Tổng quan luận án
Bệnh tăng hồng cầu vô căn (Polycythemia vera - PV, viết tắt là THCVC) là bệnh lý ác tính thuộc nhóm tăng sinh tủy (Myeloproliferative neoplasms - MPNs) không mang nhiễm sắc thể Philadelphia (Ph- âm tính, không chứa tổ hợp gen BCR-ABL1). Bệnh đặc trưng bởi sự rối loạn của các tế bào gốc tạo máu trong tủy xương, dẫn tới sự tăng sinh quá mức các dòng tế bào máu ngoại vi gồm hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu, trong đó dòng hồng cầu chiếm ưu thế tuyệt đối. Lượng hồng cầu gia tăng làm tăng độ nhớt của máu, giảm tốc độ tuần hoàn và gia tăng nguy cơ biến cố huyết khối tắc mạch. Về mặt di truyền phân tử, đột biến điểm JAK2V617F (rs77375493) tại exon 14 chiếm hơn 90% các trường hợp mắc bệnh, làm tăng hoạt tính phosphoryl hóa của kinase JAK2 và kích hoạt liên tục con đường truyền tín hiệu nội bào. Tuy nhiên, các nghiên cứu sinh học phân tử cho thấy ngoài đột biến JAK2V617F, cơ chế bệnh sinh của THCVC vẫn chưa được làm sáng tỏ toàn diện, đặc biệt là vai trò của các gen điều hòa phiên mã, các gen kiểm soát miễn dịch và nhóm gen mã hóa enzyme khử ubiquitin (deubiquitinase - DUB). Các bằng chứng về sự biến đổi của nhóm gen DUB và các tín hiệu phân tử liên quan trên tế bào miễn dịch ở bệnh nhân THCVC vẫn là một khoảng trống nghiên cứu cần được giải quyết.
Luận án được thực hiện nhằm giải quyết các mục tiêu cụ thể, được đánh số theo văn bản như sau:
- Xác định vai trò của gen A20 và gen Otubain-1 điều hòa chức năng sinh học tế bào PBMC bao gồm sự thuần thục, sự biệt hóa và sự chết apoptosis.
- Xác định mức độ biểu hiện mRNA/đa hình của một số gen mã hóa deubiquitinase, gen tín hiệu liên quan và kiểu hình miễn dịch trên bệnh nhân THCVC và người khỏe mạnh.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của luận án:
- Đối tượng nghiên cứu lâm sàng: Gồm 77 bệnh nhân được chẩn đoán mắc tăng hồng cầu vô căn và 55 mẫu đối chứng từ người khỏe mạnh.
- Đối tượng nghiên cứu thực nghiệm tế bào: Tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) được phân lập từ 150 ml mẫu máu của người tình nguyện hiến máu khỏe mạnh.
- Phạm vi không gian và thời gian: Đề tài được triển khai tại Phòng Hệ gen học miễn dịch và Phòng Hệ gen học chức năng thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, hoàn thành luận án vào năm 2022. Nghiên cứu nhận kinh phí hỗ trợ từ đề tài cấp Nhà nước mã số ĐTĐL.CN-43/21 của Bộ Khoa học và Công nghệ.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các hướng nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến bệnh tăng hồng cầu vô căn, đặc tính của tế bào PBMC và cơ chế hoạt động của các enzyme khử ubiquitin:
- Dịch tễ học và phân loại bệnh: Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) phân loại MPN thành các nhóm bệnh chính, trong đó THCVC, tăng tiểu cầu tiền phát (ET) và xơ tủy nguyên phát (PM) thuộc nhóm không có nhiễm sắc thể Philadelphia. Số liệu dịch tễ tại Hoa Kỳ năm 2014 ghi nhận khoảng 148.000 người mắc THCVC với tỷ lệ hiện mắc dao động từ 2,5 đến 10 ca trên 100.000 dân. Tại châu Âu giai đoạn 1995–2002, tỷ lệ sống sau 5 năm đạt 84,8% (khoảng tin cậy 81,5–87,5%) và giảm còn 79,4% ở nhóm bệnh nhân từ 70 tuổi.
- Nghiên cứu di truyền và đột biến gen: Năm 2003, Bench và cộng sự đã đề xuất quy trình xét nghiệm đột biến JAK2V617F trong chẩn đoán sớm THCVC. Đột biến trên exon 12 của gen JAK2 được ghi nhận ở 2% đến 3% bệnh nhân âm tính với V617F, thường biểu hiện ở độ tuổi trẻ hơn, có nồng độ hemoglobin cao hơn nhưng số lượng bạch cầu và tiểu cầu thấp hơn. Misa Imai và cộng sự (2013) nghiên cứu đột biến gen CALR (mất và chèn đoạn ở exon 9) trên bệnh nhân tăng tiểu cầu nguyên phát và chỉ ra rằng đột biến này hiếm gặp ở bệnh nhân THCVC, trong khi đột biến gen MPL hầu như không xuất hiện. Năm 2017, Yu-Cheng Chang và cộng sự sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới trên 30 bệnh nhân THCVC nhằm tầm soát các đột biến soma và germline.
