CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Vai trò của gen HER2 trong ung thư dạ dày 1. Vai trò của HER2 trong tiên lượng ung thư dạ dày Tỷ lệ biểu hiện quá mức của HER2 ở bệnh nhân UTBMTDD là khác nhau, trong thử nghiệm ToGA trên 3.665 bệnh nhân thì tỷ lệ HER2 dương tính chiếm 810/3665 bệnh nhân (22%). Trong một phân tích gộp từ 49 nghiên cứu với 11.337 bệnh nhân, tỷ lệ này là 18%.
Khoảng 9–38% tổng số bệnh nhân UTDD cho thấy sự biểu hiện quá mức của thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì ở người-2 (HER2), có thể đóng vai trò tiên lượng cho một bệnh nặng hơn và kết quả xấu hơn, mặc dù vấn đề này vẫn chưa rõ ràng với các kết quả trái ngược nhau cho đến nay trong các nghiên cứu khác nhau. Ứng dụng lâm sàng của dấu ấn HER2 trong ung thư dạ dày Nghiên cứu ToGA đánh giá sự kết hợp của trastuzumab với fluoropyrimidine chuẩn cùng với hóa trị liệu cisplatin trong ung thư dạ dày tiến triển HER2 dương tính. Kết quả của nghiên cứu nói rằng trastuzumab kết hợp với hóa trị liệu có thể được coi là một lựa chọn tiêu chuẩn mới cho bệnh nhân ung thư dạ dày thực quản tiến triển dương tính với HER2. Dựa trên vai trò của HER2 trong quá trình phát sinh và tiến triển của nhiều loại ung thư nói chung và UTBMTDD nói riêng, đặc biệt qua các nghiên cứu cho thấy sự biểu hiện của HER2 thường có liên quan với tiên lượng xấu, người ta đã ứng dụng các thuốc hướng đến các đích phân tử này để điều trị UTBMTDD.
Liệu pháp kháng HER2 là một chiến lược điều trị đầy hứa hẹn cho bệnh nhân UTBMTDD. Vai trò của CD44 trong ung thư 1. Vai trò của CD44 trong sinh khối u CD44 hoạt hóa, điều chỉnh một số hệ thống tín hiệu tế bào vì vậy nó đóng vai trò quan trọng trung gian của đặc tính sinh khối u của tế bào dẫn đến hình thành khối u, di căn và kháng thuốc. Chức năng của CD44 trong quá trình dịch chuyển biểu mô trung mô đã được nghiên cứu ở một vài loại ung thư.
Tăng biểu hiện của CD44 làm giảm biểu hiện của E-cadherin, tăng N-cadherin, α-actin, vimentin, fibronectin ức chế sự hình thành phức hợp màng E- cadherin-β-catenin, điều này làm tăng quá trình xâm lấn và di cư của tế bào. CD44 và sự kháng thuốc của tế bào ung thư Bằng chứng lâm sàng cho thấy mối tương quan tích cực giữa biểu hiện CD44 và tình trạng di căn. Trong ống nghiệm, giảm sự biểu hiện của CD44 trong các dòng tế bào ung thư vú dẫn đến giảm đáng kể sự hình thành khối u. Sự di cư và xâm chiếm tế bào đã bị ngăn chặn bởi việc loại bỏ CD44.
Sự biểu hiện quá mức của CD44 làm tăng sự hình thành khối u và chuyển dịch tế bào. Trong cơ thể sinh học, sự hình thành khối u ở chuột bị ức chế khi được tiêm tế bào đã loại bỏ CD44. Số lượng tế bào hủy xương giảm ở tổ chức xương di căn có CD44 bị loại bỏ. Những nghiên cứu này chỉ ra rằng tế bào ung thư đạt được xu hướng kháng thuốc khi được đi kèm các với các dạng CD44 biểu hiện quá mức.
Vai trò của ALDH trong ung thư dạ dày 1. ALDH biểu hiện quá mức trong một số loại ung thư Tăng hoạt độ enzym ALDH1 đã được xác định trong một vài loại ung thư như đa u tủy xương, bệnh bạch cầu cấp và một số loại 5 ung thư tạng đặc. Một số marker của tế bào gốc gồm ALDH1, CD166, LGR5 có nồng độ rất thấp ở niêm mạc dạ dày người bình thường nhưng những marker này tăng rất cao trong ung thư biểu mô tuyến dạ dày. Sự biểu hiện của ALDH1 tương quan có ý nghĩa với mức độ xâm lấn, tình trạng hạch di căn, giai đoạn bệnh, thời gian sống thêm không tiến triển bệnh và thời gian sống thêm toàn bộ.
