CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Cấu tạo hóa học Thuật ngữ “Betalains” bắt nguồn từ tên Latin của củ dền (Beta vulgaris). So với các nhóm chất màu khác như carotenoids, chlorophylls và anthocyanins thì betalains ít được nghiên cứu hơn [Stintzing và cộng sự, 2006]. Hiện nay, betalains có khoảng 55 cấu trúc bao gồm 2 nhóm betacyanins (đỏ tím) và betaxanthins (vàng cam).
Betalains là chất màu tan trong nước có chứa nitơ, được sinh tổng hợp từ tyrosine.1: Cấu trúc của betalamic acid (a), betacyanins (b) and betaxanthins (c). R3=nhóm amine hoặc amino acid) Betalamic acid là cấu trúc mang màu phổ biến trong tất cả các chất màu betalains [Strack và cộng sự, 2003] (hình 1a), phần còn lại của betalamic acid quyết định nhóm chất màu là betacyanins hay betaxanthins (hình 1b và 1c). Sự khác biệt trong cấu trúc của betacyanins và betaxanthins làm cho chúng có độ hấp thu quang phổ khác nhau, betacyanins hấp thu tối đa ở bước sóng 540 nm và betaxanthins hấp thu tối đa ở 480 nm [Jackman và cộng sự, 1996; Strack và cộng sự, 2003]. Betalains hình thành khi betalamic acid liên kết với cyclo-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-L-alanine (cyclo-dopa), amino acid hoặc amine.
2 Betanidin là cấu trúc phi đường (rượu, acid, aldehyde, phenol, tannin…) có trong hầu hết betacyanins, kiểu thay thế khác nhau trong cấu trúc ở một hoặc hai nhóm hydroxyl của betanidin (ở vị trí 5 hoặc 6) làm xuất hiện các loại betacyanins khác nhau. Cấu trúc thường thấy là 5-O-glucosides, nhưng 6-O-glucosides cũng thường được phát hiện. Không có loại betacyanins nào có cả hai gốc đường trong thành phần cấu tạo [Delgado-Vargas và cộng sự, 2000]. Betacyanins phổ biến nhất là betanidin-5-O-β-glycoside (betanin) – màu đỏ trong củ dền [Stintzing và cộng sự, 2004].
Tính chất của betalains Betalains là chất màu trong không bào, tan nhiều và ổn định trong nước hơn trong cồn. Betalains tan trong nước tốt hơn anthocyanins [Stintzing và cộng sự, 2006] và khả năng nhuộm màu tốt hơn gấp 3 lần so với anthocyanins [Stintzing và cộng sự, 2007]. Ngoài ra, betalains bền ở khoảng pH từ 3 tới 7 thích hợp với các sản phẩm thực phẩm có pH từ acid tới trung tính. Betalains có hệ số hấp thu phân tử lớn trong vùng ánh sáng thấy được nên có thể dễ dàng phát hiện ra chúng trong dịch trích của các loại thực vật khác nhau.
Betacyanins có khối lượng phân tử là 565 Da và betaxanthins có khối lượng phân tử là 309 Da. Betalains là chất màu tự nhiên được sử dụng rộng rãi trong các quá trình chế biến thực phẩm, các sản phẩm mỹ phẩm và dược phẩm. Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để xác định sự phân hủy và ổn định [Reynoso và cộng sự, 1997], sự đột biến [Schwartz và cộng sự, 1983] và độc tính cho thấy rằng nhóm màu này không gây hại đối với sức khỏe con người. Betalains là một nhóm các hợp chất có khả năng chống oxy hóa và quét gốc tự do [Pedreno và cộng sự, 2000; Kanner và cộng sự, 2001; Georgiev và cộng sự, 2010].
Betacyanins như là betanin và betanidin, betaxanthins như là indicaxathin và vulgaxanthin đã được chứng minh rằng đều có khả năng làm giảm các ion tự do. Các ion này hình thành do sự oxy hóa gián tiếp của enzyme horseradish peroxidase, hydrogen peroxide, hoặc là phản ứng với potassium persulfate (K2S2O8). Khi được 3 biểu diễn dưới dạng đương lượng Trolox, betacyanins có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn betaxanthins [Escribano và cộng sự, 1997; Butera và cộng sự, 2002]. Sự khác nhau này là do cấu tạo hóa học của betacyanins và betaxanthins.