- Nghiên cứu về kiểu hình miễn dịch và tế bào PBMC: Kornberg A và cộng sự chứng minh sau kích thích bằng endotoxin, PBMC của bệnh nhân THCVC sản xuất yếu tố mô (TF) tăng gấp 21 lần so với nhóm chứng (p < 0,001), đi kèm nồng độ prothrombin F1+2 huyết tương tăng cao rõ rệt (2,46 nM so với mức 0,22–0,32 nM ở nhóm chứng). Tỷ lệ tế bào T CD4/CD8 ở bệnh nhân THCVC có sự biến đổi đáng kể (p < 0,01) chủ yếu do giảm quần thể T CD8+, đồng thời có sự tăng sinh lympho bào đáp ứng với PHA (p < 0,001) và IL-2 (p < 0,005). Nghiên cứu năm 2015 trên 14 bệnh nhân THCVC và 6 bệnh nhân ET chỉ ra rằng điều trị interferon-alpha làm thay đổi cấu trúc tế bào T điều hòa (CD4+CD25+Foxp3+), tế bào NK và tế bào tua (DC).
- Nghiên cứu về nhóm gen DUB và điểm kiểm soát miễn dịch: Kuro-o và cộng sự (1997) phát hiện gen Klotho nằm trên nhiễm sắc thể 13 ở người, có vai trò điều hòa lão hóa và phản ứng viêm. Triebel và cộng sự (1990) định danh thụ thể ức chế miễn dịch LAG3 trên nhiễm sắc thể 12. Về nhóm enzyme khử ubiquitin, Masahiro Marshall Nakagawa và cộng sự chứng minh sự thiếu hụt A20 (TNFAIP3) trong tế bào gốc tạo máu (HSC) dẫn đến bệnh lý tự viêm và tăng sinh tủy. Melania Tesio và cộng sự (2015) xác định CYLD tương tác với TRAF2 để duy trì trạng thái ngủ của HSC qua ức chế p38MAPK. Junting Cai xác định sự tăng cường biểu hiện của USP50 và USP7 trong các giai đoạn biệt hóa hồng cầu. Durocher (2010) mô tả hai phương thức hoạt động độc lập và phụ thuộc của Otubain-1 đối với enzyme liên hợp ubiquitin E2. Xiaofei Zhou và cộng sự (2019) chứng minh Otubain-1 điều hòa chức năng tế bào T CD8+ và NK. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Xuân xác định Otubain-1 ức chế sự hoạt hóa kéo dài của phân tử p38MAPK trên tế bào tua. David Komander làm rõ cấu trúc enzyme Cezanne (OTUD7B) có hoạt tính xúc tác đặc hiệu cao đối với chuỗi polyubiquitin liên kết Lys11.
- Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam: Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị của Bộ Y tế theo Quyết định số 1494/QĐ-BYT (năm 2015) và Quyết định số 1832/QĐ-BYT (năm 2022) chủ yếu dựa vào tiêu chuẩn xác định đột biến JAK2V617F hoặc JAK2 exon 12. Năm 2013, khảo sát trên Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh công bố tỷ lệ đột biến JAK2V617F trên 30 bệnh nhân THCVC nguyên phát có độ tuổi trung bình 53. Nghiên cứu trước đây của nhóm tác giả (Nguyễn Thị Xuân và cộng sự) ghi nhận sự suy giảm biểu hiện của các gen kiểm soát miễn dịch gồm Klotho, LAG3, CTLA4 và PD1 ở bệnh nhân THCVC.
Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết là: Trước thời điểm luận án thực hiện, chưa có công trình nào trong nước và quốc tế nghiên cứu toàn diện về mức độ biểu hiện, các biến thể đa hình đơn nucleotide (SNP) của nhóm gen DUB (A20, Otubain-1, Otubain-2, CYLD, Cezanne) và các phân tử tín hiệu nội bào trên bệnh nhân THCVC; đồng thời chưa có thực nghiệm can thiệp bất hoạt gen bằng siRNA nhằm làm rõ vai trò sinh học của A20 và Otubain-1 trên tế bào PBMC.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Luận án xây dựng trên cơ sở lý thuyết về hệ thống ubiquitin - proteasome, trong đó các enzyme khử ubiquitin (DUB) đảm nhiệm chức năng loại bỏ các chuỗi polyubiquitin liên kết qua Lys48, Lys63 hoặc Lys11 ra khỏi phân tử protein cơ chất, từ đó điều hòa sự thoái hóa protein, truyền tín hiệu nội bào và kiểm soát chu kỳ tế bào. Khung phân tích tập trung vào mối liên hệ giữa nhóm DUB với hai trục truyền tín hiệu trung tâm trong bệnh lý huyết học ác tính là JAK-STAT và NF-κB, kết hợp với các phân tử kiểm soát miễn dịch bề mặt tế bào (Klotho, LAG3, CTLA4, PD1) và các cytokine tiền viêm (IL-6, TNF-α, IL-1β, IL-12p70).
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm kết hợp giữa kỹ thuật sinh học phân tử, di truyền học tế bào và miễn dịch học:
- Tách chiết vật liệu di truyền và xét nghiệm biểu hiện gen: DNA và RNA tổng số được tách chiết từ máu ngoại vi của 77 bệnh nhân THCVC và 55 người khỏe mạnh. Sau khi chuyển đổi ngược thành cDNA, phản ứng Real-Time PCR được sử dụng để định lượng mức độ biểu hiện mRNA của nhóm gen DUB (A20, Otubain-1, Otubain-2, CYLD, Cezanne), nhóm gen kiểm soát miễn dịch (Klotho, LAG3, CTLA4, PD1) và các gen tín hiệu nội bào (SHP-1, SHP-2, IκB-α, STAT-1, STAT-3, STAT-5, STAT-6).
- Giải trình tự gen và phân tích tin sinh học: Giải trình tự trực tiếp bằng phương pháp Sanger trên các sản phẩm PCR khuếch đại các vùng exon của gen JAK2, CYLD, A20 và Cezanne để phát hiện các biến thể đa hình nucleotide đơn (SNP). Tác động gây bệnh của các đột biến tại vị trí ghép nối nối tiếp (splice site) được phân tích dự đoán bằng các chương trình phần mềm tin sinh học SD-Score và MaxEntScan.
- Nuôi cấy tế bào và can thiệp gen: Tế bào PBMC từ 150 ml máu người khỏe mạnh được phân lập bằng phương pháp ly tâm phân lớp theo thang tỷ trọng sử dụng dung dịch Ficoll-Paque. Tế bào được nuôi cấy trong ống nghiệm và chuyển nạp đoạn RNA can thiệp nhỏ đặc hiệu (siRNA-A20 và siRNA-Otubain-1) để bất hoạt có chủ đích sự biểu hiện của gen A20 và Otubain-1.
- Đánh giá kiểu hình và chức năng miễn dịch: Kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy (Flow cytometry) được sử dụng để phân tích tỷ lệ các tiểu quần thể tế bào miễn dịch thông qua các kháng thể huỳnh quang đánh dấu bề mặt tế bào (CD3, CD4, CD8, CD11b, CD19, CD25, CD40, CD44, CD56) và đánh giá tỷ lệ tế bào chết theo chương trình qua các chất chỉ thị huỳnh quang Annexin V, Propidium Iodide (PI) và Caspase-3. Khả năng di chuyển của tế bào được kiểm tra thông qua thử nghiệm di cư tế bào. Nồng độ các cytokine (IL-6, TNF-α, IL-1β, IL-12p70) và nồng độ kháng nguyên ung thư CA125 trong dịch nổi tế bào hoặc huyết tương được xác định bằng phương pháp ELISA.
- Đạo đức trong nghiên cứu y sinh: Đề tài tuân thủ các quy chuẩn đạo đức nghiên cứu trên đối tượng người và được Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh thông qua.
