CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về con hến 1.1 Con hến Con hến có tên khoa học là Corbiculidae sp. là một họ gồm các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ thuộc bộ Veneroida. Hến có phân bố rộng rãi ở các khu vực sông và gần cửa sông. Hến cũng phân bố tập trung chủ yếu ở các vùng có khí hậu ôn đới và nhiệt đới như phía nam châu Á, phía tây đến phía đông Địa Trung Hải, các đảo Đông Nam Á và phía đông của nước Úc [6].2 Phân loại Con hến có tên tiếng anh là baby clam, tên khoa học là Corbiculidae sp., thuộc họ Corbiculidae trong bộ Veneroida.
Phân loại con hến được trình bày trong bảng 1.1 Phân loại tên khoa học con hến [7].3 Đặc điểm sinh học của con hến Con hến (Corbicula sp.) có kích thước chỉ to hơn đầu ngón tay út, có vỏ hình bầu dục hoặc tam giác giác. Vùng đỉnh vỏ của hến nhô cao trong khi phần đầu và đuôi thì gần bằng nhau. Phần cạnh bụng của hến cong nhiều hơn trong khi phần cạnh trước và cạnh sau đều tròn. Kích thước hến trưởng thành gặp từ 20,5mm đến 28,5mm.
Trên lớp vỏ có đường vân sinh trưởng thể hiện số tuổi của hến. Màu sắc của mặt ngoài vỏ hến thường có màu vàng xanh hay vàng đen. Mặt trong thì màu trắng hoặc xám. Màu sắc của hến cũng thay đổi phụ thuộc vào nơi chúng sinh sống, vỏ của hến thường có màu từ vàng lục đến nâu nhạt hoặc từ màu trắng đến xanh nhạt.
Một số hến ở tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc có vỏ màu vàng và nâu trong khi hến được thu hoạch ở phía Tây Nam Hoa Kỳ lại có màu sắc tối [8]. Hến sinh sản khá nhanh, một con hến có thể sinh sản 400 con non trong một ngày. Hến sống ở môi trường nước có nhiệt độ từ 2-30oC. Ở Việt Nam, hến sống ở kênh rạch và lớn hơn một tí là ra sông, khi trưởng thành thì thường sống ở vùng cồn cát.
Lúc hến sống được bên cồn cát là rất mập, trắng lại tròn. Ở Việt Nam, từ tháng 3 đến tháng 8 âm lịch là mùa hến sinh sản và phát triển nhiều nhất. Hến sinh sản bằng cách thả các ấu trùng đã nở bên trong vỏ vào các vùng nước xung quanh nó sinh sống, sự thụ tinh diễn ra bên trong vỏ. Tuổi thọ của hến khoảng từ 1-7 năm [9].2 Dịch thủy phân protein Dịch thủy phân protein là sản phẩm tạo ra từ quá trình thủy phân protein sử dụng các tác nhân khác nhau như tác nhân hóa học gồm acid và base hoặc tác nhân sinh học (chế phẩm enzyme protease).
Bên cạnh đó, dịch thủy phân protein còn được định nghĩa là 5 hỗn hợp của các polypeptide phân tử lượng cao, hỗn hợp của các oligopeptide phân tử lượng trung bình, peptone, hỗn hợp các peptide mạch ngắn, hỗn hợp các peptide phân tử lượng thấp và hỗn hợp các acid amin tự do [10]. Dịch thủy phân protein là một hỗn hợp chứa nhiều các peptide có độ dài và trình tự acid amin khác nhau. Thông thường, những peptide được tạo ra từ quá trình thủy phân chứa từ 2-20 acid amin cùng với các acid amin tự do [10].1 Phương pháp thu nhận 1.1 Thủy phân Quá trình thuỷ phân được định nghĩa là quá trình phá vỡ các liên kết peptide trong protein có sự tham gia của nước khi sự có mặt của chất xúc tác như tác nhân hoá học (acid hoặc base) hoặc tác nhân hóa sinh (chế phẩm enzyme).2 Thủy phân bằng tác nhân hóa học Trong sản xuất công nghiệp thực phẩm, thủy phân bằng tác nhân hóa học thường được sử dụng do những ưu điểm như giá thành thấp và đơn giản dễ thực hiện. Trong sản xuất thực phẩm, phương pháp này thường được áp dụng trong sản xuất nước tương, các sản phẩm lên men.