Trong cấu tạo của betacyanins có chứa gốc glucose ở vị trí ortho dường như ngăn chặn nhóm phenolic phản ứng với gốc tự do và khi đó nhóm amine đóng vai trò là nhóm cho điện tử. Giả thiết này dựa trên phản ứng của ethoxyquin và hoạt tính của vòng amine khi bị oxy hóa. Ngược lại, betaxanthins chỉ chứa duy nhất vòng amine. Trong một vài nghiên cứu trước đây của Kanner và cộng sự [2001] đã chứng minh là betacyanins có hoạt tính chống oxy hóa mạnh và có tác dụng sinh học ở người.
Nhóm tác giả cho rằng khi sắt trong cytochrome C phản ứng với lipid sẽ tạo thành ferryl và xúc tác quá trình oxy hóa lipid bằng các phản ứng sau: Cyt C Fe3+ + ROOH → Cyt C Fe2+ + ROO• + H+ (1) Cyt C Fe2+ + ROOH → Cyt C Fe3+ + RO• + HO- (2) Betalains có thể ngăn chặn quá trình oxy hóa lipid bằng cách phản ứng với gốc peroxyl và alkoxyl trong phương trình (1) và (2). Nhóm tác giả cũng cho rằng betalains có khả năng phản ứng tốt hơn catechin và α-tocopherol là do khả năng tan tốt hơn trong dung dịch. Độ bền Trong quá trình chế biến, sự ổn định của chất màu là vô cùng quan trọng. Betalains bị biến đổi ngay sau khi trích ly ra từ không bào của tế bào thực vật.
Betalains có thể bị phá hủy theo nhiều cơ chế khác nhau, nhưng có thể chia thành 2 nhóm chính như sau: • Nhóm các yếu tố bên trong gồm có các enzyme oxy hóa có trong tế bào thực vật như là polyphenoloxidase, peroxidase và β-glucosidase; thành phần cấu tạo của chất màu; mức độ glycosyl hóa và acyl hóa 4 • Nhóm các yếu tố bên ngoài gồm có các điều kiện trong quá trình trích ly và bảo quản như là nhiệt độ, pH, oxy, ánh sáng, ion kim loại, nồng độ màu, hoạt độ nước. • 3 < pH <7 • 3 > pH >7 • Nhiệt độ thấp • Nhiệt độ cao • aW thấp • aW cao • Bóng tối • Ánh sáng • Chất chống oxy hóa • Ion kim loại • Các tác nhân chelate Sự ổn • Các enzyme oxy hóa + - • Thành phần cấu tạo định của • O2, H2O2, SO2 Betalains • Mức độ glycosyl hóa cao • Mức độ glycosyl hóa thấp • Mức độ acyl hóa cao • Mức độ acyl hóa thấp • Nồng độ màu cao • Nồng độ màu thấp • Khí nitơ Hình 1.2: Các yếu tố ảnh hưởng tới sự ổn định của betalains a) Cấu trúc và thành phần Betacyanins đã được chứng minh là ổn định hơn betaxanthins khi để ở nhiệt độ phòng [Sapers và cộng sự, 1979] và nhiệt độ cao [Herbach và cộng sự, 2004; Singer và cộng sự, 1980]. So sánh sự ổn định của các loại betacyanins khác nhau thì cấu trúc glycosylate ổn định hơn so với aglycons [Attoe và cộng sự, 1985]. Sự ổn định không tăng theo mức độ glycosyl hóa [Huang và cộng sự, 1986].
Nhiều nghiên cứu trước đây đã tiến hành gia tăng sự ổn định của betacyanis bằng cách este hóa với acid béo, các acid thơm, đặc biệt là tại vị trí 6-O [Reynoso và cộng sự, 1997; Heuer và cộng sự, 1994; Schliemann và cộng sự, 1998]. Tuy nhiên, Herbach và cộng sự [2006c] đã tiến hành quan sát sự phân hủy do nhiệt của betanin và các betacyanins acyl hóa (phyllocactin và hylocerenin) bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC-DAD). Nhóm tác giả thấy rằng betanin ổn định hơn cấu trúc acyl hóa. 5 b) pH Màu đỏ của betanin ổn định ở pH từ 3 tới 7.