Bảng tổng hợp các nhóm phương pháp và chỉ số phân tích chính:
| Nhóm phương pháp |
Kỹ thuật thực hiện |
Chỉ số / Phân tử mục tiêu |
| Huyết học & Sinh hóa |
Phân tích tự động, tách huyết tương |
Các chỉ số huyết học cơ bản, nồng độ enzym gan, thận |
| Biểu hiện gen |
Real-Time PCR (mRNA) |
A20, Otubain-1, Otubain-2, CYLD, Cezanne, Klotho, LAG3, CTLA4, PD1, SHP-1, SHP-2, IκB-α, STAT-1, 3, 5, 6 |
| Di truyền học phân tử |
Giải trình tự Sanger, SD-Score, MaxEntScan |
JAK2 (V617F), CYLD (11 SNP, gồm W736G, p.2483+6 T>G), A20, Cezanne |
| Can thiệp tế bào |
Chuyển nạp siRNA vào PBMC |
Bất hoạt gen A20 (siRNA-A20) và Otubain-1 (siRNA-Otubain-1) |
| Đếm tế bào dòng chảy |
Flow cytometry |
Tỷ lệ tế bào T (CD3, CD4, CD8, CD25), tế bào B (CD19), tế bào tủy (CD11b, CD40), NK (CD56, CD44), Annexin V, Caspase-3, PI |
| Miễn dịch & Độc tính |
ELISA, thử nghiệm di cư tế bào |
IL-6, TNF-α, IL-1β, IL-12p70, CA125, khoảng cách di chuyển tế bào |
Nội dung chính theo từng chương
Mở đầu
Phần Mở đầu trình bày tổng quan tính cấp thiết của đề tài THCVC trong nhóm bệnh tăng sinh tủy MPNs không có nhiễm sắc thể Philadelphia, nêu bật vai trò chủ đạo của đột biến JAK2V617F nhưng khẳng định đây chưa phải là nguyên nhân duy nhất dẫn đến sự tiến triển ác tính. Tác giả chỉ ra tầm quan trọng của tế bào PBMC và nhóm enzyme khử ubiquitin (DUB) gồm A20, Otubain-1, CYLD, Cezanne trong việc duy trì cân bằng tạo máu và đáp ứng miễn dịch. Từ đó, tác giả xác định 2 mục tiêu nghiên cứu và tóm tắt 4 nhóm đóng góp mới về mặt khoa học của luận án.
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 1 cung cấp dữ liệu toàn diện về bệnh lý THCVC, đặc điểm sinh học tế bào PBMC, cơ chế của nhóm gen deubiquitinase và tổng quan tình hình nghiên cứu. Các nội dung được chia thành các phân mục chi tiết:
- Phân loại bệnh THCVC theo tiêu chuẩn của WHO, phân tích đột biến JAK2V617F, đột biến trên exon 12 của gen JAK2, đột biến gen CALR trên exon 9 và các bất thường nhiễm sắc thể (mất đoạn 20q, trisomy 8, 9).
- Thành phần sinh học của PBMC ở người bình thường được tổng hợp cụ thể theo bảng số liệu của luận án:
| STT |
Thành phần PBMC người |
Tỷ lệ phần trăm (%) |
| 1 |
Tế bào bạch cầu |
10 - 30% |
| 2 |
Tế bào Lympho |
70 - 90% |
| 3 |
Tế bào T (CD3+) |
45 - 70% |
| 4 |
Tế bào T (CD4+) |
25 - 60% |
| 5 |
Tế bào T (CD8+) |
5 - 30% |
| 6 |
Tế bào B |
5 - 15% |
| 7 |
Tế bào NK |
5 - 10% |
| 8 |
Tế bào tua |
1 - 2% |
| 9 |
Tế bào gốc |
0,1 - 0,2% |
- Trình bày đặc điểm của các dấu ấn sinh học apoptosis gồm Annexin V, Caspase-3 và Propidium Iodide (PI) được kích thích ở bước sóng 488 nm và phát xạ cực đại tại 617 nm.
- Phân tích vai trò của các gen kiểm soát miễn dịch Klotho (nhiễm sắc thể 13 ở người), PD-1, LAG3 (nhiễm sắc thể 12 ở người) và CTLA4; đặc tính của các cytokine IL-6, TNF-α, IL-1β, IL-12p70 và kháng nguyên CA125 (ngưỡng bình thường < 35 U/mL).
- Cơ chế của các protein DUB:
- Protein A20 (TNFAIP3, 775 axit amin, 87,6 kDa) chứa miền OTU ở đầu N và 7 miền ngón tay kẽm ZnF ở đầu C, có chức năng ức chế tín hiệu NF-κB và caspase-8.