Tuy nhiên, vai trò tiên lượng của các isozyme ALDH1 còn chưa được xác định. Kết quả nghiên cứu của Chen J. và cs cũng cho thấy ALDH1A1 biểu hiện quá mức ở bệnh nhân ung thư dạ dày và có thể đóng một vai trò quan trọng trong sự xâm lấn, di căn và tiên lượng của khối u. ALDH trong kháng hóa trị ALDH là enzym tham gia vào quá trình khử độc, bảo vệ mô khỏi tác dụng độc hại của các aldehyde đã được biết đến từ lâu.
ALDH1A1 và ALDH3A1 có thể bảo vệ tế bào chống lại tác dụng độc hại của thuốc. Những quan sát đầu tiên cách đây vài thập kỷ ở tế bào gốc tạo máu và tế bào gốc bạch cầu với ALDH có tính kháng thuốc cao với cyclophosphamide và các alkyl, ALDH1A1 và ALDH3A1 đã biến đổi cyclophosphamide ở dạng hoạt động và 4- hydroperoxycyclophosphamide thành dạng không hoạt động để bài tiết ra ngoài. Vì vậy, ALDH có thể gây kháng thuốc và kháng với xạ trị. Trong những năm gần đây, các thụ thể của yếu tố sinh trưởng, các chất ức chế tyrosine kinase (EGFR-TKI) đã được sử dụng như một liệu pháp tiềm năng trong việc ức chế sự sinh trưởng của các tế bào ung thư.
6 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là 107 bệnh nhân được chẩn đoán xác định ung thư biểu mô tuyến dạ dày được phẫu thuật cắt u tại Bệnh viện K (Cơ sở Tân Triều và Quán Sứ), từ tháng 7/2016 đến tháng 7/2020. Tiêu chuẩn chọn - Bệnh nhân được chẩn đoán xác định ung thư biểu mô tuyến dạ dày dựa trên kết quả mô bệnh học bằng nhuộm Hematoxylin-Eosin (HE) theo tiêu chuẩn ESMO năm 2016. - Bệnh phẩm khối u nguyên phát sau mổ được xử lý theo qui trình chuẩn và nhuộm hóa mô miễn dịch xác định dấu ấn HER2 và dấu ấn miễn dịch tế bào gốc ung thư.
- Bệnh nhân đồng ý, tự nguyện tham gia vào nghiên cứu. Tiêu chuẩn loại trừ - Các trường hợp ung thư dạ dày di căn từ cơ quan khác. - Ung thư dạ dày đã được điều trị hoá trị hoặc xạ trị. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang.
Các tiêu chuẩn, phân loại chính trong nghiên cứu - Vị trí khối u tại dạ dày. - Hình thái khối u theo Borrmann: + Borrmann type I (Dạng Polyp), Borrmann type II (Dạng nấm), Borrmann type III (Dạng loét), Borrmann type IV (Dạng thâm nhiễm). - Kích thước khối u trên nội soi dạ dày: 7 + Nhóm I: Kích thước u < 2 cm. + Nhóm II: Kích thước u từ 2 đến < 5 cm.
+ Nhóm III: Kích thước u ≥ 5 cm. - Phân loại mô bệnh học theo Lauren: + Týp ruột (Intestinal type), týp lan tỏa (Diffuse type). - Phân loại mô bệnh học theo hệ thống phân loại của WHO 2010: + Ung thư biểu mô tuyến nhú (Papillary). + Ung thư biểu mô tuyến ống (Tubular).
+ Ung thư biểu mô tuyến nhầy (Mucinous). + Ung thư tế bào nhẫn (Signet-ring cell. - Phân loại mô bệnh học theo mức độ biệt hóa theo WHO: + Thể biệt hóa thấp. + Thể biệt hoá vừa.
+ Thể biệt hóa cao. - Chẩn đoán giai đoạn TNM: Theo hệ thống AJCC lần thứ 7. - Đánh giá mức độ biểu hiện của marker HER2 trong mẫu ung thư và mẫu đối chứng theo các mức độ: 0, 1+, 2+, 3+. Mức độ biểu hiện của HER2 là 0 và 1+ đánh giá là âm tính, mức độ biểu hiện của HER2 là 2+ và 3+ đánh giá là dương tính.