Các acid mạnh như HCl hoặc H2SO4 hoặc base mạnh (NaOH) thường được sử dụng để xúc tác ở nhiệt độ cao để cắt đứt liên kết peptide. Ngoài các ưu điểm nêu trên, phương pháp này cũng tồn tại các hạn chế. Khi thủy phân bằng tác nhân hóa học sử dụng acid mạnh dẫn đến mất các acid amin quan trọng như glutamine, asparagine và tryptophan cũng như các vitamin sẽ bị mất đi. Nguyên nhân là do nồng độ acid quá cao (6-10N) và nhiệt độ cao (118oC).
Dẫn đến tính chất chức năng và giá trị dinh dưỡng của dịch thủy phân thu được kém. Thêm vào đó, quá trình trung hòa lượng acid và kiềm dư sau khi thủy phân cũng dẫn đến dịch thủy phân chứa một hàm lượng muối cao ảnh hưởng đến cảm quan của sản phẩm [3].3 Thủy phân bằng tác nhân hóa sinh Phương pháp thủy phân protein bằng tác nhân hóa sinh phổ biến nhất là sử dụng chế phẩm enzyme protease (còn được gọi là peptidase hay proteinase). Protease là một tên gọi dùng chung cho một nhóm các enzyme có chức năng phân giải protein bằng việc phân cắt liên kết peptide của protein. Protease được tìm thấy ở động vật, thực vật nấm và vi sinh vật.
Protease có nguồn gốc từ vi sinh vật là nguồn enzyme lớn nhất, được ứng dụng trong các lĩnh vực công nghiệp, công nghệ sinh học, y dược và phục vụ nghiên cứu các lĩnh vực khoa học cơ bản [3]. Protease được phân loại thành 5 nhóm chính dựa vào nhóm chức chức năng ở trung tâm hoạt động bao gồm serine, thiol, cystein, carboxyl và metallo. Bên cạnh đó, protease còn được phân loại thành 2 nhóm là endoprotease và exoprotease dựa theo vị trí phản ứng. Nhóm endoprotease, nhóm này thủy phân liên kết peptide trong protein, sinh ra những peptide lớn.
Và nhóm còn lại là exoprotease (aminopeptidase thủy phân liên kết peptide ở đầu N và carboxypeptidase thủy phân liên kết peptide đầu C của protein) [3]. Thủy phân bằng tác nhân hóa sinh có nhiều ưu điểm vượt trội hơn so với phương pháp hóa học. Ưu điểm lớn nhất là bảo vệ được giá trị dinh dưỡng của các acid amin được tạo ra trong quá trình thủy phân do hạn chế sử dụng hóa chất. Ngoài ra dựa vào sự đặc hiệu của vị trí cắt của các enzyme protease khác nhau, từ đó có thể lựa chọn enzyme protease phù hợp để kiểm soát được thành phần peptide và acid amin của dịch thủy phân [11].3 Hoạt tính sinh học của dịch thủy phân protein Hoạt tính sinh học của dịch thủy phân có được có liên quan tới sự cộng hưởng hoạt tính của các thành phần có trong dịch thủy phân như peptide, protein tan trong nước và các acid amin [12].
Trong đó, peptide đóng vai trò quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của dịch thủy phân do peptide chiếm phần lớn trong thành phần dịch. Tuy nhiên, các peptide chỉ thể hiện được các hoạt tính sinh học như liên kết kim loại, kháng khuẩn, ức chế enzyme chuyển hóa Angiotensin (ACE), kháng oxy hóa và các hoạt tính khác khi 7 chúng được giải phóng khỏi trình tự protein thông qua các quá trình như tiêu hóa, thủy phân bằng enzyme [13].1 Hoạt tính ức chế enzyme chuyển hóa Angiotensin (ACE) Cao huyết áp là một tình trạng bệnh lý mãn tính, trong đó huyết áp trong động mạch tăng cao. Do đó, nó là nguy cơ phổ biến nhất của nhiều bệnh lý liên quan về tim mạch [14]. ACE là một enzyme có vai trò quan trọng trong cơ chế điều hòa huyết áp.