- Protein Otubain-1 (nhiễm sắc thể 11q13.1) hoạt động theo cơ chế độc lập (thủy phân liên kết isopeptide) và phụ thuộc (ức chế enzym liên hợp ubiquitin E2). Luận án tổng hợp các con đường mà Otubain-1 liên quan trong các bệnh lý ác tính theo bảng số liệu:
| Protein/con đường liên quan |
Cơ chế điều hòa (Độc lập: C, Phụ thuộc: NC) |
Cặp enzyme ubiquitin ligase và E2 bị ức chế bởi Otubain-1 |
Ung thư / Quá trình |
Kết quả tác động |
| Tín hiệu SMAD2 |
NC |
NEDD4L/UBCH5A |
Tín hiệu TGF-β |
Tăng sự di cư |
| Histones |
NC |
RNF168/UBC13 |
Phục hồi ADN |
Giảm quá trình ubiquitin của protein histone |
| RAS |
NC |
RABEX5/UBCH5C |
Ung thư phổi |
Tăng sự phát triển |
| P53 |
C/NC |
MDM2/UBCH5C |
Apoptosis |
Tăng apoptosis |
| MDMX |
NC |
MDM2/UBCH5C |
Apoptosis |
Tăng apoptosis |
| c-IAP |
C |
Không xác định |
Apoptosis |
Giảm apoptosis |
| DEPTOR |
NC |
Không xác định |
mTORC1 |
Tự thực bào |
| ERα |
C/NC |
Không xác định |
Ung thư màng trong dạ con |
Giảm quá trình phiên mã ERα |
| FOXM1 |
C |
Không xác định |
Ung thư vú |
Tăng sinh, kháng epirubicin |
| FOXM1 |
C |
Không xác định |
Ung thư buồng trứng |
Gia tăng sinh sôi nảy nở, di cư, xâm lấn |
| SNAIL |
C |
Không xác định |
Ung thư thực quản |
EMT, tăng di chuyển, xâm nhập |
- Protein CYLD (nhiễm sắc thể 16q12.1, 956 axit amin) chứa 3 miền Cap-Gly và miền xúc tác USP với bộ ba Cys601, His871, Asp889, xúc tác cắt polyubiquitin K63 trên NEMO, TRAF2 để ức chế NF-κB và duy trì trạng thái ngủ của HSC.
- Protein Cezanne (OTUD7B) có miền xúc tác 320–350 axit amin, ưu tiên phân cắt chuỗi polyubiquitin liên kết Lys11, tham gia điều hòa chu kỳ tế bào qua tương tác với phức hợp APC/C.
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 2 mô tả chi tiết các tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân THCVC (77 ca) và người khỏe mạnh (55 ca), quy trình thu nhận và xử lý mẫu máu. Tác giả liệt kê các trang thiết bị, hóa chất sinh học phân tử, thành phần phản ứng PCR, PCR giải trình tự Sanger và danh mục các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại cDNA của các gen DUB, gen tín hiệu và gen điểm kiểm soát miễn dịch. Quy trình phân lập PBMC bằng Ficoll-Paque, kỹ thuật nuôi cấy tế bào, quy trình transfec siRNA vào PBMC, kỹ thuật nhuộm huỳnh quang đa màu cho flow cytometry, phương pháp thử nghiệm buồng di cư tế bào và quy trình định lượng nồng độ cytokine/CA125 bằng ELISA được chuẩn hóa và thẩm định theo phê duyệt của Hội đồng đạo đức y sinh.
Chương 3: Kết quả nghiên cứu
Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được, chia làm hai phần chính:
- Kết quả nghiên cứu trên bệnh nhân THCVC:
- Chỉ số xét nghiệm sinh hóa máu: Ghi nhận tỷ lệ bệnh nhân THCVC có các chỉ số xét nghiệm huyết học và sinh hóa cao hơn người bình thường.
- Biểu hiện gen DUB và gen tín hiệu: Mức độ biểu hiện mRNA của các gen DUB gồm A20, CYLD và Cezanne giảm rõ rệt (ở trạng thái bất hoạt tương đối) ở bệnh nhân THCVC so với nhóm chứng. Ngược lại, biểu hiện của các gen tín hiệu thuộc họ STAT (STAT-1, STAT-3, STAT-5, STAT-6) và enzym phosphatase SHP-1, SHP-2 có sự biến đổi biểu hiện đặc thù.
- Biểu hiện gen kiểm soát miễn dịch: Mức biểu hiện mRNA của gen Klotho, LAG3, CTLA4 và PD1 ở bệnh nhân THCVC suy giảm đáng kể so với người khỏe mạnh.
- Phân tích đột biến và đa hình gen:
- Xác nhận tần số xuất hiện của đột biến JAK2V617F ở bệnh nhân THCVC so với nhóm chứng.
- Phân tích trình tự gen CYLD phát hiện 11 biến thể đa hình đơn nucleotide (SNP). Đáng chú ý, phát hiện SNP mới p.W736G tại exon 15 (thay đổi trình tự axit amin tại vị trí 736) chưa từng được công bố trước đó, được đánh giá có khả năng cao liên quan đến cơ chế gây bệnh. Hai SNP p.2483+6 T>G thuộc gen CYLD được phần mềm SD-Score và MaxEntScan dự đoán làm sai lệch quá trình ghép nối exon. Bệnh nhân mang SNP p.W736G đồng thời mang nhiều SNP khác trên gen CYLD, nhưng không xuất hiện đột biến trên gen A20 hoặc Cezanne.
