệnh lý dai dẳng, khó điều trị và ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống của người bệnh.

Hemophilia B chiếm tỷ lệ từ 15-20% trong nhóm bệnh hemophilia với tỷ lệ mắc bệnh là 1:30. Cơ chế sinh bệnh xuất phát từ các đột biến trên gen mã hóa yếu tố IX (gen F9). Các đột biến tác động làm suy giảm hoặc làm ngừng quá trình tổng hợp yếu tố IX của gen, gây thiếu hụt yếu tố IX và dẫn đến hiện tượng chảy máu kéo dài. Gen F9 là gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể X (Xq27.