- Đánh giá mức độ biểu hiện của marker CD44 trong mẫu ung thư và mẫu đối chứng theo các mức độ: Âm tính, dương tính. - Đánh giá mức độ biểu hiện của marker ALDH trong mẫu ung thư và mẫu đối chứng theo các mức độ: Âm tính, dương tính. Phương pháp thu thập số liệu 2. Khám bệnh nhân và các chỉ định cận lâm sàng - Bệnh nhân đến viện khám sẽ được hỏi bệnh, khám lâm sàng, chỉ định làm xét nghiệm huyết học, sinh hóa, đông máu, miễn dịch.
- Bệnh nhân được chỉ định làm nội soi dạ dày, khi thấy khối u dạ dày sẽ tiến hành sinh thiết trong lúc soi. Nội soi dạ dày có sinh thiết - Đưa máy soi qua miệng, họng vào thực quản, dạ dày, xuống tá tràng bơm hơi và quan sát. Có thể cần bơm nước làm sạch nhầy bọt ở các vùng cần quan sát, hút sạch dịch trong thực quản và dạ dày. - Nếu phát hiện tổn thương, bơm rửa sạch, sau đó quan sát kỹ bằng chế độ NBI và near focus để đánh giá, sinh thiết làm giải phẫu bệnh.
- Bệnh phẩm được cố định vào ống có chứa Formol 20% đệm trung tính. Phẫu thuật cắt u và cách xử lý bệnh phẩm - Khi có kết quả giải phẫu bệnh là ung thư dạ dày. Bệnh nhân được hội chẩn chuyển sang khoa Ngoại bụng 1,2, bệnh viện K để thực hiện phẫu thuật cắt khối u dạ dày. Sau khi phẫu thuật, khối u được bảo quản và đưa một mẫu đi làm xét nghiệm giải phẫu bệnh tại Bệnh viện K.
Phương pháp phân tích mô bệnh học - Nơi thực hiện: Phòng thí nghiệm Inserm U1053. - Kỹ thuật: Phân tích mô bệnh học bằng phương pháp nhuộm HE thường quy. 9 - Đọc kết quả trên tiêu bản nhuộm HE: Tiêu bản nhuộm HE được soi và chụp ảnh dưới kính hiển vi ánh sáng thường, ở độ phóng đại 10 - 40 lần. Phương pháp phân tích hóa mô miễn dịch - Nơi thực hiện: Phòng thí nghiệm Inserm U1053 (Đơn vị nghiên cứu Helicobacter pylori và ung thư dạ dày), Viện Sức khỏe và Nghiên cứu y học Quốc gia, Bordeaux, Pháp.
Quá trình xét nghiệm có sự hỗ trợ của GS. * Các bước nhuộm hóa mô miễn dịch: - Cắt khối mô đúc trong paraffin thành các lát cắt có độ dày 3-4 μm. - Đặt lát cát lên các lam kính đã có sẵn nước và lam kính luôn được đặt trên tấm ổn nhiệt có nhiệt độ 37°C. - Chuyển tiêu bản sang tủ ấm 56°C qua đêm.
- Bộc lộ kháng nguyên bằng cách ủ ở bể ổn nhiệt nước ở nhiệt độ 96°C trong đệm citrat pH 6,0 trong 5 phút. - Để nguội tiêu bản trong 20 phút, rửa bằng vòi xịt nước cất 2 lần × 5 phút. - Khử peroxidase nội sinh bằng dung dịch H2O2 3% × 5 phút. - Rửa tiêu bản bằng dung dịch Tris-Buffer-Saline (TBS) pH 7,6 × 5 phút.
- Khử các protein không đặc hiệu bằng albumin huyết thanh bò (BSA Bovin SerumAlbumine × 5 phút. - Rửa tiêu bản bằng dung dịch TBS 2 lần × 5 phút, luôn giữ tiêu bản trong khay ẩm. Phủ kháng thể thứ 1 kháng kháng nguyên trong 60 phút. 10 - Rửa tiêu bản bằng dung dịch TBS 2 lần × 5 phút bằng bình xịt nhẹ.
- Phủ kháng thể thứ 2 gắn Biotin trong 30 phút.