- Kiểu hình miễn dịch và cytokine huyết thanh: Phân tích tế bào dòng chảy cho thấy tỷ lệ tế bào T hoạt hóa CD25+CD4+, tế bào Th1 và tế bào T điều hòa (Treg, CD4+CD25+Foxp3+) trong máu ngoại vi của bệnh nhân THCVC tăng cao rõ rệt so với nhóm chứng. Kết quả ELISA xác định nồng độ các cytokine tiền viêm IL-6 và TNF-α trong huyết thanh bệnh nhân THCVC tăng cao hơn nhóm người khỏe mạnh.
- Kết quả nghiên cứu can thiệp trên tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC):
- Tế bào PBMC phân lập từ người hiến máu khỏe mạnh có độ tinh sạch và khả năng sống cao khi quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 40x.
- Vai trò điều hòa của gen A20: Khi làm bất hoạt gen A20 bằng siRNA-A20, hoạt hóa của các tiểu quần thể tế bào lympho T, lympho B và dòng tủy tăng lên (thể hiện qua sự gia tăng tỷ lệ CD3+CD25+, CD19+CD25+ và CD11b+CD40+). Sự bất hoạt A20 kích thích tế bào PBMC tăng cường tiết các cytokine gây viêm TNF-α và IL-1β, đồng thời gia tăng khả năng di cư của tế bào và làm thay đổi tỷ lệ tế bào sống sót/apoptosis.
- Vai trò điều hòa của gen Otubain-1: Bất hoạt gen Otubain-1 bằng siRNA làm tăng tỷ lệ hoạt hóa của tế bào diệt tự nhiên NK (CD56+CD44+), làm thay đổi cấu hình giải phóng cytokine của PBMC và điều hòa giảm sự biểu hiện của các gen tín hiệu nội bào SHP-1 và STAT-6.
Chương 4: Thảo luận
Chương 4 tập trung biện luận mối quan hệ tương tác giữa tình trạng giảm biểu hiện của nhóm gen DUB (A20, CYLD, Cezanne) với sự tăng sinh bất thường của các dòng tế bào máu và phản ứng viêm hệ thống ở bệnh nhân THCVC. Tác giả lập luận rằng sự suy giảm chức năng của A20 và CYLD dẫn đến mất khả năng ức chế con đường NF-κB, từ đó thúc đẩy biểu hiện cytokine tiền viêm (IL-6, TNF-α), kích thích sự gia tăng của các dòng tế bào T hoạt hóa và tế bào T điều hòa trong máu tuần hoàn. Sự tích tụ tế bào Treg tạo ra trạng thái ức chế miễn dịch chống khối u, gây bất lợi cho đáp ứng miễn dịch của người bệnh. Luận án cũng thảo luận sâu về ý nghĩa sinh học của biến thể mới CYLD p.W736G và khẳng định cơ chế mà A20 và Otubain-1 trực tiếp điều hòa các tín hiệu nội bào SHP-1, STAT-6 cũng như quá trình apoptosis và di cư của tế bào PBMC.
Chương 5: Kết luận và kiến nghị
Chương 5 đúc kết toàn bộ các phát hiện theo từng mục tiêu nghiên cứu cụ thể của đề tài và đưa ra các kiến nghị khoa học mang tính định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo về cơ chế bệnh sinh và đích điều trị phân tử.
Kết quả và những đóng góp mới
Luận án đã công bố những đóng góp mới về mặt lý luận và thực tiễn, được tác giả tổng hợp cụ thể như sau:
- Xác định đột biến mới trên gen CYLD: Phát hiện 11 SNP trên gen CYLD ở bệnh nhân THCVC. Trong đó, phát hiện SNP mới p.W736G thuộc exon 15 chưa từng được biết đến trước đó và có khả năng cao liên quan đến bệnh lý THCVC. Luận án xác định hai SNP p.2483+6 T>G thuộc gen CYLD được phần mềm SD-Score và MaxEntScan dự đoán có khả năng gây bệnh. Đặc biệt, nhóm bệnh nhân THCVC mang biến thể p.W736G có sự tích lũy nhiều SNP khác trong gen CYLD nhưng hoàn toàn không xuất hiện SNP trong gen A20 hoặc Cezanne.