ACE xúc tác quá trình chuyển đổi angiotensin-I (một hormone peptide) thành angiotensin-II bằng cách loại bỏ hai amino acid ở đầu cuối carboxyl của angiotensin-I. Angiotensin-II làm co mạch máu dẫn đến huyết áp cao [15]. Ngoài ra, theo hình 1.2 ACE còn làm phân hủy cả bradykinin- một chất làm giãn mạch máu khi mạch máu bị co quá mức. Vì vậy, ức chế ACE là mục tiêu chính cho hoạt động hạ huyết áp, ngăn ngừa các bệnh tim mạch.
Dựa trên cơ chế điều hòa huyết áp trong cơ thể, rất nhiều thuốc ức chế ACE tổng hợp được điều chế như captopril, lisinopril, enalapril và alacepril. Tuy nhiên, những chất này lại có tác dụng phụ khiến người sử dụng bị ho, phát ban da, rối loạn vị giác hay bị viêm. Vì thế, các chất ức chế ACE có nguồn gốc từ tự nhiên được nghiên cứu rộng rãi nhằm thay thế chất ức chế ACE tổng hợp [15].2 Mô tả hoạt động của enzyme chuyển hóa angiotensin trong cơ thể [15].2 Cơ chế ức chế enzyme chuyển hóa Angiotensin (ACE) ACE là một glycoprotein có chứa gốc carbohydrate bao gồm mannose, galactose, fructose, N-acetylneuraminic acid và N-acetyl-glucosamine. Cấu trúc của ACE bao gồm hai vùng, đó là vùng N và vùng C.
Mỗi vùng chứa các vị trí mà tại đó liên kết với Zn2+. Do đó Zn2+ đóng vai trò là cofactor xúc tác cho các phản ứng của ACE. Vì vậy, Zn2+ đóng vai trò quan trọng và cần thiết cho hoạt động của ACE.3 minh họa cấu trúc của ACE. Do đó, ACE có thể bị ức chế bởi các tác nhân tạo phức với kim loại [16].3 Cấu trúc ACE và vị trí liên kết của ion kẽm tại đầu N và đầu C [17].
Các cơ chế ức chế ACE được phát hiện là ức chế cạnh tranh và ức chế không cạnh tranh. Trong cơ chế ức chế cạnh tranh, chất ức chế cạnh tranh với cơ chất bằng cách liên kết với vị trí hoạt động của ACE. Tương tác nhiều liên kết hydro giữa ACE và peptide có thể thúc đẩy sự ức chế hoạt động của ACE [18]. Ngoài ra, các peptide ức chế cạnh tranh 9 với cơ chất thường có độ dài mạch ngắn khoảng từ 2 - 12 amino acid.
Các peptide lớn không thể liên kết với các vị trí hoạt động của ACE [16]. Một yếu tố khác là thành phần acid amin của các peptide,các peptide có các amino acid có tính acid như Glu và Asp tạo điện tích âm cho peptide. Vì vậy, peptide hình thành liên kết phối trí với Zn2+ ở vị trí hoạt động của ACE [16]. Trong cơ chế ức chế không cạnh tranh, chất ức chế liên kết với một vị trí khác với vị trí hoạt động của ACE.
Sự gắn kết của chất ức chế với ACE làm thay đổi cấu trúc của ACE, điều này ngăn cản cơ chất liên kết với vị trí hoạt động của ACE [16]. Thông thường, chất ức chế liên kết với phức hợp cơ chất-enzyme tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất-peptide ức chế, ngăn cản tạo thành sản phẩm và dẫn đến làm giảm Vmax của ACE [19].3 Đặc tính của peptide có hoạt tính ức chế ACE Theo nghiên cứu của Gu và cộng sự (2013), hai mô hình mỗi quan hệ định lượng giữa hoạt tính và cấu trúc đã được xây dựng cho các dipeptide và tripeptide tương ứng dựa trên 168 dipeptide và 140 tripeptide có hoạt tính ức chế ACE mạnh được báo cáo trong các công trình đã xuất bản trước đây.