Khi pH dưới 3, màu đỏ của betanin chuyển sang màu tím và bắt đầu biến đổi sâu sắc. Khi pH trên 7, betanin chuyển sang màu xanh và có sự thay đổi bước sóng hấp thu tối đa trong dải quang phổ hấp thụ. Cường độ màu xanh cao nhất ở pH=9 và ở pH trên 10 thì sự phân hủy diễn ra mạnh mẽ kèm theo sự giải phóng betalamic acid có màu vàng. Do đó, sự chuyển màu của betanin từ xanh sang vàng là kết quả của quá trình thủy betanin thành betalamic acid và cyclodopa-5-0-glycoside [Huang và cộng sự, 1985; Saguy và cộng sự, 1978].
c) Nhiệt độ Saguy và cộng sự [1979] đã chứng minh sự phân hủy của betanin và vulgaxanthin-I theo động học bậc nhất ở điều kiện hiếu khí và pH nằm trong khoảng 3 đến 7. Màu betalains ổn định nhất ở pH từ 5 đến 6 ở điều kiện kị khí và pH từ 4 đến 5 trong điều kiện hiếu khí [von Elbe và cộng sự, 1974; Saguy và cộng sự, 1979; Huang và cộng sự, 1987]. Suốt quá trình gia nhiệt betanin bị phân hủy bằng các quá trình đồng phân hóa, decarboxyl hóa hoặc là phân tách (Hình 1. Kết quả là màu đỏ giảm dần và có thể xuất hiện màu nâu sáng.
Trong điều kiện nhiệt độ không quá khắc nghiệt thì betanin sau khi bị phân hủy có khả năng tái sinh trở lại thông qua ngưng tụ Schiff's base của betalamic acid với cyclodopa-5-0-glycoside [von Elbe và cộng sự, 1974]. Betanin có thể ngưng tụ từ các ản phẩm của quá trình phân hủy của chúng khi giữ dịch trích trong một khoảng thời gian, nhiệt độ dưới 10oC và pH khoảng 5 [Huang và cộng sự, 1986]. Những hợp chất sau khi ngựng tụ không khác với betanin về độ hấp thu, màu sắc, khả năng chịu nhiệt và pH. Sự phân hủy betanin bởi nhiệt hoặc pH đều bắt đầu bằng sự tấn công ái lực hạt nhân ở vị trí C-11, là nguyên tử carbon liền kề với nitơ amin bậc 4.
Wybraniec và cộng sự [2006] đã làm sáng tỏ cấu trúc của tất cả các mono và bicarboxylate của betacyanins được hình thành trong quá trình xử lý nhiệt củ dền và thanh long đỏ. 6 Nhiệt độ/H+ Nhiệt độ/OH- Nhiệt độ + CO2 Hình 1.3: Cơ chế phân hủy betanin d) Ánh sáng Cũng giống như anthocyanins, betalains cũng dễ bị phân hủy bởi các nguồn bức xạ khác nhau. Sự hấp thu tia UV hoặc ánh sáng vùng khả kiến làm kích thích electron π của cấu trúc mang màu chuyển sang trạng thái hoạt động hơn, làm tăng phản ứng hoặc làm giảm năng lượng kích hoạt cho các phân tử. Sự thoái hóa betalains do ánh sáng có liên quan tới oxy.
Trong một nghiên cứu của Attoe và cộng sự [1981] khi chiếu ánh sáng huỳnh quang vào betalains trong 14 ngày dưới điều kiện có oxy và không có oxy, nhóm tác giả nhận thấy là trong điều kiện có oxy thì 7 hàm lượng betalains giảm nhanh hơn so với không có oxy. Thí nghiệm tương tự cũng được nhóm tác giả tiến hành trên anthocyanins và cũng thu được quy luật tương tự. e) Oxy Bảo quản dung dịch betanin ở điều kiện thiếu oxy làm giảm khả năng phân hủy chất màu so với ở điều kiện khí quyển. Việc thiếu oxy thúc đẩy chất màu ngưng tụ một phần sau khi phân hủy [von Elbe và cộng sự, 1974; Huang và cộng sự,1987].
Betalains sẽ bền hơn khi được bảo quản trong điều kiện khí nitơ hoặc bổ sung các chất chống oxy hóa [Attoe và cộng sự, 1982]. Hoạt độ nước ảnh hưởng tới sự ổn định của betalains có thể là do giảm sự di chuyển của các chất phản ứng hoặc hạn chế oxy hòa tan [Delgado- Vargas và cộng sự, 2000].