- Làm rõ sự biến đổi biểu hiện gen DUB và kiểu hình miễn dịch lâm sàng: Chứng minh bệnh nhân THCVC có sự bất hoạt/giảm biểu hiện rõ rệt của các gen DUB gồm A20, CYLD, Cezanne và gen kiểm soát miễn dịch Klotho. Đi kèm với đó là sự gia tăng nồng độ cytokine IL-6 và TNF-α trong huyết tương; số lượng tế bào T hoạt hóa CD25+CD4+, tế bào Th1 và tế bào T điều hòa (Treg) trong máu tuần hoàn tăng lên đáng kể so với người khỏe mạnh.
- Chứng minh vai trò sinh học của gen A20 trên tế bào PBMC: Gen A20 đóng vai trò ức chế sự hoạt hóa của tế bào lympho T, lympho B và tủy bào (thể hiện qua các dấu ấn CD3+CD25+, CD19+CD25+, CD11b+CD40+), ức chế sự tiết các cytokine tiền viêm TNF-α và IL-1β, hạn chế sự di chuyển của tế bào PBMC và tham gia điều hòa quá trình apoptosis.
- Chứng minh vai trò sinh học của gen Otubain-1 trên tế bào PBMC: Gen Otubain-1 có chức năng ức chế sự hoạt hóa của tế bào diệt tự nhiên NK (CD56+CD44+), điều hòa sự tiết cytokine và ức chế mức độ biểu hiện của các gen tín hiệu nội bào gồm SHP-1 và STAT-6.
Về mặt kiến nghị, tác giả đề xuất tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phân tử điều hòa của các gen DUB, trọng tâm là gen CYLD, đối với hoạt động của hệ miễn dịch trên bệnh nhân THCVC, từ đó tạo tiền đề khoa học nhằm ứng dụng các phân tử DUB trong chẩn đoán kết hợp và điều trị nhắm trúng đích cho bệnh nhân mắc bệnh tăng hồng cầu vô căn.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của nghiên cứu:
- Cỡ mẫu nghiên cứu lâm sàng giới hạn ở 77 bệnh nhân THCVC và 55 người khỏe mạnh tại Việt Nam, chưa mở rộng so sánh đa trung tâm hoặc trên các nhóm sắc tộc khác nhau.
- Các thực nghiệm đánh giá chức năng sinh học của gen A20 và Otubain-1 thông qua can thiệp siRNA mới được thực hiện ex vivo trên tế bào PBMC phân lập từ người khỏe mạnh, chưa triển khai can thiệp trực tiếp trên mẫu PBMC thu nhận từ chính bệnh nhân THCVC.
- Đột biến mới CYLD p.W736G và hai SNP p.2483+6 T>G mới dừng lại ở mức độ phát hiện giải trình tự Sanger và đánh giá dự đoán chức năng thông qua các thuật toán tin sinh học (SD-Score, MaxEntScan), chưa có điều kiện tạo dòng tế bào mang đột biến điểm để kiểm chứng trực tiếp cơ chế sinh học phân tử in vitro và in vivo.
Hướng nghiên cứu tiếp theo:
- Đào sâu cơ chế phân tử chi tiết mà qua đó gen CYLD điều hòa chức năng các phân tử tín hiệu nội bào và tế bào miễn dịch trong bệnh lý THCVC.
- Khảo sát mở rộng vai trò của các biến thể gen DUB trên các bệnh lý tăng sinh tủy MPNs khác không mang nhiễm sắc thể Philadelphia (như tăng tiểu cầu tiền phát và xơ tủy nguyên phát).
- Nghiên cứu ứng dụng các chất điều hòa nhóm enzyme DUB kết hợp với các thuốc ức chế JAK2 hiện hành trong các thử nghiệm tiền lâm sàng nhằm nâng cao hiệu quả điều trị trúng đích.
Giá trị tham khảo
Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho các nhóm đối tượng:
- Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Sinh học phân tử, Di truyền y học và Huyết học - Truyền máu quann tâm đến bệnh học tăng sinh tủy và cơ chế điều hòa miễn dịch qua con đường khử ubiquitin.
- Các nhà nghiên cứu và giảng viên tại các viện nghiên cứu, trường đại học y dược: Có thể tham khảo hệ thống quy trình thực nghiệm chuẩn hóa, bao gồm quy trình phân lập và nuôi cấy PBMC người, kỹ thuật chuyển nạp siRNA vào tế bào máu ngoại vi nguyên phát, hệ thống mồi PCR khuếch đại các gen DUB và quy trình phân tích flow cytometry đa kênh đánh giá apoptosis và kiểu hình miễn dịch.
- Bác sĩ chuyên khoa huyết học và các nhà hoạch định chính sách y tế: Các số liệu về tỷ lệ biến đổi gen DUB, kiểu hình miễn dịch tế bào Treg và nồng độ cytokine IL-6, TNF-α cung cấp cơ sở dữ liệu thực chứng cho việc đánh giá tiên lượng và định hướng phối hợp các liệu pháp miễn dịch trong phác đồ điều trị THCVC tại Việt Nam.
Câu hỏi thường gặp
-
Luận án đã phát hiện biến thể di truyền mới nào trên nhóm gen deubiquitinase ở bệnh nhân THCVC?
Luận án đã xác định 11 biến thể đơn nucleotide (SNP) trên gen CYLD, trong đó phát hiện biến thể mới p.W736G tại exon 15 chưa từng được ghi nhận trong các cơ sở dữ liệu quốc tế trước đó. Ngoài ra, nghiên cứu xác định hai biến thể p.2483+6 T>G trên gen CYLD được phần mềm SD-Score và MaxEntScan dự đoán có khả năng ảnh hưởng đến vị trí ghép nối exon gây bệnh. Những bệnh nhân mang SNP p.W736G có tích lũy nhiều SNP trên gen CYLD nhưng không mang SNP trên gen A20 hay Cezanne.
-
Kiểu hình miễn dịch và nồng độ cytokine ở bệnh nhân THCVC có những biến đổi đặc thù nào so với người khỏe mạnh?
Ở bệnh nhân THCVC, các gen DUB gồm A20, CYLD, Cezanne và gen kiểm soát miễn dịch Klotho bị giảm biểu hiện (bất hoạt tương đối). Nồng độ các cytokine gây viêm IL-6 và TNF-α trong huyết tương tăng cao rõ rệt. Đồng thời, số lượng các tế bào T CD25+CD4+, tế bào Th1 và tế bào T điều hòa (Treg) trong máu tuần hoàn gia tăng đáng kể so với người bình thường.
-
Việc can thiệp bất hoạt gen A20 bằng siRNA trên tế bào PBMC mang lại kết quả thực nghiệm gì?
Khi gen A20 bị bất hoạt bằng siRNA-A20, các tiểu quần thể tế bào miễn dịch gồm tế bào T (CD3+CD25+), tế bào B (CD19+CD25+) và dòng tủy (CD11b+CD40+) gia tăng mức độ hoạt hóa. Tế bào PBMC tăng cường giải phóng các cytokine gây viêm gồm TNF-α và IL-1β, đồng thời gia tăng khả năng di cư tế bào và điều hòa tỷ lệ chết theo chương trình (apoptosis).
-
Vai trò sinh học của enzym Otubain-1 trên tế bào PBMC được chứng minh qua những chỉ số nào?
Thực nghiệm làm bất hoạt gen Otubain-1 bằng siRNA chứng minh Otubain-1 có vai trò ức chế sự hoạt hóa của tế bào diệt tự nhiên NK (CD56+CD44+), điều hòa lượng cytokine giải phóng từ PBMC và ức chế mức độ biểu hiện mRNA của hai gen truyền tín hiệu nội bào là SHP-1 và STAT-6.
-
Tỷ lệ đột biến gen JAK2V617F và các đột biến liên quan khác trong bệnh THCVC được luận án ghi nhận như thế nào?
Luận án ghi nhận đột biến JAK2V617F tại exon 14 chiếm hơn 90% các ca mắc THCVC. Đột biến trên exon 12 của gen JAK2 xuất hiện ở 2% đến 3% số bệnh nhân, thường gặp ở người trẻ tuổi có hemoglobin cao nhưng số lượng bạch cầu và tiểu cầu thấp. Đột biến gen CALR hiếm khi xuất hiện ở THCVC, trong khi đột biến gen MPL hầu như không được tìm thấy.
Kết luận
Luận án của nghiên cứu sinh Đỗ Thị Trang đã hoàn thành toàn diện hai mục tiêu nghiên cứu đặt ra, làm sáng tỏ vai trò điều hòa của nhóm gen khử ubiquitin (A20, Otubain-1, CYLD, Cezanne) và các phân tử tín hiệu nội bào trên tế bào PBMC và bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn. Nghiên cứu đã phát hiện biến thể mới CYLD p.W736G, xác định trạng thái bất hoạt của các gen DUB đi kèm sự gia tăng tế bào T điều hòa và cytokine gây viêm ở bệnh nhân THCVC tại Việt Nam. Đồng thời, các thực nghiệm can thiệp siRNA đã chứng minh chức năng ức chế miễn dịch và điều hòa tín hiệu của A20 và Otubain-1 trên tế bào PBMC, cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu ứng dụng điều trị nhắm đích trong tương lai.
